STERILISASI DALAM FERMENTASI

• Mikroba berperanan penting pada proses fermentasi.

• Produk hasil fermentasi dihasilkan oleh mikroba tertentu dalam suatu media yg mengandung nutrisi.

• Pada proses fermentasi sangat beresiko terjadi kontaminasi.

Proses fermentasi sangat berpotensi timbulnya kontaminasi karena:

• Proses fermentasi menggunakan

media yang kaya akan nutrien

• mengandung mikroorganisme yang

pertumbuhannya lambat

• Proses fermentasi berlangsung lama

• Proses fermentasi berlangsung dalam

temperatur dan pH menengah

• Sebagian besar proses fermentasi dilakukan dengan menggunakan kultur murni.

• Dalam kultur murni tersebut hanya strain tertentu saja yang diijinkan untuk tumbuh

contoh: S. Cereviceae pada fermentasi alkohol

1. Media harus mensupport pertumbuhan mikroorganime baik dan mikroorganisme asing, sehingga produktivitas proses fermentasi akan menurun

Organisme yang memproduksi produk fermentasi harus berkompetisi guna mendapatkan nutrien yang jumlahnya terbatas

Bisa jadi pertumbuhan mikroorganisme asing akan melebihi pertumbuhan mikroorganisme fermentasi

4. Kontaminan dapat menghasilkan produk yang tidak diinginkan

contoh:

• Kontaminasi pada industri gula oleh Leuconostoc mesenteroides (menghasilkan lendir)

• Kontaminasi pada industri bir oleh bakteri asam laktat (menghasilkan asam laktat)

5. Kontaminasi dapat merubah kondisi fermentasi, akibatnya kondisi media fermentasi tidak lagi optimum untuk menghasilkan yield terbaik

contoh:

kontaminasi E Coli pada proses produksi streptomycin oleh Streptomyces griseus. E Coli akan menggunakan oksigen dalam medium fermentasi yield turun

• Kontaminasi oleh bakteri lytic seperti bacteriophages atau Bdellovibrio dapat berakibat hancurnya mikroorganisme fermentasi

4. Mikroorganisme asing dapat menghasilkan kontaminan yang dapat mempersulit proses separasi produk

5. Kontaminan dapat mendegradasi produk akhir fermentasi

1. Menggunakan inokulum murni untuk memulai suatu proses fermentasi

2. Sterilisasi media yang digunakan

3. Sterilisasi fermentor

4. Sterilisasi semua bahan yang ditambahkan selama proses fermentasi

5. Menjaga kondisi aseptis selama proses fermentasi

• Kondisi lingkungan pada saat fermentasi dapat diatur shg sesuai utk pertumbuhan mikrobanya, spt: pH, suhu, nutrisi, RH, aerasi, oksigen terlarut dll.

contoh:

pada proses fermentasi molases, pH dijaga pada range 4,5-5 (pH optimum bakteri 6,5-7,5)

• Ketika terjadi kontaminasi, suatu industri fermentasi biasanya melakukan identifikasi mikroorganisme yang menyebabkan kontaminasi

• Sebagian besar industri fermentasi akan mengidentifikasi mikroorganisme yang biasa mereka temui dalam lingkungan industri mereka

• Kontaminasi oleh mikroorganisme yang pernah dialami sebelumnya akan mengindikasikan suatu sumber kontaminasi

Kondisi steril dapat diperoleh melalui dua metode yakni:

1. Fisik

a. Aseptis

b. Panas

c. Filtrasi

d. Radiasi

2. Kimiawi

a. Chemosterilant

b. Gaseous sterilant

c. others

• Kondisi aseptis melibatkan kebersihan secara umum

- Penggunaan kelengkapan seperti sarung tangan, masker, jas serta cuci tangan dapat meminimalisir kontaminasi ke produk

- Penggunaan desinfektan

• Kondisi aseptis tidak sepenuhnya menstrerilkan, hanya mengurangi mikroorgansime pengkontaminan

• Panas merupakan medium sterilisasi yang paling banyak digunakan dalam industri fermentasi

• Panas dapat diaplikasikan untuk proses fermentasi baik media cair maupun objek padat

• Panas diaplikasikan dalam bentuk:

1. Pemijaran (api)

2. udara panas (dry heat)

3. uap air (moist heat)

a. Pemijaran (dengan api langsung): membakar alat pada api secara langsung, contoh alat : jarum inokulum, pinset, batang L, dll.

• Udara panas biasanya digunakan untuk proses sterilisasi glasware dan material solid yang sifatnya heatable.

• Dalam industri fermentasi, udara kering digunakan untuk sterilisasi filter udara, dan sterilisasi udara melalui proses kompresi

• Mahal

• Tidak praktis

• Laju kematian bakteri rendah karena resistensi panas intrinsik bakteri meningkat tajam pada kondisi kering

• Konduksi panas lambat (dibandingkan steam)

• Uap panas dapat diaplikasikan melalui proses:

a. Tindalisasi

b. Pasteurisasi

c. Autoclave

• Konsep kerja metode ini mirip dengan mengukus

• Bahan yang mengandung air dan tidak tahan tekanan atau suhu tinggi lebih tepat disterilkan dengan metode ini

• Tindalisasi dapat diaplikasikan untuk sterilisasi media yang tidak bisa disterilisasi melalui proses filtrasi (viscous)

• Proses sterilisasi dengan pemanasan selama satu jam, dilakukan tiga hari berturutan

• Pada hari pertama: sel vegetatif mati, namun spora tidak

• Pada hari kedua: sel vegetatif dari spora yang tumbuh akan mati

• Pada hari ketiga: sel vegetatif dari spora yang masih bertahan pada hari kedua akan mati

• Kondisi operasi tindalisasi”

hari 1: suhu 1000 C selama 15-30 menit

hari 2: suhu 1000 C selama 15-30 menit

hari 3: suhu 1000 C selama 60 menit

• Biasa diaplikasikan pada industri makanan

• Ekspose suatu material terhadap panas untuk membunuh mikroba

• LTLT: 600 C selama 1,5 jam (batch)

• HTST: 700 C selama 15 detik (kontinyu)

• Autoclave laboratorium biasanya dioperasikan dengan steam bertekanan 30 psia,yang setara dengan suhu 121°C.

• Pada kondisi tersebut, spora bakteria akan mati dengan cepat.

• Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus,

• Lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip.

• Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan.

• Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media.

• Jika media tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.

Beberapa bahan yang tidak disterilisasi dengan autoclave

• Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

• Paelarut organik, seperti fenol

• Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

• Memiliki heat content yang tinggi sehingga kemampuan sterilisasinya tinggi (persatuan volume atau berat)

• Steam melepaskan panas pada temperatur yang konstan

• Steam dapat dengan mudah diproduksi dan didistribusikan

• Tidak ada produk sisa, bersih dan tidak berbau dan tidak berasa

• Tidak cocok untuk sterilisasi padatan anhidrat, bahan yang viscos, dan serbuk

• Keefektifannya berkurang dengan adanya udara

• Digunakan untuk sterilisasi pipa, fermentor dan media

• PT. Madukismo:

Sterilisasi tangki pembibitan dan fermentasi menggunakan uap bersuhu 1200 C tekanan 1,98 atm selama 20-30 menit

• Bahan kimia dapat digunakan untuk mematikan mikroorganisme sebagai akibat dari kemampuan bahan kimia tersebut untuk mengoksidasi dan mengalkilasi

• Namun demikian, bahan kimia tidak dapat digunakan untuk proses sterilisasi media karena residunya akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme fermentasi

Bahan kimia

• Bahan kimia umum digunakan untuk proses disinfeksi yang biasanya berimplikasi terhadap berkurangnya atau hilangnya organisme patogen

• Banyak sel suatu material yang akan mengalami kerusakan DNA dan pada akhirnya akan mati setelah menyerap sinar ultraviolet

• Sinar ultraviolet dengan panjang gelombang sekitar 265 nm merupakan sinar yang paling efisien dalam membunuh bakteri

Radiasi

• Namun demikian, sinar ultraviolet memiliki kelemahan yakni kemampuan penetrasinya yang lemah terhadap suatu materi.

• Oleh karenanya penggunaannya terbatas pada pengurangan populasi mikroorganisme dalam suatu ruangan (misal ruang operasi, kamar bersih suatu laboratorium)

Radiasi

• Sinar X merupakan sinar yang mematikan bagi mikroorganisme

• Kemampuan penetrasi sinar X juga lebih besar dibandingkan sinar ultraviolet

• Namun penggunaannya terbatas mengingat harga peralatan yang mahal dan alasan keamanan.

• Gelombang sonic atau ultrasonic dengan intensitas tertentu dapat merusak dan mematikan suatu sel

• Teknik ini biasanya diaplikasikan dalam proses penghancuran sel dengan tujuan mengekstrak material sel dan bukannya digunakan untuk tujuan sterilisasi

Filtrasi

• Proses filtrasi merupakan proses yang efektif digunakan dalam proses pemisahan mikroorganisme dari udara atau gas.

• Dalam hal untuk larutan, proses filtrasi digunakan untuk media atau produk yang tidak tahan panas, yang mudah rusak oleh panas

• Misalnya serum hewan atau manusia, dan enzim

1. Sterilisasi Media

2. Sterilisasi Fermentor

3. Sterilisasi Udara

• Media yang digunakan untuk proses fermentasi harus disterilkan

• Pembunuhan mikroba pada proses sterilisasi mengikuti reaksi orde pertama dg persamaan:

• dimana: N=jml mikroba hidup pd media

t=waktu perlakuan sterilisasi

k=konstanta laju reaksi atau

• kematian spesifik

• Tipe reaksi yg dapat mjd penyebab rusaknya kualitas nutrisi selama proses sterilisasi yaitu:

1. Interaksi antara komponen-komponen

nutrien

2. Degradasi senyawa2 labil akibat panas

spt vitamin dan asam amino

Interaksi antara komponen2 nutrient

Pada saat sterilisasi sering terjadi proses browning Maillard yaitu terjadinya perubahan warna mjd kecoklatan krn hasil reaksi gugus karbonil (umumnya gula2 reduksi) dg asam2 amino dr protein.

Degradasi senyawa2 labil akibat panas

• Misal: vitamin dan asam amino.

• Reaksi2 yg menimbulkan kerusakan ini dapat dikurangi dg menggunakan suhu dan waktu sterilisasi yang sesuai.

• Untuk mensterilkan media fermentasi dapat dilakukan pada suhu yang tinggi dg waktu pendek.

• Tetes disterilkan dengan menggunakan steam setelah dilakukan proses pengenceran tetes

• Sebelum proses fermentasi media dilakukan , maka fermentor harus disterilkan terlebih dahulu.

• Biasanya dilakukan dg pemanasan pada bagian pelindung (jacket) atau bagian koil dari fermentor dg menggunakan uap dan disemprotkan ke dlm fermentor. Udara yg terdapat dalam fermentor akan terdorong/terusir keluar.

• Tekanan yg digunakan adalah 15 psi selama 20 menit

• Fermentor yg telah digunakan sangat baik skl jika :

1. Dialirkan udara steril kedalamnya dan diberi tekanan atau

2. Divakumkan dg mengeluarkan udara yg tdk steril dari dalam fermentor tsb.

• Air dipompa melalui bagian atas (1)

• Air diaduk (9)

• Air dibuang (5)

• Steam masuk (3)

• Steam suhu 120-1300 C, tekanan 2 kg/cm3

• Sterilisasi gas atau udara amat vital dalam proses fermentasi.

• Udara mengandung sejumlah mikrooganisme baik bakteri, yeast, atau jenis lainnya.

• Proses aerobik memerlukan oksigen dari udara atau berupa oksigen murni.

• Proses anaerobik memerlukan nitrogen dan mungkin sedikit karbondioksida

• Fermentasi selalu menghasilkan gas, sehingga reaktor harus dilengkapi saluran gas keluar.

• Belum lagi dalam semua proses persiapan fermentasi, perlu dalam suasana steril.

• Sterilisasi udara dapat dilakukan dg pemanasan tetapi umumnya menggunakan teknik filtrasi/penyaringan dg filter.

• Gas dilewatkan pada membrane filter, umumnya terbuat dari selulosa asetat yang hidrofobik, memiliki diameter pori 0.22 micrometer sehingga bisa menyaring bakteri yang berukuran 1 micrometer.

• Pada skala lab, filter berupa disc yang dipasang pada saluran gas masuk dan keluar.

• Sedangkan cartridge filter dipakai pada skala industri.

cartridge filter.PDF

• Filter yg digunakan dpt dibagi mjd 2 klp yaitu:

1. Filter yg mempunyai pori lbh kecil dr partikel

2. Filter yg dibuat dr bahan berserat (fibrous filter)

1. Sterilisasi sistem tertutup/batch

2. Sterilisasi sistem kontinyu

• Proses fermentasi sistem batch kurang baik digunakan untuk mencegah kerusakan nutrien tp dpt meminimalkan kerusakan nutrien.

• Sterilisasi sistem batch untuk suatu fermentasi mungkin dapat diperoleh baik dalam wadah fermentasi maupun dlm wadah pemasak terpisah.

• Suhu yang paling tinggi pada proses sterilisasi adalah 121oC, shg dlm prosedur sterilisasi ini harus dipolakan sedemikian rupa shg media memperoleh suhu sebesar itu.

KEUNTUNGAN STERILISASI SISTEM BATCH

1. Keperluan modal lebih kecil

2. Resiko kontaminasi lebih rendah

3. Pengaturan secara manual lebih mudah

4. Lebih mudah menggunakan media yg

mengandung proporsi zat padat tinggi.

KELEMAHAN STERILISASI SISTEM BATCH

1. Perlu adanya pipa yg kompleks utk mengangkut media steril tp ada resiko kontaminasi.

2. Kemungkinan bs terjadi kegagalan mekanis pada alat pemasak (cooker) dlm penyediaan media utk bbrp fermentor.

• Pola sistem kontinyu mencakup periode waktu dimana media dipanaskan sampai pd suhu sterilisasi, penahanan dan pendinginan sampai pada suhu fermentasi.

KEUNTUNGAN STERILISASI SISTEM KONTINYU

1. Perawatan kualitas media lebih tinggi

2. Pengaturan otomatis lebih mudah

3. Pengurangan waktu siklus sterilisasi.

4. Dalam keadaan tertentu dpt mengurangi korosi fermentor.

STERILISASI SISTEM KONTINYU

Ada 2 tipe sterilisator kontinyu untuk fermentasi media yaitu:

1. Plat penukar panas kontinyu (continous plate heat exchanger)

2. Injektor pendingin cepat yg kontinyu (continous injector flash cooler)