04 isolasi dan inokulasi

Isolasi dan Inokulasi Mikroorganisme

BAB IPENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Populasi mikroba dialam sekitar kita begitu besar dan

kompleks. Beratus-ratus spesies pelbagai mikroba biasanya

menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk

mulut, saluran pencernaan, dan kulit. mereka terdapat dalam

jumlah besar. Sebagai contoh apabila kita bersih sekali saja

dapat menyebabkan beribu – ribu mikroorganisme. Penelitian

yang layak mengenai berbagai mikroorganisme alam berbagai

habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan berbagai

campuran yang rumit atau biakan campran menjadi spesies

yang berbeda – beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri

darisuatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel

induk.

B. Rumusan Masalah, Maksud dan Tujuan Percobaan

a) Rumusan masalah pada pratikum ini adalah:

1. Metode-metode apa saja yang digunakan untuk

memisahkan mikrobia tertentu dari populasi

campurannya untuk mendapatkan kultur murni?

2. Bagaimana karakteristik mikroba yang tumbuh pada

kultur murni?

b) Maksud percobaan pada praktikum ini adalah:

Syahrir Mana’an S Rina Andriani S. Farm, Apt.(F1F1 12 137)


1. Memahami metode-metode yang digunakan untuk

memisahkan mikrobia tertentu dari populasi

campurannya untuk mendapatkan kultur murni.

2. Memahami karakteristik mikroba yang tumbuh pada

kultur murni

c) Tujuan dilakukannya Percobaan ini adalah:

1. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan

untuk memisahkan mikroba tertentu dari populasi

campurannya untuk mendapatkan kultur murni.

2. Untuk mengetahui karakteristik mikroba yang tumbuh

pada kultur murni.



BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Teori Umum

Metode yang digunakan untuk pengujian mikrobiologi

sangat ditentukan oleh persyaratan yang diacu, umumnya

pengujian dilakukan secara kualitatif dengan metode pengayakan

(enrichment) yaitu isolasi dan identifikasi mikroba dan interpretasi

hasil (negatif pergram/ml atau negatif per 25 gram atau per 100

gram/ml). Pengujian secara kuantitatif (enumerasi) dengan

penghitungan jumlah mikroba dan interpretasi hasil berupa koloni

per ml/g atau koloni per 100 ml. Identifikasi mikroba pathogen

dapat dilakukan dengan cara konvensional maupun dengan

pengujian cepat (rapid test) (BPOM, 2008).

Jumlah dan jenis mikroba berbahaya yang terdapat pada

makanan perlu dihilangkan. Berbagai cara telah dilakukan untuk

tujuan tersebut, misalnya dengan pemanasan, penyimpanan pada

suhu rendah, penggaraman, pengasaman, penambahan zat kimia

tertentu, dan lain-lain. Bahan-bahan alami terutama rempah-

rempah juga digunakan dengan tujuan yang sama selain tujuan

utamanya sebagai bumbu atau penambah cita rasa. Oleh sebab

itu, perlu diteliti pengaruh lamanya pendedahan makanan pada

lingkungan dan perbedaan musim terhadap keberadaan

Enterobacteriaceae patogen pada makanan berbumbu dan tidak

berbumbu (Ernyn, 2007).



Teknik penanaman bakteri metode Spread plate (agar

tabur ulas) adalah teknik menanam dengan menyebarkan

suspense bakteri dipermukaan agar diperoleh kultur murni. Selain

itu ada ula yang disebut dengan Pour plate yakni teknik untuk

memperoleh kultur murni bakteri dengan memerlukan agar yang

belumpadat (>450C) untuk dituang bersama suspensi bakteri

kedalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan

memadat. Hal ini menyebarkan sel – sel bakteri tidak hanya pada

permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (didalam agar)

sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya

O2 dan ada yang tumbh didalam agar yang tidak banyak

mengandung oksigen (Anonim, 2014).

Identifikasi bakteri dilakukan terhadap isolatisolat yang

diperoleh dengan berpedoman pada buku Bergey’s Determinative

Bacteriology dengan melakukan serangkaian uji morfologi dan

biokimia yaitu uji pewarnaan Gram, uji motilitas, pengamatan

bentuk sel, tipe penggandengan sel, sifat aerobik dan anaerobik,

kemampuan tumbuh pada suhu 50C, 200C, dan 300C. Pengamatan

dilakukan juga pada warna koloni, ukuran koloni, bentuk koloni

yang dilihat dari dalam, samping dan atas, kemampuan

memproduksi katalase dan oksidase, uji halofilik dan oksidase

sitokrom untuk menentukan genus bakteri heterotroph (Efendy,

2004).

B. Uraian Bahan

1. Agar (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal : 74)



Nama resmi : Agar

Nama lain : Agar-agar

Pemerian : Berkas potongan memanjang, tipis seperti

selaput dan berlekatan, atau berbentuk

keping, serpih atau butiran; jingga lemah

kekuningan, abu-abu kekuningan sampai

kuning pucat atau tidak berwarna; tidak

berbau atau berbau lemah; rasa berlendir;

jika lembab liat; jika kering rapuh

Kelarutan : Praktis tidak larut dalam air, dan larut

dalam air mendidih.

Kegunaan : Sebagai bahan pemadat medium.

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.

2. Aquades (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal : 96)

Nama resmi : Aqua Destillata

Sinonim : Aquadest / Air Suling

RM / BM : H2O / 18,02

Rumus struktur : H – O - H

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna. Tidak

berasa, tidak berbau.


Kegunaan : Sebagai pelarut

3. Dekstrosa (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal :67 )

Nama resmi : Dextrosum

Sinonim : Dekstrosa



RM / BM : C6H12O6.H2O / 180,16

Pemerian : Hablur tidak berwarna, serbuk hablur atau

serbuk granul putih, tidak berbau, rasa

manis.

Kelarutan : Mudah larut dalam air, sangat mudah larut

dalam air mendidih, larut dalam etanol

mendidih, sukar larut dalam etanol.


Kegunaan : Sebagai komponen pembuat medium PDA

4. Ekstrak Beef (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal : 45 )

Nama resmi : Beef Extract

Nama lain : Kaldu nabati, kaldu hewani, ekstrak beef

Pemerian : Berbau dan berasa pada lidah. Kaldu

daging sapi konsentrat diperoleh dengan

mengekstraksi daging sapi segar tanpa

lemak, dengn cara merebus dalam air dan

menguapkan kaldu pada suhu rendah

dalam hampa udara sampai terbentuk

residu kental berbentuk pasta. Massa

berbentuk pasta, berwarna coklat

kekuningan sampai coklat tua, baud an

rasa seperti daging, sedikit asam.

Kelarutan : Larut dalam air dingin.

Kegunaan : Sumber protein untuk pertumbuhan

mikroorganisme



Penyimpanan : Simpan dalam wadah tertutup rapat, tidak

tembus cahaya.

5. Ekstrak Yeast (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal :

671)

Nama resmi : Ekstrak Ragi

Sinonim : Sari ragi

Pemerian : Kuning kemerahan sampai coklat, bau

khas tidak busuk

Kelarutan : Larut dalam air, membentuk larutan

kuning sampai coklat, bereaksi asam

lemah, tidak mengandung karbohidrat

Penyimpanan : Dalam wadah tertrutup baik

6. Alkohol ( Dirjen POM, 1979)

Nama resmi : Aethanolum

Nama Lain : Etanol

RM / BM : C2H5OH / 47,06

Pemerian : Cairan tak berwarna, jernih muda

menguap, mudahbergerak, bau khas, rasa

panas, mudah terbakar, memberikan

nyala biru yang tak berasap.

Kelarutan : Bercampur dengan air dan praktis

bercampur dengan semua pelarut organik

Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindung

dari cahaya, ditempat sejuk, jauh dari

nyala api.



Kegunaan : Sebagai pelarut

7. Pepton (Farmakope Indonesia, edisi III, Hal : 721)

Nama resmi : Pepton

Pemerian : Serbuk, kuning kemerahan sampai coklat,

bau khas, tapi tidak busuk.

Kelarutan : Larut dalam air; memberikan larutan

berwarna coklat kekuningan yang bereaksi

agak asam; praktis tidak larutan dalam

etanol (95%) P dan dalam eter P.


Kegunaan : Sebagai komponen pembuat

medium PDA

C. Uraian Mikroba Uji

1. Candida albicans

a. Klasifikasi

Klasifikasi Candida albicans adalah sebagai berikut:

Divisio : Thallophyta

Subdivisio : Fungi

Classis : Deuteromycetes

Ordo : Moniliales

Familia : Cryptococcaceae

Genus : Candida

Spesies : Candida albicans (Ariningsih, 2009)

b. Morfologi dan identifikasi



Sel jamur Candida berbentuk bulat, lonjong atau bulat

lonjong. Koloninya pada medium padat sedikit menimbul

dari permukaan medium, dengan permukaan halus, licin

atau berlipat-lipat, berwarna putih kekuningan dan berbau

ragi. Besar koloni bergantung pada umur. Pada tepi koloni

dapat dilihat hifa semu

sebagai benang-benang halus yang masuk ke dalam

medium. Pada medium cair jamur biasanya tumbuh pada

dasar tabung (Ariningsih, 2009).

2. Pseudomonas aureginosa

a. Klasifikasi

Pseudomonas aeruginosa memiliki klasifikasi sebagai

berikut:

Divisi : Protophyta

Class : Schizomycetes

Ordo : Pseudomonadales

Sub Ordo : Pseudomonadinae

Familia : Pseudomonadaceae

Genus : Pseudomonas

Species : Pseudomonas aeruginosa

(Rostinawati, 2009).

b. Morfologi

P. aeruginosa merupakan bakteri Gram negatif,

berbentuk batang lurus atau lengkung, berukuran sekitar

0,6 x 2 μm, ditemukan tunggal, berpasangan, dan kadang-



kadang membentuk rantai pendek, tidak mempunyai spora,

tidak mempunyai selubung (sheath), serta mempunyai

(Rostinawati, 2009).



BAB III

KAJIAN PRAKTIKUM

A. Alat yang dipakai

Alat-alat yang digunakan pada pratikum ini, yakni tabung

reaksi, spoit, lampu spiritus, jarum inokulum, cawan petri,

inkubator, laminar air flow, enkas, botol gelap.

B. Bahan yang digunakan

Bahan- bahan yang di gunakan pada pratikum ini, yakni

akuades, NB (Nutrient Bront), PDA (Potato dectrose agar), alkohol

70%, Aluminium voil, kapas, tissu, air got.

C. Prosedur Kerja

Pada praktikum ini, prosedur kerja yang dilakukan adalah

sebagai berikut.

1. Isolasi mikroorganisme

a. Diencerkan sampel yang akan diisolasi dari pengenceran

10-1 hingga 10-4.

b. Dari pengenceran yang dikehendaki sebanyak 1 mL

larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri steril.

c. Dituangkan agar nutrisi yang telah dicairkan ke dalam

cawan petri tersebut, dihomogenkn dengan cara

memutar cawan petri di atas meja dengan gerakan

seperti angka delapan untuk menyebarkan sel-sel

mikroba secara merata.



d. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut diinkubasi

dengan posisi terbalik.

e. diamati koloni mikroba yang terbentuk.

2. Teknik Pemindahan Biakan

a. Dipegang tabung yang berisi biakan mikroorganisme

dengan tangan kiri, dan jarum inokulasi dengan tangan

kanan.

b. Dibuka tabung biakan dengan melepaskan sumbat kapas

menggunakan tangan kanan, dipijarkan memijarkan

mulut tabung diatas nyala api sebanyak 2 kali.

c. Dipijarkan jarum inokulasi sampai berwarna merah,

didinginkan ke dalam larutan alkohol 70 % kemudian

dipijarkan kembali.

d. Diambil biakan, dengan cara dipindahkan sedikit dari

permukaan medium tabung dan langsung menyentuhkan

ke permukaan medium tabung.

e. Dipijarkan kembali dan ditutup tabung biakan,

dipanaskan seperti semula. ditutup kembali dengan

sumbat kapas dan jarum inokulasi dipijarkan sampai

warnanya merah dan diletakkan di tempatnya.

3. Pengamatan mikroorganisme dan berbagai macam media

a. Medium Agar Miring

1. Media PDA, dituang ke dalam tabung reaksi dan

memiringkannya dan membiarkanya memadat.



2. Dipegang tabung medium pembiakan dengan tangan

kiri.

3. Diambil koloni yang ada dengan jarum inokulasi pada

lempeng pembiakan.

4. Digores biakan pada permukaan medium miring,

dimulai dari dasar tabung dibuat garis lurus sampai

keatas.

5. Diinkubasi pada suhu 300C selama 2 x 24 jam.

6. Dilakukan pengamatan koloni secara morfologi.

b. Medium Agar Tegak

1. Dimasukan medium kedalam tabung reaksi sebanyak

10 ml.

2. Diambil satu ose isolat dari medium biakan kemudian

tusukkan kedalam permukaan medium agar didalam

tabung reaksi.

3. Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam.




c. Medium Cair

1. Dimasukan medium NB

2. Diambil satu isolat bakteri dari medium biakan

dengan jarum ose dan dikocok.

3. Diinkubasi pada suhu 300C selama 24 jam.




BAB IV

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A. Gambar Pengamatan

Inokulasi Mikroba

1.


LABORATORIUM

MIKROBIOLOGI FARMASI

UNIVERSITAS HALUOLEO

MIKROBA :Pseudomonas AureusMEDIUM : NB

LABORATORIUM



MIKROBA :Candida albicans

MEDIUM : PDA Miring

Keterangan :

1. Tabung reaksi2. Medium NB3. Bentuk koloni Sediment


Keterangan

1.Tabung reaksi

2. Medium PDA

3. Bentuk spreading

Keterangan:

1.Tabung reaksi

2. Medium PDA

3.Bentuk beaded


LABORATORIUM



MIKROBA:Candida albicans

MEDIUM : PDA Tegak


Tabel Hasil Pengamatan Isolasi

No. Nama Sampel

Nama

Media

Ciri KoloniWarn

aUkuran Bentuk

Elevasi Tepi

1. Air got 10-1

PDA Small Irreguler Convex Undulate Putih

2. Air got 10-2

PDA Small Circular Raised Entire Putih

3. Air got 10-3

PDA Moderate Circular Raise

d Entire Putih

4. Air got 10-4

PDA Moderate Circular Flat Entire Putih



Tabel Hasil Pengamatan Inokulasi

No. Mikroorganisme Medium Bentuk Koloni

1. Pseudomonas Aureus NB Cair Sediment

2. Candida albicans PDA Miring Spreading

3. Candida albicans PDA Tegak Echinulate

B. Pembahasan

Isolasi adalah cara pemisahan mikroorganisme tertentu

dari lingkungan, sehingga dapat diperoleh biakan yang sifatnya

murni, sehingga dapat dibuat sebagai biakan kultur murni.

Metode inokulasi terbagi dua yaitu metode agar tegak dimana

Metode ini menggunakan medium yang telah dipadatkan dengan

tegak (permukaannya rata) dalam tabung reaksi. Inokulasi

dengan cara ini menggunakan ose lurus dengan cara menusukkan

ose yang telah disentuhkan dengan biakan bakteri atau jamur ke

dalam medium yang memadat hingga ½ dari tinggi medium.

Kemudian diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37oC selama

1 x 24 jam untuk bakteri dan selama 3 x 24 jam untuk jamur pada

suhu kamar.

Metode inokulasi selanjutnya yakni metode agar miring.

Pada metode agar miring inokulasi menggunakan medium yang

telah dipadatkan dengan dimiringkan dalam tabung reaksi. Pada

metode ini digunakan ose bulat yang telah disentuhkan dengan

biakan bakteri atau jamur dengan cara digoreskan secara zig –



zag pada permukaan medium. Kemudian diinkubasikan selama 1

x 24 jam untuk bakteri

dalam inkubator pada suhu 37oC dan selama 3 x 24 jam untuk

jamur pada suhu kamar. Selain itu, dalam kultur murni digunakan

pula Metode isolasi dan terbagi menjadi tiga bagian yaitu isolasi

substrat padat dengan metode gores. Pertama-tama medium

dimasukkan dalam cawan Petri, ditunggu hingga memadat. Lalu

digoreskankan sampel yang telah digerus pada medium yang

memadat. Setelah itu, cawan Petri tersebut dibungkus dan

diinkubasi secara terbali. Diamati pertumbuhan koloni

mikrobanya. Selanjutnya yakni isolasi substrat cair dengan

metode tuang.

Sampel yang berupa larutan atau suspensi dimasukkan ke

dalam cawan Petri, lalu dimasukkan juga medium. Dihomogenkan

dengan cara digerakkan membentuk angka delapan. Ditunggu

hingga medium memadat lalu cawan Petri tersebut dibungkus

dan diinkubasi secara terbalik dan diamati pertumbuhan koloni

mikrobanya.

Lamanya inkubasi bakteri dan jamur berbeda. Ini

dikarenakan perbedaan waktu yang dibutuhkan bakteri dan jamur

untuk bereprodiksi (melakukan pembelahan) berbeda. Bakteri

membutuhkan waktu untuk pembelahan selama 1 - 2 hari

sedangkan jamur membutuhkan waktu untuk pembelahan selama 3

- 5 hari.Inkubasi dilakukan dengan membalik cawan Petri. Hal ini



dimaksudkan agar uap air yang terjadi selama proses inkubasi,

tidak jatuh ke dalam medium yang dapat mengganggu petumbuhan

mikroba.

Secara umum metode sebar dilakukan dengan

memasukkan medium kedalam cawan Petri, ditunggu hingga

setengah memadat kemudian sampel disebar dengan spatel,

setelah itu cawan Petri

tersebut dibungkus dan diinkubasi secara terbalik.



BAB V

PENUTUP

A. Kesimpulan

Dari percobaan yang telah dilakukan, maka dapat

disimpulkan bahwa:

1. Metode yang biasa digunakan untuk memisahkan mikroba

tertentu dari populasi campurannya untuk mendapatkan

kultur murni diantaranya : teknik gores, teknik sebar dan

teknik tuang, namun yang lebih sederhana adalah teknik

tuang yaitu dengan menuangkan sampel terlebih dahulu

pada cawan petri kemudian dilanjutkan dengan menuangkan

media.

2. Mikroba yang tumbuh pada media memiliki karakteristik

yang berbeda-beda dan dapat diamati dengan melihat

bentuknya, warnanya baik itu warna koloni dan warna media

serta morfologi lainnya.

B. Saran

Saran yang dapat disampaikan pada praktikum ini adalah

agar setiap pratikan dapat mengetahui tentang inokulasi dan

isolasi mikroba serta sebaiknya setelah praktikum selesai

praktikan lebih memperhatikan kebersihan didalam laboratorium.

DAFTAR PUSTAKA



Anonim. 2008. “Pengujian Mikrobiologi Pangan”. Jurnal Badan Pengawasan Obat dan Bahan Makanan Republik Indonesia. 09 (02). Hal: 03.

Anonym. 2014. “Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi”. Universitas Halu Oleo. Kendari.

Ariningsih, Rizky Istya. 2009. “Isolasi Sterptomicetes dari rhizofer Familia Poaceae yang Berpotensi Menghasilkan Antijamur Terhadap Candida albicans”. Skripsi. Fakultas Farmasu Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta.

Effendi, Irwan., Suryadi, Edwar., Feliatra. 2004. “Isolasi dan Identifiasi Bakteri Probiotik dari Ikan Kerapu Macan (Ephinephelus fuscogatus) dalam Upaya Efisiensi Pakan Ikan”. Jurnal Natuan Indonesia. 06 (02). Hal: 02.

Hidayati, Ernin., Juli, Nuryati., Marwani, Erly. 2002. “Isolasi Enterobacteriaceae Patogen dari Makanan Berbumbu dan Tidak Berbumbu Kunyit ( Curcuma longa L.) serta uji Pengaruh Ekstrak Kunyit (Curcuma longa L.) Terhadap Pertumbuhan Bakteri Yang diisolasi. Jurnal Matematika dan Sains”. 07 (02). Hal: 02.

Rostinawati, Tina. 2009. “Aktifitas Antibakteri Madu Amber dan Madu Putih Terhadap Bakteri Pseudomonas aureginosa multiresisten dan Staphylococcus aureus resisten metisilin”. Jurnal Penelitian Mandiri. Bandung.


04 isolasi dan inokulasi

Healthcare