Laporan Praktikum Hari/ tanggal : Selasa, 24 September 2013Biokimia Waktu : 13.00-14.40 WIB

PJP : Puspa Julistia Puspita, S. Si, M. Sc.Asisten : Resti Siti Muthmainah, S. Si.

Lusianawati, S. Si.

PROTEIN I

Kelompok 7Ayu Septra Wulandari J3L112029Yaya Nugraha J3L112089Diana Agustini Raharja J3L112168

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIAPROGAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR

2013

Pendahuluan

Menurut Hart (2003), protein berasal dari kata protos. Protos memiliki arti,

yaitu utama. Protein merupakan senyawa organik kompleks yang memiliki berat

molekul yang tinggi dan merupakan polimer yang terdiri dari monomer-monomer

asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Menurut

Lehninger (1982), struktur umum asam amino mempunyai dua gugus pada tiap

molekulnya, yaitu gugus amino dan gugus karboksil yang digambarkan sebagai

struktur ion dipolar.

Gambar 1 Struktur molekul asam amino (Fessenden 1986)

Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat

spesifiknya. Karena asam amino mengandung kedua gugus terebut, senyawa ini

akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugusnya. Asam amino

juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton

kepada basa kuat atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa

kuat. Protein terbentuk dari beberapa asam amino yang dihubungkan dengan

ikatan peptida. Peptida merupakan oligomer dari asam amino yang memainkan

peran penting dalam banyak proses biologis.

Gambar 2 Ikatan peptida antar asam amino dalam membentuk protein

Melalui reaksi hidrolisis protein telah didapatkan 20 macam asam amino

yang dibagi berdasarkan gugus R-nya. Berdasarkan gugus sampingnya hidrogen

adalah glisina. Gugus samping alkil terdiri dari alanina, valina, leusina, isoleusina,

dan prolina. Fenilalanina, tirosina, serta triptofan didasarkan pada gugus samping

yang dimiliki adalah aromatik. Untuk gugus samping yang mengandung alkohol,

di antaranya serina dan treonina. Gugus samping basa, yaitu lisina, arginina, dan

histidina sedangkan untuk gugus samping berupa asam, yaitu asam aspartat dan

asam glutamat. Sedangkan untuk gugus samping amida, yaitu asparagina dan

glutamina dan untuk gugus samping yang mengandung sulfur, yaitu sisteina dan

metionina. Dari ke-20 asam amino yang ada, terdapat sembilan macam asam

amino esensial, yaitu leusina, isoleusina, fenilalanina, triptofan, treonina, lisina,

arginine, histidina, dan metionina. Asam amino esensial ini tidak dapat disintesis

oleh manusia sehingga harus didapatkan dari luar seperti makanan dan zat nutrisi

lainnya.

Tujuan

Praktikum dilakukan untuk mengidentifikasi sifat dan struktur asam amino

dan protein melalui uji-uji kualitatif, yaitu uji Millon, uji ninhidrin, uji belerang,

uji Xantoproteat, dan uji biuret.

Metode

Bahan-bahan yang digunakan, di antaranya albumin 2% dan 0,002%,

gelatin 2% dan 0,002%, kasein 2% dan 0,002%, pepton 2% dan 0,002%, serta

fenol 2% dan 0,002%, pereaksi Millon, pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat pekat,

pereaksi ninhidrin, NaOH 10% dan pekat, Pb-asetat 5%, HNO3 pekat, CuSO4

0,1%, serta akuades. Alat-alat yang digunakan adalah penangas air dan alat-alat

gelas.

Uji Millon dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein

ditambahkan 5 tetes pereaksi Millon. Larutan protein yang diuji adalah albumin

2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%. Campuran larutan protein

dengan pereaksi Millon dipanaskan baik-baik. Jika peeaksi yang digunakan terlalu

banyak maka warna akan hilang pada pemanasan.

Uji ninhidrin dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein

ditambahkan 0,5 mL larutan ninhidrin 0,1%. Kemudian, campuran ini dipanaskan

dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Perubahan warna yang terjadi

diperhatikan. Uji ini dilakukan terhadap larutan albumin 0,02%, gelatin 0,02%,

kasein 0,02%, pepton 0,02%, dan fenol 0,02%.

Uji belerang dilakukan dengan cara ke dalam 2 mL larutan protein

ditambahkan 5 mL NaOH 10%. Kemudian, campuran dididihkan selama beberapa

menit dan ditambahkan 2 tetes larutan Pb-asetat 5%. Pemanasan dilanjutkan

beberapa menit dan warna yang terjadi diamati. Uji ini dilakukan terhadap larutan

albumin 0,02%, gelatin 0,02%, kasein 0,02%, pepton 0,02%, dan fenol 0,02%.

Uji Xantoproteat dilakukan dengan cara ke dalam 2 mL larutan protein

ditambahkan 1 mL HNO3 pekat, dicampurkan baik-baik, dan dipanaskan dengan

hati-hati. Warna kuning tua yang terbentuk diamati. Kemudian, tabung

didinginkan dan ditambahkan tetes demi tetes larutan NaOH pekat sampai larutan

menjadi basa. Perubahan warna yang terjadi diamati. Uji ini dilakukan terhadap

larutan albumin 2%, gelatin 2%, kasein 2%, pepton 2%, dan fenol 2%.

Uji biuret dilakukan dengan cara ke dalam 3 mL larutan protein, yaitu

albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol ditambahkan 1 mL NaOH 10% dan

ditambahkan 1 tetes larutan CuSO4 0,1%. Campuran ini dikocok dan apabila tidak

timbul warna maka ditambahkan CuSO4 lagi.

Hasil dan Pembahasan

Keistimewaan dari protein adalah strukturnya yang mengandung N, selain

C, H, O, S, dan kadang-kadang P, Fe, dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan

protein). Molekul protein merupakan rantai panjang yang tersusun oleh asam-

asam amino. Albumin adalah protein terpenting yang disintesis oleh hati. Albumin

merupakan unsur utama yang terdapat pada putih telur dan mengandung 584 asam

amino. Gelatin ialah protein hewani yang diambil dari jaringan hewan, seperti

tulang dan jaringan ligamen. Kasein merupakan senyawa fosfogliko protein

berbentuk misel. Kasein mengandung lisina, kekurangan sisteina, tetapi kaya akan

metionina dan dapat dihidrolisis menjadi oligopeptida yang larut dan mudah

dicerna. Fenol merupakan senyawa aromatik dengan satu atau beberapa gugus

hidroksil yang terikat secara langsung pada cincin benzena. Protein derivat

merupakan hasil pemecahan protein alam sebelum menjadi asam α-amino.

Pemecahan protein umumnya melalui hidrolisis. Hidrolisis berat diperoleh protein

derivat sekunder, salah satunya ialah pepton. Pepton ikut larut dalam air dan tak

menggumpal apabila dipanaskan.

Tabel 1 Hasil uji Millon

Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutanAlbumin - KuningGelatin - Tidak berwarnaKasein - Tidak berwarnaPepton - Tidak berwarnaFenol + Jingga

Keterangan: (+) = mengandung tirosin

(-) = tidak mengandung tirosin

Gambar 3 Hasil uji Millon pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d),

dan fenol (e)

Menurut Poedjiadi (1994), prinsip dari uji Millon adalah ternitrasinya

tirosin membentuk garam merkuri yang berwarna merah. Pereaksi Millon berisi

merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Fungsi uji Millon

adalah untuk membuktikan adanya tirosin yang terkandung dalam suatu protein.

Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa

merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. Hasil percobaan tidak sesuai

dengan literatur. Menurut literatur, selain fenol, albumin dan kasein juga positif

dalam uji ini karena tirosin memiliki molekul fenol pada gugus alkilnya dan

albumin serta kasein mengandung tirosin sebagai salah satu asam penyusunnya.

Gambar 4 Reaksi yang terjadi pada uji Millon

Uji Hopkins-Cole tidak dilakukan pada percobaan, akan tetapi prinsip dari

uji Hopkins-Cole, yaitu berdasarkan adanya triptofan dalam molekul protein.

Triptofan mudah sekali berkondensasi dengan aldehida bila ada asam kuat,

sehingga membentuk senyawa berwarna. Pereaksi ini mengandung asam

glioksilat. Fungsi uji Hopkins-Cole, yaitu untuk membuktikan adanya gugus indol

dalam protein atau triptofan dalam molekul protein. Menurut literatur, hasil positif

(membentuk cincin ungu) diberikan oleh larutan uji , yaitu albumin dan kasein.

Gambar 5 Reaksi yang terjadi pada uji Hopkins-Cole

Tabel 2 Hasil uji ninhidrin

Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutanAlbumin + Biru unguGelatin - Tidak berwarnaKasein - Tidak berwarnaPepton + Biru unguFenol - Tidak berwarna

Keterangan: (+) = mengandung asam amino bebas

(-) = tidak mengandung asam amino bebas

Gambar 6 Hasil uji Ninhidrin pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d),

dan fenol (e)

Prinsip dari uji ninhidrin yaitu semua asam amino atau peptida yang

mengandung asam α-amino bebas dan sedikitnya satu gugus hidroksil akan

bereaksi dengan ninhidrin (triketohidrindenahidrat) membentuk senyawa

kompleks berwarna biru ungu. Namun, prolin dan hidroksi prolin menghasilkan

senyawa berwarna kuning. Fungsi dari uji ninhidrin adalah untuk membuktikan

adanya asam amino bebas dalam protein. Uji ini umum sifatnya karena semua

protein mengandung sedikitnya satu gugus karboksil dan gugus amino bebas

(asam α-amino). Hasil percobaan kurang sesuai dengan literatur. Hasil positif

seharusnya ditunjukkan pula pada gelatin dan kasein selain pada albumin dan

pepton. Albumin, gelatin, dan pepton membentuk warna biru ungu karena

mempunyai gugus asam amino bebas dan kasein menunjukkan warna kuning

karena mengandung gugus prolin atau hidroksiprolin.

Gambar 7 Reaksi yang terjadi pada uji ninhidrin

Tabel 3 Hasil uji belerang

Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutanAlbumin + Cokelat kehitamanGelatin - Tidak berwarnaKasein - KuningPepton - Tidak berwarnaFenol - Tidak berwarna

Keterangan: (+) = mengandung sisteina atau metionina

(-) = tidak mengandung sisteina dan metionina

Gambar 8 Hasil uji belerang pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d),

dan fenol (e)

Prinsip uji belerang adalah dalam larutan basa, yang berasal dari sisteina

atau metionina akan bereaksi dengan Pb-asestat membentuk garam PbS yang

berwarna hitam. Fungsi uji belerang adalah membuktikan adanya asam amino

yang mengandung gugus samping sulfur. Sisteina dan metionina merupakan asam

amino yang mengandung S pada molekulnya. Reaksi Pb-asetat dengan asam

amino tersebut akan membentuk endapan berwarna hitam atau kelabu.

Penambahan NaOH dalam percobaan tersebut ialah untuk mendenaturasi protein

sehingga ikatan yang menghubungkan atom S dapat terputus oleh Pb-asetat dan

membentuk garam PbS. Menurut literatur, tidak hanya albumin yang

menunjukkan hasil positif tetapi juga kasein dengan warna yang terbentuk berupa

kuning gelap.

Gambar 9 Reaksi yang terjadi pada uji belerang

Tabel 4 Hasil uji Xantoproteat

Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutanAlbumin + JinggaGelatin - Tidak berwarnaKasein - Tidak berwarnaPepton - Kuning mudaFenol + Jingga

Keterangan: (+) = asam amino mengandung inti benzena

(-) = asam amino tidak mengandung inti benzena

Gambar 10 Hasil uji Xantoproteat pada albumin (a), gelatin (b), kasein (c), pepton

(d), dan fenol (e)

Menurut Yazid (2006), prinsip uji Xantoproteat didasarkan pada nitrasi

inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Jika protein yang mengandung

cincin benzena (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) ditambahkan asam nitrat pekat,

maka akan terbentuk endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning tua

sewaktu dipanaskan. Senyawa nitro yang terbentuk dalam suasana basa akan

terionisasi dan warnanya berubah menjadi jingga. Fungsi untuk uji ini merupakan

uji khas untuk asam-asam amino yang mengandung inti benzena. Hasil percobaan

kurang sesuai dengan literatur. Menurut literatur, albumin, kasein, gelatin, pepton

dan fenol seluruhnya menunjukkan hasil yang positif karena semua bahan

mengandung inti benzena pada molekulnya.

Gambar 11 Reaksi yang terjadi pada uji Xantoproteat

Tabel 5 Hasil uji biuret

Bahan uji Hasil pengamatan (+/-) Perubahan warna larutanAlbumin + (7 tetes) Ungu Gelatin + (7 tetes) Ungu Kasein - (12 tetes) Tidak berwarna Pepton - (35 tetes) Biru Fenol - (27 tetes) Biru

Keterangan: (+) = mengandung molekul peptida dari protein

(-) = tidak mengandung molekul peptida dari protein

Gambar 12 Hasil uji biuret pada albumin (a), pepton (b), kasein (c), gelatin (d),

dan fenol (e)

Prinsip uji biuret, yaitu ion Cu2+ (dari pereaksi biuret) dalam suasana basa

akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptida yang menyusun

protein membentuk senyawa kompleks berwarna ungu (violet). Reaksi biuret

positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam

amino bebas atau dipeptida, yaitu dipeptida dari asam-asam amino histidin, serin,

dan treonin. Reaksi pun positif terhadap senyawa-senyawa yang mengandung dua

gugus: -CH2NH2, -CSNH2, -C(NH)NH2, dan –CONH2. Fungsi dari uji biuret

adalah untuk membuktikan adanya molekul-molekul peptida dari protein. Hasil

percobaan tidak sesuai dengan literatur. Menurut literatur albumin, gelatin, kasein

dan pepton memberikan hasil yang positif. Sedangkan fenol tidak bereaksi dengan

pereaksi biuret. Hal ini disebabkan albumin, kasein, pepton dan kasein merupakan

asam amino yang memiliki ikatan peptida sedangkan fenol tidak termasuk ke

dalam golongan asam amino sehingga tidak memiliki ikatan peptida dan bereaksi

negatif terhadap uji biuret.

Gambar 13 Reaksi yang terjadi pada uji biuret

Pemanasan dilakukan pada uji Millon, ninhidrin, belerang, dan uji

Xantoproteat adalah untuk mempercepat laju reaksi. Banyaknya hasil percobaan

yang tidak sesuai dengan literatur dapat disebabkan oleh pereaksi atau bahan uji

yang digunakan sudah tidak dalam keadaan segar lagi atau terlalu lama disimpan

sehingga kurang reaktif.

Aplikasi uji-uji kualitatif protein dan asam amino ini salah satunya adalah

untuk menganalisis kandungan suatu produk. Uji Millon untuk analisis tirosin. Uji

Hopkins-Cole untuk analisis triptofan. Uji ninhidrin termasuk yang paling umum

dilakukan untuk analisis kualitatif protein dan produk hasil hidrolisisnya. Reaksi

ninhidrin dapat pula dilakukan terhadap urin untuk mengetahui adanya asam

amino atau untuk mengetahui adanya pelepasan protein oleh cairan tubuh.

Sedangkan untuk uji belerang yang dapat membentuk ikatan disulfida pada

sisteina atau metionina penerapannya dapat berupa pengeritingan dan pelurusan

rambut. Uji Xantoproteat untuk analisis asam amino tirosina, triptofan dan

fenilalanina yang terdapat dalam suatu produk yang mengandung protein. Pada uji

biuret digunakan untuk analisis molekul peptida dari protein.

Simpulan

Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa ada uji Millon, fenol

memberikan hasil yang positif yang mana albumin dan kasein juga seharusnya

memberikan hasil positif. Pada uji ninhidrin, albumin dan pepton memberikan

hasil positif yang mana kasein dan gelatin juga seharusnya memberikan hasil

positif. Pada uji belerang, albumin memberikan hasil positif yang mana kasein

juga seharusnya memberikan hasil positif. Sedangkan pada uji Xantoproteat,

albumin dan fenol memberikan hasil yang positif yang seharusnya gelatin, pepton,

dan kasein juga memberikan hasil yang positif. Untuk uji biuret, albumin dan

gelatin memberikan hasil positif yang seharusnya kasein dan pepton juga

memberikan hasil positif.

Daftar Pustaka

Fessenden RJ, JS Fessenden. 1986. Kimia Organik. Jilid ke-2. Pudjaatmaka AH, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-3.

Hart Harold, LE Craine, DJ Hart. 2003. Kimia Organik. Achmadi SS, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Ed. ke-11.

Lehninger AL. 1982. Dasar- Dasar Biokimia. Maggy T, penerjemah; Jakarta (ID): Erlangga. Terjemahan dari: Principle of Biochemistry.Poedjiadi Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Press.

Yazid Estien, Lisda Nursanti. 2006. Penuntun Praktikum Biokimia untuk Mahasiswa Analis. Yogyakarta (ID): Andi.