Teori TotipotensiTeori totipotensi ini dikemukakan oleh G. Heberlandt tahun 1898. Dia adalah seorang

ahli fisiologi yang berasal dari Jerman. Pada tahun 1969, F.C. Steward menguji ulang teori

tersebut dengan menggunakan objek empulur wortel. Dengan mengambil satu sel empulur

wartel, F.C. Steward bisa menumbuhkannya menjadi satu individu wortel.

Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi.Teori ini mempercayai bahwa

setiap bagian tanaman dapat berkebang biak.karena seluruh bagian tanaman terdiri atas

jaringan - jaringan hidup.

Totipotensi dalam biologisel menunjukkan kemampuan suatu sel untuk dapat

memperbanyak diri dalam keseluruhan (total) kemungkinan perkembangan yang

dimungkinkan. Kata sifat totipoten lebih banyak dipakai. Sel punca, termasuk zigot, memiliki

kemampuan ini. Pada tumbuhan, sel meristem yang berada pada titik tumbuh juga memiliki

kemampuan ini.

Kemampuan totipotensi dapat diubah dengan mengganti lingkungan hidup/tumbuh

sel. Modifikasi osmotik, nutrisi, hormon, atau sumber energi yang dipaparkan pada sel dapat

mengubah sifat ini menjadi pluripoten ("banyak potensi"), multipoten ("berbagai potensi"),

atau unipoten ("tunggal potensi"). Sel yang pluripoten memiliki kemampuan berubah yang

masih banyak, multipoten hanya beberapa, dan unipoten adalah bentuk sel yang telah

terspesifikasi.

Prasyarat Melakukan Totipotensi

Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan

jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril.

Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung

kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan

untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat

dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi

dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat

bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.

PENGERTIAN TENTANG KULTUR JARINGAN

Menurut Suryowinoto (1991), kultur jaringan dalam baha asing disebut sebagai tissue

culture. Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai bentuk

dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman

menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.

Kultur jaringan akan lebih besar presentase keberhasilannya bila menggunakan

jaringan meristem. Jaringan meristem adalah jaringan muda, yaitu jaringan yang terdiri dari

sel-sel yang selalu membelah, dinding tipis, plasmanya penuh dan vakuolanya kecil-kecil.

Kebanyakan orang menggunakan jaringan ini untuk tissue culture. Sebab, jaringan meristem

keadaannya selalu membelah, sehingga diperkirakan mempunyai zat hormon yang mengatur

pembelahan.

Teknik kultur jaringan sebenarnya sangat sederhana, yaitu suatu sel atau irisan

jaringan tanaman yang sering disebut eksplan secara aseptik diletakkan dan dipelihara dalam

medium pada atau cair yang cocok dan dalam keadaan steril. dengan cara demikian sebaian

sel pada permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi dan membentuk kalus.

Apabila kalus yang terbentuk dipindahkan kedlam medium diferensiasi yang cocok, maka

akan terbentuk tanaman kecil yang lengkap dan disebut planlet. Dengan teknik kultur

jaringan ini hanya dari satu irisan kecil suatu jaringan tanaman dapat dihasilkan kalus yang

dapat menjadi planlet dlama jumlah yang besar.

Pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman ini berdasarkan teori sel seperti yang

dikemukakan oleh Schleiden, yaitu bahwa sel mempunyai kemampuan autonom, bahkan

mempunyai kemampuan totipotensi. Totipotensi adalah kemampuan setiap sel, darimana saja

sel tersebut diambil, apabila diletakkan dilingkungan yangsesuai akan tumbuh menjadi

tanaman yang sempurna.

Teknik kultur jaringan akan berhasil dengan baik apabila syarat-syarat yang

diperlukan terpenuhi. Syarat-syarat tersebut meliputi pemilihan eksplan sebagai bahan dasar

untuk pembentukkan kalus, penggunaan medium yang cocok, keadaan yang aseptik dan

pengaturan udara yang baik terutama untuk kultur cair. Meskipun pada prinsipnya semua

jenis sel dapat ditumbuhkan, tetapi sebaiknya dipilih bagian tanaman yang masih muda dan

mudah tumbuh yaitu bagian meristem, seperti: daun muda, ujung akar, ujung batang, keping

biji dan sebagainya. Bila menggunakan embrio bagian bji-biji yang lain sebagai eksplan,

yang perlu diperhatikan adalah kemasakan embrio, waktu imbibisi, temperatur dan dormansi.

MANFAAT KULTUR JARINGAN

Kegunaan utama dari kultur jaringan adalah untuk mendapatkan tanaman baru dalam

jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan

morfologi sama persis dengan induknya. Dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan

juga memperoleh tanaman baru yang bersifat unggul. Secara lebih rinci dan jelas berikut ini

akan dibahas secara khusus kegunaan dari kultur jaringan terhadap berbagai ilmu

pengetahuan.

Perbanyakan tanaman secara besar-besaran telah dibuktikan keberhasilannya pada

perkebunan kelapa sawit dan tebu. Dengan car kultur jaringan dapat klon suatu komoditas

tanaman dalam relatif cepat. Manfaat yang dapat diperoleh dari kloning ini cukup banyak,

misalnya: di luar pulau Jawa akan didirikan suatu perkebunan yang membutuhkan bibit

tanaman dalam jumlah ribuan, maka sudah dapat dibayangkan betapa mahalnya biayanya

hanya untuk trasnportasi saja. Hala ini dapat diatasi denga usaha kloning melalui budaya

jaringan, karena hanya perlu membawa beberapa puluh botol planlet yang berisi ribuan bibit.

Dengan cara ini dapat menghemat waktu dan biaya yang cukup banyak dalam persiapan

pemberangkatan ataupun transportasinya. Pada ekspor anggrek, misalnya, orang luar negeri

menghendaki bunga anggrek yang seragam baik bentuk maupun warnanya. Dalam hal ini

dapat dipenuhi juga dengan usaha kloning. Bibit-bibit tanaman dari usaha mericlono

(tanaman hasil budidaya meristem) akan berharga lebih mahal, karena induknya dipilih dari

tanaman yang mempunyai sifat paling bagus (unggul).

Teori Dasar Kultur Jaringan

a. Sel dari suatu organisme multiseluler di mana pun letaknya, sebenarnya sama dengan

sel zigot karena berasal dari satu sel tersebut (Setiap sel berasal dari satu sel).

b. Teori Totipotensi Sel (Total Genetic Potential), artinya setiap sel memiliki potensi

genetik seperti zigot yaitu mampu memperbanyak diri dan berediferensiasi menjadi

tanaman lengkap.

Kultur jaringan tanaman telah dikenal banyak orang sebagai usaha mendapatkan

varietas baru (unggul) dari suatu jenis tanaman dalam waktu yang relatif lebih singkat dari

pada dengan cara pemuliaan tanaman yang harus dilakukan penanaman secara berulang-

ulang sampai beberapa generasi. Untuk mendapatkan varietas baru melalui kultur jaringan

dapat dilakukan dengan cara isolasi protoplas dari 2 macam varietas yang difusikan. Atau

dengan cara isolasi khloroplas suatu jenis tanaman yang dimasukkan kedalam protoplas jenis

tanaman yang lain, sehingga terjadi penggabungan sifat-sifat yang baik dari kedua jenis

tanaman tersebut hingga terjadi hibrid somatik. Cara yang lain adalah dengan menyuntikkan

protoplas dari suatu tanaman ketanaman lain. Contohnya transfer khloroplas dari tanaman

tembakau berwarna hijau ke dalam protoplas tanaman tembakau yang albino, hasilnya sangat

memuaskan karena tanaman tembakau menjadi hijau pula. Contoh lain adalah keberhasilan

mentrasnfer khloroplas dari tanaman jagung ke dalam protoplas tanaman tebu hasilnya

memuaskan (Anik Herawati, 1991).

Khloroplas yang ditransfer harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut:

Sewaktu dilakukan isolasi, khloroplas harus sempurna.

Setelah diisolasi harus mempuyai sifat yang sama dengan khloroplas yang tumbuh

secara in vivo (budidaya biasa).

Setelah diisolasi masih mempunyai sifat atau aktivitas fotosintesa yang cukup

tinggi.

Contoh isolasi protoplas dalam budidaya jaringan yang sangat berguna adalah

ditemukannya sun-chlorella (jenis ganggang). Ganggang ini secara enzimatis dijadikan

protoplas (sel-selnya ditelanjangi dengan cara diinkubasikan dalam enzim medium

sehingga dinding selnya larut), kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari.

Protoplas tersebut selanjutnya dipecah hingga didapatkan khloroplas dan akhirnya

dibuat pil-pil untuk pengobatan.

Menciptakan varietas baru dapat pula dilakukan dengan menggunakan bantuan jenis

bakteri seperti bakteri penyebab tumor yang disebut Agrobacterium tumifaciens. Bakteri ini

disuntikkan pada tanaman sehat mempunyai buah ukuran besar, agar tanaman sehat tersebut

menjadi sakit tumor. Bakteri yang berada dalam jaringan yang menonjol karena terkena

tumor tersebut kemudian diambil dan disuntikkan kedalam tanaman lain yang ukuran

buahnya kecil-kecil. Dengan cara ini terbukti bahwa tidak lam kemudian tanaman tersebut

menghasilkan buah yang ukurannya besar. Hal ini membuktikan bahwa bakteri yang

dipindahkan tersebut membawa sifat keturunan yang ada pada tanaman semula. Sedangkan

untuk mendapatkan yang baru yang tahan terhadap stress garam, pestisida tertentu, logam

berat, suhu rendah atau tinggi dan sebagainya dapat dilakukan dengan cara-cara khusus.

Menciptakan tanaman baru yang toleran terhadap stress garam pernah dilakukan oleh

Handa dkk. (Suryowinoto, 1985) yaitu terhadap tanaman tomat dan tembakau. Pada

penelitian ini menggunakan penambahan PEG (Poly Ethilen- Glycol) atau NaCL, yang biasa

dipergunakan untuk mendapatkan kultivar yang toleransi terhadap garam.

Beberapa jenis tanaman ada yang teramcam punah (endangered species), misalnya

berbagai jenis tanaman pisang, tanaman melati, kenanga, kayu jati, dan kayu putih. Usaha

yang paling tepat untuk melestarikan tanaman yang terancam punah adalah dengan jalan

kloning. Dengan usaha kloning ini, populasi dari tanaman tersebut akan terselamatkan,

bahkan dapat bertambah, sekaligus sifat-sifat yang dimiliki oleh tanaman tersebut tetap

terjamin.

Kultur jaringan juga mempunyai manfaat yang besar dibidang farmasi, karena dari

usaha ini dapat dihasilkan metabolit skunder upaya untuk pembuatan obat-obatan, yaitu

dengan memisahkan unsur-unsur yang terdapat di dalam kalus ataupun protokormus,

misalnya alkoloid, steroid, dan terponoid. Dengan ditemukannya cara mendapatkan metabolit

skunderdari kalus suatu eksplan yang di tumbuhkan dalam medium kultur jaringan, mak

berarti dapat menghemat waktu dan tenaga. Dengan cara biasa, untuk mendapatkannya harus

menunggu lama samapai tanaman cukup umur bahkan sampai berproduksi hingga bertahun-

tahun. Sedangkan dengan teknik kultur jaringan hanya membuthkan waktu antara tiga

minggu sampai satu bulan saja. Metabolit yang dihasilkan dari kalus ternyata juga memiliki

kadar yang lebih tinggi daripada dengan cara biasa (langsung dari tanaman). Dengan cara

pengambilan metabolit skunder dari kalus, biasanya selalu diperoleh kandungan lain yang

lebih banyak jenisnya, karena seringkali timbul zat-zat alkaloid atau persenyawaan-

persenyawaan lainnya yang sangat berguna untuk pengobatan.

Persenyawaan yang bermanfaat yang diambil dari kalus dapat ditingkatkan kadarnya dengan

cara memanipulasinya, antara lain:

Memakai medium lain yang sesuai.

Mengubah salah satu kadar komponen dalam medium.

Memberi zat tambahan tertentu ke dalam medium, misalnya penambahan zat

pengatur tumbuh auksin ataupun sitokinin.

Kultur jaringan juga memberikan masukkan atau informasi pengetahuan yang sangat

bermanfaat dibidang fisiologi tanaman. Pada tanaman anggrek misalnya, telah berhasil

diketahui bahwa jika ujung akarnya diiris melintang akan memperlihatkan warna tertentu.

Warna tersebut nantinya akan sama dengan warna bunganya. Hal ini sangat berguna dalam

bidang perdangan bunga hias, sebab walaupun tanamannya belum berbunga orang sudah

dapat mengetahui warna bunga yang akan muncul.

Melalui perbanyakan vegetatif dengan kultur jaringan ternyata juga berpengaruh

terhadap devisa negara. Misalnya, denagn terlaksananya ekspor tanaman anggrek ke negara

lain, maka akan menaikkan devisan negara dibidang pertanian.

Teknik kultur jaringan sampai saat ini memang belum biasa dilaksanakan oleh para

petani, baru beberapa kalangan pengusaha swasta saja yang sudah mencoba

melaksanakannya, karena pelaksanaan teknik kultur jaringan tanaman memerlukan

keterampilan khusus dan harus diltar belakangi dengan ilmu pengetahuan dasar tentang

fisiologi tumbuhan, anatomi tumbuhan, biologi, kimia dan pertanian. Dengan demikian jelas

akan amat sulit untuk diterima oleh kalangan petani biasa. Di samping itu, pelaksanaan teknik

kultur jaringan mutlak memerlukan laboratorium khusus, walaupun dapat di usahakan secara

sederhana (dalam ruang yang terbatas), namun tetap memerlukan peralatan yang memadai.

Kemungkinan lain petani akan merasa enggan bekerja secara aseptik. Karena semua

pekerjaan harus dilaksanakan secara hatri-hati dan cermat serta memerlukan kesabaran yang

tinggi. Biaya untuk mewujudkan perbanyakan tanaman cecara in vitro ini juga sangat mahal,

kecuali kita meramu medium sendiri. Bila kia terpaksa harus membeli medium yang sudah

jadi (dalam kemasan) jelas akan sangat mahal, sebab medium yang sudah jadi masih harus di

impor dari luar negeri. Apalagi kita harus membeli saran untuk perlakuan isolasi dan fusi

protoplas, tentu biayanya akan bertambah besar. Enzim-enzim yang digunakan dalam kultur

jaringan juga masih dibeli dari luar negeri sepertti Jepang.

Lepas semua dari kendala-kendala tersebut diatas, kita harus mengakui bahwa teknik

kultur jaringan sangat bermanfaat bagi dunia ilmu pengetahuan, terutama untuk

pengembangan bioteknologi.

Aplikasi Teknik Kultur Jaringan dalam Bidang Agronomi

a. Perbanyakan vegetatif secara cepat (Micropropagation).

b. Membersihkan bahan tanaman/bibit dari virus

c. Membantu program pemuliaan tanaman (Kultur Haploid, Embryo Rescue, Seleksi In

Vitro, Variasi Somaklonal, Fusiprotoplas, Transformasi Gen /Rekayasa Genetika

Tanaman dll).

d. Produksi metabolit sekunder.

A. Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Regenerasi

1. Bentuk Regenerasi dalam Kultur In Vitro : pucuk aksilar, pucuk adventif, embrio

somatik, pembentukan protocorm like bodies, dll

2. Eksplan ,adalah bagian tanaman yang dipergunakan sebagai bahan awal untuk

perbanyakan tanaman. Faktor eksplan yang penting adalah genotipe/varietas, umur

eksplan, letak pada cabang, dan seks (jantan/betina). Bagian tanaman yang dapat

digunakan sebagi eksplan adalah pucuk muda, batang muda, daun muda, kotiledon,

hipokotil, endosperm, ovari muda, anther, embrio, dll.

3. Media Tumbuh

Di dalam media tumbuh mengandung komposisi garam anorganik, zat pengatur

tumbuh, dan bentuk fisik media. Terdapat 13 komposisi media dalam kultur jaringan,

antara lain: Murashige dan Skoog (MS), Woody Plant Medium (WPM), Knop,

Knudson-C, Anderson dll. Media yang sering digunakan secara luas adalah MS.

4. Zat Pengatur Tumbuh Tanaman

Faktor yang perlu diperhatikan dalam penggunaan ZPT adalah konsentrasi, urutan

penggunaan dan periode masa induksi dalam kultur tertentu. Jenis yang sering

digunakan adalah golongan Auksin seperti Indole Aceti Acid(IAA), Napthalene

Acetic Acid (NAA), 2,4-D, CPA dan Indole Acetic Acid (IBA). Golongan Sitokinin

seperti Kinetin, Benziladenin (BA), 2I-P, Zeatin, Thidiazuron, dan PBA. Golongan

Gibberelin seperti GA3. Golongan zat penghambat tumbuh seperti Ancymidol,

Paclobutrazol, TIBA, dan CCC.

5. Lingkungan Tumbuh

Lingkungan tumbuh yang dapat mempengruhi regenerasi tanaman meliputi

temperatur, panjang penyinaran, intensitas penyinaran, kualitas sinar, dan ukuran

wadah kultur.

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan

adalah :

1) Pembuatan media

2) Inisiasi

3) Sterilisasi

4) Multiplikasi

5) Pengakaran

6) Aklimatisasi

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi

media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang

digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan

juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang

ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari

kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau

botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya

dengan autoklaf.

Biasanya, komposisi media yang digunakan adalah sebagai berikut :

Ammonium nitrate (NH4NO3) 1,650 mg/l

Boric acid (H3BO3) 6.2 mg/l

Calcium chloride (CaCl2 · H2O) 440 mg/l

Cobalt chloride (CoCl2 · 6H2O) 0.025 mg/l

Magnesium sulfate (MgSO4 · 7H2O) 370 mg/l

Cupric sulfate (CuSO4 · 5H2O) 0.025 mg/l

Potassium phosphate (KH2PO4) 170 mg/l

Ferrous sulfate (FeSO4 · 7H2O) 27.8 mg/l

Potassium nitrate (KNO3) 1,900 mg/l

Manganese sulfate (MnSO4 · 4H2O) 22.3 mg/l

Potassium iodine (KI) 0.83 mg/l

Sodium molybdate (Na2MoO4 · 2H2O) 0.25 mg/l

Zinc sulfate (ZnSO4 · 7H2O) 8.6 mg/l

Na2EDTA · 2H2Oa 37.2 mg/lb

Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan.

Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di

tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.

Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang

disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan

kultur jaringan juga harus steril.

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan

pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya

kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang

telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril

dengan suhu kamar.

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar

yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan

baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan

perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun

jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih

atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke

bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan

memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan

serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap

serangan hama penyakit dan udara luar.

Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap

sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan

pemeliharaan bibit generatif.

Keunggulan inilah yang menarik bagi produsen bibit untuk mulai mengembangkan

usaha kultur jaringan ini. Saat ini sudah terdapat beberapa tanaman kehutanan yang

dikembangbiakkan dengan teknik kultur jaringan, antara lain adalah: jati, sengon, akasia, dll.

Bibit hasil kultur jaringan yang ditanam di beberapa areal menunjukkan pertumbuhan

yang baik, bahkan jati hasil kultur jaringan yang sering disebut dengan jati emas dapat

dipanen dalam jangka waktu yang relatif lebih pendek dibandingkan dengan tanaman jati

yang berasal dari benih generatif, terlepas dari kualitas kayunya yang belum teruji di

Indonesia. Hal ini sangat menguntungkan pengusaha karena akan memperoleh hasil yang

lebih cepat.

B. Media Tanam Kultur Jaringan

I. Unsur-unsur yang Dibutuhkan Tanaman

Sebelum menguraikan cara-cara membuat medium kultur jaringan, maka terlebih dahulu kita

harus mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Unsur-unsur

yang dibuthkan tanaman dikelompokkan menjadi:

1. Garam-garam Anorganik

Setiap tanaman membutuhkan paling sedikit 16 unsur untuk pertumbuhannya yang normal.

Tiga unsur di antaranya adalah C,H,O yang di ambil dari udara, sedangkan 13 unsur yang lain

berupa pupuk yang dapat diberikan melalui akar atau melalui daun. Pada perbanyakan

tanaman secara kultur jaringan. Semua unsur tersebut dibutuhkan oleh tanaman untuk

pertumbuhannya. Ada unsur yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah besar yang disebut

unsur makro, ada pula yang dibutuhkan oleh tanaman dalam jumlah sedikit tetapi harus

tersedia yang disebut unsur mikro.

2. Zat-zat Organik

Zat-zat organik yang biasanya ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah sukrosa,

mio inositol, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Sedangkan sebagai tambahan biasanya

diberi zat organik lain seperti air kelapa, ekstrak ragi, pisang, tomat, toge dan lain-lain.

II. Kegunaan Setiap Unsur Bagi Tanaman

Setelah kita mengetahui unsur-unsur yang dibutuhkan oleh tanaman, maka sebelum kita

menentukan unsur-unsur yang akan digunakan untuk meramu medium kultur jaringan perlu

mengetahui terlebih dahulu kegunaan unsur-unsur tersebut bagi pertumbuhan tanaman atau

jaringan tanaman.

1. Unsur Nitrogen (N)

Kegunaan unsur Nitrogen bagi tanaman adalah untuk menyuburkan tanaman, sebab unsur N

dapat membentuk protein, lemak dan berbagai persenyawaan organik yang lain.

2. Unsur Fospor (P)

Dibutuhkan oleh tanaman untuk membentuk karbohidrat. Maka, unsur P ini dibutuhkan

secara besar-besaran pada waktu pertumbuhan benih.

3. Unsur Kalium (K)

Memperkuat untuk tubuh tanaman, karena unsur ini dapat digunakan untuk memperkuat

serabut-serabut akar, sehingga daun, bunga dan buah tidak mudah gugur.

4. Unsur Sulpur (S)

Unsur ini digunakan untuk proses pembentukan anakan sehingga pertumbuhan dan ketahanan

tanaman terjamin.

5. Unsur Kalsium (Ca)

Digunakan untuk merangsang pembentukkan bulu-bulu akar, mengeraskan batang dan

merangsang pembentukkan biji.

6. Unsur Magnesium (Mg)

Digunakan tanaman sebagai bahan mentah untuk ppembentukkan sejumlah protein.

7. Unsur Besi (Fe)

Unsur ini digunakan sebagai penyangga (chelati agint) yang sangat penting untuk menyagga

kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.

8. Unsur Sukrosa

Unsur ini sering ditambahkan pada medium kultur jaringan sebagai sumber energi yang

diperlukan untuk induksi kalus.

9. Unsur Glukosa atau Fruktosa

Unsur ini dapat digunakan sebagai unsur pengganti sukrosa karena dapat merangsang

beberapa jaringan.

10. Unsur Mio-inositol

Penambahan unsur ini pada medium bertujuan untuk membantu diferensiasi dan

pertumbuhan sejumlah jaringan.

11. Unsur Vitamin

Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam mediumklutur jaringan antara lain adalah

Thiamin. Thiamin adalah vitamin esensial yang digunakan untuk medium kultur jaringan.

12. Unsur Asam Amino

Unsur ini diunakan oleh tanaman untuk proses pertumbuhan dan diferensiasi sel. Kebutuhan unsur

asam amino oleh tanaman berbeda.

13. Unsur Zat Pengatur Tumbuh.

Zat pengatur tumbuh pada tanaman adalah senywa organik bukan hara, yang dalam jumlah sedikit

dapat mendukung, menghambat dan dapat merubah proses fisiologi tumbuhan. Zat pengatur tumbuh

dalam tanaman terdir dari lima kelompok yaitu, Auksin, Sitokinin, Giberelin, Etilen dan Inhibitor

dengan ciri khas dan pengaruh yang berlainan terhadap proses fisiologis.

Zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium bagi pertumbuhan dan

diferensiasi. Tanpa penambahan zat pengatur tumbuh dalam medium, pertumbuhan sangat terhambat

bahkan tidak akan tumbuh sama sekali.

III. Bentuk Fisik Media Tanam

Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-

bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula ,

vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk

tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti

campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut

ditambah dengan zat pemadat agar.

IV. Faktor Lingkungan

1. Keasaman (pH)

Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air.

Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam

pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH

pada 7.

Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai

toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan

mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik

apabila nutrein habis terpakai.

Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila

menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila

ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes.

Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan

HCL.

2. Kelembapan

Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling

kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan

tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.

3. Cahaya

Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan

organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan

pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.

4. Temperatur

Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum

umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum

untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.

V. Pembuatan Media Tanam

Sebelum membuat medium, maka terlebih dahulu kita harus menentukan medium apa

yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat

digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya media

Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media

tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM,

sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium

MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.

Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan

kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena memakan

banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk

menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat

diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi

perlu membuat larutan stoc mikro.

C. Metode Pelaksanaan Kultur Jaringan

I. Metode Kultur Jaringan.

1) Dilihat dari Macam Media Tanam

Teknik kultur jaringan dapat dilaksanakan dengan dua metode yaitu:

a. Metode Padat (Solid Method)

Metode pada dilakukan dengan tujuan mendapatkan kalus dan kemudian dengan

medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar dan tunas sehingga kalus dapat

tumbuh menjadi planlet. Media padat adalah media yang mengandung semua komponen

kimia yang dibutuhkan oleh tanaman dan kemudian dipadatkan dengan menambahkan zat

pemadat. Zat pemadat tersebut dapat berupa agar-agar batangan, agar-agar bubuk, atau agar-

agar kemasan kaleng yang yang memang khusus digunakan untuk media padat untuk kultur

jaringan.

Media yang terlalu padat akan mengakibatkan akar sukar tumbuh, sebab akar sulit

untuk menembus ke dalam media. Sedangkan media yang terlalu lembek akan menyebabkan

kegagalan dalam pekerjaan. Kegagalan dapat berupa tenggelamnya eksplan yang ditanam.

Eksplan yang tenggelam tidak akan dapat tumbuh menjadi kalus, karena tempat area kalus

yaitu pada irisan (jaringan yang luka) tertutup oleh medium.

Metode padat dapat digunakan untuk metode kloning, untuk menumbuhkan protoplas

stelah diisolasikan, untuk menumbuhkan planlet dari protokormus stelah dipindahkan dari

suspensi sel, dan untuk menumbuhkan planlet dari prtoplas yang sudah difusikan

(digabungkan).

b. Metode Cair(Liquid Metho)

Penggunaan metode cair ini kurang praktis dibandingkan dengan metode padat, karena

untuk menumbuhkan kalus langsung dari ekspaln sangat sulit sehingga keberhasilannya

sangat kecil dan hana tanaman-tanaman tertentu yang dapat berhasil. Oleh karena itu,

penggunaan media cair lebih ditekankan untuk suspensi sel, yaitu untuk menumbuhkan plb

(prtocorm like bodies). Dari protokormus ini nantinya dapat tumbuh menjadi planlet apabila

dipindahkan kedalam media padat yang sesuai.

Pembuatan media cair jauh lebih cepat daripada media padat, karena kita tidak perlu

memanaskannya untuk melarutkan agar-agar. Media cair juga tidak memerlukan zat pemadat

sehingga keadaannya tetap berupa larutan nutrein.

2) Dilihat dari Bahan atau Eksplan yang Dipakai

Bila dilihat dari macam bahan yang digunakan, maka metode kultur jaringan yang telah

dikenal sekarang antara lain adalah:

1) Kultur meristem.

2) Kultur antera

3) Kultru endosperma

4) Kultur suspensi sel

5) Kultur protoplas

6) Kultur embrio

7) Kultur spora

8) Dan lain-lain

3) Dilihat dari Cara Pemeliharaan

Eksplan yang telah ditanam, agar dapat tumbuh menjadi kalus dan kemudian menjadi

planlet, membutuhkan pemeliharaan yang rutin dan tepat. Artinya, eksplan atau kalus yang

sudah waktunya untuk dipindahkan ke dalam media tanam yang baru harus segera

dilaksanakan, tidak boleh sampai terlambat. Pemindahan yang terlambat dapat menyebabkan

pertumbuahn eksplan atau kalus dapat terhenti atau dapat mengalami brownig atau

terkontaminasi oleh jamur atau bakteri.

II. Pelaksanaan Kultur Jaringan

1. Sterilisasi Alat Penabur

Sebelum digunakan, enkas harus diterilisasi dengan menggunakan hand sprayer

berisi spirtus atau campuran formalin 10% dan alkohol 70%, dengan perbandinga

1:1. setelah disemprot kemudian dibiarkan terlebih dahulu kurang lebih 10 menit,

baru kemudian boleh digunakan.

2. Sterilisasi Alat dan Medium

Alat-alat dissecting –set dan glass ware yang akan digunakan untuk kultur jaringan,

setelah dicuci dan dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan

disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu 121 oC, tekanan 15 lb, dan lama

sterilsiasi 20-30 menit.

Botol-botol eksplan yang sudah berisi medium setelah ditutup dengan alumunium

foil, kemudian disterilisasi. Sterilisasi medium lebih sedikit waktunya dibandingkan

dengan sterilisasi alat-alat, yakni 15 menit, tetapi suhu dan tekannya sama.

3. Sterilisasi Eksplan

Sterilisasi eksplan dilaksanakan dengan dua cara yaitu:

a. Sterilisasi Eksplan secara Mekanis

Cara ini digunakan untuk eksplan yang keras atau berdaging, yaitu dengan

membakar eksplan tersebut di atas lampu spirtus sebanyak tiga kali.

b. Sterilisasi Eksplan secara Kimiawi

Sterilisasi ini gunakan untuk eksplan yang lunak. Sterilisasi ini menggunakan

bahan kimia. Bahan-bahan yang digunakan untuk sterilisasi:

♦ Sodium hipoklorit

♦ Mercuri chlorit

♦ Alkohol 70%

4. Menabur Eksplan

Menabur eksplan dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet dengan kondisi

aseptik. Sebelum kita bekerja di dalam laminar air flow cabinet, semua perhiasan

tangan harus dilepas, dan tangan dibasuh terlebih dahulu dengan alkohol 70%.

Eksplan yang siap ditaman dipotng dengan menggunakan scalpel di dlam cawan

petri. Potongan eksplan dimasukan kedalam erlenmeyer yang berisi media tumbuh,

hingga permukaan yang teriris bersentuhan dengan medium.

Setelah semua pekerjaan menabur selesai, kemudian alat-alat yang sudah dipakai

dibersihkan.

5. Melaksanakan Sub-Kultur

Dalam waktu satu sampai dua minggu, eksplan akan tumbuh menjadi kalus. Kalus

adalah suatu masa sel yang terbentuk pada permukaan eksplan atau irisan eksplan.

Kalus ini akan tumbuh pada media eksplan yang padat., sedangkan pada media cair

akan tumbuh plb (protokormus)

Sub-kultur adalah suatu usaha untuk mengganti media kultur jaringan dengan media

yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk kalus atau protokormus dapat terpenuhi.

D. Masalah-masalah yang terjadi dalam kultur jaringan

1) Kontaminasi

Kontaminasi adalah gangguan yang sangat umum terjadi dalam kegiatan kultur

jaringan. Munculnya gangguan ini bila dipahami secara mendasar adalah

merupakan sesuatu yang sangat wajar sebagai konsekuensi penggunaan yang

diperkaya.

Penomena kontaminasi sangat beragam, keragaman tersebut dapat dilihat dari

jenis kontaminasinya (bakteri, jamur, virus, dll).

Upaya mencegah terjadinya kontaminsai.

- Biasakan membersihkan berbagai sarana yang diperlukan dalam kultur

jaringan.

- Yakinkan bahwa proses sterilisasi media secara baik dan benar.

- Lakukan proses penanaman bahan pada keadaan anda nyaman dan cari waktu

yang longgar.

2) Pencoklatan/browning

Pencoklatan adalah suatu karakter munculnya warna coklat atau hitam yang sering

membuat tidak terjadinya pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Peristiwa

pencoklatan sesunggguhnya merupakan peristiwa alamiah yang biasa yang sering

terjadi.

Pencoklatan umumnya merupakan suatu tanda-tanda kemunduran fisiologi

eksplan dan tidak jarang berakhir pada kematian eksplan.

3) Vitrifikasi

Vitrifikasi adalah suatu istilah problem pada kultur yang ditandai dengan:

Munculnya pertumbuhan dan pertumbuhan yang tidak normal, Tanaman yang

dihasikan pendek-pendek atau kerdil. Perturumbuhan batang cenderung ke arah

penambahan diameter. Tanaman utuhnya menjadi sangat turgescent. Pada

daunnya tidak memiliki jaringan pallisade.

4) Variabilitas Genetik

Bila kultur jaringan digunakan untuk upaya perbanyakan tanaman yang seragam

dalam jumlah yang banyak, dan bukan sebagai upayapemuliaan tanaman maka

variasi genetik adalah kendala. Variasi genetik dapat terjadi pada kultur in vitro

karena:

- Laju multiflikasi yang tinggi, variasi terjadi karena terjadinya sub kultur

berulang yang tidak terkontrol

- Penggunaan teknik yang tidak sesuai.

- Variasi genetik yang paling umum terjadi pada kultur kalus dan kultur suspensi

sel, hal tersebut terjadi karena munculnya sifat instabilitas kromosom mungkin

akibat teknis kultur, media atau hormon.

Cara mengatasi problem variasi genetik tentunya tidak sederhana, harus

memperhatikan aspek yang dikulturkan.

5) Pertumbuhan dan Perkembangan

Problem utama berkaitan dengan proses pertumbuhan adalah bila eksplan yang

ditanam mengalami stagnasi, dari mulai tanam hingga kurun waktu tertentu tidak

mati tetapi tidak tumbuh.

Untuk menghindari hal itu dapat dilakukan dengan preventif menghindari bahan

tanam yang tidak juvenil atau tidak meristematik. Karena awal pertumbuhan

eksplan akan dimulai dari sel-sel yang muda yang aktif membelah, atau dari sel-sel

tua yang muda kembali.

Media juga dapat menjadi sebab terjadinya stagnasi pertumbuhan, karena dari

kondisi medialah suatu sel dapat atau tidak terdorong melakukan proses

pembelahan dan pembesaran dirinya.

Pada proses klutur jaringan yang bersifa inderict embriogenesis, tahapan

pembentukan kalus harus dilanjutkan dengan mendorong induksi embriosomatik

dari sel-sel kalus. Terjadinya embrio somatik dapat secara endogen atau eksogen.

6) Praperlakuan

Masalah pada kegiatan in vitro bukan hanya dari penanaman eksplan saja,

pertumbuahan dan perkembangannya dlama botol saja tetapi juga sangat bisa

dipengaruhi oleh persyaratan kegiatan prapelakuan. Pada kasus ini masalah akan

muncul bila kegiatan prapelakuaan tidak dilakukan.

Prapelakuan dilakukan umumnya untuk tujuan-tujuan tertentu, secara umum adalah

dalam rangka menghilangkan hambatan. Hambatan apat berupa hambatan

kemikalis, fisik, biologis. Hambatan berupa bahan kimia penanganannya harus

dimulai dari pengenalan senyawa aktif, potensi gangguan, proses reaksi dan

alternatif pengelolaannya.

7) Lingkungan Mikro

Masalah lingkungan inkubator juga tidak bisa diabaiakan karena ini juga sering

menjadi masalah. Suhu ruangan inkubator sangat menentukan optimasi

pertumbuhan eksplan, suhu yang terlalu rendah aatau tinggi dapat mempengaruhi

pertumbuhan dan perkembangan pada eksplan.

Kebutuhan antara satu tananaman dengan tanaman yang lain berbeda,

namunddemikian solusinya sulit dilakukan mengingat umumnya ruangan inkubator

suatu ruangan laboratorium kultur jaringan tidak bisa dibuat variasi antara satu

ruangan dengan bagian ruangan yang lainnya. Sehingga optimasi pertumbuhan

tidak bisa diharapkan sama antara kultur yang satu dengan kultur yang lain.

Kultur adalah budidaya dan jaringan adalah sekelompok sel yang mempunyai

bentuk dan fungsi yang sama. jadi, kultur jaringan berarti membudidayakan suatu

jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat seperti induknya.

Manfaat dari teknik kultur jaringan tanaman ini diharapkan juga memperoleh

tanaman baru yang bersifat unggul. Dalam kegiatan kultur jaringan perlu

memerlukan bahan-bahan yang dibutuhkan dalam proses kegiatan kultur jaringan.

Bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan diantaranya: Unsur

hara makro dan mikro yaitu Zat Pengatur tumbuh, Aquades, Vitamin, Agar, Gula,

Ekstrak-ekstrak organik (ekstrak air kelapa, ekstrak tomat, dll).

Pembuatan Larutan stok

Pembuatan larutan stok merupakan langkah awal pembuatan media yang

dipilih.Pembuatan larutan stok menghemat pekerjaan menimbang bahan yang berulang-ulang

setiap kali membuat media. Pembuatan larutan stok berdasarkan pengelompokkan terdiri dari

stok makro, stok mikro, stok Fe, stok vitamin dan stok hormon. Stok hormon dapat disimpan

antara 2-4 minggu sedangkan stok hara 4-8 minggu.Dengan adanya larutan stok, pembuatan

media selanjutnya hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja.

4.2. Stok Hara makro

Senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah yang cukup besar. Oleh

karena itu dibuat dalam stok larutan tunggal, selain itu jenis anion senyawa sumber unsur

hara makro tidak sama. hal tersebut akan memungkinkan percepatan pengendapan larutan

bila dibuat larutan stok tunggal. Hara makro tersebut meliputi, Nitrogen (N), Fosfor (P),

Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg), dan Besi (Fe). Kegunaan unsur hara

makro tersebut dalam kultur jaringan menurut Qosim, 2006 dalam Sukarasa 2007 adalah

sebagai berikut:

1. Nitrogen (N) diberikan dalam bentuk NH4NO3, NH2PO4, NH2SO4.

Berfungsi untuk membentuk protein, lemak, dan berbagai senyawa organik lain,

morfogenesis (pertumbuhan akar dan tunas), pertumbuhan dan pembentukan embrio,

pembentukan embrio zigotik dan pertumbuhan vegetatif.

2. Fosfor (P), diberikan dalam bentuk KH2PO4

Berfungsi untuk metabolisme energi, sebagai stabilitor membran sel, pengaturan metabolisme

tanaman, pengaturan produksi pati/amilum, pembentukan karbohidrat, sangat penting dalam

transfer energi, protein, dan sintesis asam amino serta konstribusi terhadap struktur dan asam

nukleat.

3. Kalium (K), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O

Berfungsi untuk pemanjangan sel tanaman, memperkuat tubuh tanaman, memperlancar

metabolisme dan penyerapan makanan, ion kalsium ditransfer secara cepat menyebrangi

membran sel dan mengatur pH dan tekanan osmotik di antara sel.

4. Kalsium (Ca), diberikan dalam bentuk CaCl2.2H2O

Berfungsi untuk merangsang bulu-bulu akar, penggandaan atau perbanyakan sel dan akar,

pembentukan tabung polen, dinding dan membran sel lebih kuat, tahan terhadap serangan

patogen, mengeraskan batang, memproduksi cadangan makanan.

5. Sulfur (S) Unsur S merupakan unsur yang penting untuk pembentukan beberapa jenis protein,

seperti asam amino dan vitamin B1. Unsur S juga berperan penting dalam pembentukan bitil-

bintil akar.

6. Magnesium (Mg), diberikan dalam bentuk MgSO4.7H2O.

Berfungsi untuk meningkatkan kandungan fosfat, pembentukan protein.

7. Besi (Fe), diberikan dalam bentuk Fe2(SO4)3;FeSO4.7H2O

Berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk menyangga

kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan tanaman.Pada

tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun (George &

Sherringtone, 1984).

4.3. Stok Hara Mikro

Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media.Biasanya

larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200kali konsentrasi akhir media dan bahan

yang diperlukan masih cukup kecil jumlahnya.Oleh karena itu larutan stok unsur hara

mikro dapat dibuat sebagai stok campuran.Besarnya konsentrasi senyawa mikro yang

digunakan sangat kecil yaitu berukuran mikromolar, antara lain: besi (Fe), mangan (Mn),

boron (Bo), tembaga (Cu), seng (Zn), Iodine (I), molybdenum (Mo), cobalt (Co). Unsur-

unsur tersebut adalah merupakan komponen protein sel tanaman yang penting dalam

proses metabolisme dan proses fisiologi.Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan

dalam jumlah yang sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang

penting dalam proses metabolisme dan proses fisioligi lainnya (Gunawan, 1992). Unsur

hara mikro tersebut diantaranya adalah :

1. Klor (Cl), diberikan dalam bentu KI.

2. Mangan (Mn), diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O.

3. Tembaga (Cu), diberikan dalam bentuk CuSO4.5H2O.

4. Kobal (CO), diberikan dalam bentuk CoCl2.6H2O.

5. Molibdenun (Mo), diberikan dalam bentuk NaMoO4.2H2O.

6. Seng (Zn), diberikan dalam bentuk ZnSO4.4H2O.

7. Boron (B), diberikan dalam bentuk H3BO3.

Penggunaan unsur mikro awalnya dilakukan oleh Knudson pada tahun 1922, dengan

menambahkan Fe dan Mn dalam media kultur untuk perkecambahan anggrek, yang ternyata

hasilnya sangat baik. Barthelot, Gautheret, dan Nobecourt pada tahun 1934-1939,

menyarankan penggunaan Cu, Co, Ni, Ti dan Bo dalam media kultur. Hildebrant dan kawan-

kawannya pada tahun 1946, menyatakan kebutuhan Bo, Mn, Zn dan Fe yang optimum, untuk

pertumbuhan kalus tanaman tembakau dan bunga matahari,sedangkan penggunaan Mo

diperkenalkan oleh Buerk Holder dan Nickel. (George & Sherringtone, 1984).

Fungsi dari unsur mikro antara lain:

1. Mangan (Mn) mengatur oksidasi auksin, sebagai aktifator enzim. Mn dalam level

yang tinggi dapat mengsubstitusikan Mo dalam kultur akar tomat. Mn dapat

menggantikan fungsi Mg dalam beberapa sistem enzym tertentu

2. Clorine (Cl) berperan dalam proses osmosis dan kesetimbangan ion.

3. Tembaga (Cu) berperan dalam cofactor enzim.

4. Zinc (Zn) berperan menahan oksidasi auksin, berguna dalam sintesa triptofan dan

sebagai aktifator enzim.

5. Boron (Bo) berperan mempengaruhi penggunaan kalsium. Kekurangan Boron

mengurangi laju pertumbuhan kultur sel tebu, bunga matahari, dan wortel.

Sebaliknya konsentrasi lebih tinggi dari 2 mg/l, dapat berubah sisatnya menjadi

racun dalam media kultur. Dalam beberapa species, ternyata terdapat interaksi

antara Bo dan auksin dalam pengaturan pengakaran pada percobaan setek.

6. Cobalt (Co) diperlukan oleh organisme dalam memfiksasi N2.

7. Seng (Zn) dibutuhkan dalam sintesa tryptophan

(George & Sherringtone, 1984).

4.4. Stok vitamin

Vitamin bukan merupakan perlakuan artinya semua media menggunakkan konsentrasi

vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat stok campuran Larutan stok zat

pengatur tumbuh Zat pengatur tumbuh umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit.

Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok sulit digeneralisasikan, karena

biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan(Bonner dan

Devirian, 1939).

Vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur jaringan tanaman, adalah

thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin) dan pyridoxine (vitamin B6). Thiamine

merupakan vitamin yang esensial hampir pada semua kultur jaringan tanaman. Fungsi

thiamine adalah untuk mempercepat pembelahan sel pada meristem akar juga berperan

sebagai koenzim dalam reaksi yang menghasilkan energi dan karbohidrat serta memindahkan

energy.Asam nikotinik penting dalam reaksi - reaksi enzimatik, disamping berperan sebagai

prekusor dari beberapa alkaloid, pemberian vit C bertujuan untuk mencegah terjadinya

pencoklatan pada permukaan irisan jaringan (Bonner dan Devirian, 1939).

Vitamin lain yang sering ditambahkan dalam medium kultur jaringan adalah : Niasin,

glisin, Myo-inositol, asam folat, sianokabalamin, riboflavin, biotin, kolin klorida, kalsium

pantetonat, piridoksin pospat. Setiap jenis vitamin mempunyai fungsi yang berbeda-beda

didalam tubuh tanaman, antara lain:

1. Inositol (a vit. B) bagian dari berbagai macam membrane (kloroplas).

2. Pyridoxine (vit. B6) berperan sebagai coenzim pada beberapa enzim.

3. Pantothenic acid (a vit. B) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme lemak.

4. Riboflavin (vit. B12) berperan sebagai coenzim, reseptor sinar biru.

5. Biotin (vit. H) berperan sebagai coenzim dalam metabolisme lemak.

(Robbins dan Schmidt, 1939).

Pada pembuatan larutan stok vitamin juga ditambahkan glycine.Glycine merupakan

asam amino yang ditambahkan sejak tahun 1939, Glycine dengan konsentrasi 2 mg/l

merupakan komposisi tetap dalam banyak formulasi media (Robbins dan Schmidt, 1939).

4.5. Pembuatan 1 L MS0

Langkah awal menyiapkan alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan, yaitu

timbangan analitik, tabung erlenmeyer, gelas ukur, pengaduk, kompor gas, pH meter atau

kertas pH, botol media, gula, agar 0.8 %, NAA 2 mg/L, dan BA 0.5 mg/L, makronutrien dan

mikronutrien. Menimbang agar – agar 8 gr dan gula 30 gr dan memasukkan keduanya ke

beker gelas dengan tambahan sidikit air.Dan di panaskan diatas kompor sampai larut

seluruhnya sambil diaduk- aduk.Pemanasan dihentikan ketika larutan terlihat bening dan

mulai terlihat gelembung – gelembung udara.Kemudian ditambahkan denngan makronutrien

100 ml, mikronutrien 10 ml, stik Fe 10 ml dan Stok vitamin 10 ml. gula dan agar dipanaskan

terlebih dahulu karena MS mudah rusak dalam kondisi panas serta karena ukuran dari agar –

agar yang sangat kecil sehingga nanti akan menyebabkan tidak larut dan medium menajadi

tidak padat.

Setelah tercampur rata, media tersebut dituangkan ke dalam botol-botol media yang

telah dipersiapkan sesuai kebutuhan. Kemudian menutup botol yang sudah terisi

media.Diusahakan supaya botol benar-benar tertutup rapat.Memasukkan botol-botol tersebut

ke dalam autoclaf dan disterilisasi dengan suhu 121°C selama 20 menit.Media yang sudah

disterilisasi disimpan di dalam ruang penyimpanan media selama 3 hari sebelum digunakan

untuk memastikan bahwa media tersebut tidak terkontaminasi dan media padat dengan

sempurna.Bahan pemadat digunakan adalah agar.

Keuntungan dari pemakain media agar adalah :

a. Agar membeku pada temperatur ≤ 45o C dan mencair pada temperature 100o

C, sehingga dalam kisaran temperatur kultur, agar akan berada dalam keadaan

beku yang stabil.

b. Tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan oleh jaringan tanaman.

c. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media.

(George & Sherrington, 1984).

Agar merupakan campuran polisakharida yang diperoleh dari beberapa spesies

Algae.Dalam analisa unsur diperoleh data, bahwa kandungan agar meliputi unsur Ca, Mg, K,

dan Na dalam jumlah yang sedikit (Debergh, (1982 dalam Gunawan 1988).Kekentalan media

pada umumnya meningkat secara linier oleh pertambahan konsentrasi agar.Kekentalan media

juga dipengaruhi oleh Merek agar yang digunakan.merek agar yang berbeda, memberikan

kekentalan yang sedikit berbeda walaupun beratnya sama.Kekerasan media meningkat secara

linear pada pertambahan konsentrasi agar, kekerasan media juga dipengaruhi oleh jenis agar

yang dipakai, pH media, dan penambahan arang aktif (Debergh, 1982 dalam Gunawan,

1992).

Eksplan yang kecil mudah terlihat dalam media padat, selama kultur eksplan tetap

berada pada orientasi yang sama, eksplan berada di atas permukaan media sehingga tidak

diperlukan teknik aerasi tambahan pada kultur, orientasi pertumbuhan tunas dan akar tetap,

dan kalus tidak pecah seperti jika ditempatkan pada media cair. Namun penambahan agar

dalam beberapa kasus dapat menghambat pertumbuhan karena: agar mungkin mengandung

senyawa penghambat yang dapat menghambat morfogenesis beberapa kultur atau

memperlambat pertumbuhan kultur(Dodds dan Robert, 1982).

Perkembangan pemilihan jenis karbohidrat dimulai tahun 1946 oleh Gautheret yang

membandingkan pengaruh berbagai jenis gula pada kultur jaringan wortel (George &

Sherringtone, 1984). Gautheret mendapatkan bahwa sukrosa adalah yang paling baik, lalu

glukosa, maltosa, dan rafinosa.Fruktosa dan galaktosa kurang efektif, sedangkan manosa dan

laktosa merupakan karbohidrat yang paling tidak efektif.Pada umumnya urutan yang

demikian berlaku hampir semua tanaman. Induksi sitodiferensiasi ke arah pembentukan

elemen trachea dapat terjadi dengan pemilihan jenis karbohidrat dan konsentrasi yang tepat

dalam media kultur (Dodds dan Robert, 1982).

Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian

tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang

rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup

sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber

karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa.Namun jika

tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula

pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber

energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media.Sukrosa di dalam media

dihidrolisa menjadi monosakharida selama masa kultur. Hidrolisa terjadi karena aktifitas

enzim invertase yang terdapat pada dinding sel. Hidrolisa sukrosa paling efektif dalam media

dengan pH rendah.Konsentrasi optimum sukrosa tergantung dari jenis jaringan yang dikultur.

Pada kultur kalus dan pucuk, konsentrasi sukrosa yang digunakan adalah antara 2-4 % yang

merupakan konsentrasi optimum. Namun dalam kultur embrio, konsentrasi gula dapat

mencapai 12 % Penambahan sukrosa disini berfungsi sebagai sumber gula dan energy

(George & Sherrington, 1984).

4.6. Perbandingan medium MS dengan medium lain

Apabila medium MS dibandingkan dengan medium yang lain maka perbedaannya

disesuaikan dengan eksplan yang digunakan. Medium MS merupakan medium yang sesuai

jika digunakan untuk hampir semua macam tanaman terutama tanaman herbaceus.

Sedangkan pada medium yang lain hanya mampu menumbuhkan tanaman tertentu. Selain itu

pada medium MS mempunyai konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi dan senyawa N

dalam bentuk NO3- dan NH4+(Hendaryono, 1994). Media MS (murashing and skoog)

mengandung unsur hara makro dan mikro yang tinggi yang mampu menjamin pertumbuhan

jaringan tanaman(Gunawan 1987 dalam Matatula 2003).

Menurut Mandang (1993) dalam Matatula 2003), pembuatan medium MS dapat

disubsitusi dengan air kelapa yang berarti menambah komponen-komponen yang dimiliki

maupun yang tidak dimiliki medium MS seperti asam amino, asam organik, gula dan

fitohormon.

Beberapa macam medium yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama

penemunya antara lain :

a. Medium Dasar B5 Atau Gamborg : digunakan untuk kultur suspensi sel kedele, alfafa

dan legume lain.

b. Medium Dasar White : digunakan untuk kultur akar. Medium ini merupakan medium

dasar dengan konsentrasi garam-garam mineral yang rendah.

c. Medium Vacin Went (VW) : digunakan khusus untuk medium anggrek.

d. Medium Dasar Nitsch Dan Nitsch : digunakan untuk kultur serbuk sari (pollen) dan

kultur sel.

e. Medium Dasar Woody Plant Medium (WPM) : digunakan untuk tanaman berkayu.

f. Medium Dasar Schenk Dan Hildebrandt : Digunakan untuk kultur jaringan tanaman

monokotil.

g. Medium Dasar N6 : digunakan utnuk tanaman serealia (Hendaryono, 1994).

Pada eksplan Jasminium sp. dapat menggunakan medium WPM karena medium

tersebut digunakan untuk tanaman berkayu. Kesulitan yang sering timbul pada kultur jaringan

tanaman berkayu adalah keluarnya phelic compound, sehingga kalus atau eksplan menjadi

berwarna coklat yang akhirnya tidak dapat tumbuh. Hal tersebut disebut browning.

ALAT-ALAT LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

A. Laminar Air Flow Cabinet (LAFC)

Alat ini letaknya diruang penabur, yaitu ruang yang selalu harus dalam keadaan steril. alat

ini digunakan sebagai tahap perlakuan penanaman.

B. Entkas

Merupakan bentuk lama dari alat penabur (LAFC), maka fungsinya pun sama seperti

(LAFC)

C. Shaker (penggojok)

Merupakan alat penggojok yang putarannya dapat diatur menurut kemauan kita.

Penggojok ini dapat digunakan untuk keperluan menumbuhkan kalus pada eksplan anggrek

atau untuk membentuk protokormusatau sering disebut plb (protocorm like bodies) dari kalus

bermacam jaringan tanaman.

D. Autoklaf

Autoklaf adalah alat sterilisasi untuk alat dan medium kultur jarinang tanaman.

E. Timbangan Analitik

Jenis alat ini bermacam-macam, tetapi yang penting adalah timbanagn yaang dapat

dipergunakan untuk menimbang sampai satuan yang sangat keil. Alat ini berfungsi sebagai

alat untuk menimbang bahan-bahan kimia yang digunakan untuk kultur jaringan.

F. Stirer

Alat ini berfungsi untuk menggojok dengan pemanas. Dengan menggunakan listrik, alat

ini berfungsi sebagai kompor disamping sebagai penggojok.

G. Erlenmeyer

Alat ini digunakan dalama kultur jaringan tanaman sebagai sarana mmenuangkan air

suling maupun untuk tempat media dan penanaman eeksplan.

H. Gelas Ukur

Gelas ukur digunakan untuk menakar air suling dan bahan kimia yang akan digunakan.

I. Gelas Piala

Alat ini digunakan untuk menuangkan atau mempersiapkan bahan kimia dan air suling

dalam pembuatan medium.

J. Petridish

Alat ini merupakan semacam jenis gelas piala yang mutlak dibutuhkan dalam kultur

jaringan.

K. Pinset dan Scalpel

Pinset digunakan untuk memegang atau mengambil irisan eksplan atau untuk menanam

eksplan

L. Lampu Spiritus

Digunakan untuk sterilisasi dissecting kit (skalpel dan pinset) di dalam laminar air flow

cabinet atau di dalam enkas pada kita mengerjakan penanaman atau sub-culture.

M. Tabung Reaksi

Alat ini digunakan pada saat mengerjakan isolasi protoplas dan isiolasi khloroplas.

FASILITAS LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Fasilitas laboratorium kultur jaringan di bagi dalam beberapa bagian yang fungsinya

satu sama lainnya berbeda-beda dan persyaratannya pun berbeda-beda pula. Laboratorium

kultur jaringan harus dirancang secara khusus. Karena ada bagian-bagian atau ruangan-

ruanagn yang harus dalam suasana steril atau bebas mikroba.

Ruang-ruang dalam kultur jaringan di kelompokkan menurut macam kegiatan yang

ada di dalamnya,, yaitu sebagai berikut:

A. Ruang Tidak Steril

Ruang Tamu.

Dalam laborsatorium kultur jaringan sebaiknya di lengkapi dengan ruang tamu,

karena biasanya laboratorium kultur jaringan selalu di datangi tamu baik tamu yang ingin

melihat sarana dan suasana laboratorium maupun tamu ingin membeli hasil biakan kultur

jaringan.

Ruang Administrasi.

Segala surat-menyurat tentang pembelian alat-alatlboratorium, pembelian media

kultur jringan, penjualan bibit-bibit hasil biakan kultur jaringan, dan transaksi-transaksi

ataupun perjanjian-perjanjian kerja sama tentang penelitian dilaksanakan di dalam ruangan

administrasi.

Ruang Staf.

Laboratorium kultur jaringan membutuhkan staf peneliti dalam jumlah banyak,

tujuannya adalah agar dapat di adakan pembagian kerja sesuai dengan spesialisasinya

masing-masing. Di dalam ruang staf ini dapat pula di lakasanakan diskusi antar staf pada

waktu berkumpul bersama.

Kamar Mandi dan WC.

Ruang kultur jaringan harus dalam suasana bersih untuk menghindari kontaminasi

oleh mikroba. Bila pekerja akan memasuki ruangan penabur atau ruang inkubator, tubuh dan

pakaiannya harus bersih, tidak berkeringat dan tidak berdebu. Untuk inilah kamar mandi dan

wc perlu diadakan.

Ruang Ganti Pakaian.

Untuk menghindari timbulnya kontaminasi oleh mikroba, maka para karyawan di

dalam laboratorium kultur jaringan perlu memakai pakaian yang bersih, dalam arti baru di

cuci. Oleh karena itu dalam ruangan kultur jaringan perlu di adakan ruang ganti pakaian.

Ruang Tempat Penyimpanan Bahan Kimia dan Alat-alat dari Gelas.

Komponen bahan kimia penyusun media kultur jaringan sangat banyak macamna.

Oleh karena itu, penyimpanannya memerlukan pengaturn yang khusus supaya mudah

mecarinya. Penyimpanan yang tidak teratur akan mempelambat dalam pekerjaan, misalnya

dalam mencari salah sau komponen media saja membutuhkan waktu yang lama.

Bahan kimia yang mahal harganya seperti hormon tumbuh dan enzim untuk isolasi protoplas

harus disimpan dala ruangan yang sejuk.

Alat-alat dari gelas seperti erlenmeyer, gelas ukurdan alat gelas lainnya perlu disimpan dalam

almari tersendiri.

Ruang Preparasi.

Di dalam ruangan ini disediakan peralatan dan tempat untuk mencuci alat-alat

laboratorium yang akan digunakan. Peralatan yang ada antara lain keranjang-keranjang

plastik untuk tempat peralatan yang baru dicuci.

Ruang Penimbangan dan Sterilisasi.

Bermacam-macam media kultur jaringan dijual dalam bentuk kemasan dengan harga

yang relatif mahal. Oleh karena itu, staf labolatorium lebih senang meramu sendiri medum

tanam yang dibutuhkannya.dengan demikian dibutuhkan lat untuk menimbang semua

komponen bahan kimia tersebut. Misalnya menimbang bahan kimia makro dan mikro.

Rumah Kaca (Green House)

Rumah kaca adalah suatu bangunan yang atap dan sekeliling dinding bagian atasnya

terbuat dari kaca. Tujuan penyediaan rumah kaca adalah untuk tempat meletakkan pot-pot

bibit tanaman, baik bibit yang akan dijadikan bahan kultur jarinang maupun bibit hasil dari

kultur jaringan yang sudah siap djual atau dipelihara sendiri.

B. Ruang Tidak Mutlak Steril

Ruang Planlet.

Ruangan ini menggunakan alat pendingi (AC), maka temperatur ruangan dapat mencapai

sekitar 25OC sehingga ideal bagi pertumbuhan planlet. Botol-botol yang berisi planlet

jumlahnya dapat mencapai ratusan. Oleh sebab itu, dalam ruangan ini perlu disediakan rak-

rak alumuniaum yang dasrnya berlobang-lobang untuk meletakkan botol-botol tersebut

secara teratur dan rapi.

Ruang Inkubator.

Eksplan yang sudah ditanam dalam media kultur jringan perlu dipantau pertumbuhannya

setiap hari. Untuk pemantauan ini perlu ruangan khusus yang keadaannya lebih steril dari

ruang planlet, yaitu ruang inkubator.

Ruang inkubator harus memiliki suhu kurang lebih 25OC dan harus dilengkapi dengan

lampu-lampu neon, karena eksplan yang ditumbuhkan dalam ruangan inkubasi membutuhkan

temperatru dan cahaya yang dapat diatur dan disesuaikan dengan jenis eksplannya.

Ruang Shaker dsn Enkas.

Eksplan yang baru ditanam dan diinkubasikan dalam ruang inkubator akan menghasilkan

kalus. Bila kalus ini cukup umur, maka dapat diperlukan suspensi sel, yaitu menumbuhkan

suatu eksplan atau kalus dengan menggunakan media cair (media yang tidak menggunakan

zat pemadat atau agar), kemudian digojok di atas shaker.

Hasil pertumbuhan kalus ini adalah berupa protokormus atau dalam istilah asing disebut plb

(protocorm like bodies). Bentuk protocormus adalah bulat-bulat padat dan berwarna hijau.

Bila keadaan protocormus sudah keadaan demikian maka sudah siap dipindahkan kedalam

media padat untuk di tumbuhkan menjadi planlet.

Enksa juga sering di letakkan dalam satu ruang dengan shaker, kegunaan enkas ini sama

dengan Laminar Air Flow Cabinet, yaitu untuk menabur eksplan.

C. Ruang Mutlak Steril.

Ruang Penabur.

Ruang penabur biasanya di buat dengan ukuran yang tidak terlalu besar, yaitu 2x3 m2.

tujuannya adalah agar pelaksanaan sterilisasi ruangannya tidak membutuhkan waktu yang

lama dan tidak mengalami kesulitan.

Dinding ruang penabur dilengkapi dengan porselin, sehingga sterilisasi mudah dilakukan.

Sterilisasi ruangan dilakukan dengan cara menyemprotkan alkohol 96% dengan hand-sprayer.

Sedangkan sterilisasi lantai dengan menggunakan kain pel yang dibasahi alkohol 96%.

Sterilisasi ini mutlak harus dilakukan menjelang ruang penabur akan digunakan.

Bila saat calon penabur akan memasuki ruangan, lampu ultra violet harus dimatkan terlebih

dahulu kemudian menyalakan lampu neon biasa dan calon penabur diperbolehkan memasuki

ruangan tersebut. Sebaiknya, pada saat akan keluar lampu neon di matikan dan setelah keluar

menutup daun pintu kembali lampu ultra violet dinyalakan. Dengan demikian steril ruangan

dapat dijamin.

Penyiapan Eksplan kultur jaringan

MENYIAPKAN EKSPLAN

Dalam menyiapkan bahan tanam, tanaman induk sebagai sumber bahan (eksplan)

mruakan faktor penentu dalam menghasilkan produk akhir (bibit) hail perbanyakan melalui

kultur jaringan yang berkualitas. Sedangkan sterilitas bahan tanam, sehingga prosedur

sterlisasi eksplan harus tepat anpa memaikan jaringan dari eksplan.

A. Menyiapkan bahan eksplan

Eksplan atau bahan tanam adalah bagian kecil bagian kecil jaringan atau organ yang

diambil/dipisahkan dari tanaman nduk kemudian ikulturkan. Ketepatan dalam menyiapkan

eksplan adalah salah satu faktor yang dapat mempengaruhi inisiasi eksplan.

1. Deskripsi varetas tanaman sumber bahan eksplan

Dalam upaya menghasilkan tanaman induk yang sesuai dengan kriteria diatas dapat

dilakukan dengan cara mengkodisikan tanaman induk dalam lingkungan yang lebih

terkendali, misalnya dengan cara mencangkok tanaman induk, kemudian ditanam dalam po

dan dipelihara secara otimal didalam green house/net house.

2. Persyaratan bagian tanaman sebagai bahan eksplan

Bagian tanana yang dapat dijadikan sebagai eksplan adlah ujung akar, pucuk, daun, bunga,

dan tepung sari. Faktor yang dimiliki ekplan itu sendiri yaitu ukuran, umur fisiologis, sumber

genotip dan sterilitas ekplan yang akan menentukan berhasil tidaknya pegkulturan eksplan.

Umur fisiologis eksplan berpengaru terhadap kemampuanya untuk beregenerasi

jaringan tanaman yang masih muda yang meristematik (sel-selnya masil aktif membelah)

lebih mudah beregenerasi dibandingkan dengan jaringan yang sudah tua, sehingga bagian

tanaman yang meristematik paling banyak berhasil bila dijadikan eksplan yang termasuk 

jaringan meristem adlah pucuk apikal, pucuk lateral dan pucuk aksial.

3. Karakter bagian tanaman sebagian bahan eksplan

Pemelihan bagian tanaman sebagaibahan eksplan menentukan keberhasilan eksplan

untuk dikulturkan. Pada dasarnya setiap bagian tanaman yang dapat dijadikan sebagai bahan

ekspla, tetapi dalam memilih bagian tanaman yang akan dikulturkan harus mempertimbankan

faktor kemudahan beregenerasi dan tingkat kontaminasinya.

Bagian tanaman yang banyak mengandung persediaanmakanan serta bahan-bahan lain

untuk pertumbuhan, seperti  umbi adalah lebih mudah untuk beregenerasi dibanding denagn

bagian tanaman yang kurang mengandung bahan makanan. Bagian yang berasal lebih tinggi

dibandingkan dengan bagian-bagian tanaman yang ada diatas permukaan tanah seperti pucuk

atau daun.

B. Mensterilkan eksplan

Dari semua komunikasi, kontaminasi dari bahan tanam/eksplan merupakan yang paling sulit

diatasi. Untuk itu dipelukan bahan sterilan yang tepat untukmenghasilkan kontaminan dari

eksplan.

Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, seranga dan telurnya, tungau serta

spora. Bila kontaminan ini tidak dihiangkan, maka pada media yang mengandung gula,

vitamin dan minera, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yang

mineral, dalam waktu singkat seluruh botol terpenuhi oleh kontaminan yangakhirnya

mengakibatkan eksplan menjadi mati.

Sterilisai eksplan dengan bahan strelisasi adalah sebatas membersihkan debu,

cendawan, bakteri dan kontaminan lain dari bagan permukaan eksplan atau disebut

desinfestasi.

1. Macam-macam bahan streisasi dan fungsinya

Macam-macam bahan untuk sterilisasi dan fungsinya adalah sebagai baerikut :

N

o.

Nama bahan sterilisasi Fungsinya

1

.

deterjen Membershkan kotora/debu

dari eksplan

2

.

fungisida Memberihkan

jamur/cendawan

3

.

bakterisida Membersihkan bakteri

4

.

Alkohol  70% dan 95% Desinfektan

5

.

Sodium hipoklorik dengan nama

dagang clorox atau bayclin

Desinfektan

6

.

Mercury chlorit dengan nama dagang

sublima 0,05 %

Desinfektan

7

.

Tween -20 Agen pembasah

8

.

Antibiotik Desinfektan

9

.

Iodine/betadine Antiseptik

2. Memilih bahan strerilisasi

Dalam melakukan sterilisasi eksplan, pemilihan metode sterilisasi harus selektif,

termasuk dalam hal ini adalah memilih memilih bahan sterilisasi yang tepat.

Setiap bahan tanam mempuntai tingkat kontaminan permukaan yang berbeda,

tergantung dari:

a. Jenis tanaman

b. Bagian tanaman yang dipergunakan

c. Morfologi permukaan( misalnya : berbulu atau tidak)

d. Lingkungan tumbuh (green house atau lahan)

e. Musim waktu mengambil (musim hijau/kemarau)

f. Umur tanaman (seeding atau tanaman dewasa)

g. Kondisi tanaman (sakit atau sehat)

3. Mensterikan eksplan dengan cara merendam bahan kimia

Pada dasarnya semua jenis eksplan dapat disterisasi dengan menggunakan bahan kimia.

Hanya saja perlu diperhatikan kosentrasi larutan bahan kimia ynag digunakan serta lamanya

perendaman. Keras, lunaknya eksplan berpengaruh terhadap penggunaan kosentrasi larutan

dan lamanya perendaman. Eksplan yang lunak sebaiknya menggunakan kosentrasi bahan

kimia yang rendah dan waktu yang tidak terlalu lama. Sebaiknya pada eksplan yang keras,

dapat digunakan kosentrasi yang lebih tinggi dan waktu perendaman yang lama.

Prosedur sterilasasi eksplan dengan memrendam dalam bahan kimia adalah eksplan

dicuci dengan fungisida, eksplan dicuci dengan aquadest steril eksplan direndam dala larutan

antiseptik, dan eksplan siap dinokulasi.

Cara Sterilisasi Tanaman (Eksplan) Kultur jaringan

Sebelumnya eksplan kultur jaringan (kuljar) harus dicuci dulu dengan detergen

dan dibuang bagian yang tidak perlu. Sterilisasi dilakukan dengan menggunakan lebih dari

satu bahan seperti alcohol, bahan pemutih pakaian dan HgCl2. Lamanya proses sterilisasi dan

konsentrasi bahan tergantung jenis dan bagian tanaman yang digunakan. Prinsip dasar

sterilisasi eksplan adalah mensterilkan eksplan dari berbagai mikroorganisme, tetapi

eksplannya tidak ikut mati. Setiap tanaman memerlukan perlakuan khusus sehingga sebelum

mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi.

Untuk dapat melakukan percobaan sterilisasi kultur jaringan dengan baik, kita bisa

membuat kisaran konsentrasi dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi dengan rentang

yang cukup lebar. Jika dengan konsentrasi tertentu tidak terkontaminasi tetapi eksplannya

mati, berarti konsentrasinya harus diturunkan. Begitu juga sebaliknya, jika masih banyak

kontaminannya, konsentrasi bahan harus dinaikkan supaya tidak terkontaminasi lagi. Sama

juga halnya dengan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi. Jika masih banyak kontaminasi,

berarti proses sterilisasi harus lebih lama. Jika kita telah berhasil mendapatkan satu kultur

jaringan saja yang bebas kontaminan, maka kita dapat memperbanyaknya dalam jumlah

banyak.

Untuk meningkatkan efisiensi pensterilisasian pada kultur jaringan dapat menggunakan

Tween 20 dengan cara meneteskan 1-2 tetes ke dalam larutan sterilisasi. Tujuannya supaya

tegangan permukaan bahan disinfektan menjadi lebih rendah sehingga bahan disinfektan

dapat menyentuh lekukan-lekukan kecil atau rongga-rongga kecil seperti celah-celah di

antara bulu-bulu halus yang ada di eksplan sehingga eksplan benar-benar steril.

Semua peralatan dan bahan yang dipakai untuk sterilisasi eksplan kultur jaringan seperti

Bunsen, cawan petri, botol kultur yang berisi media, botol bahan disinfektan, botol alkohol

70%, dan alat-alat disiapkan di dalam laminar air flow atau enkas. Setelah semua siap, proses

sterilisasi bisa dimulai.

Eksplan kultur jaringan dimasukkan ke dalam larutan disinfektan pertama dengan

konsentrasi dan waktu tertentu sambil dikocok-kocok, lalu dibilas dan dimasukkan kedalam

larutan disinfektan kedua dan seterusnya hingga semua larutan disinfektan selesai dilakukan.

Terakhir, eksplan dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali, tujuannya supaya tidak terdapat

sisa-sisa bahan disinfektan yang menempel di eksplan.

Selain sterilisasi dengan kombinasi berbagi bahan disinfektan, bisa juga dilakukan

sterilisasi bertingkat (konsentrasi bahan disinfektan semakin rendah) untuk suatu disinfektan

yang dibarengi dengan pembukaan setiap daun muda sampai mata tunas telanjang. Untuk

kultur anter, anter dapat dipotong dari bunga dan disterilisasi menggunakan klorox (pemutih

pakaian) dan HgCl2 dan tidak memerlukan sterilisasi bertingkat.

Sebagai patokan, konsentrasi bahan dan waktu yang diperlukan untuk sterilisasi eksplan

sebagai berikut.

Sterilisasi Ringan, Eksplan kuljar direndam dalam cairan pemutih pakaian 20% selama

10 menit, lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih

pakaian 15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam

cairan pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Sedang, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 7 menit,

lalu dibilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian

15% selama 10 menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan

pemutih pakaian 10% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Sterilisasi Keras, Eksplan kuljar direndam dalam HgCl2 0,1-0,5 mg/l selama 10 menit,

lalu bilas dengan air steril. Setelah itu, eksplan direndam dalam alkohol 90% selama 15

menit, lalu bilas dengan air steril. Terakhir, eksplan direndam dalam cairan pemutih pakaian

20% selama 10 menit, lalu dibilas dengan air steril tiga kali.

Teknik Kultur Jaringan Jati

Cakupan kegiatan ini meliputi beberapa tahapan meliputi :

a. Seleksi material

Secara teori sangat mungkin mulai melaksanakan penelitian dari bagian sel tanaman,

akan tetapi yang harus dipilih adalah bagian tanaman yang masih aktif membelah seperti

bagaian pucuk tanaman dari pohon induk.

b. Sterilisasi bahan tanaman

Kontrol kontaminasi dari mikroorganisme adalah sangat penting dalam proses

pertumbuhan selanjutnya. Jaringan tanaman seperti meristern apikal dan kambium mungkin

bebas dari mikro-organisme, tetapi jaringan lain sering terkontaminasi cendawan dan bakteri,

te rutama jaringan yang berasal dari tanaman yang ditumbuhkan di lapangan. Sterilisasi

permukaan dari eksplan dapat digunakan 2 % Bayclean. Penggunaan 0, 1 % Tween 80

sebagai surfactan sangat membantu penetrasi sodium hypochlorite masuk ke dalam jaringan

eksplan. Selain itu eksplan dapat juga direndam dalam 70 % ethanol selama 30 -60 detik

sebelum perlakuan bayclean.

c. Induksi dan Multiplikasi

Pemantapan kultur dan regenerasi tanaman dilakukan dengan sistem penapisan. Jenis

tanaman dan media ditapis secara bersama-sama. Eksplan yang dipakai pucuk aksiler.

Terdapat tiap tipe eksplan yang ditanam dalam medium MS. Pada. media yang cocok, suatu

species mungkin akan menunjukkan pertumbuhan yang belum optimum. Zat pengatur

tumbuh kemudian dimasukan sebagai faktor. Pada umumnya zat pengatur tumbuh yang

digunakan dari golongan sitokinin, dengan konsentrasi yang digunakan berkisar 0,15 - 1,5

mg/l. Vi tamin dan sumber karbon adalah faktor tambahan yang kadang-kadang

mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan eksplan. Tahap tersebut dapat dipakai untuk

tujuan perbanyakan metalui produksi tunas aksiler, multiplikasi tunas adventif langsung atau

tidak langsung atau perbanyakan melalui embrio somatik.

d. Pengakaran

Penggunaan medium W (white), kombinasi IBA dan IAA, sucrosa 2% dan si tokinin

rendah se ring lebih baik menginduksi perakaran. Mengurangi konsentrasi medium MS

menjadi ½ x konsentrasi akan mengurangi terbentuknya kalus pada dasar tunas yang,

diakarkan.

e. Aklimatisasi

Agar dapat bertahan di lapangan, maka dilakukan aklimatisasi jati hasil kultur jaringan.

Terdapat beberapa tahapan dalam kegiatan aklimatisasi ini yaitu dengan penyungkupan dan

peningkatan daya tahan terhadap cahaya matahari (perlakuan naungan).

f. Mikro cutting

Kegiatan mikro cutting merupakan kelanjutan dari teknik kultur jaringan, yaitu setelah

tahapan multiplikasi tanaman dilakukan penyetekan pada media padat (pasir).

aklimatisasi planlet

Aklimatisasi adalah proses untuk memindahkan tanaman dari kondisi heterotrof  ke

kondisi autotrof dan juga dari kondisi steril ke kondisi normal( tidak steril). Proses

aklimatisasi dilakukan pada planlet yang kondisinya telah lengkap, yaitu telah membentuk

akar, batang, dan daun. Aklimatisasi bertujuan untuk memindahkan tanaman dari kondisi

ruang ke kondisi lapang. 

Tahap-tahap yang dilakukakan dalam prses aklimatisasi yaitu :

1.      Hardening, yaitu planlet dalam botol dari kondisi runag steril di pindahkan ke

kondisi non steril dan terkena sedikit sinar matahari. Proses ini berkangsung pada 1-2

minggu.

2.      Pembuatan media aklimatisasi, komposisi media yang akan di gunakan adalah

campuran cocopit dan pasir dengan perbandingan 1:1. Campuran media selanjutnya di

sterilkan dengan di masak ( di rebus ) selama 1 jam, setelah itu media di dinginkan.

3.      Pencician planlet. Planlet yang telah mengalami proses hardening kemudian di

keluarka dari botol. Planlet trsebut di cuci dengan air mengalir agar semua media yang masih

menempel dapat di lepas, hal ini di lakukan untuk menekan tumbuhnya mikroorganisme pada

planlet yang dapat mengakibatkan kegagalan proses aklimatisasi.

4.      Perendaman dalam fungisida dan bakterisida, planlet yang telah bersih direndam

dalam campuran tersebut selama 15-30 menit.

5.      Perendaman dalam larutan rooton, guna untuk  merangsang pertumbuhan

perakaran yang pptimal maka pangkal planlet direndam dalam larutan rooton selama 15

menit.

6.      Tahap selanjutnya adalah penanaman planlet pada media yang telah disediakan.

Planlet yang telah di tanam kemudian di tutup dengan menggunakan bahan tembus cahaya,

kondisi ini di biarkan sampai planlet memunculkan daun baru, dan setelah daun baru muncul

maka sungkup plastik di buka secara bertahap dan mulai dilakukan penyiraman pada planlet.