POKOK BAHASAN I PENGANTAR MIKROBIOLOGI INDUSTRI Deskripsi singkat Dalam pokok bahasan pertama akan dibahas tentang pengertian Mikrobiologi Industr i, industri fermentasi dan bioteknologi. Mikrobiologi Industri adalah ilmu yang mempelajari tentang peranan mikrobia yang menguntungkan dalam industri dalam pen ghasilan produk yang mempunyai nilai ekonomi lebih tinggi dibandingkan dengan ba han dasar. Disamping itu juga dalam mikrobiologi industri juga dipelajari tentan g pertumbuhan mikrobia isolasi dan peningkatan, pemeliharaan kultur mikrobia yan g potensial dalam industri, rancang bangun biorektor strain mikrobia, pengunduha n dan punifikasi produk, produksi metabolit primer dan sekunder, biokonversi ste roid serta protein sel tunggal serta penanganan limbah. Tujuan Instruksional khusus Mahasiswa mampu menjelaskan pengertian Mikrobiologi Industri, industri fermentas i dan bioteknologi, sejarah fermentasi dan peranan mikrobia bagi manusia.

A. Pengertian Mikrobiologi Industri Mikrobiologi Industri adalah ilmu yang mempelajari proses industri dengan mengik ut sertakan mikrobia dalam memproduksi produk-produk yang mempunyai nilai ekonom i tinggi. Produk yang dibuat dipilih senyawa yang sulit diperoleh melalui cara k imiawi. B. Aspek-aspek Mikrobiologi Industri Aspek yang dipelajari dalam Mikrobiologi Industri adalah dinamika fermentasi, al at untuk fermentasi, kinetika pertumbuhan, pengunduhan produk serta penangan lim bah industri, produksi metabolit, protein sel tunggal. C. Sejarah Fermentasi Sejarah perkembangan fermentasi a. Fermentasi telah dikenal sejak 6000 SM, di Babylonia, diketemukan khamir penghasil minuman beralkohol (bir) b. Orang Mesir menemukan khamir pengembang roti, pada 4000 SM. c. Abad ke-14 diketemukan cara distilasi alkohol dari hasil fermentasi sere alia. d. Di Cina, Timur Tengah, menggunakan bakteri asam laktat untuk pengawetan susu menjadi yoghurt, kefir dan kusmiss. e. Bakteri asam asetat ditemukan sebelum penemuan oleh Anthony Van Leuwenho ek. f. Columbus di Amerika, menemukan fermentasi dari jagung. g. Pabrik bir Carlsberg tahun 1800 sebagai pioner pengembang starter, untuk inokulum bir. h. Tahun 1803 L.J. Thenard (Perancis) menemukan khamir penghasil alkohol. i. Edward Buchner tahun 1857 menemukan mikrobia untuk produksi alkohol. j. Rudolf Emmerich dan Oscarlow tahun 1901 mendapatkan pyonase, adalah biot ik yang dighasilkan oleh Pseudomonas aeruginosa. k. Chaim Wismann tahun 1914-1918 menemukan Clostridium penghasil aseton unt uk bahan peledak. l. Pfizer tahun 1923 menemukan Aspergillus niger penghasil asam sitrat. m. Alexander Flemming tahun 1928 menemukan pinisilin yang dihasilkan oleh P . notatum chrysogenum untuk menghambat Staphylococcus aureus. n. Selman Waksman menemukan Streptomyces griseus penghasil streptomisin. o. Louis Pasteur tahun 1957 menemukan khamir penghasil alkohol, diketemukan pula fermentasi vitamin, antibiotik, steroid dan asam amino. p. Tahun 1900 sampai 1920 dihasilkan gliserol, aseton, butanol, ensim dari bakteri dan fungi. Pada waktu itu juga diperkenalkan tangki Imhoff untuk digesti

anaerob air limbah menggunakan lumpur aktif. q. Tahun 1960 telah diteliti tentang produksi biomasa sel mikrobia untuk su mber protein. r. Rekayasa genetika tidak hanya memindah gen diantra mikrobia tetapi juga genom. D. Masa depan perkembangan fermentasi (Industri fermentasi) Perkembangan fermentasi umumnya menuju pada bahan kompleks dan sukar dibuat seca ra sintetis, contohnya: asam nukleat, alkoloid, polipeptida, protein, dan asam p olihidroksi. Untuk memenuhi obat-obatan, makanan, ensim, detergen dan sebagainya perlu dicari mikrobia yang bersifat unggul. Penyediaan bahan untuk industriferm entasi sangat dibutuhkan dalam jumlah besar. E. Peranan Mikrobiologi dalam Industri bagi Manusia. 1 Mikrobia dapat digunakan dalam industri untuk menghasilkan produk sepert i ensim, polisakarida, asam amino, hormon dan antibodi monoklonal. 2 Mikrobia dapat digunakan untuk degradasi senyawa toksik, mengakumulasi l apisan minyak, berperanan sebagai peptisida dan tujuan untuk penambangan. 3 Ensim digunakan untuk penyamakan kulit penghasil detergen dan pembuatan mentega pengempukan daging. 4 Polisakharida digunakan untuk menstabilkan dan memberi pengental makanan sebagai bahan kosmetik, agensia pengikat (perekat) obat-obatan, untuk menyaring senyawa dan sebagainya. 5 Hormon seperti insulin dan hormon pertumbuhan digunakan untuk diberikan kepada manusia yang memang sifat genetik tak mampu memproduksi vitamin dan hormo n. Peranan Mikrobia dalam Industri : Mikrobia : 1. Menguntungkan 2. Merugikan 1. Menguntungkan produk metabolit mempunyai nilai komersial a. Produk metabolit primer b. Produk metabolit sekunder Berupa obat-obatan, antibiotik tetrasilin, penisilin, vitamin, asam amino, dan l ain-lain. 2. Mikrobia yang berperanan: mold, yeast dan bakteria a. Minuman beralkohol, bir, anggur b. Senyawa obat-obatan, antibiotik, steroid. c. Makanan suplement: yeast, alge (PST) d. Senyawa pelarut: aseton, butanol, alkohol. e. Vaksin. Latihan soal : 1 Jelaskan ruang lingkup yang dipelajari dalam Mikrobiologi Industri 2 Jelaskan perbedaan antara industri fermentasi dan bioteknologi 3 Sebutkan salah satu produk fermentasi (biopestisida) yang dihasilkan ol eh bakteri 4 Mengapa produk fermentasi ada yang tergolong dalam metabolit primer dan sekunder ! beri contoh. 5 Apakah yang dimaksud dengan a. Mikrobiologi Industri b. Protein sel tunggal c. Bioteknologi.

Pokok Bahasan II DASAR-DASAR DAN BIOKIMIA FERMENTASI Deskripsi Singkat Fermentasi berasal dari kata latin yaitu fervere yang berarti mendidih (toboil), hal ini ternyata merupakan aktifitas khamir pada ekstrak buah-buahan atau sekea lia. Selama fermentasi dihasilkan CO2 sehingga kondisinya menjadi anaerob. Definisi fermentasi ini diperluas yaitu reaksi oksidasi reduksi menggunakan sumb er energi dan sumber karbon, nitrogen dan lain-lain untuk membentuk senyawa yang mempunyai nilai ekonomi lebih tinggi serta terakumulasi dalam medium. Adapun tahapan fermentasi adalah jenis mikrobia dan kultur stok, media, preparas i inokulum, fermentasi, kontrol proses dan pengunduhan hasil serta operasi ferme ntasi. Operasi fermentasi secara komersial dapat digolongkan menjadi tiga golong an yaitu fermentasi non aseptis, semi aseptis dan aseptis. Sebagai contoh fermen tasi non aseptis yaitu produksi protein sel tunggal (PST) dari hidrokarbon, ferm entasi alkohol tergolong fermentasi semi aseptis dan produksi antibiotik bersifa t fermentasi aseptis. Kebanyakan produk berasal dari substrat yang mengandung karbon. Bermacam-macam p roduk antara yang dihasilkan dari glukosa dan dihasilkan asam piruvat sebagai se nyawa kunci, kemudian asam piruvat direduksi menjadi asam laktat, asam butirat, asam propional, butanediol, etil alkohol dan sebagainya. Produk yang dihasilkan tergantung ada dan tidaknya ensim mikrobia. Sebagai conto h bakteri asam laktat tidak menghasilkan ensim piruvat dekarboksilase, tetapi me reduksi piruvat menjadi asam laktat, sedang khamir dapat menghasilkan piruvat de karboksilase untuk mereduksi senyawa CO2 menjadi etanol. Metabolisme glukosa dalam kondisi anaerob oleh mikrobia melalui Embden-MeyerhafParnas. Kemudian pseudomonas melalui reaksi Entner Doudoroff mendegradasi menjad i etil alkohol. Leuconostoc mesenteraides melalui fermentasi glukosa menjadi asa m laktat. Banyak fermentasi lain yang dilakukan oleh mikrobia sesuai sifat khara kteristik masing-masing. Tujuan Instruksional Khusus Mahasiswa setelah mempelajari dasar-dasar fermentasi dan biokimianya mampu menje laskan tahapan fermentasi, asam piruvat, suatu kunci utama dalam fermentasi karb ohidrat, mengetahui urutan reaksi Heksosa Di Phosphat (DHP), Heksosa Mono Phosph at (HMP). Embden Meyerhaf-Paruas (EMP), Entner Soudoroff.

A. DASAR-DASAR FERMENTASI 1 Dalam fermentasi terdapat hubungan antara pertumbuhan sel, kecepatan per tumbuhan, konsentrasi substrat serta produk akhir. Tipe fermentasi dibedak an atas pertumbuhan mikrobia dan produk : a. Sinonim : produksi protein sel tunggal b. Assosiasi (associated) : fermentasi alkohol asam sitrat, dan asam laktat . c. Non assosiasi (non associated) : fermentasi antibiotik. d. Stepwise : fermentasi antibiotik 2 Mikrobia yang berperanan dalam industri adalah bakteri, fungi, khamir, a lge, dam protozoa. a. Bakteri contohnya : Zymomonus mobilis, Clostridium acetobutylicum, Aceto bacter aceti. b. Fungi contohnya : Aspergillus oryzae, Penicellium notatum, Rhizopus olig osporus c. Khamir contohnya : Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Saccharomyc es pombe. d. Virus perlu dipelajari karena penyebab kontaminasi e. Protozoa penting dalam penangan limbah f. Alge untuk produksi bahan makanan yaitu agar, protein sel tunggal. 3 Peranan mikrobia dalam metabolisme yaitu :

a. Katabolisme : fermentasi alkohol, aseton, butanol dan asam organik b. Anabolisme : fermentasi polisakarida protein, asam nukleat, alkaloid. 4 Peranan ensim dalam fermentasi a. Katalisator ensim dapat mempercepat reaksi kimia 1012 1020 kali dibandin gkan dengan katalisator anorganik. b. Reaksi dengan menggunakan ensim untuk mendapatkan produk melalui degrada si tahap demi tahap. c. Energi yang dihasilkan oleh ensim ditangkap lalu dilepas, tidak seperti katalisator anorganik. d. Ensim dapat menurunkan energi aktivasi reaksi. 5. Fermentasi oleh mikrobia dapat menggunakan substrat dasar karbohidrat da n senyawa nitrogen organik. Macam-macam fermentasi karbohidrat No. Macam Glikolisis Hasil akhir utama 1. Fermentasi alkohol Oleh khamir HDP etanol, CO2 Oleh bakteri EDP etanol, CO2 2. Fermentasi asam laktat 2.1. Homofermentasi HDP asam laktat (Homolaktat) 2.2. Heterofermentasi HMP asam laktat, etanol, (Heterolaktat) asam asetat dan CO2 3. Fermentasi asam propionat HDP asam propionat, asam asetat CO2 4. Fermentasi asam butiran HDP asam butirat,asam asetat, H2 CO2, butanol, etanol, aseton Isopropanol. 5. Fermentasi asam campur HDP etanol, asetat, format, H2, CO2, laktat, suksinat. 6. Fermentasi butanediol HDP butanediol, etanol, laktat, suksinat, asetat, H2, CO2. Peruraian glukosa menjadi asam piruvat dibedakan menjadi 3 jalur : Jalur heksosa difosfat (HDP), yaitu Embden-Meyerhoff-Parras atau glikolisa. Jalur heksosa monfosfat (HMP), yaitu jalur Warburg Dicken, jalur fosfoketolosa, atau jalur pentosa fosfat. Jalur 2 keto-3 deoksi glukonat-6 fosfat (jalur KDGP), atau jalur Entner Doudorof f.

Glukosa Jalur HDP Jalur HMP Jalur KDGP Laktat Piruvat Asetaldehid Glukolasetat Asetoin Astil KoA Asetil KoA Suksinat Propional anol Butadediol Asetat Butirat Etanol Etanol + Format Asetat Aseton H2 CO2 Butanol Prop Asetil KoA + H2 + CO2

Skema berbagai jalur perubahan asam piruvat

6. Tahapan fermentasi a. Pemilihan mikrobia Mikrobia yang dipakai dalam industri akan sangat bermanfaat bila disimpan untuk penggunaan lebih lanjut tanpa mengurangi kemampuan tumbuh dan produksinya. Ada d ua macam kultur yaitu primary culture dan working culture. b. Media fermentasi Media sangat penting dalam fermentasi karena mikrobia mampu tumbuh pada substrat tersebut. Media harus mengandung makronutrien Media fermentasi dapat digolongka n menjadi dua macam yaitu media sintetik dan kompleks. c. Preparasi inokulum Media untuk penyiapan inokulum biasanya berbeda dengan media fermentasi. Media u ntuk inokulum untuk menghasilkan sel mikrobia dalam jumlah besar tanpa terjadi p erubahan sifat genetik sel. Konsentrasi penggunaan 0,5 % sampai 5 % volume, kada ng 10 % - 20 % inokulum yang terlalu sedikit mengakibatkan waktu fermentasi menj adi lama dan produktivitas menurun. d. Kontrol proses fermentasi dan pengunduhan produk akan dibahas pada bab b erikutnya. B. BIOKIMIA FERMENTASI 1 Pada reaksi-reaksi katabolisme-anabolisme ATP dan nikotin adenin di nucl eotide yang tereduksi (NADH) adalah kunci utama dalam fermentasi. 2 Fermentasi terjadi bila produk fermentasi kandungannya lebih rendah dari substrat yang difermentasi. 3 Rumus untuk menyatakan perubahan energi bebas dengan perombakan potensia l bila elektron pindah dari sistem ke sestem lain. Fo = - n F Eo Fo = perubahan energi bebas pada keadaan standard (Cal/mole) n = jumlah elektron yang dipindahkan Fo = Faraday, setara dengan 23,063 Cal/volt Eo = potensial 4 Reaksi-reaksi metabolisme ada dua yaitu a. Proses disimilasi (katabolisme) dapat menghasilkan hasil antara dan ener gi oleh mikrobia. b. Proses asimilasi (biosintesa/anabolisme) atau reaksi yang dapat mensinte sa konstituen-konstituen sel dan produk akhir lainnya sesuai sifat mikrobia. 5 Reaksi EMP dan Krebs disebut juga reaksi amphibolik. Reaksi amphibolik b erfungsi mengarahkan dan mutlak diperlukan dalam biosintesa. Karena reaksi amphi bolik menghasilkan energi dan senyawa prekursor untuk biosintesa. 6 Pemecahan (metabolisme) karbohidrat oleh mikrobia. a. Fermentasi alkohol oleh khamir (Saccharomyces)

Jalur HDP Glukosa 2 NAD etanol

2 piruvat 2 NAD piruvat dekarboksilasa CO2

2 asetaldehid alkohol dehidrogenasa Skema jalur fermentasi alkohol oleh khamir b.1. Fermentasi asam laktat yaitu homolaktat dan heterolaktat Fermentasi homolaktat mengikuti jalur HDP lalu dengan ensim laktat dehidrogenase , asam piruvat dirubah jadi asam laktat. Fermentasi heterolaktat mengikuti jalur HMP. Asetilfosfat diubah menjadi asetil KoA. Oleh ensim asetaldehida dehidrogenasa dan alkohol. Dehidrogenase akan dihasilkan alkohol. Piruvat oleh ensim laktat dihdrogenase di rubah menjadi asam laktat.

3. Fermentasi asam laktat oleh Bibidolac ferium bifidum. Bakteri ini mempun yai ensim fruktosa 6-fosfat fosfo ketolase dan xilulosa-5-fosfat fosfoketolase y ang menghasilkan asetil fosfat. Asetil fosfat akan dirubah menjadi asetat dengan bantuan asetat kinasa. c. Fermentasi asam propionat Bakteri asam propionat menghasilkan asam propionat dari karbonat, lalu hasil lai nnya asam asetat dan CO2 Contoh bakteri asam propionat: Propionibacterium, Clostridium propionicum, Pept ostreptococcus elsdeni. d. Fermentasi asam butirat Bakteri asam butirat antara lain Clostridium, Butyrivibrio, Eubacterium, Fusobac terium. Selain asam butirat dihasilkan pula asetat, aseton, isopropanol, butanol CO2 dan H2. e. Fermentasi asam campur butanediol Fermentasi asam campur dilakukan oleh jenis : Jenis Enterobacterioceae, genus Escherichia, Salmonella dan Shigella. Hasilnya a sam laktat, asetat, suksinat dan formiat, CO2, H2 dan etanol. Pada fermentasi butanediol, asam-asam organik yang dihasilkan sedikit , lebih banyak CO2, etanol dan menghasilkan senyawa khusus 2,3 butanediol. Bakte ri yang berperanan: Enterobacter seratia dan Erwinia f. Fermentasi senyawa nitrogen organik, dibagi menjadi 3 macam : 1. Fermentsi asam amino tunggal 2. Fermentasi sepasang amino (reaksi stickland) 3. Fermentasi senyawa nitrogen heterosiklik Bakteri yang berperanan Clostridium. Contoh fermentasi glisin, treonin, glutamat , lisin dan sebagainya. Fermentasi senyawa N-heterosiklik dapat dilakukan oleh jenis bakteri Clostridium acidi-urici dan Cl. Cylindrosporum. Kedua bakteri ini memfermentasi guanin, hipoxantin, urat dan xantin. Latihan soal. 1. Sebutkan faktor-faktor yang mempengaruhi fermentasi. Jelaskan salah satu faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan mikrobia. 2. Bedakan antara isolasi metoda crawded plate technique, auxonography dan enrichment culture ! 3. Beri contoh lima macam senyawa unsur yang tergolong dalam makronutrien , mikro, mesonutrien dan mikronutrien. 4. Jelaskan fungsi dan sumber nitrogen organik dan anorganik bagi pertumbuh an mikrobia. 5. Mengapa dalam suatu fermentasi antibiotik perlu ditambah prekursor.

Pokok Bahasan III PERTUMBUHAN MIKROBIA DALAM BIOREAKTOR Deskripsi Singkat Pertumbuhan mikrobia adalah peningkatan semua komponen sel, sehingga menghasilka n peningkatan ukuran sel dan jumlah sel (kecuali mikrobia yang berbentuk filamen ) akan menyebabkan peningkatan jumlah individu didalam populasi. Pertmbuhan mikrobia dalam bioreaktor terjadi secara pertumbuhan individu sel dan pertumbuhan populasi pertumbuhan individu sel meliputi peningkatan substansi da n komponen sel, peningkatan ukuran sel serta pembelahan sel. Sedang pertumbuhan populasi meliputi peningkatan jumlah akibat pembelahan sel dan peningkatan aktiv itas sel yang melibatkan sintesa ensim. Dalam pertumbuhan mikrobia juga terlibat proses metabolik yaitu mulai dari trans port nutrien dari medium kedalam sel, konversi bahan nutrien menjadi energi dan konstituen sel, replikasi kromosom, peningkatan ukuran dan masa sel serta pembel

ahan sel secara biner yang terjadi pula pewarisan genetik (genom turunan) ke sel anakan. Dalam bab ini akan dibahas tentang kinetik pertumbuhan mikrobia dalam sistim sek ali unduh, kontinyu dan kultur terputus, studi kinetika pertumbuhan dan fermenta si diperlukan sebagai dasar untuk memahami setiap proses fermentasi. Kinetika pe rtumbuhan mikrobia terutama menguraikan tentang kecepatan produksi sel (biomasa) dan pengaruh lingkungan terhadap kecepatannya. Pengamatan pertumbuhan mikrobia tidak cukup untuk mengetahui apakah biakan tumbuh atau tidak (pengamatan kuantit atif) tetapi juga diperlukan pengamatan yang bersifat kualitatif dari studi kine tika pertumbuhan. Pengukuran pertumbuhan secara kuantitatif disajikan dalam bentuk kurva yang menu njukkan hubungan antara waktu dan jumlah biomasa. Data pengamatan pertumbuhan mi krobia perlu diamati parameter-parameter seperti: 1 Kecepatan pertumbuhan (specific growth rate) 2 Waktu mengganda (doubling time) 3 Hasil pertumbuhan (growth yield) 4 Kemampuan metabolime (metabolic quosient) 5 Affinitas substrat 6 Jumlah maksimum biomasa Kinetika untuk pertumbuhan mikrobia pembentuk koloni, filamen maupun imobilisasi sel memiliki kinetika pertumbuhan yang lebih kompleks. Tujuan Instruksional khusus Setelah mahasiswa mempelajari pokok bahasan tentang pertumbuhan mikrobia dalam b ioreaktor, maka mahasiswa mampu mengethui pertumbuhan dan menerapkan sistem pert umbuhan serta kinetikanya pada sistim sekali unduh, continue dan fedbatch cultur e. Apakah yang dimaksud pertumbuhan untuk mikrobia ? Definisi umum : peningkatan semua komponen di dalam sel sehingga menghasilkan su atu peningkatan ukuran sel dan pembelahan sel (kecuali mikrobia yang membentuk f ilamen) sehingga terjadi peningkatan jumlah individu di dalam populasi. Pertumbuhan mikrobia di dalam bioreaktor : 1 Pertumbuhan individu sel : a. Peningkatan substansi dan komponen sel b. Peningkatan ukuran sel c. Pembelahan sel 2 Pertumbuhan populasi a. Peningkatan jumlah akibat pembelahan sel b. Peningkatan aktivitas sel yang melibatkan sintesis ensim Bagaimana mekanisme terjadinya pertumbuhan mikrobia ? Reproduksi sel bakteri : 1. Pembelahan biner : proses pembelahan sel menjadi dua sel anakan yang mem punyai ukuran hampir sama. 2. Melibatkan 3 proses : a. Peningkatan ukuran sel (pemanjangan sel): memerlukan pertumbuhan dinding sel, yaitu untuk menutup permukaan pada sisi tertentu. Streptococcus sp Escherichia coli

b. Replika DNA: indikasi pertumbuhan awal pada sel bakteri. c. Pembelahan sel: diawali dengan invaginasi lapisan di bagian tengah sel H ampir semua bakteri menerima DNA. Proses metabolik apa yang terlibat dalam pertumbuhan ? 1 Transportasi nutrien dari medium ke dalam sel 2 Konversi bahan nutrien sehingga menjadi tenaga dan konstituen sel 3 Replikasi kromosom 4 Peningkatan ukuran dan masa sel 5 Pembelahan sel secara biner yang dibarengi dengan pewarisan genetik (gen

om turunan) ke sel anakan. KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBIA Pertumbuhan mikrobia (Prokariota) 1 Sel prokariotik membelah secara biner: 1 2 4 8 16 32 64 n. 2 Pembelahan sel dinyatakan sebagai fungsi 2: 21 22 23 24 25 26 2n 3 Apabila jumlah sel setelah waktu tertentu = Nt, maka Nt = 1 x 2n jumlah total sel tergantung pada jumlah generasi (pembelahan) yang terjadi didalam waktu tertentu. 4 Apabila jumlah sel awal = N0, jumlah sel dalam populasi dapat dinyatakan sebagai berikut : Nt = N0 x 2n 5 Jumlah total sel dalam populasi = Nt yang merupakan fungsi dari 2, dapat lebih mudah diplot dengan nilai logaritmiknya, sehingga diperoleh garis ekspone nsial. Didalam praktek digunakan angka dasar 10 log Nt = log N0 + n log2 log Nt - log N0 n = ------------------log 2 Kecepatan pembelahan sel : k n/t ---log 2 (t) log Nt - log N0 k = -----------------0.301 t Kecepatan tumbuh suatu bakteri biasanya dinyatakan sebagai jumlah generasi per s atuan waktu atau generasi per jam. 6 Waktu generasi (g) adalah waktu yang diperlukan sel didalam suatu popula si untuk membelah diri. Pada umumnya berlangsung konstan dan relatif singkat (me nit). log Nt - log N0 log (2N0) - log N0 0.6931 k = ------------------ = ---------------------- = ---------g = t/n = 1/k 0.301 g 0.301 x g g Cara-cara penentuan pertumbuhan : 1 Menentukan jumlah dalam suatu populasi : a. Dengan plating menggunakan medium yang sesuai, diperoleh : jumlah x m l-1 b. Menghitung secara langsung dengan pengecatan sederhana : jumlah x ml-1 2 Mengukur kerapatan/densitas a. Kerapatan optik dngan spektrofotometer (Absorbansi 450-660 nm) b. Berat kering melalui flitrasi kultur dengan filter (0.20 m): mg berat ker ing x ml-1 Beberapa parameter yang harus ditentukan didalam penentuan pertumbuhan kultur : 1 Jumlah generasi (n) 2 Kecepatan membelah sel (jumlah jam-1) 3 Waktu generasi rata-rata (jam) Pengukuran pertumbuhan berdsarkan masa bakteri 1 Secara langsung : a. Biomasa berdasarkan berat kering (g l-1) dengan melalui sentrifugasi k log Nt - log N0 = ---------------

b. Aktivitas metabolik atau ensim, melalui analisis : Kandungan N total di dalam kultur dengan teknik mikro Kjeldhal (g l-1) Kandungan C di dalam kultur dengan menggunakan fenol-sulfat (g l-1) Kandungan protein dengan metoda Lowry Kandungan asam nukleat 2 Pengukuran pertumbuhan secara tidak langsung berdasarkan aktivitas metab olik : a. Keperluan oksigen untuk pertumbuhan b. CO2 yang dilepaskan dan asam organik yang terbentuk c. Kekeruhan kultur bakteri Pengukuran parameter pertumbuhan dikerjakan dengan interval waktu sesingkat mung kin sehingga dapat dideteksi pertumbuhan eksponensial Pengaruh kecepatan pertumbuhan pada fisiologi sel 1 Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan semakin tinggi biomasa 2 Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan sel-sel menjadi lebih besar dan men gandung komponen lebih banyak, antara lain: DNA, RNA dan protein 3 Konsentrasi makromolekul meningkat 4 RNA relatif lebih banyak dibanding dengan makromolekul lain, karena ribo som meningkat jumlahnya. 5 Semakin tinggi kecepatan pertumbuhan sel semakin tinggi jumlah DNA Fase-fase pertumbuhan mikrobia 1 Penentuan fase-fase pertumbuhan dapat dikerjakan dengan menumbuhkan kult ur bakteri dengan jumlah tertentu ke medium baru. Pertumbuhan dipantau dengan pe ngukuran konsentrasi sel pada interval waktu tertentu (jam). Perubahan konsentra si sel pada waktu tertentu dapat diplot menjadi kurva pertumbuhan. 2 Pengukuran pertumbuhan dilakukan dengan menggunakan sistem tertentu, ant ara lain kultur sekali unduh (batch culture), kultur berkesinambungan (contuous culture), dan kultur terputus (fed-batch culture). PERTUMBUHAN KULTUR BAKTERI 1 Dengan menggunakan sistem pemeliharaan khusus : a. Kultur sekali unduh (batch culture) b. Kultur berkesinambungan (contuous culture) c. Kultur terputus (fed-batch culture). 2 Memerlukan kultur murni 3 Medium yang tepat 4 Bejana untuk berlangsungnya pertumbuhan yang disebut bioreaktor. Kultur sekali unduh (batch culture) 1 Merupakan sistem tertutup 2 Medium segar yang berupa nutrien dengan jumlah tertentu diinokulasi deng an bakteri yang telah diketahui jumlahnya. 3 Nutrien akan habis dan terjadi akumulasi hasil akhir 4 Untuk mempelajari beberapa parameter pertumbuhan, dan faktor lingkungan yang mempengaruhi pertumbuhan 5 Untuk produksi biomasa, metabolit primer dan metabolit sekunder 6 Kultur akan tumbuh melalui beberapa fase a. Setelah inokulasi terdapat suatu waktu dimana tidak tampak adanya pertum buhan. Fase tersebut adalah fase lag yang merupakan waktu beradaptasi. b. Di dalam proses komersial lama fase lag diusahakan sependek mungkin, yai tu dengan menyiapkan inokulum yang sesuai dan sehat c. Fase berikutnya terjadi peningkatan kecepatan pertumbuhan, sel tumbuh ko nstan dan mencapai kecemapat maksimum. Fase ini adalah fase eksponensial. x d. Persamaan untuk fase eksponensial adalah dx/dt = Dimana x : konsentrasi biomasa mikrobia t : waktu (jam) : kecepatan pertumbuhan spesifik (perjam = jam-1) e. Dalam integrasi maka : xt = xo e t

f.

Bila digunakan log normal :

ln xt = ln xo +

t

7 Selama fase eksponensial akan dicapai kecepatan pertumbuhan maksimum ( max ). kecepatan pertumbuhan maksimum sangat spesifik untuk masing-masing jenis mikr obia. Misal aspegillus nidulans mempunyai max = 0,36; Methylomonas methyanolytic a max = 0,53. 8 Mikrobia tumbuh mengkonsumsi makanan dan mengekskresikan hasil akhir. Ha sil akhir yang terbentuk dapat mempengaruhi pertumbuhan mikrobia. 9 Suatu saat pertumbuhan akan berhenti dan bahkan mati. Berhentinya pertum buhan disebabkan karena : a. Kekurangan makanan yang tersedia di dalam medium. b. Terjadi akumulasi produk yang bersifat ototoksik terhadap jasadnya. c. Kombinasi keadaan tersebut diatas. 10 Untuk mengetahui berapa banyak substrat pertumbuhan diperlukan, dapat di lakukan percobaan pertumbuhan mikrobia dengan menggunakan konsentrasi substrat y ang berbeda, hasilnya dapat dinyatakan dalam pesamaan sebagai berikut : x = Y (S 0 St) x : konsentrasi biomasa yang dihasilkan, Y : faktor hasil S0 : konsentrasi substrat awal St : substrat tersisa 11 Penurunan kecepatan pertumbuhan dan berhentinya pertumbuhan yang disebab kan karena kekurangan substrat, maka dapat diamati hubungan antara dan substrat yang tersisa di dalam medium yaitu melalui persamaan Monod (1942) sebagai beriku t : 12 St : konsentrasi substrat tersisa Ks : konsentrasi substrat ketika = max Ks biasanya digunakan untuk mengukur afinitas atau spesifikasi substrat a. Kalau nilai Ks rendah artinya bahwa mikrobia tersebut mempunyai afinita s tinggi untuk substrat pertumbuhannya maka kecepatan pertumbuhan tidak terpenga ruh oleh kurangnya substrat b. Kalau nilai Ks tinggi maka mikrobia tersebut mempunyai afinitas rendah untuk substratnya, artinya kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh konsen trasi substrat yang relatif tinggi. Kecepatan pertumbuhannya rendah. 13 Fase stasioner pada kultur sekali unduh merupakan titik dimana kecepatan pertumbuhan turun menjadi nol. 14 Menurut Bull (1974): fase stasioner merupakan istilah yang salah karena pada fase ini populasi mikrobia tetap aktif melakukan metabolisme dan aktif meng hasilkan metabolit sekunder. Maka fase ini dapat dikatakan sebagai fase populasi maksimum. 15 Beberapa contoh metabolit sekunder : Asam giberelat. 16 Berdasarkan tipe produk metabolisme yang dihasilkan selama pertumbuhan, dikenal dua tipe metabolit : a. Metabolit primer (ensim, asam organik dan alkohol) dihasilkan pada fase eksponensial (trofofase). b. Metablit sekunder yang dihasilkan selama fase stasioner atau fase idiofa se. 17 Kinetika pembentukan hasil akhir (produk) oleh kultur mikrobia yang dihu bungkan dengan pertumbuhan : dp/dt = qpx ..(1) p : konsentrasi produk qp : kecepatan spesifik pembentukan produk 18 Hubungan antara pembentukan produk dan produksi biomasa, dapat dinyataka n persamaan : dp/dx = Yp/x Yp/x : produk yang dihasilkan setelah mengkonsumsi substrat 19 Kalau dp/dx = Yp/x dikalikan dx/dt = x dp/dt = Yp/x . x (2) 20 Gabungan antara (1) dan (2) : qp = Yp/x. 21 Persamaan di atas dapat dilihat bahwa kecepatan pertumbuhan erat hubunga nnya dengan kecepatan spesifik pembentukan produk.

Persyaratan yang harus diperhatikan di dalam kultur sekali unduh : a. Kondisi kultur harus steril sehingga tercapai produksi biomasa yang maks imum b. Memperpendek fase lag dan memperpanjang waktu eksponensial: diaplikasika n untuk produksi metabolit primer. c. Memperpendek fase eksponensial: digunakan untuk produksi metabolit sekun der. d. Fermentasi sekali unduh telah digunakan untuk : Produksi biomasa : kondisi kultur yang mendukung populasi sel maksimum. Produksi metabolit sekunder: memerlukan kondisi untukmempercepat tercapainya fas e stasioner. Kultur berkesinambungan (cotinuous culture) 1. Penambahan media baru untuk memperpanjang fase eksponensial 2. Penambahan substrat yang terus menerus dengan kecepatan alir tertentu se hingga mencapai keadaan tunak steady state yang artinya pembentukan sel seimbang dengan terlepasnya sel keluar fermentor. 3. Alat turbidostat : sistem yang dilengkapi dengan pengukur turbiditas, si gnal listrik yang digunakan untuk mengatur aliran media segar kedalam bejana fer mentasi. 4. Aliran medium masuk ke dalam fermentor secara berkesinambungan dengan ke cepatan tertentu, maka segera tercapai keadaan tunak (steady state), yaitu keada an dimana pembentukan biomasa baru seimbang dengan hilangnya sel-sel yang keluar fermentor. Aliran medium tersebut erat hubungannya dengan volume fermentor, seh ingga menimbulkan kecepatan pengenceran (D): F : kecepatan alir D = F / V V : isi fermentor D : kecepatan alir medium 5. Alat kemostat: alat yang digunakan untuk mengukur pertumbuhan yang dilen gkapi dengan bejana penyimpan media, dialirkan dengan kecepatan tertentu, sehing ga tidak terjadi akumulasi hasil akhir. Bahkan kemungkinan terjadi pengenceran d an menyebabkan sel terbuang keluar (washed out). Kecepatan pertumbuhan populasi bakteri di dalam kemostat dapat diformulasikan sebagai berikut : dx --- = pertumbuhan yang keluar dt dx/dt = X ( D) (3) D : kecepatan pengenceran Pada kondisi tunak (steady state) : dx/dt = 0 X = DX atau = D Kecepatan terlepasnya sel (washed out) sama dengan kecepatan pertumbuhan, maka k ecepatan pengenceran sama dengan kecepatan tumbuh sel yang ada di dalam kemostat . Hubungan antara waktu generasi dan konsentrasi substrat pembatas pertumbuhan : = max s/Ks +s) digabungkan dengan persamaan (3) dx max s --- = X (---------- - D ) dt Ks + S dx/dt = X DX

(4)

: waktu generasi kultur max : kecepatan pertumbuhan maksimal s : konsentrasi substrat Ks : konstanta konsentrasi substrat pada = max Apabila dihubungkan dengan sisa konsentrasi substrat yang dikonsumsi, maka : dS/ dt = substrat yang masuk substrat yang keluar substrat yang dikonsumsi sel dS/dt = Dsa DS - max x/Y (S/Ks + s) (5) Pada keadaan tunak ; ds/dt atau dx/dt = 0, maka persamaan (4) dan (5) menjadi : S = Ks D / ( max D)

S = konsentrasi sisa substrat X = konsentrasi sel pada kondisi tunak X = Y (So S) Kelebihan kultur berkesinambungan : a. kesereagaman didalam operasionalnya yang berkaitan dengan produktivitas b. mudah dikerjakan dengan otomatik c. mudah terkontaminasi Kultur terputus (Fed-batch culture) 1. Kultur berkesinambungan terputus adalah sekali unduh yang diberi tambaha n makanan secara terus menerus tetapi pengurangan cairan kultur 2. Terjadi peningkatan volume : Xt = Xo + Y (So St) 3. Konsentrasi biomasa akhir yang diproduksi dimana St = 0 maka Xo adalah l ebih kecil dari Xmax : Xmax = Y So Pada keadaan X = Xmax maka segera medium segar ditambahkan sehingga: D < Xmax D = F/(V + Ft) 4. Aplikasi kultur berkesinambungan terputus : a. untuk memelihara kultur aerobik b. untuk menghindarkan kultur dari pengaruh substansi yang toksik di dalam medium Latihan soal untuk pertumbuhan 1. Selama pertumbuhan bakteri dalam kultur sekali unduh, biomasa meningkat dari 2,1 mg berat kering sel per ml dalam waktu 15 menit. Hitung kecepatan tumbu h spesifik bakteri tersebut dan waktu bergandanya. Asumsi apa saja yang harus an da kerjakan untuk menghitung parameter pertumbuhan ? 2. pertumbuhan eksponensial menyebabkan populasi bakteri meningkat dari 4 x 108 sel per ml menjadi 6,25 x 108 sel per ml dalam waktu 30 menit. 1012 sel ek ivalen dengan 2,5 x berat kering sel. Berapa kecepatan tumbuh dan waktu berganda kultur tersebut. 3. medium segar dialirkan secara kontinyu ke dalam kemostat (V = 3,250 L) d engan kecepatan 15 ml per menit. Berapa kecepatan pengenceran yang terjadi di da lam kemostat tersebut dan berapa waktu tinggal dan waktu berganda kultur pada ko ndisi tersebut. 4. Pseudomonas sp ditumbuhkan di dalam kemostat dengan glukosa sebagai subs trat pembatas pertumbuhannya (So = 10 g l-1). Buatlah plot secara teori bakteri tersebut dalam keadaan tunak (steady state). Hitung berapa kecepatan pengenceran nya! Berapa nilai produktivitasnya apabila max = 1 per jam; Ks = 0,1 g.l-1; Y = 0 ,5 g berat kering per g substrat

POKOK BAHASAN IV ISOLASI, SELEKSI DAN PENYIAPAN SERTA PENINGKATAN SIFAT MIKROBIA Deskripsi Singkat Isolasi merupakan salah satu tahapan seleksi mikrobia yang sangat potens ial dalam Industri. Isolat mikrobia yang diperoleh dan bersifat unggul digunakan untuk memproduksi senyawa yang bersifat komersial. Metode isolasi mikrobia dapat menggunakan cara Crowded Plate Technique, Auxonography, dan kultur diperkaya. Penyimpanan kultur hasil isolasi diusahaka n untuk mengurangi terjadinya pengurangan sifat genetik, mencegah terjadinya kon taminasi serta menjaga viabilitas. Teknik penyimpanan kultur mikrobia melalui cara disimpan pada suhu renda h atau dalam bentuk kering. Penyimpanan mikrobia dalam suhu rendah meliputi peny

impanan dalam media agar miring, spora dalam pasir steril, dalam nitrogen, sedan g penyimpanan dalam kondisi kering, contohnya kultur pasir dan lyophilisasi. Mikrobia yang berperan dalam industri perlu ditingkatkan aktivitas metab olismenya, sebab isolat alami hanya mampu menghasilkan produk dalam jumlah sedik it. Caranya dengan transformasi lisogeni, rekombinasi dan pembuatan mutan auxotr of. Tujuan Instruksional khusus Mahasiswa setelah mempelajari pokok bahasan IV mampu mengisolasi dan sel eksi serta meningkatkan aktifitas mikrobia dan penyimpanannya. 1. Metoda penemuan mikrobia baru Kultur baru dapat diisolasi dari sumber di alam yaitu substrat alami material or ganik, biji-bijian, dan air, tanah, udara. Contoh Penicellium notatum dari konta minan pada media agar yang ditumbuhi Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis da n B. licheniformis penghasil protease alkaline diisolasi dari hippopptatmus buru ng di Copenhagen. 2. Metoda isolasi dari tanah. a. Crowded plate technique untuk mendapatkan isolat jamur penghasil antibio tik dengan cara taburkan jamur diinokulasi bakteri uji (Staphylococcus aureus). b. Auxonography untuk isolasi mikrobia penghasil faktor tumbuh. Tanah yang telah disuspensikan dituang dipermukaan agar yang telah diinokulasi dengan bakte ri auxotrof = (bakteri pengguna faktor tumbuh/vitamin atau asam amino) c. Kultur diperkaya Untuk isolasi mikrobia penghasil ensim dalam media diperkaya dengan esktrak subs trat yang ditumbuhi oleh mikrobia yang akan diisolasi, misal ditambah ekstrak ta nah. 3. Penyimpanan mikrobia yang penting dalam industri Mikrobia komersial adalah sangat penting untuk industri fermentasi, Penyimpanan kultur dengan beberapa cara : a. Penyimpanan dalam nutrien agar miring lalu disimpan dalam refrigerator ( 50 C) atau freeezer (-200 C), kapas dibakar kemudian ditutup dengan mineral oil. b. Penyimpanan spora jamur benang dalam akuades steril disimpan pada suhu 5 0 C, cara ini jarang dipakai. c. Penyimpanan mikrobia dalam nitrogen cair. Mikrobia disimpan dalam freeze r suhu -1500 C sampai -1960 C. d. Penyimpanan mikrobia dalam bentuk dehidrasi 1. Penyimpanan ini digunakan untuk aktinomesetes dengan menumbuhkan dalam m edia, lalu dikeringkan pada suhu kamar selama 2 minggu atau dalam refrigerator. 2. Lyophilisasi (freeze-drying) Penyimpanan mikrobia menggunakan CO2 kering, dalam kondisi vaccum, penyimpanan i ni, kultur ditumbuhkan sampai fase stationer maksimum dan sel dilindungi dalam m edia susu, serum dan sodium glutamat 4. Peningkatan aktivitas mikrobia a. Pembuatan mutan autro dengan dua sistem , yaitu sistem regulasi iso ensi m dan multi valent regulator b. Transformasi buatan dan alami. Bila transformasi buatan, DNA diekstraksi lalu dipindahkan ke media yang ditumbuhi mikrobia resipiennya. Contoh: transfor masin Streptomyces ini dapat mensintesa streptomisin dan chlortetracyclin c. Lisogeni Metode ini dipakai untuk menghasilkan strain baru menggunakan phage. Contoh Stre ptomyces olivaccus penghasil antibiotik, strain baru kemampuan lebih besar dari pada kultur induknya. Contoh lain strain lisogeni mampu menghasilkan tirosin 10 kali lebih besar d. Rekombinasi. Cara reombinasi dari dua spesies mikrobia dapat digunakan untuk membuat rekombin asi baru. Pembuatan rekombinasi baru ini melalui proses seksual. Contoh : Strept omyces rimosus dikombinasi dengan strain penghasil oxitetracyclin.

Latihan soal pokok bahasan IV 1. Jelaskan cara isolasi bakteri dari tanah, sampai mendapatkan biakan murn i? 2. Apakah perbedaan antara crowded plate technique dan Auxonagraphy 3. Pilihlah penyimpanan kultur yang paling murah dan mudah dikerjakan 4. Jelaskan salah satu cara peningkatan kultur mikrobia untuk mendapatkan s train unggul? 5. Apakah yang dimaksud dengan : a. lisogeni b. transformasi c. lyophilisasi

Pokok Bahasan V RANCANG BANGUN BIOREAKTOR Deskripsi singkat Bioreaktor (fermentor) merupakan bejana fermentasi aseptis untuk produks i senyawa oleh mikrobia melalui fermentasi. Kendala yang timbul adalah terjadiny a kontaminasi selama proses fermentasi terutama bila sistemnya berkesinambungan (kontinyu) Bioreaktor dirancang untuk proses fermentasi secara anaerob dan aerob. Apakah si stem sekali unduh berkesinambungan atau nutrien terputus. Fungsi bioreaktor ada lah untuk menghasilkan produk oleh mikrobia baik kultur murni atau campuran, yan g dikendalikan menggunakan sistem komputer dalam mengatur faktor lingkungan dan pertumbuhan serta kebutuhan nutriennya. Rancangan dan kontroksi bioreaktor perlu diperhatikan tentang bejana har us dapat dioperasikan dalam jangka waktu lama, serasi dan afitasi memadai untuk kelangsungan proses metabolik mirkobia, sistem kontrol suhu, pH dan penambahan nutrien, bejana harus dapat dicuci dan disterilisasi fasilitas sampling harus a da konsumsi tenaga serendah mungkin, bahan kontroksi murah dan evaporasi diusaha kan tidak terlalu besar. Macam-macam bioreaktor ada empat yaitu : Bioreaktor tangki adukan (stirred tank bioreaktor), kolum gelembung (Bubble colum bioreaktor), dengan pancaran udara (Airlift bioreaktor) dan bioreaktor ter kemas padat (Packed bed bioreaktor) Tujuan Instruksional khusus Mahasiswa mampu menyeleseikan fungsi bioreaktor dan mengetahui bentuk dan macam bioreaktor serta operasi pengendaliannya. Suatu kebutuhan untuk melangsungkan dan pengembangan proses untuk produk si hasil fermentasi yang melibatkan mikrobia adalah bejana fermentasi yang asept is, disebut FERMENTOR atau BIOREAKTOR Apakah FERMENTOR atau BIOREAKTOR ? Bejana untuk melaksanakan proses industri

Ukuran bervariasi : 5- 10 liter untuk skala laboratorium 10 500 liter untuk skala percobaan 50- 400.000 liter untuk skala industri besar Ukuran bioreaktor tergantung pada : Proses : sekali unduh, berkesinambungan, nutrien terputus. Bagaimana proses yang dioperasikan : pancaran ke bawah (down flow) atan pancaran keatas (up flow) Produk yang diproduksi No. Ukuran fermentor Produk 1. 2. 3. 4. 1 20.000 40 80.000 100 150.000

lebih dari 450.000 Ensim diagnostik, substansi biologi molekuler Ensim dan antibiotik Penisilin, antibiotika aminoglikosida, protease, amilase, transfomasi steroid, a sam amino Asam amino, asam glutamat Proses yang berlangsung selama produksi : proses aerobik, anaerobik. Proses kultur tungal atau kultur campuran Fungsi Dasar Fermentor atau Bioreaktor Suatu tempat yang menyediakan lingkungan yang tepat dan dapat dipantau untuk per tumbuhan dan aktivitas mikrobia atau kultur campuran tertentu untuk menghasilkan produk yang diinginkan. Desain dan konstruksi bioreaktor harus memperhatikan beberapa hal : a. Bejana dapat dioperasikan dalam keadaan aseptis untuk jangka waktu lama. b. Aerasi dan agitasi cukup memadai untuk kelangsungan proses metabolik mik robia. c. Konsumsi tenaga serendah mungkin. d. Sistim kontrol temperatur, pH harus ada. e. Fasilitas untuk sampling harus ada. f. Evaporasi diusahakan tidak terlalu besar. g. Bejana harus dapat dicuci, dibersihkan dan mudah dipelihara, mempunyai g eometri yang sama baik untuk laboratorium maupun skala industri. h. Dikonstruksi dari bahan yang murah. Karakteristik fermenter Fermentor anaerobik memerlukan alat khusus kecuali untuk menghilangkan panas. Fermentor aerobik memerlukan alat untuk mengaduk dan memberikan aerasi cukup. Konstruksi fermentor aerobik Tebuat dari baja anti karat. Berupa silinder besar, tertutup di bagian atas atau bawah, dilengkapi pipa-pipa (Gambar 1). Bagian fermentor terpenting: sistem aerasi berperan dalam transfer oksigen dari bentuk gas ke bentuk cair. Karena oksigen itu tidak mudah larut dalam air, maka perlu agitasi atau pengaduk an atau disebut impeller dan sparger (alat untuk memecah gelembung udara yang ma suk melaluinya) Process control and monitoring meliputi : Pantauan proses : untuk memantau aktivitas mikrobia dalam fermentasi seperti yan g diinginkan. Kontrol : pH, temperatur, masa sel dan konsentrasi produk Kontrol komputer proses fermentasi untuk :

Memperoleh data yang menunjukkan perubahan selama fermentasi. Mengendalikan faktor lingkungan yang harus selalu dipantau Peningkatan kinerja fermentor/bioreaktor (Scale-up) Beberapa aspek mikrobiologi industri adalah perpindahan dari skala laboratorium ke skala industri. Prosedur ini disebut peningkatan proses (scale-up) Mengapa scale up itu sangat penting Karena aktivitas masing-masing mikrobia pada fermentor skala laboratorium itu sa ma Mengapa proses mikrobia berbeda antara skala industri dengan skala laboratoirum? Mengapa pengetahuan scale up sangat esensial? Pengadukan dan oksigen lebih mudah ditangai pada fermenter kecil. Kalau ukuran fermentor ditingkatkan, Maka perbandingan antara permukaan/volume berubah. Bioreaktor besa maka volume meningkat, memberikan area permukaan yng meluas. Fransfer lebih oksigen sukar terjadi. Hampir semua bioreaktor pada umumnya aerobik maka transfer oksigen yang efektif sangat diperlukan. Perlu media yang kaya sehingga terjadi peningkatan biomasa yang perlu oksigen le bih besar. Scale up proses industri merupakan tanggung jawab insinyur biokimia karena merek a ahli dalam transfer oksigen, dinamika cairan, pengadukan dan termodinamika, be kerja sama dengan ahli mikrobiologi industri untuk memastikan semua parameter ya ng diperlukan sehingga menghasilkan proses fermentasi berlangsung dengan baik. Ahli mikrobiologi industri sangat diperlukan dalam scale-up yaitu berperan untuk meningkatkan strain mikrobia yang tepat yang diaplikasikan pada proses skala be sar. Transfer proses dari laboratorium ke bioreaktor skala industri, beberapa tahapan proses yang harus diperhatikan : 1. Tahap percobaan di laboratorium: menunjukkan indikasi fermentasi menarik untuk diaplikasikan ke industri. 2. Percobaan tahap awal di laboratorium untuk optimasi pertumbuhan dan akti vitas mikrobia peningkatan proses, menggunakan fermentor gelas (1-5 liter). Perc obaan di laboratoirum, meliputi menguji berbagai macam media, temperatur, pH, da n sebagainya semurah mungkin (Gambar 1). 3. Tahap percobaan lapangan (pilot plant stage) biasanya menggunakan biorea ktor 300 3.000 liter. Pada tahap ini kondisi mendekati dengan skala industri. 4. Tahap komersial atau industri, menggunakan fermentor 10.000 400.000 lite r. Aerasi dan agitasi Aerasi diperlukan untuk pengadaan oksigen yang cukup demi kelangsungan hidup mik robia yang ditumbuhkan dalam medium cair (kultur tenggelam- submerged culture) Agitasi diperlukan untuk mencampur semua isi bioreaktor sehingga diperoleh kondi si homogen Tipe sistem aerasi dan agitasi sangat tipikal tergantung pada karakteristik pros es fermentatif yang diinginkan. Aerasi dapat diadakan dengan mengalirkan udara s teril melalui aerator, kemudian gelembung udara dibuat sekecil mungkin, sehingga memungkinkan terjadi oksigen udara masuk ke fase cair. Gelembung udara dapat di perkecil melalui alat yang porus disebut sparger. Agitasi selain berfungsi sebag ai pengaduk (agitator) juga dapat berfungsi untuk memecah gelembung yang lewat d i dalam medium. Agitator atau disebut impeller ini khususnya didesign khusus yan g diperlukan untuk fermentor yang digunakan untuk menumbuhkan fungi atau aktinom isetes. Komponen utama struktur fermentor yang diperlukan aerasi dan agitasi : a. Agitator (impeller) b. Pengaduk c. Sistem aerator d. Saringan halus atau penyekat (baffle)

Macam-macam reaktor 1. Bioreaktor tanki adukan (stirres tank bioreactor), udara disirkulasikan melalui medium yang diaduk dengan impeller. 2. Biorekator kolum gelembung (Bubble column bioreactor): udara dialirkan m elalui sparger di dasar bejana. 3. Bioreaktor dengan pancaran udara (Airlift bioreactor): terdiri dari dua kolum yang dimasukkan ke dalam kolum yang lain. Udara dipaksa masuk melewati pip a sehingga udara dapat terpancar keatas dan medium ikut terbawa. 4. Bioreaktor terkemas padat: diisi dengan bahan padatan yang dapat menjari ng mikrobia masuk kedalamnya. Medium dapat dipompakan melalui mikrobia dengan ar ah ke atas atau ke bawah (Gambar 2).

Latihan soal : 1. Mengapa bejana fermentasi disebut dengan fermentor atau bioreaktor 2. Jelaskan perbedaan fermentor aerob dan anaerob 3. Sebutkan faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam merancang fermentasi. 4. Apakah yang dimaksud dengan : a. Scale-up b. Agitasi. c. aseptis

BAB VI. PENGUNDUHAN DAN PURIFIKASI Deskripsi Singkat Ekstraksi dan purifikasi produk fermentasi biasanya sulit dilakukan dan biayanya mahal. Pada kenyataannya salah satu cara untuk mendapatkan produk yang berkualitas tinggi dan cepat diharapkan biayanya murah. Kebanyakan produk fermentasi dihasilkan kedalam media dan ekstraksi dari sel. Pungunduhan produk mikrobia memerlukan biaya sebanyak 20% sampai 605 dari biaya produksi. Pengunduhan produk didasarkan atas beberapa kriteria : produk ek stra selular atau infraseluler, konsentrasi produk dalam media fermentasi, sifat fisik dan kimia produk, kemurnian dalam media, standardisasai permintaan, kegun aan dari produk dan harga produk dipasaran. Tujuan Instruksional Khusus Mahasiswa mampu menjelaskan padatan sel dan buih, presifikasi, sentrifug e, ultrasentrifuge, pemecahan sel, penggunaan solven, kromatografi, penyaringan dan kristalisasi. Produk diekstraksi dari medium dipisahkan dari sel. Berat molekul produk asam laktat dan asam glutamat rendah, seang antibiotik atau ensim konsentrasiny a tinggi. Tapi konsentrasi vitamin B12 rendah, yaitu hanya mgr per liter.

1. Pengunduhan produk ekstraseluler dapat digambarkan sebagai berikut : Kultur fermentasi farksi larut

Produk die ncerkan Sel dan bahan tak larut

Pemurnian PRODUK AK HIR 2. Pengunduhan produk yang tidak larut : Gravitasi ik sentrifugasi flokulasi filtrasi ion elektroelektro foresis osmosis 3. Contoh pengunduhan mikrobia dengan cara sentrifugasi Metode Mikorbia Diameter ( ) Virus, phage Bakteri Khamir Fungi filamentous 0,01 0,1 0,30 3,0 4,00 7,0 10,0 150 Ultrasentrifugasi Normal Normal Normal 4. Flokulasi sangat esensial untuk bir Senyawa flukulan : aluminium sulfat (0,1 0,5 %), CaCl2 (0,1 0,5 %), titanium tet rakloride (0,01 0,02 %), garam alkylamin dan alkylpyridinium digunakan 0,01 % 1,0 %. dialisa elektroabsorpsi dialisa flotasi permukaan Mekanik Penyerapan permukaan Listr

Latihan Soal Pokok Bahasan VI 1. Jelaskan perbedaan antara pengunduhan senyawa ekstraseluler dan intrasel ular? 2. Bagaiman car mendapatkan senyawa metabolit primer supaya mendapatkan pro duk dalam jumlah besar? 3. Jelaskan cara pemisahan biomassa jamur benang dalam memproduksi pinisili n? 4. Jelaskan cara pemisahan produk metabolit secara kimiawi? 5. Apakah yang dimaksud dengan : a. Purifikasi b. Ekstraksi c. Fase idiofase

Pokok Bahasan VII FERMENTASI METABOLIT PRIMER Deskripsi singkat Metabolit primer adalah senyawa yang termasuk produk akhir yang mempunyai berat molekul rendah dan dihasilkan pada fase eksponensial oleh mikrobia . Senyawa metabolit primer di gunakan untuk membentuk makromolekul atau yang dikon versikan menjadi koenzim senyawa antara seperti asam amino nukletida purin, piri mudin, vitamin, asam organik, seperti asam sitrat, asam fumarat, aseton butanol asam asetat dan enzim termasuk metabolit primer. Metabolit primer lainnya adalah yang termasuk senyawa antara pada jalur reaksi Embden Meyerhof, jalur pentosafozfet, dan siklus asam triherboksilat (Sik lus Krebs). Untuk produksi senyawa metabolit primer dipilih mikrobia yang potens ial untuk fermentasi. Tujuan Intruksional khusus Mahasiswa mampu menjelaskan fermentasi metabolit primer misalnya aseton butanol, asam cuka, asam sitrat, etanol, enzim dan vitamin A. Fermentasi Aseton Butanol oleh Bakteri Bakteri yang berperanan dalam fermentasi aseton butanol adalah Clostridium aceto butyricum, Clostridium butyricum. Inokulum Clostridium acetobutyricum jika dipak ai berkali-kali sifatnya menurun, maka diperlukan HEAT SHOCKING. Bahan dasar yang digunakan : padi, tepung tapioka, arabinosa, xylosa Sumber nitrogen yang dibutuhkan : protein, pepton, dan asam amino Kondisi fermentasi ; suhu optimum 37o C, anaerob, pH 4,7-8, konsentrasi bahan da sar 3 10 %. Produk akhir : fermentasi aseton butanol dari glukosa menghasilkan n-butanol 8 b agian, 3 bagian aseton dan 1 bagian etanol. Bila menggunakan xylosa, sukrosa, da n lefulosa sama hasilnya dengan glukosa. Sedang bila bahan dasarnya arabinosa ak an menghasilkan rasio butanol : aseton : etanol = 5 : 4 : 1

B. Fermentasi Asam Cuka Kata vinegar (cuka) berasal dari istilah Perancis vinaigre yang berarti anggur a sam. Menurut Food and Drugs Administration di Amerika Serikat, cuka, cuka sari b uah apel, cuka apel, dibuat melalui fermentasi alkoholik sari buah apel diikuti fermentasi asetat (Pelczar and Chan, 1988). Sedangkan menurut Frazier (1976), cu ka didefinisikan sebagai bumbu yang dibuat dari bahan yang mengandung pati atau gula dengan fermentasi alkohol diikuti oksidasi asetat. A. Bahan dasar Ada bermacam-macam cuka, perbedaannya terutama terletak pada bahan yang dipakai dalam fermentasi alkohol, seperti macam sari buah, sirop, dan bahan yang mengand ung pati yang dihidrolisis. Bermacam-macam bahan yang dapat dibuat menjadi cuka diantaranya adalah : 1. Sari buah-buahan, misalnya apel, anggur, jeruk, dan sebagainya. 2. Sayur-sayuran yang mengandung pati, misalnya kentang atau kentang . manis, yang mana pati harus dihidrolisis menjadi gula lebih dahulu. 3. Biji-bijian gandum, seperti barley, gandum hitam, jagung, dan gandum. 4. Minuman keras atau alkohol, misalnya dari bir, atau dari etil alkohol . . yang berubah sifat. B. Mikrobia yang berperan Mikrobia yang berperan dalam proses pembuatan cuka adalah khamir dan bakteri. Kh amir yang berperan adalah Saccharomyces cerevisiae Var. ellipsoideus. Sedangkan bakteri yang berperanan adalah dari genus Acetobacter (familia Pseudomonadaceae) dan genus Bacterium. Beberapa spesies Acetobacter diantaranya adalah : Acetobac ter aceti, A. rancens, A. xylinum. Bacterium yang ditemukan adalah : Bacterium s chentzenbachii, B. curvum, dan B. orleanense 1.Proses pembuatan Pada proses pembuatan cuka terjadi 2 macam perubahan biokimiawi, yaitu : 1. Fermentasi gula menjadi etil alkohol, dan 2. Oksidasi alkohol menjadi asam asetat Tahap pertama adalah proses anaerobik yang dilakukan khamir dan menghasilkan alk ohol Reaksi : C6H12O6 2 CO2 + 2 C2H5OH Glukosa alkohol Pada proses ini sejumlah kecil produk lain dihasilkan, seperti gliserol dan asam asetat. Juga ada sejumlah kecil substansi lain, dihasilkan dari senyawa selain gula, termasuk asam suksinat dan amil alkohol. Alkohol yang dihasilkan pada proses pertama digunakan sebagai sumber energi bagi bakteri, yang kemudian mengoksidasinya menjadi asam asetat. Bakteri ini menggun akan substansi lain dalam cairan yang difermentasi sebagai makanan. Reaksi yang merupakan reaksi aerob ini dapat dituliskan sebagai berikut : C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O Alkohol asam asetat Asetaldehid adalah senyawa intermedier dalam reaksi ini. Di antara produk akhirn ya adalah sejumlah kecil aldehid, ester, aseton, dan sebagainya. Bau cuka yang sedap berasal dari adanya bermacam-macam ester seperti etil asetat , dari alkohol, gula, gliserin dan minyak menguap yang dihasilkan dalam julah ke cil oleh aksi mikrobia. Bau ni dapat juga berasal dari sari buah-buahan yang dif ermentasi, gandum, atau cairan bersifat alkohol lainnya, dari mana cuka dibuat. Metode pembuatan cuka dapat dibedakan menjadi metode lambat seperti yang dikerja kan di rumah, atau metode let alone, metode Perancis atau Orleans, dan metode ce pat, seperti proses pembuatan dengan genera atau prosedur fogging. Pada metode l ambat, cairan alkohol tidak bergerak selama asetifikasi, sedangkan pada metode c epat, cairan alkohol bergerak. Metode lambat menggunakan sari buah-buahan yang d ifermentasi atau cairan gandum untuk menghasilkan asam asetat. Sedangkan metode cepat kebanyakan untuk menghasilkan cuka dari minuman keras (alkohol). Cairan ga ndum atau buah disediakan untuk makanan bakteri cuka, tetapi untuk memelihara ba kteri cuka aktif dalam metode cepat menggunakan alkohol, ditambah dengan vinegar food, yang merupakan kombinasi senyawa organik dan anorganik.

Prosentase cuka dinyatakan dalam grain, yaitu 10 kali jumlah gram asam asetat pe r 100 ml cuka. Jadi cuka 40 grain mengandung 4 gram asam asetat per 100 ml cuka pada suhu 200 C. 3.Penyebab kerusakan cuka Logam dan garam-garamnya menyebabkan kekeruhan dan perubahan warna cuka. Kerusak an yang disebabkan mikroorganisme dapat menyebabkan rendahnya mutu bahan dari ma na cuka dibuat atau rendahnya mutu cuku itu sendiri. Spesies Lactobacillus dan L euconostoc dalam sari buah-buahan tidak hanya bertanggung jawab pada rasa tidak enak, tetapi juga menghasilkan asam asetat yang cukup mengganggu fermentasi alko hol oleh khamir. Pada keadaan anaerob, bakteri asam butirat menghasilkan asam ya ng tidak diinginkan. Kesulitan ini dapat dikurangi dengan penambahan sulfur diok sida pada sari buah, tetapi kemikalia ini menghambat bakteri cuka. Kerusakan cuka diantaranya adalah rusaknya asam asetat pada produk. Lapisan tipi s bakteri pada proses pembuatan cuka mengurangi kecepatan asetifikasi. Oksidasi asam asetat dalam cuka menjadi karbondioksida dan air dapat ditimbulkan oleh bak teri asam asetat sendiri selama proses pembuatan cuka jika kekurangan alkohol at au aerasinya berlebihan. Organisme lain yang dapat mengoksidasi asam asetat pada keadaan aerob adalah lapisan khamir, jamur benang dan algae.

5.Fermentasi Asam Sitrat oleh Jamur Benang Asam sitrat dihasilkan oleh Penicillium luteum, Mucor puriformis, Aspergillus ni ger. Faktor yang menentukan dalam fermentasi asam nitrat : 6. Sumber C 2.Garam organik 3. Perbandingan permukaan dengan volume medium 4.pH, suhu, dan oksigen 5.Organisme Ad. 1. Senyawa organik yang mempunyai senyawa atom C 2,3,4,5,6,7, dan 12. Banyak digunakan sukrosa, fruktosa, laktosa, dan glukosa. Konsentrasi gula 14 20 %. Ad. 2. Garam organik setiap liter memerlukan NH4NO3: 2 2,5 gram, KH2PO4: 0,75 1, 0 gram, MgSO4 7H2O: 0,2 0,25 gram, HCl 5 N sebanyak 5 cc, pH 3,4 -3,5. Ad. 3. Perbandingan permukaan dan volume. Apabila volume media besar kemudian permukaannya dalam asam sitrat yang terbentu klambat, sedang bila permukaan luas akan terbentuk asam sitrat lebih cepat. Ad. 4. Persediaan oksigen Oksigen dibutuhkan untuk pertumbuhan jamur Aspergillus niger, Aspergillus wentii . Erlenmeyer diberi oksigen 15 ml per menit. Suhu digunakan 25 350 C. Lama ferme ntasi 7 10 hari. Produk diambil dengan menambahkan Ca, lalu Ca sitrat diendapkan dngan asam sulfat, lalu asam sitrat dipisahkan dari kalsium sulfat. 5. Aktivitas Khamir dalam Fermentasi Minuman beralkohol Pendahuluan Hampir sebagian besar industri minuman beralkohol menggunakan produk pertanian s ebagai bahan mentah dan khamir yang mengkonversikan menjadi minuman. Semua bahan organik yang terkandung dalam produk pertanian khususnya buah-buahan demikian a da beberapa aktivitas khamir yang tidak diinginkan karena khamir tersebut sebaga i agen pembusuk buah. Proses akibat aktivitas khamir yang telah lama dikenal ada lah fermentasi bir dan minuman anggur (wine). Proses tersebut melibatkan khamir yang secara alami banyak terdapat dalam buah-buahan atau biji-bijian yaitu genus Saccharomyces. Beberapa jenis khamir yang terlibat dalam fermentasi minuman ber alkohol tercantum pada tabel 1 Tabel 1. Fermentasi yang dilakukan oleh khamir Produk fermentasi Mikrobia Bir Anggur (wine) Cider

Sake dari beras Tuak Madu difermentasikan Tape Kumiss dari susu (Rusia) Kecap Miso dari kedelai dan beras Saccharomyces carlbegensi dan S. cerevisieae Saccharomyces cerevisieae var. ellipsoides Saccharomyces cerevisieae var. ellipsoides Saccharomyces sake dan Aspergillus Saccharomyces cerevisieae dan Schyzosacharomyces Saccharomyces cerevisieae Saccharomyces cerevisieae, Candida tropicalis dan Pediococcus Saccharomyces cerevisieae, Lactobacillus Saccharomyces dan Aspergilllus oryzae Saccharomyces rouxii, Aspergilllus oryzae Fermentasi bir Minuman fermentasi yang tertua adalah bir : Pada tahun 4000 SM bir dibuat dari : Gandum (barley), padi-padian atau bijian yang lain, yang diolah menjadi roti, ke mudian dihancurkan disuspensikan dengan air dan difermentasikan. Rasanya ada yang manis dan ada yang masam. Sebelum tahun 700, bir dibuat dari : Biji-bijian tanpa ditambah hop (bunga) sehingga rasanya berbeda dengan bir sekar ang Ditambah rempah-rempah. Pada abad ke 15, bir telah menggunakan hop Sekarang bir terbuat dari : Kecambah gandum (malt), tepung beras atau jagung, air, hop. Difermentasikan dengan menggunakan khamir Mekanisme proses fermentasi bir tersbut : Pati dari kecambah gandum, beras atau jagung dikonversikan menjadi maltosa dan d ekstrin yang dibantu oleh ensim yang terdapat dalam kecambah gandum. Campuran karbohidrat yang diperoleh tersebut dalam bentuk larutan yang disebut w orl, direbus bersama-sama dengan hop, didinginkan Difermentasikan menjadi bir yang beralkohol, CO2 dan sisa-sisa dekstrin. Bir telah jadi mengandung : a. Air, dekstrin, alkohol dan CO2 b. Gula-gula yang tak dapat difermentasikan, protein dan senyawa aromatik y ang berasal dari resin hop c. Dan hasil samping minyak fussel Proses-proses penting dalam pembuatan bir : 1. Malting : perkecambahan barley di rumah kecambah gandum (Malthouse)

(Gambar 1).

Sampai 3 hari ditapis 5 sampai 7 hari

dengan 45 % air 00 C untuk malt encer (agak . jernih) 50 C untuk malt kental dengan 3-4 % air

KE TEMPAT FERMENTASI Kecambah gandum berisi : Ensim yang merombak pati dari malt itu sendiri dan pati-pati yang ditambahkan (b eras atau jagung) Sumber protein bir yang penting artinya untuk pembentukan buih Memberikan aroma yang tipikal 3. Proses perkecambahan barley a. Barley dicuci, direndam ari sehingga memungkinkan baley berkecambah b. Air ditapis c. Perkecambahan dilanjutkan sampai 5 atau 7 hari d. Selama perkecambahan, -amilase, dan terbtnuk ensim baru yaitu - mil se e. - mil se berperan menyerang pati yang ada disekitarnya, hanya menyerang p ada (rantai C yang laurus) dan tidak mampu menyerang rantai C yang bercabang (am ilodekstrin). - mil se berperan dalam pembentukan gula akhir. f. Ensim lain yaitu : Protease meningkatkan ke larutan protein Sitase yang mendegradasikan beberapa gum pentosan Filase yang melepaskan gugus fosfat dan inositol 4. Pemasakan atau pemanasan a. Selama pemanasan sering timbul reaksi pencoklatan (browning) karena mela noidin meningkat b. Melanoidin sangat penting untuk memberi warna dan aroma yang khas. 5. Komposisi bir : alkohol 3,8 % - 5 % Dekstrin 4,3 % Protein 0,3 % Abu 0,3 % dan CO2 6. Mikrobiologi brewing a. Khamir sangat menentukan kualitas bir: memberikan aroma dan sejumlah oli gosakarida yang tidak terfermentasikan. b. Pada bir lager menggunakan S. carlsbergensis yang mampu memfermentasikan melibiosa dan gas; sedangkan S. cerevisieae tidak mampu memfermentasikan melibi osa. c. Selama proses fermentasi gula dikonversikan menjadi alkohol, CO2 dan sed ikit gliserol, serta asam asetat dari hasil fermentasi karbohidrat yang lain. Pr otein dan lipid yang terkandung di dalam wort sebagian difermentasikan menjadi a lkohol, asam dan ester yang memberikan aroma yang khas. Bir yang dihasilkan berw arna hijau, maka perlu pemeraman lebih lanjut (aging) d. Selama aging protein, khamir dan resin dipresipitasikan sehingga beir me njadi masak dan jernih dengan aroma yang lembut. Bir tersebut diunduh dengan mel alui penyaringan, kemudian diinjeksi dengan CO2 agar terbentuk buih-buih (sparkl ing). Pada umumnya CO2 yang terbentuk selama fermentasi ditampung ke dalam bejan a yang kemudian diijeksikan kembali setelah proses akhir. Kandungan CO2 di dalam bir sekitar 0,45 % - 0,5 %. Beberapa industri bir sering menambah sedikit gula kedalam masing-masing botol untuk mempertahankan proses fermentasi tetap berlang sung. e. Proses terakhir adalah bottling dan pasteurisasi sekitar 60-65 0C kemudi an disaring. 2.

f.

Mengapa tidak banyak mikrobia mengkontaminasi bir : Khamir menggunakan O2 dengan cepat dan menghasilkan CO2 Hop mengandung -resin dan humulon yaitu senyawa antimikrobia khususnya terhadap b akteri gram positip Bir mempunyai pH asam (3,7 4,5) Alkohol yang dihasilkan juga mempengaruhi pertumbuhan mikrobia. Bir disimpan pada suhu dingin. g. Kontaminan selama brewing bir : Lactobacillus pastorianus dan Pediococcu s cereviseae, Flavobacterium proteus. h. Fermentasi dilakukan pada suhu rendah, sekitar 2 minggu untuk produksi b ir i. Produksi komersial bir dilakukan : Dengan proses sekali unduh Dengan proses berkesinambungan : penambahan substrat baru dilakukan secara terus menerus. j. Macam-macam bir : 1. Lager bir : fermentasi yang melibatkan bottom yeasts dan tak berspora : S. carlsbergensis. 2. Ale : fermentasi bir yang melibatkan top yeasts dan berspora : S. cerevi sieae mempunyai kandungan alkohol cukup tinggi. 3. Bir Pilsener (dari Chekoslovakia) : warna jernih, kering (dry) karena me ngandung gula yang difermentasikan rendah, mempunyai aroma hop tajam. 4. Minuman malt : kandungan alkohol lebih tinggi dari pada bir 5. Bir non karbohidrat: bir yang dibuat dari larutan karbohidrat dimana sem ua dekstrin dihidrolisa oleh ensim menjadi maltosa dan glukosa. Fermentasi anggur (wine) Semua fermentasi alkohol memerlukan substrat gula dan untuk produksi wine menggu nakan sari buah anggur (Vitis vinifera). Buah tersebut merupakan medium yang bai k : a. Kandungan nutrien cukup tinggi b. Mempunyai keasaman yang tinggi sehingga dapat menghambat pertumbuhan mik robia yang tidak diinginkan. c. Kandungan gula cukup tinggi d. Mempunyai aroma yang sedap. Fermentasi anggur dilakukan penambahan SO2 ke buah anggur dengan tujuan untuk : a. Mencegah brwoning selama penghancuran buah b. Menghambat aktivitas khamir lain Macam-macam wine : 1. Wine putih : anggur yang dibuat dari buah anggur berwarna hijau dan juga warna merah yang telah dikupas kulitnya. 2. Wine menrah : anggur yang dibuat dari keseluruhan buah anggur berwarna m erah. Jenis khamir Terdapatnya Candida pulcherima (Metschnikovia pulcherima) Sccharomyces cerevisiae Kloeckera africana; K. apiculata S. carlsbergensis; S. rouxii Torulopsis stelatta Ekstrak (hancuran buah anggur dan wine Wine klasik Wine dan buah anggur Wine dan buahnya Wine

Wine putih

Wine merah

Gambar 2 : Diagram alir pembuatan wine Cara pembuatan wine (Gambar 2) 1. Buah anggur yang dipetik dari kebun dihancurkan menjadi bentuk cairan ya ng disebut must. 2. Khamir yang berasal dari permukaan kulit anggur sebagai inokulum dan kad ang-kadang diinokulasi dengan S. cerevisieae. 3. Proses fermentasi dilakukan : a. Red wine : Warna merah terbentuk selama proses fermentsi karena terjadi ekstraksi warna kul it buah anggur oleh alkohol yang terbentuk. CO2 terbentuk selama fermentasi sehingga sisa buahan dan kulit terangkat keatas Lama fermentasi 3 5 hari pada 24 27 0C b. White wine : Proses hampir sama dengan red wine tetapi tidak terjadi warna Lama fermentasi 7 14 hari pada 10 21 0C Kandungan alkohol 19 21 %. c. Memerlukan karbonasi yang dilakukan dengan menginjeksikan CO2 setelah pr oses fermentasi selesai.

2. ASAM AMINO Kebanyakan mikrobia mensintesa asam amino yang digunakan untuk biosintesa protei n dari glukosa dan ammonium. Asam amino ini sebagai senyawa antara dalam metabol isme, tetapi pada akhir fase exponensial dibebaskan dalam medium walaupun jumlah sedikit. Di Jepang banyak paten produksi asam amino tetapi hanya asam glutamat dan lisin yang diproduksi oleh industri dalam jumlah besar. Produksi asam glutamat Produksi asam glutamat di seluruh dunia lebih dari 100.000 ton per tahun. Monoso dium glutamat digunakan untuk penyedap makanan sup. Asam glutamat dihasilkan oleh mutan Corynebactericum glutamicum sebesar 60 gram/ liter, untuk bakterinya sendiri sebesar 300 miligram/liter. Lama fermentasi 40 j am pada suhu 300 C, keasaman medium alkalis dan mengandung biotin (1 5 gr/l), glu kosa dapat diganti dengan molase. Produksi asam glutamat oleh Corynebactericum g lutamicum, sebagai berikut :

Glukose Fosfoenolpiruvat CO2

Piruvat

CO2 Oxalo asetat Sitrat Cis akonitat Isositrat CO2 -Ketoglut r t NH4+ Glut m t 3. VIT MIN Mikro i prototrof dapat mensintesa semua vitamin, koensim dan faktor tumbuh unt uk pertumbuhan dan metaboisme Sedikit vitamin yang dihasilkan dalam skala industri dapat dilihat tabel berikut : Jenis vitamin Jenis Mikrobia Medium Kondisi fermentasi Ekstraksi Produkgr/l (%) Karoten (prekusor vitamin A) Asetyl Co.A

Riboflavin

L-sorbosa (dalam sintesa vitamin C) 5-ketoasam glukolat (dalam sintesa vitamin C) Blakeslea trispora

Myobacterium smignaxtis Ashbya gassypii

Gluconobacter oxidans Sub spesies Suboxidans Gluconobacter oxidans Sub spesies Suboxidans - Molase - minyak

kedelai - -ionon - Thianin

- glukosa - kolagen - minyak kedelai - glisin - D-sorbitol - 30% rendaman jagung - glukosa - CaCO3 - air rendaman jagung 72 jam 300C, aerob

6 hari 360C, aerob 45 jam 300C, aerob 33 jam 300C, aerob Solven

Dipanaskan 1200C + reagen untuk pengendapan Filtrasi dan pemekatan di bawah vaccium Filtrasi dan pemekatan di bawah vaccium 1 gr/l

0,007 gr/l

4,25 gr/l

70 %

100 % Biosintesa B12 dihasilkan oleh bermacam-macam bakteri dan Streptomyces. Produksi vitamin B12 menggunakan Propionibacterium.

Seperti dalam dan mikrobia lain seperti berikut ini : Spesies Medium Aerasi Proses (0C) Waktu (jam) (mg/l) Bacillus megaterium Propionibacterium freudenreichii Suhu Produk

Propiobacterium shermanii

Bacillus coagulans Streptomyces oliveseae Pseudomonans denitrifieans Malase, garam, mi-neral, karbon

Glukosa, cornsteep, hetain kobalt, pH 7,5 Glukosa, cornsteep, kobalt, pH 7

Asam sitrat, tri etanolamin, kobalt, cornsteep Glukosa, tepung Kedelai, koblat, garam mineral. Asam oksalat, betain, koblat, garam mineral Aerobik

Anaerobik (3 hari) + aerobik (2 hari) Anaerobik (3 hari) + aerobik (2 hari) Aerobik

Aerobik

Aerobik 30 30

28

55

28

18 120

150

18

96

-

0-45

20

23

6,0

5,7

10

4. ENSIM Produk metabolit yang bersifat primer dan sekunder adalah ensim. Ensim dihasilka n oleh mikrobia dalam industri fermentasi berupa exoensim dan endoensim. Ensim d apat digunakan sebagai komponen pengempuk daging, komponen pembuatan detergen, u ntuk kebersihan, pembuatn sirup, dan sebagainya. 1. Komposisi media untuk produksi ensim Kebanyakan ensim mikrobia bersifat hidrolase yaitu ensim indusibel, ensim diprod uksi bila diinduksi. Misal ensim -gl ctosid se diproduksi dalam media yang mengan dung laktosa. Metoda untuk memperoleh ensim dalam jumlah besar perlu ditambahkan kedalam mediu m inducer dengan konsentrasi rendah (contoh 0,05 % selobiosa). Pengaruh bermacam -macam inducer terhadap penghasilan ensim sebagai berikut : Ensim Jenis jamur Benang Inducer Produ (international unit) Selulase

Dextranase

Invertase

Trichoderma viride

Penicellium funiculosum Aureobasidium pullulans Selulose Selobiose Selobiose diplamitat Dekstran Isomaltosa Isomaltosa dipalmiat

Sukrosa Sukrosa monopalmiat 0,2 4,8 1080 2 1098 1,3 108

22,5

2. Ensim mikrobia dan kegunaannya a. Amilase Strain Bacillus dan Aspergillus menghasilkan beberapa ensim yaitu 1. - mil se mengkatalisa hidrolisis ikatan -1,49 glukosidik, berfungsi memeca h pati menjadi dextrin dan maltosa 2. Amyloglikosidase yang langsung menghasilkan glukosa dari pati. 3. maltase menghidrolisa maltosa menjadi glukosa. Amilase yang dihasilkan oleh Aspergillus niger dan A. oryzae digunakan untuk hid rolisa pati menjadi gula b. Protease Protease dihasilkan oleh Bacillus subtilis dan Bacillus licheniformis atau A. ni ger, A. oryzae. Protease alkalin toleransi pada pH basa dan aktif dalam adanya sodium perborate, sodium aripoyphosphate dan sodium alkylbenzen sulphonat. Prolease alkalin dihas ilkan oleh Bacillus dan Streptomyces. Latihan soal pokok bahasan VII 1. Sebutkan senyawa metabolit primer sebanyak 5 macam dan mikrobia penghasi lnya 2. Bedakan antara pembuatan asam cuka metoda cepat dan lambat 3. Jelaskan perbedaan antara Redwizcl dan White Wine 4. Apakah kegunaan penambahan S02 pada ekstrak buah sebagai bahan dasar fe rmentasi anggur. 5. Mengapa dalam memproduksi enzim tertentu ditambah dengan inducer ?

Pokok Bahasan VIII FERMENTASI METABOLIT SEKUNDER Deskripsi singkat Mikrobia mampu mensintesa senyawa metabolit sekunder pada fase pertumbu han stationer. Senyawametabolit sekunder digunakan sebagai nutrien darurat untuk

mempertahankan hidupnya. Metabolit sekunder itu tergolong dalam antibiotik biop estisida, mikotoksin dan pigmen, alkaloid serta ensim. Antibiotik yang dihasilkan oleh fungi meliputi griscofulvin, penisilin, cephalosporin, dan asam fusidat dan lain sebagainya. Bakteri juga mampu menghasi lkan cyclokeximide, amphoserin, pimaricin, streptomisin, tetrasiklin, khloramfen icol, movabiosin, erithromisin, polimisin dan nisin, Aktinomisetes juga hampir s etiap tahunnya menghasilkan 50-100 antibiotik contoh Streptomycesgriseus menghas ilkan 40 macam antibiotik yang berbeda. Biopestisida merupakan senyawa yang dihasilkan oleh mikrobia berdaya ins ektisida sebagai contoh Bacillus thuringiensis bersifat patogen terhadap larva l epidoptera, Bacillus popilliae patogen terhadap larva lebah. Alkaloid merupakan senyawa yang diproduksi oleh mikrobia dan senyawa ini dapat berperanan sebagai h erbisida contohnya Cloviceps purpurea dan C pospali untuk membunuh rumput Pospal um. Tujuan Instruksional khusus Mahasiswa mampu menjelaskan tentang fermentasi antibiotik, seperti penis ilin dan biopestisida. A. Penisilin Pada abad 19 telah diketemukan mikrobia penghambat pertumbuhan mikrobia lain, ka rena menghasilkan senyawa toksin. Penemuan tersebut disebut pinisilin yang berpe ranan sebagai antibiotik. Banyak antibiotik yang dapat digunakan dalam bidang pengobatan yaitu : Senyawa antifungal dan antibacterial yang dihasilkan oleh mikrobia Jenis mikrobia yang dihambat Senyawa sntibiotik dari Fungi Bakteria Griseofulvin

Penisilin Cephalosporin Asam fusidat Cycloheximide Amphosetrim Pimarcin Streptomisin Tetrasiklin Khloramfenicol Novobiosin Erythromisin Polimysin Nisin Alexander Flemming secara kebetulan menentukan Penicellium notatum tumbuh pada k ultur Staphylococcus yang menyebabkan terbentuk zone jernih disekitar Penicelliu m, karena kedua mikrobia tersebut saling bersifat antagonisme. Kemudian setelah senyawa diisolasi ternyata antibiotik penisilin.Florey tahun 1940 menemukan P. c hrysogenium penghasil penisilin bersifat lebih efektif daya hambatnya dan tidak toksis terhadap jaringan manusia. Industri pinisilin terus mengembangkannya dengan cara : meneliti strain baru dar i alam, melakukan seleksi, meningkatkan sifat kultur melalui mutasi, optimalisas i media dan kondisi produksi. Skema pengembangan strain sebagai berikut : Isolasi dari melon Isolat P. chrysogenum Mutasi Mutan

Produksi Penisilin Pengujian dengan Staphylococcus aureus ( 1 unit/ml ) Isolasi penisilin Purifikasi Kristalisasi (1 unit = 0,5988 gr / sodium benzyl penisilin Produksi Penisilin melalui dua cara 1. kultur tenggelam 2. kultur permukaan Dalam produksi penisilin perlu Penicellium ditumbuhkan untuk membentuk spora, sp ora tersebut sebagai inokulum. Faktor-faktor yang perlu diperhatikan selama fermentasi penisilin adalah : 1. Bahan dasar terdiri dari : a. Sumber karbon (6 %), laktosa, pati jagung dan dextrin jagung. b. Sumber nitrogen : sodium nitrat, ammonium sulfat, ammonium asetat, ammon ium laktat, corn steep liquor. c. Sumber mineral : magnesium sulfat (MgSO4 7H2O) d. Prekursor : asam phenylacetat. 2. Kondisi fermentasi Suhu 240 C, pH : 5-7,5, aerasi 400 cu/menit, antifolam tributyl citrat, 3 % octa decanol. B. Biopestisida Kebanyakan antibiotik dengan konsentrasi antara (55-200 ppm) berdaya insektisida l. Kemudian novobioci dan cycloheximide (actidione) mempunyai spektrum lebih lua s terhadap insekta lain, tetapi apakah bersifat menghancurkan atau kontak saja. Di Jepang telah banyak dilakukan seleksi dan akhirnya menemukan metabolit sekund er baru mempunyai daya insektisida. Insektisida tersebut dihasilkan oleh Strepto myces Insektisida yang dihasilkan mikrobia Jenis mikrobia Produk Toksisitas terhadap manusia Streptomyces factum Streptomyces mabaraence Metarrhizium anisapliae Aspergillus ochraccus Aspergillus versicolor Pactomycin Piericidins A dan B Dextrixin A dan B Aspachchracin Versimide Tinggi Tinggi Tinggi Rendah Dari fungi tingkat tinggi di jepang digunakan untuk pengendalian lalat, yaitu as am tricolomat yang dihasilkan oleh Tricholoma muscarium dan asam ibotenat dari A mania muscaria Bakteri yang berperanan sebagai pengendali hama adalah : 1. Bacillus thuringiensis : sporanya bersifat patogen terhadap larva Lipido ptera 2. Bacillus popilliae : sporanya bersifat patogen terhadap lebah (Popillia japanica). Nematoda berperanan sebagai vektor serangga patogen, kadang digunakan untuk peng endalian hama , contohnya simbiose antara Achromobacter nematophilus dan Neoplec tana carpocapsae Pestisica dari fungi Fungi menginfeksi integumen hospes. Spesien fungi yang paling baik yaitu Beauver ia bassiana mematikan penyakit pada ulat sutera (Bombyx mori). Jamur Metarrhiziu

m anisolphae. Latihan soal Pokok Bahasan VIII 1. Jelaskan cara isolasi mikrobia penghasil antibiotik ? 2. Apakah perbedaan antara bakterisida dan bakteriosfatik ? 3. Jelaskan mengapa dalam produksi penisilin perlu ditambah ekstrak / rendaman jagung ? 4. Apakah fungsi metabolit sekunder beri contoh 5 (lima) macam metabolit sekunder ? 5. Apakah yang dimaksud dengan a. insektisida b. metabolit sekunder c. prekursor

Pokok Bahasan IX BIOKONVERSI STEROID C. Deskripsi singkat Sterol dan steroid telah lama menjadi perhatian oleh ahli biokimia. Pada tahun 1920 ahli estrogenik dan androgenik untuk memenuhi kebutuhan steroid dipe roleh dengan ekstraksi bahan alami misalnya korteks adrenal hewan. Senyawa stero id tersebut berupa cortico steroid. Kemudian coktison berhasil disintesa secara kimiawi yang berguna untuk o bat rematoid arthritis dan rematik akut. Selanjutnya pada tahun 1952 Rhizopus ni gricans berperanan dalam mengubah progresteron menjadi - hidroksiproges rion ya ng bersifat baik dan diproduksi secara komersil. Pada tahun 1970 reaksi 11 origenan oleh fungi 16x hidroksilasi oleh Streptomyces dehidrogenasi oleh Arthrobacter Samplex mycobacteria, nocardia dan kebanyakan f ungi dilakukan di dalam industri. Namun demikian banyak kendala yang timbul dalam produksi steroid melalui proses fermentasi, misalnya biaya operasional lebih mahal dibandingkan melalui reaksi kimiawi. Sehingga dalam prakteknya di pabrik, biotransformasi/biokonversi steroid digunakan untuk menggantikan sebagian reaksi secara kimiawi. Struktur steroid kebanyakan mempunyai gugus methil pada atom karbon nome r 13 dan 10 (C-10 dan C-19). Steroid dapat dianalisa secara paper chromatography (PC) , khromatography lapis tipis (TLC) dan vapor-phase chromatography (VPC). E kstraksi produk steroid menggunakan methylene chloride dan bermacam-macam solven non polar yaitu ethyl ecetat, amyl acetat, ethelene chlorida, chloroform hasil ekstraksi steroid lalu dianalisa menggunakan cara hromatography. Penemuan penting dibidang mikrobiologi industri adalah mikrobia yang mampu melak ukan aktivitas biokimia. Contoh spora Penicellium roqueforii mampu merubah asam kapilat (asam oktanoat ) menjadi 2 heptanone. 1. Definisi dan peranan steroid Steroid adalah senyawa mempunyai kerangka perhydro 1,2-cyclo-pentano-phenanthene . Knight memperoleh 11--hydroxyl derivat progesteron menggunakan Aspergillus chra ceus. :

Pembntukan 11--hydroxyl dari progesteron steroid yang dibentuk oleh mikrobia yait u ergosterol, diosgenin pada tumbuhan, kholesterol terdapat pada hewan, kortisos teroid, hormon sex. Steroid penting sebagai agensia therapeutik, dihasilkan sela ma regulasi metabolisme

Steroid corteson berguna untuk penyakit rheumatoid arthritis dan rheumatic akut. Progestin dan estrogen untuk agensia mengurangi kesuburan (antifertility). Ster oid juga berperanan sebagai agensia therapeutic bagi manusia dan hewan misalnya estrogen, progestin dan androgen 2. Struktur steroid Kebanyakan steroid mempunyai gugus methyl pada rantai karbon nomer 13 da n 10 (C-18 dan C 19). Bentuk dasar steroid (trans, anti, trans, anti , trans) te rgantung pada ikatan cincin karbon nomor 4 dari rantaian karbon dalam Chair Shap e. Contoh bentuk dasar steroid adalah sebagai berikut Pada garis tebal yang di beri nomor 18 dan 19 dap at berikatan dengan gugus m etyl 17 B konfigurasi Adapun nama beberapa steroid baik nama perdagangan dan nama kimia dapat ditunjuk kan dalam tabel dibawah ini

Nama perdagangan Nama kimia Androstenedione Testosterone Progesteron Predmisone A-1 E Predmisolone Androst-yene-3,17 dione 17B-Hydroryandrost-4-en-3 ane Prcgn-4-enc-3,2 adio nc 17 X-21-dihydroxy-prequa-1,4-diene-3, 11,20 trione 11 B, Ekstraksi steroid dari miselium jamur benang atau semua steroid mengguna kan aseton. Sesudah steroid diekstraksi, akan mendapatkan hasil berwarna kecokla tan, lalu didecolorasi dengan karbon dan kristalisasi dari solven aseton metanol atau methelene chloride. Banyak solven yang dapat digunakan untuk ekstraksi ste roid yaitu ethyl asetat, amyl asetat, ethy-lene chlorida, chloroform. 3. Metoda analisis steroid Steroid hasil fermentasi lebih cocok dianalisis secara khromatografi ker tas (Paper chromatography), sedang THIN LAYAR chromatography) sering digunakan u ntuk penelitian, tetapi untuk kebanyakan penelitian yang spesifik analisis stero id memakai cara Vapor. Phase chromatography (VPC) karena sangat sensitiv untuk i dentifikasi steroid menggunakan resonansi nuclear magnetic, dan spektrofotometri masa. Setelah steroid dianalisis secara khromatografi maka noda dideteksi meng gunakan sinar ultraviolet dengan panjang gelombang 243 nm dan 268 nm 4.Tipe biokonversi steroid Biokonversi steroid yang digunakan dalam industri ada dua macam : a. hidroksilasi ada 4 macam : 11--hydroksil si, 11--hydroksil si, 16--hydroksil si, 21-hydroksilasi b. Dehidrogenasi 11--hydroksil si 11--hydroksi progesteron diperoleh dari progesteron yang dihasilkan oleh Aspergil lus ochroceus, 11--hydroksi progesteron merupakan hasil antara pembuatan cortison . 11--hydroksil si

Steroid hidrokartison (cortisol) langsung oleh Curvularia lunata atau ensim hewa n mammalia 16--hydroksil si Hidroksil si ini dilakukan oleh Streptomyces. Reaksi ini menjadi penting karena mampu membentuk 16 hidroksi 9-fluoroprednison yang sangat cocok untuk obat anti i nflammantory. 21-hydroksilasi Reaksi ini sangat mudah terutama dilakukan oleh Aspergillus niger dan Opphiobol us herpotricus untuk transformasi progesteron menjadi deoxycortison Dehidrogenasi Arthrobacter simplex dapat melakukan sintesa prednisolon dari cortison. 5. Metoda Biokonversi steroid Spora dari fungi atau aktinomesetes sangat esensial untuk biokonversi. Spora dip roduksi pada permukaan media atau sekam yang direndam air. Aktivitas air dan kelembaban relatif sangat menentukan sporulasi : Pengaruh aktivitas air (aw) pada produksi spora fungi (produksi sebesar 1011 kon idia/erlenmeyer Ml air/ erlenmeyer Aspergillus ochroceus NRRL 405 A. niger ATCC9142 14 40 60 80 100 120 140 160