EKSTRAK PROPOLIS SEBAGAIPREVENTIF PADA KULTURMAKROFAGYANG DIINFEKSI VIRUS Newcastle DiseaseBERDASARKAN PENURUNAN

TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha) DAN IL-6 (Interleukin-6)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh : REYUDZKY PUTRI FITYANTI

125130100111029

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2017

1

LEMBAR PENGESAHANSKRIPSI

Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-

(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)

Oleh :

REYUDZKY PUTRI FITYANTI 125130100111029

Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji pada tanggal

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan

Pembimbing I Pembimbing II

Dr. Sri Murwani, drh., MP drh. Dahliatul Qosimah, M.kes NIP. 196301011989032001 NIP. 198201272015042001

Mengetahui, Dekan FakultasKedokteran Hewan

Universitas Brawijaya

Prof. Dr. NIP. 19600903 198802 2 001

ii

ii

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Reyudzky Putri Fityanti

NIM : 125130100111029

Program Studi : Kedokteran Hewan

Penulis skripsi berjudul :

Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang

Diinfeksi VirusNewcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF-

(Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)

Dengan ini menyatakan bahwa :

1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak

menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan

tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil

jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya

terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang,April 2017

Yang menyatakan,

Reyudzky Putri Fityanti

NIM. 125130100111029

iii

iii

Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Virus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan TNF- (Tumor Necrosis

Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)

ABSTRAK

Newcastle Disease merupakan penyakit dengan mortalitas tinggi yang menyerang unggas disebabkan oleh strain virulen avian paramyxoviridae.Virus merupakan mikroorganisme intraseluler, sehingga keberadaannya dapat memicu timbulnya respon imun seluler seperti aktivasi dari makrofag dan meningkatnya produksi sitokin. Oleh karena itu diperlukan antivirus dan imunostimulator sebagai upaya pencegahan agar makrofag tidak terinfeksi virus.Propolis memiliki kandungan aktif yang dapat berperan sebagai antivirus dan imunostimulator. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif infeksi ND pada kultur makrofag berdasarkan penurunan produksi sitokin proinflamasi. Penelitian ini bersifat eksperimental dengan metode post test only control group design dan rancangan acak lengkap menggunakan kultur makrofag yang didapat dari peritoneum mencit strain Balb/Cjantan umur 6 minggu. Kultur makrofag dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kontrol negatif (A) kultur makrofag tanpa perlakuan, kontrol positif (B) kultur makrofag tidak diberi ekstrak propolis tetapi diinduksi virus ND, (C) kultur makrofag diberi ekstrak propolis 25 µg/ml lalu diinduksi virus ND, (D) kultur makrofag diberi ekstrak propolis50µg/mllalu diinduksi virus ND, dan (E)kultur makrofag diberi ekstrak propolis 100µg/ml lalu diinduksi virus ND.Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF- -6. Masing-masing diukur dengan metode flowcytometry setelah melewati masa inkubasi dan panen sel. Analisa data dilakukan secara nonparametrik menggunakan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji |Ri-Rj|. Hasil dari penelitin ini adalah terjadi penurunan produksi TNF-

-6 pada kultur makrofag yang diberi preventif ekstrak propolis. Konsentrasi ekstrak propolis 25 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek paling besar untuk mencegah peningkatan produksi TNF- -6.

Kata kunci : Paramyxoviridae, Propolis, kultur makrofag, Sitokin

iv

iv

Propolis Extractasa Preventive InMacrophages CultureInfected By Newcastle DiseaseViruses Based On Declining of TNF- (Tumor

Necrosis Factor Alpha) and IL-6 (interleukin-6)

ABSTRACT

Newcastle Disease is a high mortality disease affecting poultry, caused by a virulent of avian Paramyxoviridae. Virus is intracellular microorganism, its presence can lead to cellular immune responses such as the activation of macrophages and increase production of cytokines. Thus antivirus immunostimulator needed as the preventive action for macrophages not to infected by virus. Propolis contains active substanceswhich can be acted as antivirus and immunostimulator. The purpose of this study was to determine the potential of propolis extract as a preventive in macrophage cultureinfected by NDV 64 HAU based on decreasing production of proinflamatory cytokines. This research was an experimental study with post test only control group design, completely randomized design, using macrophages culture of Balb/C miceperitoneal, male, age 6 weeks. Macrophages culture were divided into 5 groups: negative control (A), macrophages culture without treatment;positive control (B),macrophages culture were not not given the propolis extract but induced by NDV; induced virus ND (C), macrophages culture were given propolis extract 25 µg/ml then induced by NDV; (D) macrophages culture were given propolis extract 50 µg/ml then induced by NDV; (E) macrophages culture were given propolis extract 100 µg/ml then induced by NDV. The parameters observed in this researchwere the levels of TNF- -6. The parameters were measured using flowcytometry method after incubation and cell harvest period. Data analysis were done in nonparametric using Kruskal-Wallis test followed by |Ri-Rj|. The results of this researchshowed that there is a declining in the production of TNF-IL-6 in macrophages culture given a preventive action with propolis extract. Propolis extract concentration 50 µg/ml was the best treatment which has the biggest effect to prevent increasing production of TNF- -6.

key word : Paramyxoviridae, Propolis, macrophages cultured, cytokines

v

v

KATA PENGANTAR

Puji Syukur kehadirat Allah SWT yang telah memberikan nikmat,

limpahan rahmat, serta hidayah-Nya sehingga penulis mampu menyelesaikan

skripsi Ekstrak PropolisSebagai Preventif Pada Kultur

Makrofag Yang DiinfeksiVirus Newcastle Disease Berdasarkan Penurunan

TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha) Dan IL-6 (Interleukin-6)

Penulis menyampaikan terima kasih kepada segenap pihak, yang secara

langsung maupun tidak langsung telah membantu dan membimbing dalam

menyelesaikan Skripsi ini. Secara khusus penulis menyampaikan terima kasih

kepada:

1. Dr. Sri Murwani, drh., MP.selaku pembimbing I dandrh. Dahliatul Qosimah,

M.Kes selaku pembimbing II yang telah memberikan bimbingan serta

nasehat kepada penulis.

2. drh. Ahmad fauzi, M.Sc dan drh. Yudit Oktanella, M.Si selaku dosen

penguji atas saran yang diberikan.

3.

atas kepemimpinan dan dukungan demi kemajuan FKH UB.

4. Drh. Dyah Ayu Oktavianie A. P., M. Biotech selaku Wakil Dekan 1

Fakultas Kedokteran Hewan atas kepemimpinan dan dukungan demi

kemajuan FKH UB.

5. Mama dan Ayah (Inda Rekyanti dan Tri Yudono) yang selalu memberikan

semangat, doa, kasih sayang, dukungan baik secara moril maupun materil

kepada penulis.

6. Teman-teman satu tim penelitian : Muhtamalia Riska F. D., Rakhmah Wira

W., Dien Ayu Utami, dan Didik Afif Sucitra.

7. Keluarga besar serta seluruh mahasiswa FKH UB yang telah menjadi kolega

baru selama proses pendidikan di Kedokteran Hewan.

8. Serta semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penulisan

Skripsi ini yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.

vi

vi

Penulis menyadari bahwa Skripsi ini masih jauh dari

kesempurnaan, maka saran dan kritik yang konstruktif dari semua pihak

sangat diharapkan demi penyempurnaan selanjutnya.

Semoga laporan Skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak,

khususnya bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.

Malang, April 2017

Penulis

vii

vii

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................. ii LEMBAR PERNYATAAN ................................................................................. iii ABSTRAK ........................................................................................................... iv ABSTRACT ............................................................................................................ v KATA PENGANTAR .......................................................................................... vi DAFTAR ISI ....................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. x DAFTAR TABEL.......................................................................................xi DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xii DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG...............................................xiii BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang ...................................................................................... 1 1.2. Perumusan Masalah............................................................................... 3 1.3. Batasan Masalah .................................................................................... 3 1.4. Tujuan Penelitian................................................................................... 4 1.5. Manfaat Penelitian................................................................................. 5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Newcastle Disease (ND) ....................................................................... 6 2.2 TNF- (Tumor Necrosis Factor Alpha) .............................................. 12 2.3 IL-6 (Interleukin 6).............................................................................. 14 2.4 Makrofag ............................................................................................. 14 2.5 Propolis................................................................................................ 16

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL 3.1 Kerangka konsep ................................................................................. 18 3.2 Hipotesis penelitian ............................................................................. 21

BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 22 4.2 Alat dan bahan

4.2.1 Alat penelitian ......................................................................... 22 4.2.2 Bahan penelitian ...................................................................... 23

4.3 Tahapan Penelitian .............................................................................. 24 4.4 Langkah Kerja

4.4.1 Persiapan Hewan Coba ............................................................ 24 4.4.2 Rancangan Penelitian .............................................................. 26 4.4.3 Variabel Penelitian .................................................................. 28 4.4.4 Pembuatan Ekstrak Propolis .................................................... 28 4.4.5 Pembuatan Kultur Makrofag ................................................... 29 4.4.6 Pemberian Ekstrak Propolis Pada Kultur Makrofag ............... 31 4.4.7 Preparasi Virus ND ................................................................. 31 4.4.8 Penentuan Produksi TNF- .............. 33 4.4.9 Penentuan Produksi IL-6 Dengan Flowcytometry .................. 34

4.5Analisis Data ........................................................................................... 34

viii

viii

BAB 5 HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-

IL-6 ....................................................................................................... 39 5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF- dengan Uji Kruskal-

5.1.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6 dengan Uji Kruskal-Wa

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN 51 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 52 LAMPIRAN .......................................................................................................... 58

ix

ix

DAFTAR GAMBAR Gambar Halaman 2.1 Struktur Virus Newcastle Disease ...................................................................... 7 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease .......................................................... 32 5.1 Gambaran Kultur Makrofag ............................................................................. 37 5.2 Gambaran Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak Propolis Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam ..................................................................................... 38 5.3 Hasil Uji HA Diperoleh 64 HAU.....................................................................39 5.4 Histogram Rata-rata Kadar TNF- .................................................................. 41 5.5 Histogram Rata-rata Kadar IL-6 ...................................................................... 48

x

x

DAFTAR TABEL Tabel Halaman Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis .................................................................... 16 Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF- Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj5% ........................................................... 44 Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6 dengan Uji Kruskal-Wallis dan Ri-Rj 5% .......................................................... 49

xi

xi

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran Halaman Lampiran 1. Sertifikat Laik Etik ........................................................................... 58 Lampiran 2. Surat Keterangan Skrining Fitokimia Propolis ................................. 59 Lampiran 3. Surat Keterangan Kesehatan Mencit ................................................ 60 Lampiran 4. Kerangka Operasional ...................................................................... 61 Lampiran 5. Pembuatan Ekstrak Propolis ............................................................. 62 Lampiran 6. Pengenceran Propolis ........................................................................ 63 Lampiran 7. Preparasi Virus ND ........................................................................... 64 Lampiran 8. Pembuatan Kultur Makrofag ............................................................ 65 Lampiran 9. Perhitungan Makrofag ...................................................................... 66 Lampiran 10. Metode Flowcytometry .................................................................... 67 Lampiran 11. Gambar Hasil Flowcytometry ......................................................... 68 Lampiran 12. Data Hasil Analisa Statistik IL-6 dan TNF- ................................. 75

xii

xii

DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG Simbol/singkatan Keterangan ND Newcastle Disease TNF- Tumor Necrosis Factor Alpha IL-6 Interleukin 6 HAU HA Unit RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute 1640 TAB Telur Ayam Berembrio HA Test Hemaglutination Test SN Serum Neutralization ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FAT Flourescent Antibody Technique IFN Interferon DOC Day Old Chicken APP Acute Phaseprotein MCP Monocyte Recruitment Protein MMP Matrix Metalloproteinase ROS Reactive Oxygen Species GF Growth Factor PBS Phosphate Buffer Saline RBC Red Blood Cell FBS Fetal Bovine Serum TLR Toll Like Receptor

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Newcastle Disease merupakan penyakit infeksius menyerang

unggas yang mematikan. Penyakit ini disebabkan oleh NDV (Newcastle

Disease Virus) famili Paramyxoviridae yang merupakan virus RNA.Pada

tahun 1926, wabah ND pertama kali dilaporkan terjadi di pulau Jawa, dan

sekarang ND merupakan penyakit endemik di Indonesia. Laporan terakhir

mengenai isolasi virus ND di Indonesia adalah tahun 2009, isolat tersebut

dinamakan sebagai NDV/Bali-1/07. Meskipun sudah dilakukan vaksinasi

yang ketat pada peternakan ayam, akhir-akhir ini kasus ND masih

dilaporkan di lapangan. Hal ini mungkin disebabkan virus yang

bersirkulasi di lapangan tidak sesuai lagi dengan strain virus pad vaksin

yang tersedia(Adi et al., 2010).Kerugian yang ditimbulkan ND berupa

kematian yang tinggi, penurunan produksi telur dan daya tetas, serta

hambatan terhadap pertumbuhan (Pudjiatmoko et al., 2014).

Tindakan pencegahan harus dilakukan secara komprehensif, salah

satunya dengan meningkatkan sistem imun menggunakan senyawa atau

bahan tertentu sebagai imunostimulator. ND bersifat intraseluler, sehingga

dapat hidup di kultur makrofag. Dalam hal ini makrofag berperan dalam

fagositosis sertamemproduksi sitokin (Kaihena,2013). Interaksi antara

antibodi dan molekul antigen dapat mengaktifasi makrofag menginduksi

ekspresi sitokin proinflamasi. Sitokin proinflamasi yang berperan sebagai

2

indikator terjadinya inflamasi adalah sitokin TNF- -6. Infeksi yang

berat akan memicu produksi TNF- Hardyanto, 2013).

Sitokin IL-6 merupakan mediator penting dari respon inflamasi dan

terlibat dalam berbagai kegiatan seluler, termasuk proliferasi sel,

diferensiasi, dan apoptosis. Fungsi sitokin IL-6 selain sebagai indikator

inflamasi adalah bersama dengan TNF-

monosit ke tempat inflamasi untuk menyingkirkan antigen atau stimulus

terjadinya inflamasi (Bratawidjaja, 1998).

Tindakan preventif untuk kasus ND yang umum dilakukan adalah

dengan memberikan vaksinasi. Namun karena kasus ND masih terjadi di

lapangan, maka perlu dilakukan upaya alternatif. Kali ini kami akan

mencoba untuk menggunakan Ekstrak Propolis sebagai preventif pada

kultur makrofag yang diinfeksi virus ND. Propolis adalah salah satu jenis

bahan yang memiliki potensi sebagai imunostimulator alami (Herawati et

al, 2015).

Propolis adalah suatu zat yang dihasilkan oleh lebah madu dengan

cara mengumpulkan resin atau getah dari berbagai macam tumbuhan,

kamudian resin ini akan bercampur dengan saliva dan enzim yang ada

pada lebah. Bagi lebah, propolis bersifat desinfektan atau antimikroba

yang dapat membunuh bakteri atau virus yang masuk ke dalam sarangnya

(Lofty, 2006). Propolis mengandung senyawa kompleks seperti vitamin,

mineral, enzim, senyawa fenolik dan flavonoid. Flavonoid mempunyai

berbagai efek farmakologis antara lain sebagai imunostomulan, antikanker,

3

antioksidan, antiviral, antialergi, antihepatoksik (Koca, 2007); dan juga

memiliki aktivitas dalam hal meningkatkan respon imun (Wu et al, 2011).

Berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini dilakukan untuk

mengetahui pengaruh dari ekstrak etanol propolis terhadap ekspresi dari

TNF- -6.Diharapkanpada penelitian ini pemberian ekstrak etanol

propolismampu menurunkan produksi TNF- -6 pada kultur

makrofag yang didapatkan dari peritoneal mencit.

1.2. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka perumusan

masalah dari penelitian ini adalah :

1. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur makrofag

yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan produksi

Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-

2. Apakah ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur makrofag

yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan produksi

Interleukin 6(IL-6)?

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini

dibatasi pada :

1. Hewan model yang digunakan adalah mencit jantan (Mus musculus) galur

Balb/C. Mencit yang digunakan berjumlah 4 ekor, usia 6-8minggu dengan

berat badan 20-30 gram (Rahayuningsih, 2010). Mencit didapatkan dari

Dinas Pertanian Kota Malang. Penggunaan hewan coba telah mendapatkan

4

sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya

Malang No: 610-KEP-UB.

2. Prosedur kultur makrofag dari peritoneum mencit menggunakan medium

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) dilakukan dengan

menggunakan metode yang digunakan oleh Rahayuningsih (2010).

3. Virus Newcastle Disease diperoleh dari PUSVETMA yang kemudian

dikembangbiakan pada Telor Ayam Berembrio (TAB) dan dilakukan

Hemaglutination Test (HA) untuk mengetahui titer virus. Titer dari virus

yang diinfeksikan pada kultur makrofag adalah 64 HAU (Hoss et al,

1989).

4. Propolis didapatkan dari lebah jenis Trigona sp yang menghisap bunga

randu dan bunga hutan di Peternakan Lebah Lawang Rimba Raya.

Kemudian dilakukan ekstrak di Laboraturium Farmakologi Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya Malang dengan menggunakan metode

dari Jaya et al (2008).

5. Penentuan perlakuan yang diberikan pada kultur makrofag dibedakan

menjadi lima (A) kontrol negatif, (B) kontrol positif, (C)pemberian ekstrak

propolis25µg/ml, (D) pemberian ekstrak propolis 50µg/ml, dan (E)

pemberian ekstrak propolis 100µg/ml(Herawati et al, 2015).

6. Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar TNF- -6

5

1.4. Tujuan penelitian

Adapun tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif terhadap kultur

makrofag yang diinfeksi virusNewcastle Disease melalui penurunan

produksi Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-

2. Mengetahui potensi ekstrak propolis sebagai preventif terhadap kultur

makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan

produksiInterleukin 6(IL-6).

1.5 Manfaat penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi

mengenai potensi ekstrak propolissebagai preventif terhadap kultur

makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease melalui penurunan

produksi sitokin proinflamasi, Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-

Interleukin-6 (IL-6). Selain itu juga sebagai referensi atau acuan dalam

penelitian selanjutnya terhadap tindakan preventif terhadap virus

Newcastle Disease.

5

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1Newcastle Disease (ND)

2.1.1 Etiologi

Newcastle disease (ND) merupakan suatu penyakit pernapasan dan

sistemik, yang bersifat akut dan mudah sekali menular, yang disebabkan

oleh virus dan menyerang berbagai jenis unggas, terutama ayam (Tabbu,

2000). ND disebabkan oleh virus berukuran 150-250 milimikron yang

memiliki amplop dan kapsid berbentuk heliks yang simetris.

Spesies : Newcastle Disease Virus

Genus : Avulavirus

Famili : Paramyxoviridae

Ordo : Mononegavirales

Grup : ss-RNA

Genom virus ini mempunyai enam protein utama yang

menyusunnya yaitu Nucleocapsid protein (N), Phosphoprotein (P), Matrix

protein (M), Fusion protein (F), Hemagglutininneuraminidase protein

(HN) dan Large polymerase protein (L) (Rout & Samal 2008). Gambar

2.1 merupakan gambaran struktur virus ND. Terdapat dua protein non-

struktural lainnya yang dihasilkan selama proses transkripsi gen P yaitu V

dan W. Protein N, P, HN dan F terletak di bagian luar envelope sedangkan

protein M terdapat di lapisan dalam virion (Peeters et al. 2004).Ada dua

protein penting pada virus ND, yakni HN dan F. Protein H merupakan

6

protein yang melekat dan mengikat pada reseptor pada bagian luar

membran sel inang, termasuk sel darah merah. Bagian N (neuraminidase)

merupakan enzim aktif yang membantu dalam pelepasan virus dari

membran sel inang. Aktivitas enzim ini mempengaruhi waktu yang

dibutuhkan bagi virus untuk mengelusi dari sel darah merah. Protein F

berfungsi untuk fusi antara amplop virus dengan membran sel inang

(Pudjiatmoko et al., 2014).

Gambar 2.1 Struktur Virus Newcastle Disease (Chang and Dutch, 2012)

2.1.2 Gejala Klinis

Penyakit ini menyebar dengan cepat pada spesies ayam, kalkun dan

spesies unggas yang lain. Periode inkubasi dan gejala klinis ND

dipengaruhi oleh beberapa faktor. Masa inkubasi ND pada unggas antara

3-6 hari tergantung pada jenis spesies inang, kekebalan inang serta

konsentrasi dan strain virus ND. Gejala klinis non-spesifik yang

ditunjukkan oleh ND meliputi depresi, bulu rontok, sulit bernafas dengan

mulut terbuka, hipertermia, anoreksia, lesu dan hipotermia sebelum

kematian.Meskipun demikian, dugaan terhadap ND muncul apabila organ

7

limpa, timus, bursa fabricius dan saluran pencernaan unggas yang sakit

mengalami perdarahan dan nekrosis (Courtney et al. 2013).

Berdasarkan gejala klinis yang diperlihatkan ayam terinfeksi virus

ND dikelompokkan dalam lima patotipe yaitu viscerotropic velogenic,

sangat patogenik dengan ciri kematian yang tinggi dan lesi hemoragik

pada usus; neurotropic velogenic, dengan ciri kematian yang tinggi, gejala

pernafasan dan saraf; mesogenic, dengan kematian rendah, gejala

pernafasan dan saraf; lentogenic, dengan gejala klinis ringan dari saluran

pernafasan; dan asymptomatic enteritic, dengan bentuk infeksi subklinis

enteric (OIE, 2012).

Tekanan respon kekebalan inang oleh infeksi virus ND

menyebabkan kerusakan organ limfoid primer bersifat sementara atau

permanen (Nasser et al. 2000). Sistem kekebalan spesifik (humoral dan

seluler) tidak dapat berfungsi secara optimal pada ayam yang terinfeksi

virus ND karena jaringan limfoid tidak berkembang sehingga

menyebabkan kelainan patologi atau kerusakan pada organ limfoid seluler

seperti limpa dan timus (Rue et al, 2011).

2.1.3 Cara Penularan

Penularan virus ND yang utama terjadi secara per inhalasi atau

lewat saluran pernafasan. Virus ND dikeluarkan oleh ayam terutama lewat

berbagai ekskresi. Barang atau bahan-bahan yang ada di kandang,

termasuk alas kandang (liter), dapat tercemar virus ND dan terbawa angin

ke peternakan ayam yang jaraknya berdekatan. Penularan virus ND juga

8

dapat terjadi per os pada ayam yang berdekatan dalam satu kandang.

Ayam yang selamat dari serangan virus ND, tetapi masih meninggalkan

gejala saraf hendaknya disingkirkan (dipotong) agar tidak menularkan

penyakit pada ayam lain (Soeharsono, 2005).

2.1.4 Patogenesitas

Protein HN berperan dalam tahap penempelan virus ND pada

reseptor sel inang yang mengandung sialic acid yaitu glycoprotein dan

glycolipid (Iorio et al. 2009). Protein F sebagai perantara penempelan

virus dengan penyatuan virus dan membran sel inang. Selanjutnya, RNA

virus dilepaskan ke dalam sitoplasma kemudian terjadi replikasi. Proses

masuknya virus ke dalam sel melalui dua cara, yang pertama adalah

penyatuan secara langsung antara envelope virus dengan membran plasma

dan yang kedua adalah diperantarai oleh reseptor endositosis (Ferreira et

al, 2004).

Disamping mempunyai reseptor yang cocok dengan virus ND, sel

inang juga harus memiliki enzim tripsin yang fungsinya mirip protease

untuk memecah protein F0 menjadi F1 dan F2 pada infeksi ND avirulen

walaupun protease tidak selalu diperlukan untuk penempelan virus ND

virulen (Sakaguchi et al. 1991). Penyebaran reseptor sel pada ayam yang

peka terhadap virus ND avirulen bersifat terbatas dan hanya ditemukan

pada saluran pencernaan dan pernafasan atas, sedangkan replikasi virus

ND virulen terjadi di sebagian besar jaringan inang (Brown et al. 1999).

Virus ND avirulen yang diinokulasikan lewat mulut bereplikasi di

9

esofagus, tembolok dan proventrikulus satu hari pasca-inokulasi, lalu

bereplikasi di duodenum, jejunum, ileum dan sekum, kemungkinan terjadi

sebagai akibat dari viremia pada hari keempat hingga keenam pasca-

infeksi (Bouzari & Spardbrow, 2006).

2.1.5 Diagnosis

Diagnosa awal terhadap ND tipe velogenik viserotropik dapat

didasarkan atas gejala klinik yang diperkuat oleh pemeriksaan patologik.

ND tipe Velogenik Neurotropik bersifat kurang spesifik dibandingkan

dengan VVND. Diagnosa awal untuk bentuk ini dapat didasarkan atas

adanya gejala gangguan pernapasan dan gangguan saraf. Sedangkan untuk

infeksi virus ND yang disebabkan oleh galur mesogenik dan lentogenik,

sulit untuk didiagnosa berdasarkan gejala klinik dan perubahan patologik

tertentu. Diagnosa akhir didasarkan atas isolasi dan identifikasi virus

penyebab penyakit (Tabbu, 2000).

Menurut Pudjiatmoko et al. (2014), diagnosa penyakit Newcastle

Disease dapat didasarkan atas epizootiologi, tanda-tanda klinis, kelainan

patologi anatomi yang dikukuhkan dengan hasil pemeriksaan

laboratorium, sebagai berikut:

a) Isolasi dari swab trakea atau kloaka atau suspensi 10% dari otak

atau paru, dalam larutan NaCl fisiolofis yang mengandung

antibiotik diinokulasikan pada telur ayam berembrio (TAB) umur

9-11 hari.

10

b) Pemeriksaan serologi, dengan menguji adanya antibodi dalam

tubuh dengan uji HI, uji Serum Neutralization (SN) dan Enzyme

linked immunosorbent assay (ELISA).

c) Pengujian adanya antigen dapat dilakuukan pula dengan uji

Flourescent Antibody Technique (FAT) atau dengan rapid test.

2.1.6 Imunitas Terhadap Virus

Respon kekebalan non-spesifik (alamiah) terdiri dari faktor-faktor

yang sudah ada sejak lahir atau sebelum tubuh terinfeksi mikroorganisme.

Respon kekebalan ini bersifat cepat dan paling awal dalam pertahanan

terhadap infeksi mikroorganisme.Komponen sistem imun non spesifik

tidak mempunyai kemampuan untuk bereplikasi secara cepat, akan tetapi

selalu siap untuk melawan dan mencerna bahan-bahan asing dalam waktu

yang singkat. Sel-sel dalam sistem imun non spesifik meliputi granulosit

yang berfungsi memfagosit atau mencerna, natural killer cells khusus

untuk sel kanker, makrofag dan komplemen yang kesemuanya berfungsi

sebagai pertahanan pertama terhadap adanya infeksi(Ferdous et al.

2008)dan mediator peradangangan sitokin (Scott & Owens, 2008).

Menurut, ada beberapa mekanisme utama respons nonspesifik

terhadap virus, yaitu :

1. Infeksi virus secara langsung akan merangsang produksi IFN

oleh sel-sel terinfeksi; IFN berfungsi menghambat replikasi

virus (Sinthari, 2014).

11

2. IFN tidak akan bekerja sendirian. IFN akan merangsang

makrofag untuk meningkatkan sintesis dari sitokin lain seperti

TNF- -6 (Ishartadiati, 2008).

2.1.7 Pengendalian dan Pencegahan

Tujuan dari pengendalian ND adalah mencegah ayam yang peka agar tidak

terinfeksi oleh virus tersebut atau mengurangi jumlah ayam yang peka

dengan program vaksinasi. Untuk mencegah masuknya dan menyebarnya

virus ND ke dalam suatu peternakan, maka diperlukan pengamanan

biologis yang ketat dan pelaksanaan aspek manajemen lainnya secara

optimal untuk menghilangkan faktor pendukung / sumber infeksi virus.

Sistem perkandangan, sanitasi/desinfeksi, kualitas DOC, kualitas dan

kuantitas pakan, pengaturan pekerja atau pengujung dan system

transportasi sapronak/pronak juga penting untuk diperhatikan.

Pengamanan biologis yang ketat perlu didukung oleh program vaksinasi

terhadap ND yang sesuai untuk merangsang timbulnya kekebalan pada

suatu kelompok ayam yang peka (Tabbu, 2000).

2.2Tumor Necrosis Factor -

Tumor Necrosis Factor -

proinflamasi dalam sistem imun. TNF-

termasuk makrofag (Widegren, 2008). TNF-

memiliki susunan struktur trimer yang pada awalnya berbentuk prekursor

(pTNF-

12

bentuk terlarut (sTNF-

biologis dari TNF- diantaranya :

1. Mengerahkan neutrofil dan monosit ke tempat infeksi serta

mengaktifkan sel-sel tersebut untuk menyingkirkan mikroba.

2. Merangsangan yang multiple terhadap limfosit T teraktifkan, misalnya

respon proliferasi limfosit T terhadap antigen, peningkatan reseptor

untuk IL-2 dan IFN- tkan ekspresi antigen

MHC kelas 1 pada fibroblast dan sel endotel(Abbas et al., 2010).

3. Merangsang fagosit mononuklear untuk mensekresi IL-1 dengan efek

seperti TNF.

4. Menjadi reseptor pengatur respon kekebalan serta mampu

menimbulkan efek seluler yang beragam termasuk apoptosis, nekrosis,

efek keradangan, efek proliferasi atau yang mempromosikan

pertumbuhan dan efek hematopoietik.

5. Mengaktivasi produksi khemokin yang memiliki efek kemotaksis

terhadap sel-sel inflamasi.

Interaksi antara faktor-faktor tersebut merupakan mekanisme

efektor yang terjadi pada respon imun yang dapat bersifat protektif atau

bahkan menyebabkan kerusakan jaringan yang disebut reaksi

hipersensitifitas (Thomas, 2001).

Tumor Necrosis Factor dibentuk atas 212 asam amino diatur pada

homotrimers yang stabil dengan berat molekul 51 kD. Seperti sitokin 14

proinflamasi yang lain, ekspresi dan sintesa dari TNF-

13

dihasilkan oleh sel-sel hematopoetik saja (Raharjo, 2010). TNF-

mengalami peningkatan produksi pada keadaan inflamasi akut dan kronik

(Popa et al., 2007). Infeksi yang berat dapat memicu produksi TNF- dalam

jumlah besar. Peranan yang menguntungkan dari TNF-

sebagai respon imun terhadap bakteri, jamur, virus, dan invasi parasit

(Tracey and Cerami, 1994).

2.3 Interleukin-6 (IL-6)

Interleukin-6 ini merupakan salah satu IL dengan berat molekul 22-29 kD

yang memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi dan

menginduksi produksi antibodi (Silva et al., 2007).IL-6 berfungsi dalam

imunitas nonspesifik dan spesifik. Diproduksi fagosit momonuklear, sel

endotel vascular, fibroblast, dan sel lain sebagai respon terhadap mikroba

dan sitokin lain. IL-6 mempunyai berbagai fungsi. Dalam imunitas

nonspesifik, IL-6 merangsang hepatosit untuk memproduksiacute

phaseprotein(APP) dan bersama CSF merangsang progenitor di sumsum

tulang untuk memproduksi neutrofil. Dalam imunitas spesifik, IL-6

merangsang pertumbuhan dan diferensiasi sel B menjadi sel mast yang

memproduksi antibodi.Pelepasan IL-6 ini merangsang sel makrofag muda

menjadi matang dan sel makrofag yang sudah matang akan mampu

melakukan fagositosis lebih efisien (Martinez dan Dunn, 2011; Mosser,

2003).IL-6 bersama dengan TNF-a dan IL-1, meningkat pada kondisi

septik atau peradangan aseptik.

14

2.4 Makrofag

Makrofag adalah salah satu tipe sel darah putih yang memakan benda

asing. Makrofag mempunyai peranan kunci dalam respon imun yang

bereaksi terhadap benda asing. Makrofag terutama berasal dari sel dari

sum-sum tulang, dari promonosit yang akan membelah menghasilkan

monosit yang beredar dalam darah. Pada tahap kedua monosit berimigrasi

kedalam jaringan ikat tempat mereka menjadi matang dan inilah yang

disebut makrofag. Makrofag membantu dalam proses penghancuran

antigen. Makrofag juga mengeluarkan substansi yang menstimulasi sel

lainnya yang juga berperan dalam sistem imun, dan juga terlibat dalam

presentasi antigen, dalam hal ini makrofag membawa antigen di

permukaan sel dan mempresentasikan kepada sel T (Effendi, 2003).

Makrofag juga melepaskan TNF-

(Baratawidjaja, 2004).

Monosit berdiferensiasi menjadi makrofag yang memproduksi berbagai

macam sitokin (TNF- -1, IL-10, IL-6 TGF- -8, MCP-

1), growth facor, metalloproteinase dan dapat memodifikasi lipoprotein

melalui oksidasi. Monocyte recruitment protein-1 (MCP-1), berperan

dalam perekrutan monosit dari sirkulasi. (Osterud & Bjorklid, 2003; van

Haelst, 2005). Kerja kolektif dari macrophage-derived cytokine dan lipid-

mediator adalah menginduksi inflamasi lokal yang banyak mengandung

neutrofil yang akan memfagositosis dan menghancurkan patogen (Abbas

and Litchtman, 2003).

15

Makrofag memegang peranan utama dalam proses inflamasi dan

kekebalan alami. Aktivitasnya besar, tergantung pada kapasitasnya untuk

memproduksi free-oxygen radicals, protease, complement factor, dan

sitokin (Hansson, 2001). Pada umumnya makrofag atau monosit yang

diaktifkan dengan berbagai rangsangan, dengan cepat menginduksi

produksi sejumlah sitokin seperti TNF- - - -6.

Makrofag, limfosit, fibroblast, sel endotel, otot polos yang ditemukan

dalam vaskuler dengan inflamasi dapat mengekspresikan reseptor TNF

(Baratawidjaja,2004).

2.5 Propolis

Ada banyak produk yang dihasilkan dari lebah, diantaranya adalah

madu, royal jeli, polen, dan juga propolis. Propolis adalah kompleks dari

resin yang dikumpulkan dari berbagai tanaman oleh lebah madu yang

kemudian bercampur dengan air liur lebah madu. Lebah menggunakan

propolis dalam pembuatan, pemeliharaan, perlindungan, dan untuk

mensterilkan sarangnya (Marcucci et al, 2001). Komposisi dari propolis

sangat kompleks. Unsur utamanya adalah lilin lebah, resin, dan senyawa

volatil. Lilin lebah adalah hasil sekresi dari lebah itu sendiri, sedangkan

resin dan volatil berasal dari tanaman (Rachmadian, 2011). Beberapa

kandungan kimia telah diidentifikasi dalam propolis, diantaranya adalah

resin, lilin lebah, minyak esensial, protein, senyawa organik lainnya yang

akan ditampilkan pada Tabel 2.5. berikut :

16

Tabel 2.5 Kandungan Kimia Propolis (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005)

Kelas Komponen Jumlah Group Komponen

Resin 45-55% Flavonoid, asam fenolat dan esternya Lilin dan asam lemak 25-53% Sebagian besar dari lilin lebah dan beberapa

dari tanaman Minyak esensial 10% Senyawa volatile Protein 5% Protein kemungkinan berasal dari polen dan

amino bebas Senyawa organik lain dan mineral

5%% Mineral yang paling terkenal adalah Fe dan Zn, selain itu adalah Au, Ag, Cs, Hg, La, dan Sb. Senyawa lain seperti keton, laktan, kuinon, asam benzoate, gula, vitamin B3

Senyawa yang terkandung dalam propolis secara garis besar

dikelompokkan dalam tiga kelompok yaitu flavonoid, turunan cinnamic

acid, dan terpenoid. Senyawa tersebut memiliki peran penting dalam

aktivitas biologis propolis, antara lain sebagai imunomodulator,

antimikrobial, antioksidan, antiinflamasi, antifungal, antiprotozoa,

antiparasit, dan antiproliferatif (Rachmadian, 2011).

35

BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL

3.1 Kerangka Konsep

Keterangan :

: Variabel Terikat : Induksi NDV

: Variabel Bebas : Pemberian Propolis

: Efek Pemberian Propolis

: Efek Pemberian NDV

Mencit

Kultur Makrofag Ekstrak Propolis

TNF- IL-6

Aktivitas Makrofag

KulturMakrofagDiinfeksi Virus ND (64 HAU)

Proliferasi dan Diferensiasi Makrofag Imunostimulator

Antivirus

ROS Sitokin MMP GF

Penurunan Aktivasi dari Makrofag

18

Ekstrak propolis mengandung flavonoid, tanin, dan saponin.

Flavonoid sebagai antioksidan dapat melindungi dari radikal bebas dengan

cara mentransfer ion hidrogen ke ion yang mengalami radikal bebas

sehingga menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil menyebabkan

menurunnya keadaan stres oksidatif. Tannin atau polifenol bekerja

menghambat pelepasan mediator inflamasi dan menghentikan reaksi rantai

radikal bebas. Sedangkan saponin akan mencegah kerusakan membran sel

akibat radikal bebas. Telah dibuktikan bahwa flavonoid mampu

mempercepat fagositosis. Fagositois yang berlebih akan memerlukan O².

Hal ini akan menyebabkan terjadinya respiratory burst. Jika tidak

tergantung dengan O² maka fagositosis akan menggunakan enzim sebagai

antioksidan endogen (SOD, NO, H²O²). Pada saat terdapat antigen yang

harus difagositosis namun antioksidan endogen tidak tersedia dalam jumlah

yang cukup, maka diperlukan antioksidan tambahan untuk membantu

menurunkan produksi dari ROS. Radikal bebas yang banyak dan tidak

diimbangi dengan antioksidan yang cukup akan menyebabkan stres

oksidatif yang meningkat. Pemberian ekstrak propolis akan mencegah

terjadinya peningkatan produksi dari makrofag seperti ROS, Sitokin

proinflamasi (TNF- -6), MMP, dan Growth Factor. Sehingga fungsi

makrofag akan kembali normal.

Pada saat NDV diinfeksikan ke dalam kultur makrofag, akan terjadi

diferensiasi dan proliferasi dari makrofag. Hal ini akan menyebabkan

peningkatan dari sitokin proinflamasi diantaranya TNF- -6. TNF-

19

merupakan sitokin yang mengawali proses apoptosis dan menginduksi

sitokin-sitokin lainnya seperti IL-6. Sedangkan IL-6 akan membuat

makrofag mampu melakukan fagositosis dengan lebih efisien. Aktivitas dari

makrofag tergantung pada kapasitasnya untuk memproduksi free-oxygen

radicals (ROS), sitokin, matrix metalloprotease (MMP), dan growth factor

(GF).

ROS adalah beberapa jenis molekul dan radikal yang berasal dari

molekul oksigen (O2) yang digunakan dalam pernapasan. Efek toksik ROS

pada DNA adalah dapat modifikasi basa DNA atau pemotongan cincin

DNA sehingga mengakibatkan penuaan dan kanker. Sedangkan efek toksik

pada protein adalah inaktivasi enzim, depolarisasi protein yang dapat

mengakibatkan radang inflamasi. Sitokin merupakan protein sistem imun

yang mengatur interaksi antarsel dan memacu reaktivitas imun.

Metaloproteinase matriks atau MMP merupakan protease dengan aktivitas

degradasi terhadap proteinjaringan ikat seperti kolagen, elastin, proteoglikan

dan laminin. MMP telah dikenal perannya dalam pertumbuhan sel kanker

dan metastasisdan telah sering menjadi target terapi anti kanker karena

ekspresinya yang berlebih.Sedangkangrowth factor sebagian besar berperan

untuk memicu siklus sel dan menghambat apoptosis.Aktivasi makrofag

karena pemberian NDV juga akan menyebabkan peningkatan produksi dari

ROS, sitokin, MMP, dan GF. Sehingga akan menyebabkan kerusakan

jaringan.

20

3.2 Hipotesis Penelitian

Berdasarkan kerangka konseptual yang telah ada, maka hipotesis

yang

dapat diajukan adalah sebagai berikut ini :

1. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur

makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi Tumor

Necrosis Factor Alpha (TNF-

2. Pemberian ekstrak propolis memiliki efek preventif terhadap kultur

makrofag yang diinfeksi virus ND dengan menurunkan produksi

Interleukin 6 (IL-6).

35

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2016. Pelaksanaan

penelitian terdiri atas beberapa tahapan meliputi :

1. Pembuatan ekstrak propolisdi Laboraturium Farmakologi Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya.

2. Aklimatisasi mencit dilakukan di Laboratorium Farmakologi Universitas

Muhammadiah Malang.

3. Preparasi NDV di Laboraturium Imunologi Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Brawijaya.

4. Pembuatan kultur makrofag dilaksanakan di Laboratorium Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

5. Pengukuran Tumor Necrosis Factor (TNF- Interleukin-6 (IL-6)

menggunakan teknik flowcytometry dilaksanakan di Laboratorium

Fisiologi Hewan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan (MIPA)

Universitas Brawijaya Malang.

4.2 Alat dan Bahan

4.2.1 Alat Penelitian

Alat pemeliharaan hewan coba terdiri atas kandang kotak plastik

dengan ukuran 35 x 27,5 x 12 cm untuk setiap kelompok perlakuan, tutup

kandang yang terbuat dari kawat, meja untuk meletakkan kandang, tempat

22

pakan dan minum, lampu serta alas kandang berupa sekam. Alat yang

digunakan untuk preparasi dan pembuatan kultur makrofag terdiri atas

blade, spuit 10 cc, tabung sentrifuse steril, hemasitometer, microplate 24

sumuran, inkubator CO2. Alat preparasi virus ND adalah Peneropong

telur, Pengebor telur, Spuit 1 ml, Forceps, Gunting, Inkubator Telur (37°

C, 62% kelembaban), microplate 96 sumuran dengan dasar U, dan

Mikropipet. Alat untuk membuat ekstrak propolis adalah Erlenmeyer 500

ml dan 1000 ml, pengaduk, corong gelas, pipet, kertas saring, Rotary

evaporator, Thermostirer, Vortex-mixe, waterbath, Magnetic stirrer 5 cm,

aliminium foil, kulkas, Thermometer, dan botol untuk menyimpan dosis.

Alat untuk pengujian flowcytometry terdiri atas spuit 5 mL, sentrifuge

tube, mikropipet 10 dan 1000 mikroliter, tabung dan rak eppendorf,

sentrifus, masker, sarung tangan dan tissue tabung propilen, microtube,

Pro

4.2.2 Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi mencit

Balb/C, bahan pemeliharaan hewan coba yaitu pakan, air minum dan

sekam. Bahan preparasi virus ND berupa Phospat Buffered Saline (PBS)

dan alkohol 70%. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan ekstrak

propolis adalah propolis yang diambil dari peternakan lebah Rimba Raya

Lawang, E-pure, etanol dan DMSO. Bahan yang dilakukan untuk

preparasi NDV adalah Telur Berembrio, Alkohol 70%, Lilin yang telah

23

dicairkan, RBC 10% (Washed red blood cells), PBS (Phosphat Buffer

Saline).Bahan yang digunakan untuk preparasi dan pembutan kultur

makrofag terdiri atas alkohol 70%,larutan RPMI dingin, PBS, medium

komplit (RPMI 1640, FBS 10%, penicillin, streptomycin dan glutamin),

asam asetat 3%. Bahan pada uji flowcytometry terdiri atas PBS steril,

antibodi intraseluler (TNF - -6).

4.3 Tahapan Penelitian

Berikut ini adalah tahapan penelitian yang dilakukan:

1. Persiapan hewan coba

2. Rancangan penelitian

3. Variabel penelitian

4. Pembuatan ekstrak propolis

5. Preparasi virus ND

6. Pembuatan kultur makrofag dari peritoneum mencit

7. Pemberian ekstrak propolis pada kultur makrofag

8. Pemberian virus ND pada kultur makrofag

9. Penentuan produksi TNF- -6 dengan flowcytometry

4.4. Langkah Kerja

4.4.1 Persiapan Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit

Balb/c jantan umur 6 minggu dengan berat badan 20-30 gram

(Rahayuningsih,2010). Strain yang dipilih adalah Balb/C sebab strain ini

dapat menimbulkan respon imuntias apabila diinokulasi dengan virus

24

Newcastle Disease (Hoss et al,1989). Penelitian ini menggunakan hewan

coba mencit Balb/c karena merupakan mencit yang sering digunakan pada

penelitian bertujuan umum maupun penelitian di bidang imunologi.

Sebelum perlakuan terlebih dahulu mencit diaklimatisasi selama

lima hari dengan cara ditempatkan pada sebuah kandang yang terbuat dari

plastik dan diberi pakan berupa susu PAP berbentuk pelet dan air minum

secara ad libitum (Mangkoewidjojo, 2006). PAP adalah pelet buatan

pabrik dan tebuat dari biji-bijian seperti jagung, wheat bran, tetes tebu,

palm olein, asam amino esensial, mineral esensial, premix, dan vitamin.

Kandungan protein pada susu PAP yang tinggi namun memiliki

kandungan serat yang rendah. PAP biasa digunakan sebagai pakan kelinci

dan pakan untuk menggemukkan anak sapi. Kandungan gizi susu PAP

adalah : Protein 16%, Lemak kasar 3-7%, Serat kasar 8%, Kalsium 0,9-

1,2%, dan Phosphor 0,6-1,0%. Menurut Harmita dan Maksum (2008),

mencit bersifat penakut, fotofobia, cenderung berkumpul dengan

sesamanya dan lebih aktif pada malam hari dibandingkan siang hari

sehingga perlu dilakukan aklimatisasi. Hal ini juga dijelaskan oleh

Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life Science

(2010) bahwa sebelum hewan coba digunakan dalam percobaan, diberikan

aklimatisasi atau masa adaptasi minimal selama lima hari untuk tujuan

meminimalisasi stress dan hewan coba dapat mengekspresikan tingkah

laku alaminya. Hewan coba dikandangkan dalam lima kandang kelompok

sesuai dengan kelompok perlakuan yang akan diberikan. Setiap kandang

25

berisi 4 ekor mencit.Kandang mencit diletakkan pada lokasi yang bebas

dari kebisingan dan polutan dengan suhu ruang 20-24ºC dan siklus gelap-

terang selama 12 jam.Kandang dibersihkan dan diganti alas kandang setiap

hari.

4.4.2 Rancangan Penelitian

Penelitian bersifat eksperimental dengan menggunakan Rancangan

Acak Lengkap (RAL) yaitu penggunaan media yang sama atau dianggap

seragam dalam penelitian (Kusriningrum, 2008). Penelitian menggunakan

metode Post test only control group design dimana percobaan

(eksperimen) yang dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh yang

timbul sebagai akibat dari adanya perlakuan tertentu. Pengukuran

parameter produksi TNF- -6 dilakukan untuk mengetahui pengaruh

pemberian ekstrak etanol propolis pada kultur makrofag yang diinduksi

virus ND. Hewan coba dalam penelitian ini dibagi menjadi lima kelompok

perlakuan yang berbeda, antara lain:

1. Kelompok A (kontrol negatif): Kultur makrofag yang tidak diberi

ekstrak propolis dan tidak diinduksi virus ND.

2. Kelompok B (kontrol positif): Kultur makrofag yang diinduksi virus

ND dosis 64.

3. Kelompok C (perlakuan satu): Kultur makrofag yang diberi ekstrak

propolis konsentrasi 25µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64

HAU.

26

4. Kelompok D (perlakuan dua): Kultur makrofag yang diberi ekstrak

propolis konsentrasi 50µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64

HAU.

5. Kelompok E (perlakuan tiga): Kultur makrofag yang diberi ekstrak

propolis konsentrasi 100µg/ml kemudian diinduksi virus ND dosis 64

HAU.

Jumlah hewan model yang diperlukan dalam penelitian ditentukan

dengan melakukan optimasi terlebih dahulu. Pada saat optimasi, dari satu

ekor mencit dapat diambil 2,5 ml yang mengandung 2.500.000 sel

makrofag. Jumlah sampel minimal dihitung menggunakan rumus

(Kusriningrum, 2008).

Sehingga:

P (n-1) 15 Keterangan:

5 (n-1) p = jumlah kelompok perlakuan

5n-5 n = jumlah ulangan yang diperlukan

5n

5n

n

Berdasarkan hasil perhitungan di atas, untuk lima kelompok perlakuan

diperlukan jumlah ulangan lebih besar sama dengan empat atau minimal

empat kali ulangan dalam setiap kelompok. Penelitian ini menggunakan

empat kali ulangan dalam setiap kelompok perlakuan sehingga jumlah

kultur makrofag yang diperlukan sebanyak 20 sumuran kultur makrofag.

27

Satu sumuran berisikan 500.000 sel makrofag (Akrom, 2013). Sehingga

satu ekor mencit dapat dipakai untuk satu kali pengulangan, jadi pada

penelitian ini dibutuhkan empat ekor mencit karena terdapat empat kali

pengulangan.

4.4.3 Variabel Penelitian

Variabel yang diamati dari penelitian ini adalah:

1. Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak propolis dengan

konsentrasi bertingkat 25 µg/ml, 50µg/ml, 100µg/ml. Penetapan

konsentrasi yang digunakan didasarkan pada modifikasi dari

penelitian yang telah dilakukan oleh Herawati et al (2015). Variabel

bebas lainnya adalah virus ND yang diberikan dengan dosis 64

HAU.

2. Variabel tidak bebas (variabel terikat)

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah TNF- -6.

3. Variabel kontrol (variabel kendali)

Variabel kontrol dalam penelitian ini adalah mencit strain Balb/C,

umur 6-8 minggu, jenis kelamin jantan, berat badan 20-25 gram,

pakan yang diberikan seragam yaitu pakan standar berbentuk pelet

(Mangkoewidjojo, 2006).

4.4.4Pembuatan Ekstrak Propolis

Langkah pertama adalah mengekstraksi propolis dengan etanol

sebagai pelarut memekai perbandingan propolis : etanol adalah 1 : 10. Alat

28

yang digunakan yaitu Thermostirer berkecepatan 150 rpm selama 4 jam

dan diputar dengan bantuan Magnetic Stirer 5 cm. Hasilnya disaring

dengan menggunakan kertas saring sehingga didapat filtrate propolis.

Filtrat dipisahkan dari pelarut dengan cara penguapan dalam rotary

evaporator pada suhu 70°C berkecepatan 2-3 rpm (Jaya et al, 2008).

4.4.4.1 Penentuan Konsentrasi Ekstrak Propolis

Penelitian ini menggunakan konsentrasi ekstrak propolis untuk

virus uji 0% (kontrol positif), 25µg/ml, 50µg/ml, dan100µg/ml. Menurut

Herawati et al (2015) pengencer yang digunakan adalah dimethyl sulfoxide

(DMSO). Alasannya adalah karena DMSO memiliki polaritas yang sama

dengan propolis. Jumlah ekstrak propolis yang dimasukkan kedalam

sumuran adalah 500 µl (Herawati et al, 2015). Jadi hel pertama yang

dilakukan adalah pembuatan stok propolis 1000 µg/ml DMSO. Kemudian

diencerkan kembali dengan medium komplit menggunakan rumus

V1.M1=V2.M2 sampai mendapatkan konsentrasi yang diinginkan.

Perhitungannya terdapat pada Lampiran 6 (halaman 64). Dalam media

perlakuan terdapat komposisi sebagai berikut:

Perlakuan C : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 25 µg/ml

+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl

Perlakuan D:500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 50 µg/ml

+ suspensi virus ND 64 HAU 100 µl

Perlakuan E : 500 µl makrofag + 500 µl ekstrak propolis konsentrasi 100

µg/ml + suspensi virus ND 64 HAU 100 µl

29

4.4.5 Pembuatan Kultur Makrofag

4.4.5.1 Isolasi Makrofag

Prosedur dibawah ini dilakukan untuk mendapatkan 5x105

sel/sumuran. Mencit dieuthanasia dengan dislokasi servikalis, kemudian

diletakkan dalam posisi terlentang, kulit abdomen dibuka sehingga tampak

peritoneum kemudian dibersihkan dengan alkohol 70%, kemudian

diinjeksi dengan 10cc larutan RPMI dingin ke dalam rongga peritoneum.

Peritoneum digoyang-goyangkan pelan untuk mendapatkan makrofag

yang cukup banyak. Setelah itu cairan disedot kembali sampai habis dan

dimasukkan dalam tabung sentrifuse steril. Cairan kemudian disentrifus

dengan kecepatan 800 rpm pada suhu ruang (25 °C) selama 8 menit.

Setelah supernatan dibuang, ditambahkan 1cc RPMI 1640, penicillin-

streptomycin sebanyak 10 µl. Sel-sel makrofag dihitung dengan

hemasitometer. Makrofag diwarnai dengan Trypan Blue 0,05% dengan

perbandingan 1:1. Campuran makrofag dan TB dimasukkan ke dalam

haemositometer dengan kemiringan 45°, sampel dimasukkan pada dua sisi

pengisian lalu didiamkan selama 1 menit sebelum dilakukan perhitungan

dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran 400x. Sel yang hidup

tidak terwarnai dan sel yang mati berwarna biru (Rahayuningsih, 2010).

Cara perhitungan sel adalah :

a) Sel yang menempel garis kanan dan bawah dimasukkan dalam

perhitungan, sedangkan yang menempel pada garis kiri dan atas tidak

dihitung. Sel yang menggumpal dihitung sebagai satu sel.

30

b) Diperkirakan jumlah sel dalam 1 kotak besar 20-60 atau 100-300 dalam

4 kotak besar. Apabila lebih banyak, harus dilakukan pengenceran lagi.

c) Jumlah sel per ml dan jumlah sel yang hidup per ml dalam suspensi

dapat dihitung dengan rumus :

Total sel/ml = total sel x faktor pengenceran x 104 4 Jumlah sel hidup = sel hidup x faktor pengenceran x 104 4

Setelah dilakukan perhitungan sel dalam suspensi sampel, maka

dilakukan pengenceran dengan densitas 5x105 sel/500 µl dengan rumus

V1xC1=V2xC2.

4.4.5.2 Kultur Makrofag

Suspensi sel yang didapat kemudian dikultur dalam medium

komplit (RPMI 1640, penicillin-streptomycin) di dalam microplate 24

sumuran dasar rata, masing-masing sumuran 500 mikroliter (kepadatan

5x105 sel/500 µl), kemudian diinkubasi dalam inkubator CO² pada suhu

370C selama 24 jam. Fungsi inkubator CO² adalah untuk mempertahankan

suhu optimal dengan tingkat CO² 5% (Rahayuningsih, 2010).

4.4.6Pemberian Ekstrak Propolis pada Kultur Makrofag

Penelitian ini menggunakan beberapa level konsentrasi ekstrak

propolis. Medium kultur diganti dengan medium komplit ditambah ekstrak

dengan konsentrasi 25µg/ml, 50µg/ml, dan 100µg/ml. Kultur makrofag

yang ada dalam sumuran sejumlah 500 µl di beri ekstrak propolis

31

sebanyak 500 µl. Kemudian diinkubasi selama 24 jam (Herawati et al,

2015).

4.4.7 Preparasi Virus ND

4.4.7.1 Membiakkan Virus Pada Telur Ayam Berembrio

Virus dibiakkan pada TAB berumur 9-11 hari. Telur diteropong terlebih

dahulu untuk memastikan tempat injeksi. Dilakukan candling untuk

mengetahui letak embrio ayam dan lokasi pembuluh darah, selanjutnya

diberi tanda dari cangkang telor supaya lokasi injeksi virus tidak mengenai

embrio dan pembuluh darah tersebut. Gambar 4.4 merupakan gambaran

lokasi injeksi virus Newcastle Disease di allantois sac.

Gambar 4.4 Lokasi Injeksi Virus Newcastle Disease (Murwani et al, 2013)

Kemudian telur disterilkan pada tempat injeksi. Setelah virus diinokulasikan,

lubang ditutup dengan menggunakan paraffin. Telur diamati setelah 16-18

jam untuk memastikan bahwa embrio sudah mati, kemudian telur dapat

disimpan dalam suhu 4° C. Cara memastikan bahwa embrio sudah mati

adalah dengan melakukan candling kembali dan embrio tidak akan

merespon terhadap cahaya (Suryana, 2001).

32

4.4.7.2 Hemaglutination (HA) Test

Uji HA dilakukan untuk mengetahui titer dari virus yang akan

diinduksikan pada kultur makrofag. Hal pertama yang dilakukan adalah

memasukkan 0,025 ml PBS dari sumuran 2-12. Suspensi virus dimasukkan

ke dalam sumuran 1 sebanyak 0,025 ml. Selanjutnya ambil 0,025 ml dari

sumuran 1 dan campurkan ke sumuran 2 sampai sumuran ke-11. Ambil

0,025 ml pada sumuran ke-11 untuk dibuang. Kemudian ditambahkan

0,025 ml RBC ke semua sumuran lalu campur hingga homogen. Sumuran

ke-12 hanya berisi PBS dan RBC karena digunakan sebagai kontrol

negatif. Jika sudah terjadi endapan eritrosit pada sumuran ke-12, maka

dapat diamati aglutinasi yang terjadi pada dasar sumuran dengan

memiringkan plat titermikro. Endapan yang tidak dapat mengalir

merupakan positif HA (OIE, 2012).

4.4.7.3 Pemberian Virus ND Pada Kultur Makrofag

Kultur makrofag yang sudah diberi ekstrak kemudian diinkubasi selama 24

jam diinduksi virus ND dengan dosis infeksi 64 HAU. Kemudian

dilakukan inkubasi kembali selama 30 menit (Herawati et al, 2015).

4.4.8Penentuan Produksi TNF- Flowcytometry

Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi

ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS

sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi dari PBS

ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari kultur sel.

Setelah itu diambil 100 µl kemudian dimasukkan ke dalam microtube

33

baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil dari

sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan antibodi cell

surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan sel

sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C. Setelah

itu ditambahkancytofix cytopermyang berfungsi untuk fiksasi dan

permeabilisasi sel untuk pewarnaan sitokin intraseluler dengan antibodi

anti-sitokin fluorochrome-terkonjugasisebanyak 100 µl, kemudian

diinkubasi selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan

washpermuntuk mencuci sel-sel dan untuk mencairkan antibodi anti-

sitokin untuk pewarnaan 1 mL dan disentrifugasi lagi dengan kecepatan

2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Setelah didapatkan pelet hasil

sentrifugasi ditambahkan antibodi intraseluler (TNF-

ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan dalam kuvet flowcytometry

4.4.9Penentuan Produksi IL-6 dengan Flowcytometry

Kultur makrofag yang sudah diinduksi dengan NDV dan diberi

ekstrak propolis dengan berbagai macam dosis ditambahkan PBS

sebanyak 1 mL lalu dihomogenkan dengan cara pipetting.Fungsi dari PBS

ini adalah untuk pencucian dan pengenceran setelah panen dari kultur

sel.Setelah itu diambil 100 µl, kemudian dimasukkan ke dalam microtube

baru. Selanjutnya ditambahkan 500 l PBS, kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 40C. Hasil dari

34

sentrifugasi diambil bagian peletnya kemudian ditambahkan antibodi cell

surface molecule yang digunakan untuk staining molekul permukaan sel

sebanyak 50 l, lalu diinkubasi selama 30 menit dengan suhu 40C. Setelah

itu ditambahkan cytofix cytoperm sebanyak 100 µl, kemudian diinkubasi

selama 20 menit dengan suhu 40C, lalu ditambahkan washperm 1 mL dan

disentrifugasi lagi dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan

suhu 40C. Setelah didapatkan pelet hasil sentrifugasi ditambahkan IL-6

sebanyak 50 µl, kemudian ditambahkan 300 l PBS, lalu dimasukkan ke

dalam kuvet flowcytometry

4.5 Analisis Data

Analisa data yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisa

kuantitatif One Way ANOVA, a

One Way ANOVA dimaksudkan untuk melihat pengaruh terhadap

pemberian ekstrak propolis sebagai preventif pada kultur makrofag yang

diinfeksi virus ND, kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat

perbedaan tiap perlakuan.

35

BAB 5

HASIL DAN PEMBAHASAN

Sebelum penelitian berlangsung, dilakukan optimasi terlebih dahulu untuk

mengetahui berapa jumlah sel makrofag yang dihasilkan dari satu ekor

mencit. Setiap sumuran dalam kultur berisi 500.000 sel makrofag. Setelah

dilakukan optimasi, dari satu ekor mencit mampu menghasilkan 2.500.000

sel. Peneitian ini memerlukan sebanyak 20 sumuran, sehingga jumlah

mencit yang dibutukan hanya 4 ekor. Makrofag diisolasi dari peritoneum

mencit dengan menginjeksikan medium RPMI 1640 kedalam rongga

peritoneum mencit. Selanjutnya makrofag dikultur dalam medium komplit

(RPMI 1640, penicillin-streptomycin) dalam microplate 24 sumuran dasar

rata. Masing-masing sumuran berisikan makrofag dengan kepadatan

500.000 sel. Kemudian kultur makrofag tersebut dibagi menjadi lima

perlakuan. Kontrol negatif berupa kultur makrofag tanpa ekstrak propolis

dan tanpa virus ND. Kontrol positif berupa kultur makrofag tanpa ekstrak

propolis tapi diberi virus ND. Perlakuan 1 adalah pemberian ekstrak

propolis konsentrasi 25 µg/ml, perlakuan 2 konsentrasi 50 µg/ml, dan

perlakuan 3 konsentrasi 100 µg/ml.

Makrofag merupakan sel yang memiliki peran utama dalam proses

fagositosis atau penghancuran antigen. Propolis memiliki kandungan

flavonoid, tanin atau polifenol, dan saponin. Kandungan-kandungan dari

propolis tersebut mampu meningkatkan proliferasi dari makrofag sehingga

dapat meningkatkan jumlah makrofag. Selain itu propolis juga mampu

36

menstimulasi fagostosis. Menurut Tyastuti et al (2006), propolis dapat

meningkatkan persentase fagositosis makrofag pada ayam yang terkena

ND. Propolis juga dapat membersihkan polutan dan racun dalam tubuh,

sehingga metabolisme sel dapat berlangsung optimal (Prasetyo et al,

2013).

Berikut ini merupakan gambar makrofag yang diambil setelah

dilakukan proses kultur, sehingga makrofag masih dalam keadaan hidup :

Gambar 5.1 Gambaran Kultur Makrofag Keterangan : Gambaran kultur makrofag yang tidak diberi ekstrak propolis, A : Perbesaran 100x, B : Perbesaran 400x, C : Sel Makrofag, D : Eritrosit

Perbesaran 100x

Perbesaran 400x

A

B

C

D

37

Gambar 5.2 Gambar Kultur Makrofag Setelah Diberi Ekstrak Propolis Kemudian Diinkubasi Selama 24 Jam (Perbesaran 100x).

Keterangan: A: Ekstrak Propolis 25 µg/ml, B: Ekstrak Propolis 50 µg/ml, C: Ekstrak Propolis 100 µg/ml. D: Makrofag. Terjadi peningkatan proliferasi dan diferensiasi dari makrofag pada kultur makrofag yang diberi ekstrak propolis. Sehingga jumlah makrofag pada kultur yang diberi ekstrak propolis akan meningkat.

Percesaran 100x

Perbesaran 100x

Perbesaran 100x

A

B

C

D

D

D

38

Makrofag berukuran 10-30 mm, berbentuk bulat, permukaan

mengkilat, kompak serta besarnya sama. Makrofag merupakan sel yang

panjang umurnya dan dapat bertahan berbulan-bulan bila berada di dalam

jaringan (Effendi, 2003). Setelah diinkubasi selama 24 jam, makrofag

diberi ekstrak propolis dengan beberapa tingkat konsentrasi yang berbeda.

Kultur makrofag yang telah digolongkan menjadi 5 perlakuan kemudian

diinduksi virus Newcastle Disease 64 HAU. Virus ND ditanam dalam telur

ayam berembrio. Kemudian setelah embrio mati, dilakukan uji HA untuk

mengetahui titernya. Gambar hasil uji HA adalah sebagai berikut :

Gambar 5.3 Hasil Uji HA diperoleh 64 HAU

Dari Gambar 5.3dapat dilihat bahwa hasil uji HA diperoleh titer 2

pangkat 6 yang setara dengan 64 HAU. Selanjutnya dilakukan panen sel

makrofag untuk diketahui pengaruh pemberian ekstrak propolis sebagai

preventif terhadap virus ND melalui produksi kadar TNF- -6. Pada

penelitian secara in vivo, kadar TNF- -6 meningkat pada hari

ketiga.

39

5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-

IL-6

Ada beberapa prasyarat parametrik yang harus terpenuhi sebelum

sebuah data dapat dianalisa menggunakan One Way ANOVA. Diantaranya

adalah uji normalitas (Saphiro-Wilk) dan homogenitas (Levene). Pengujian

asumsi normalaitas dan homogenitas untuk kadar TNF- -6 tidak

terpenuhi (Lampiran 12). Oleh karena itu proses pengujian dilakukan

secara non parametrik dengan Kruskal-Wallis yang dilanjutkan dengan uji

|Ri-Rj|. Pengujian tidak dilakukan dengan Mann-Whitney karena akan

muncul permasalahan mendasar berupa penolakan terhadap hipotesis nol

yang benar (Daniel, 1989).

5.1.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar TNF-

dengan Uji Kruskal-Wallis

Tumor Necrosis Factor Alpha dalam keadaan normal berperan

dalam proses apoptosis (Thomas, 2001). Hal inilah yang menyebabkan

TNF-

adalah mekanisme kematian sel terprogram yang penting dalam berbagai

proses biologi. Ketika terjadi inflamasi, makrofag akan bekerjadanakan

memacu produksi sitokin. Seperti yang tampak pada kontrol positif, kadar

dari TNF- Hasil penelitian menunjukkan

bahwa pemberian ekstrak propolis yang mengandung zat aktif berupa

flavonoid dan tanin memberikan efek antiinflamasi dan antioksidan yang

ditandai dengan adanya rata-rata penurunan persentase TNF- pada

40

konsentrasi 25 µg/ml, 50 µg/ml, dan 100 µg/ml.Berdasarkan rata-rata pada

perlakuan 1 dengan konsentrasi preventif25 µg/ml, perlakuan 2dengan

konsentrasi preventif50 µg/ml, danperlakuan 3 dengan konsentrasi

preventif100 µg/ml terjadi penurunan produksi TNF- makrofag.

Namun, rata-rata penurunan produksi TNF- (P2) lebih mendekati

nilai persentase kontrol negatif.

Rata-rata kadarTNF- kelompok kontrol dan perlakuan secara

lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :

Gambar 5.4 HistogramRata-Rata KadarTNF- Keterangan : K (-) adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif

dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1) adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml dan diinduksi virus ND).

41

Pada Gambar 5.4 ditunjukkan histogram rata-ratakadar TNF-

pada semua kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok K+,

terlihat bahwa rata-rata kadarTNF- menurun pada semua kelompok

perlakuan pemberian ekstrak propolis. Namun secara statistik, penurunan

tersebut tampak tidak signifikan.

Menurut data yang diperoleh, terdapat peningkatan produksi TNF-

secara signifikan (p

42

Semakin berat infeksi, TNF- yang diproduksi juga akan semakin besar.

Pada kadar rendah TNF-

menginduksi inflamasi akut. Pada kadar sedang, TNF-

inflamasi sistemik. Sedangkan pada kadar tinggi, TNF-

peradangan, penyembuhan luka, remodelling jaringan dan dapat

menginduksi syok septik dan cachexia. Semakin meningkat jumlah TNF-

akan memicu terjadinya reaksi inflamasi sistemik yang berat.Aktivitas

makrofag secara berlebihan dalam proses inflamasi dapat mengakibatkan

produksi sitokin meningkat (Popa et al, 2007).

Ekstrak propolis memiliki kandungan aktif seperti flavonoid,

tannin atau polifenol, dan saponin. Flavonoid merupakan antioksidan dan

antiinflamasi. Mekanisme hambatan yang dilakukan oleh flavonoid

sebagai antioksidan bisa terjadi secara langsung yaitu dengan

mendonorkan ion hidrogen sehingga ion-ion yang mengalami radikal

bebas berubah menjadi stabil. Keadaan ion yang telah stabil menyebabkan

menurunnya keadaan stres oksidatif. Flavonoid juga akan mengurangi

pelepasan dari peroksidase, yang menghambat produksi reactive oxygen

species (Rachmadian, 2011).

Mekanisme antiinflamasi saponin adalah dengan mencegah

kerusakan biomolekul akibat radikal bebas karena saponin mengandung

gugus antioksidan. Hal ini memungkinkan saponin untuk menekan

aktivitas superoksida melalui pembentukan intermediate hidroperoksida.

Selain flavonoid dan saponin, polifenol merupakan zat aktif dari ekstrak

43

propolis yang memiliki peran mengurangi inflamasi. Polifenol berperan

melindungi sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas sehingga

mencegah proses inflamasi dan peradangan (Rachmadian, 2011). TNF-

akan meningkat saat makrofag teraktivasi. Penurunan kadar TNF- terjadi

melalui penekanan kompleks antigen-antibodi dalam mekanisme infiltrasi

sel inflamasi sehingga dapat menurunkan aktivitas radikal bebas dan

enzim Matrix Metalloproteinase (MMP) sehingga reaksi inflamasi dapat

menurun (Lehner, 2011).

Pengujian asumsi normalitas dan homogenitas untuk variabel

kadarTNF- tidak terpenuhi (lampiran 12). Oleh karena itu dilakukan

pengujian untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak propolis

terhadap kadarTNF-

Kruskal-Wallis. Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian ekstrak

propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar TNF- dengan

menggunakan uji Kruskal-Wallis.

Tabel 5.1 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap KadarTNF-

dengan Uji Kruskal-Wallisdan |Ri-Rj| 5%

Perlakuan Mean ± SD p-value

K- 49.83 ± 11.87 a

0.022 K+ 68.04 ± 0.65 b P1 67.76 ± 0.94 b P2 61.45 ± 6.33 ab P3 63.29 ± 6.09 ab

Keterangan: Pada rata-rata ±sd jika memuat notasi yang berbeda berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).

44

Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji Kruskal-

Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.022, lebih kecil daripada

(p

45

sd kelompok P2 dan P3 memuat notasi yang sama dengan kelompok

kontrol negatif.Hal ini mengandung pengertian bahwa pemberian ekstrak

propolisdengan konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3) mampu

menurunkan kadarTNF- ultur makrofag kondisi

normal. Sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak propolis mampu

berperan sebagai antioksidan tambahan dari luar yang berfungsi untuk

menyeimbangkan sel yang mengalami radikal bebas sehingga menjadi

stabil dan ROS dihasilkan lebih sedikit. Sedangkan pada kelompok

pemberian ekstrak propolisdengan konsentrasi 25 µg/ml berbeda

signifikan dengan kelompok kontrol negatif tapi memiliki notasi sama

dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan bahwa pemberian ekstrak

propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1) belum mampu menghasilkan kadar

TNF-

5.1.2Pengujian Pengaruh Ekstrak PropolisTerhadap Kadar IL-6 dengan

Uji Kruskal-Wallis

Makrofag memiliki kemampuan menghasilkan sekresi sel yang

dikenal dengan interleukin seperti TNF- -1, IL-4, dan IL-6. Sitokin

dihasilkan oleh sel dalam reaksi radang atau imunologik yang berfungsi

sebagai isyarat antara sel-sel untuk berkomunikasi dalam respon imun.

Sitokinproinflamasi IL-6 merupakan salah satu interleukin yang

memegang peranan sangat penting pada reaksi inflamasi. Selain itu IL-6

dapat meningkatkan respon antibodi terhadap patogen yang mempercepat

46

pelenyapan patogen yang dicerna oleh makrofag. IL-6 juga berperan dalam

proses apoptosis, sehingga IL-6 juga masih dihasilkan pada kontrol negatif

(Titus et al, 1991).

Semakin meningkat aktivitas patogen akan menyebabkan adanya

infiltrasi sel inflamasi yang mengakibatkan IL-6 juga meningkat seperti

yang terdapat pada kontrol positif. Peningkatan kadar IL-6 berkolerasi

dengan kerusakan sel dan inflamasi. Makrofag berperan sebagai salah satu

sel dalam sistem pertahanan tubuh melawan invasi virus dengan cara

fagositosis. Sitokin IL-6 ini dapat memediatori makrofag mensintesis

reaksi inflamasi untuk melindungi terhadap virus. Menurut pendapat Silva

et al (2007), sitokin merupakan sinyal penting yang dihasilkan oleh sel-sel

tubuh untuk mengaktifkan kerja sel lain, sehingga jenis dari sitokin yang

disekresikan oleh sel akan memberikan efek pada sel target. Sitokin dapat

beraksi secara autocrine yaitu mempengaruhi lingkungan pada sel yang

melepaskannya, paracrine yaitu berpengaruh terhadap sel lain di

sekitarnya, dan endocrine yaitu berpengaruh terhadap lingkungan sel

sekitarnya.

Secara statistik diperoleh hasil bahwa kelompok perlakuan P (2)

dengan konsentrasi 50 µg/ml memiliki perbedaan yang signifikan

dibandingkan kelompok kontrol positif (

47

sebagai antiinflamasi dan antioksidan.Flavonoid sebagai antioksidan

melindungi tubuh terhadap efek radikal bebas dengan cara mentransfer

sebuah elektron ke senyawa radikal bebas sehingga menjadi stabil dan sel

terlindungi dari adanya peroksidasi lipid.

Fungsi tanin atau polifenol sebagai antiinflamasi bekerja dengan

cara menghambat pelepasan mediator inflamasi sedangkan sebagai

antioksidan, tanin memiliki kemampuan dalam menghentikan reaksi rantai

radikal bebas secara efisien (Pazil, 2009).Mekanisme antiinflamasi

saponin yaitu dengan mencegah kerusakan biomolekul akibat radikal

bebas karena saponin mengandung gugus antioksidan. Hal ini

memungkinkan saponin untuk merusak superoksida melalui pembentukan

intermediate hidroperoksida (Fitriyani et al, 2011).

Pada Gambar 5.5ditunjukkan histogram rata-ratakadar IL-6semua

kelompok kontrol dan perlakuan. Dimulai dari kelompok K+, terlihat

bahwa rata-rata kadar IL-6menurun pada semua kelompok perlakuan

pemberian ekstrak Propolis. Secara statistik ditunjukkan bahwa pemberian

ekstrak propolis dengan konsentrasi 50 µg/ml (P2) dan 100 µg/ml (P3)

terbukti mampu menurunkan kadar IL-6 pada kultur makrofag yang

diinduksi virus ND secara signifikan.

48

Rata-rata kadar IL-6 kelompok kontrol dan perlakuan secara

lengkap ditunjukkan dalam histogram berikut :

Gambar 5.5HistogramRata-Rata Kadar IL-6 Keterangan : K (-) adalah kontrol negatif (kultur makrofag tanpa preventif

dengan propolis dan tanpa induksi virus ND); K (+) adalah kontrol positif (kultur makrofag yang diinduksi virus ND); P (1) adalah perlakuan 1 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 25 µg/ml dan diinduksi virus ND); P (2) adalah perlakuan 2 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 50 µg/ml dan diinduksi virus ND); dan P (3) adalah perlakuan 3 (kultur makrofag dengan preventif propolis konsentrasi 100 µg/ml dan diinduksi virus ND). Jumlah IL-6 pada kelompok perlakuan 2 (konsentrasi preventif 50

µg/ml)mengalami penurunan dibandingkan kelompok kontrol positif.

Kelompok P (2) yang diberi preventif ekstrak propolis dengan konsentrasi

50 µg/ml menunjukkan bahwa konsentrasi ini merupakan konsentrasi yang

paling baik untuk menurunkan produksi IL-6.

49

Berikut hasil pengujian pengaruh pemberian ekstrak

propolisdengan beberapa level konsentrasi terhadap kadar IL-6dengan

menggunakan uji Kruskal-Wallis.

Tabel 5.2 Pengujian Pengaruh Ekstrak Propolis Terhadap Kadar IL-6

dengan Uji Kruskal-Wallis dan |Ri-Rj| 5%

Perlakuan Mean ± SD p-value K- 42.38 ± 0.33 a

0.002 K+ 60.51 ± 7.35 c P1 54.34 ± 0.63 bc P2 50.3 ± 2.29 ab P3 51.18 ± 2.71 ab

Keterangan: Pada rata-rata ± sd jika memuat notasi yang berbeda berarti ada perbedaan yangbermakna (p0.05).

Berdasarkan pada hasil analisis dengan menggunakan uji Kruskal-

Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.002, lebih kecil daripada

(p

50

Pada perbandingan antara kelompok kontrol positif (K+) dengan

perlakuan, ditunjukkan bahwa penurunan kadar IL-6 secara signifikan

ditunjukkan pada kelompok perlakuan pemberian ekstrak propolis

konsentrasi50 dan 100µg/ml (P2 dan P3).Hal ini ditunjukkan dari nilai

rata-rata ± sd kelompok perlakuan P2 dan P3 lebih rendah dan memuat

notasi yang berbeda jika dibandingkan dengan kelompok kontrol positif.

Pada perbandingan antara kelompok (K-) dengan perlakuan,

ditunjukkan bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi50 µg/ml (P2)

dan 100 µg/ml (P3) mampu menurunkan kadar IL-6 hingga mendekati

kultur makrofag normal (K-). Hal ini ditunjukkan dari nilai rata-rata ± sd

kelompokperlakuantersebut memuat notasi yang sama dengan kelompok

kontrol negatif. Dapat diartikan bahwa pemberian ekstrak propolisdengan

konsentrasi 50 dan 100 µg/ml (P2 dan P3) mampu menurunkan kadarTNF-

dikatakan bahwa ekstrak propolis mampu berperan sebagai antioksidan

tambahan dari luar yang berfungsi untuk menyeimbangkan sel yang

menglami radikal bebas sehingga menjadi stabil dan ROS dihasilkan lebih

sedikit. Sedangkan pada kelompok pemberian ekstrak propolisdengan

konsentrasi 25 µg/ml berbeda signifikan dengan kelompok kontrol negatif

tapi memiliki notasi sama dengan kontrol positif. Hal ini membuktikan

bahwa pemberian ekstrak propolis konsentrasi 25 µg/ml (P1) belum

mampu menghasilkan kadar TNF- kultur makrofag kondisi

normal.

35

BAB 6

KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini, yaitu :

1. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif pada kultur

makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi ekstrak

propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek

paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar TNF- (Tumor

Necrosis Factor Alpha).

2. Ekstrak propolis dapat digunakan sebagai tindakan preventif pada kultur

makrofag yang diinfeksi virus Newcastle Disease. Konsentrasi ekstrak

propolis 50 µg/ml merupakan perlakuan terbaik yang memiliki efek

paling besar untukmencegah peningkatan produksi kadar IL-6 (Interleukin

6).

6.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai variasi konsentrasi

ekstrak propolisuntuk mengetahui konsentrasi yang lebih efektif dalam

menurunkan kadar sitokin proinflamasi (TNF- -6).

2. Perlu adanya penelitian lebih lanjut terhadap pengaplikasian ekstrak

propolis untuk mengetahui efek klinis pada ayam sebagai preventif

terjadinya penyakit Newcastle Disease.

36

DAFTAR PUSTAKA

Abbas, A. K., Lichtman, A. H., and Pillai, S. 2010.Selular and Molecular Immunology, updated ed. 6 ed.Philadelphia. John E. Kennedy Blvd Ste 1800.

Abbas, A. K., Litchman, A. H. 2003. Chapter 12 Cytokines. Chapter 13 Effector

mechanism of cell-mediated immunity. Chapter 14 Effector mechanism of humoral immunity. In:Celluler and molecular Immunology. 21 ed. Philadelphia.

Adi, A. M., Astawa, N. M., Putra, K. S. A., Hayashi, Y. Matsumoto, Y. 2010.

Isolation and Characterization of a Pathogenis Newcastle Disease Virus From a Natural Case In Indonesia. J Vet Med Sci. 72 : 313-319.

Akrom, 2013. Mekanisme Kemopreventif MBJH pada Tikus Sprague dawley (SD)

yang Diinduksi 7,12 Dimethylbenza(a) Antracene (DMBA). Disertasi : Jogjakarta : Pasca Sarjana UGM.

Bouzari, M. and Spardbrow, P. 2006. Early Events Following Oral

Administration of Newcastle Disease Virus Strain V4. Journal Poult. Sci. 43 : 408-414.

Baratawidjaja, K. G. 2013. Imunologi Dasar. Edisi ke-10.Jakarta : FKUI. Brown, C., King, D. J., and Seal, B. S. 1999. Pathogenesis of Newcastle Disease

in Chickens experimentally Infected With Virusesof Different Virulence. Vet. Pathol. 36 : 125-132.

Chang, A. and Dutch, R. E. 2012. Paramyxovirus Fusion and Entry: Multiple

Paths to a Common End. USA : University of Kentucky. Courtney, S.C., Susta, L., Gomez, D., Hines, N., Pearson, J.E., Brown, C.C.,

Miller, P.J., Afonso, C.L., 2013. Highly divergent virulent isolates of Newcastle disease virus from the Dominican Republic are members of a new genotype that may have evolved unnoticed for over two decades. J. Clin. Microbiol. 51, 508 517.

Daniel., W., W. 1989. Statistika Nonparametrik Terapan. Georgia State

University. Jakarta : PT Gramedia. Edewor, T. I. 2016. A Review : Immunological Potential of Bioactive Flavonoids

And Flavonoids Containing Fractions Isolated From Medical Plants. Cibtech Journal of Bio-Protocol ISSN : 2319-3840 Vol. 5 (2). Ogbomoso : Ladoke Akintola University Of Technology.

37

Effendi, Z. 2003. Daya Fagositosis Makrofag Pada Jaringan Longgar Tubuh. Medan : Bagian Histologi FKUSU.

Ferdous, F., Maurice, D. & Scott, T. 2008. Broiler chick thrombocyte response to

lipopolysaccharide. Poultry Science, 87, 61_63. Ferreira, L., Villar, E. and Munoz-Barroso, I. 2004. Gangliosides and N-

glycoproteins function as Newcastle Disease Virus Reseptors. Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 : 2344-2356.

Fitriyani, A., L. Winarti, S. Muslichah, dan Nuri. 2011. Uji Antiinflamasi Ekstrak

Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) pada Tikus Putih. Majalah Obat Tradisional, 16 (1), 34-42.

Hansson, G. K. 2011. Immune Mechanism in Artherosclerosis, Artherosclerosis,

Thrombosis, and Vascular Biology. 21:1876. Hardyanto, J., Pratiwi, T., Winarso, D. 2013. Efek Perasan Daun dan Tangkai

Semanggi Air (Marsilea Crenata) Terhadap Penurunan Kadar Tumor Necrosis Alpha Dan Interleukin 1 Beta Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Urolithiasis. Malang : Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.

Harmita dan Maksum, R. 2008. Buku Ajar Analisis Hayati. Edisi Ketiga. Jakarta:

ECG pp: 63-67. Hayter, R. B. and Besch, E. L. 1974. Airborn Particle Deposition in the

Respiratory Tract of Chickens. Poult. Sci. 53, 1507-1511. Herawati, I., Husin, U. A., Sudigdoadi, S. 2015. Pengaruh Ekstrak Etanol

Propolis Terhadap Aktivitas & Kapasitas Fagositosis Pada Kultur Makrofag Yang Diinfeksi Enteropathogenic Escherichia Coli (EPEC). MKB Vol. 47 No. 2. Bandung : FK UNPAD.

Hoss, A., Zwarthoff, E. C., Zawatzky, R. 1989. Differential Expression of

Interferon Alpha and Bata Induced with Newcastle Disease Virus in Mouse Machrophage Cultures. J. gen Virol, 70. 575-589. Heidelberg : Institute of Virus Reseach.

Iorio RM, Syddall RJ, Sheehan JP, Bratt MA, Glickman RL, dan Riel AM. 2009.

Neutralization Map of the Hemagglutinin-Neuraminidase Glycoprotein of Newcastle Disease Virus: Domains Recognized by Monoclonal Antibodies That Prevent Receptor Recognition. Journal of Virology. 65(9): 4999-5006.

38

Institute of Laboratory Animal Resources Commision an Life Science. 2010. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eight Edition. Washington: The National Academies Press.

Ishartadiati, K. 2008. Peranan TNF, Il-1, dan IL-6 Pada Respon Imun Terhadap

Protozoa. Surabaya : Fakultas Kedokteran Universitas Wijaya Kusuma Surabaya.

Jaya, F., Radiati, L. E., Awwaly, K. U., Kalsum, U. 2008. Pengaruh Pemberian

Ekstrak Propolis Terhadap Sistem Kekebalan Seluler Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Strain Wistar. Malan