universitas indonesia pembuatan nanofood …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20292604-s1473-pembuatan...

UNIVERSITAS INDONESIA

PEMBUATAN NANOFOOD PROPOLIS MENGGUNAKAN

PENYALUT CASSEIN MICELLE

SKRIPSI

TONY SUPARDI

0806368181

FAKULTAS TEKNIK

PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA

DEPOK

JUNI 2011

Pembuatan nanofood..., Toni Supardi, FT UI, 2011

UNIVERSITAS INDONESIA

PEMBUATAN NANOFOOD PROPOLIS MENGGUNAKAN

PENYALUT CASSEIN MICELLE

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknik

TONY SUPARDI

0806368181

FAKULTAS TEKNIK

PROGRAM STUDI TEKNIK KIMIA

DEPOK

JUNI 2011


iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Tony Supardi

NPM : 0806368181

Tanda Tangan : ........................................

Tanggal : 28 Juni 2011


iv

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Tony Supardi

NPM : 0806368181

Program Studi : Ekstensi Teknik Kimia

Judul Skripsi : Pembuatan Nanofood Propolis menggunakan

Penyalut Cassein Micelle

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima

sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar

Sarjana Teknik pada Program Studi Ekstensi Teknik Kimia, Fakultas

Teknik, Universitas Indonesia

DEWAN PENGUJI

Pembimbing 1 : Dr.Eng Muhamad Sahlan S.Si, M.Eng ( )

Penguji 1 : Prof.Dr.Ir. Anondho Wijanarko, M.Eng ( )

Penguji 2 : Dr.Ing.Misri Gozan, M.Tech ( )

Penguji 3 : Dr.Ir. Asep Handaya Saputra, M.Eng ( )

Ditetapkan di : Depok

Tanggal : 28 Juni 2011


v

KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH

Segala puja dan puji syukur kehadirat Allah SWT atas setitik ilmu-Nya dan

kehendak-Nya hingga makalah seminar ini dapat selesai tepat pada waktunya.

Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada :

1. Dr. Eng Muhamad Sahlan S.Si, M. Eng selaku dosen pembimbing yang

selalu sabar dan tidak kenal lelah membimbing dan memotivasi penulis.

2. Kedua orang tua penulis yang selalu mendoakan kelancaran penulis di

setiap waktu shalat dan adikku Retmonasari & Haryadi Susanto yang

memberikan motovasi pada penulis.

3. Prof. Dr. Ir. Widodo Wahyu Purwanto, DEA dan selaku Ketua

Departemen Teknik Kimia FTUI dan Ir. Yuliusman, M. Eng selaku

koordinator mata kuliah spesial.

4. Mang Ijal, Kang Jajat, Mas Eko, Mas Taufik, Ius, dan Mas Her atas bantuan

dan masukannya kepada penulis.

5. Mba Lusi dari Balai Inkubator Puspitek Serpong, dan Mba Ita dari Lembaga

Eijkman Jakarta, atas hasil analisa yang sangat membantu penelitian

6. Rekan satu grup riset Bu Imelda, Mba Yusnita, dan Skripsihana, yang telah

menjadi teman diskusi dan memberikan masukan-masukan positif selama

penelitian.

7. Rekan riset grup Bioproses, yaitu grup Alga, grup Biofiltrasi, dan grup

Biodiesel yang memberikan pengalaman dinamika penelitian selama ini.

8. Teman-teman Ekstensi Teknik Kimia FTUI 2008 yang selalu saling

menyemangati dalam kebaikan dan saling mengingatkan dalam kesulitan.

Depok, 28 Juni 2011

Penulis


vi

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Indonesia, saya yang bertanda tangan

dibawah ini:

Nama : Tony Supardi

NPM : 0806368181

Program Studi : Teknik Kimia

Departemen : Teknik Kimia

Fakultas : Teknik

Jenis Karya : Skripsi

demi pengembangan ilmu pengetahuan, menyetujui untuk memberikan kepada

Universitas Indonesia Hak Bebas Royalti Noneksklusif (Non-exclusive Royalty-

Free Right) atas karya ilmiah saya yang berjudul:

PEMBUATAN NANOFOOD PROPOLIS MENGGUNAKAN PENYALUT

CASSEIN MICELLE

beserta perangkat yang ada (jika diperlukan). Dengan Hak Bebas Royalti

Noneksklusif ini Universitas Indonesia berhak menyimpan, mengalih

media/formatkan, mengelola dalam bentuk pangkalan data (database), merawat, dan

memublikasikan tugas akhir saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis/pencipta dan sebagai pemilik Hak Cipta.

Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Depok

Pada tanggal : 28 Juni 2011

Yang Menyatakan

(Tony Supardi)


vii

ABSTRAK

Nama : Tony Supardi

Program Studi : Teknik Kimia

Judul : Pembuatan Nanofood Propolis Menggunakan Penyalut Cassein

Micelle

Propolis adalah produk lebah yang banyak terdapat di Indonesia.

Pemanfaatan propolis diantaranya sebagai makanan berfungsi tinggi yang bernilai

ekonomis, karena propolis memiliki banyak kandungan bioaktif , diantaranya

senyawa flavonoid dan polifenol. Propolis bersifat hidrofob, sehingga tidak

optimal diserap tubuh, oleh karena itu harus diolah terlebih dahulu. Untuk

mendapatkan produk yang bernilai tinggi maka dibuat inovasi terhadap produk

olahan propolis, diantaranya yaitu dengan membuat nanofood propolis.

Tujuan pembuatan nanofood propolis yaitu agar kandungan bioaktif

propolis dapat diserap optimal oleh tubuh. Nanofood propolis menggunakan

penyalut yang bersumber dari protein yaitu casein micelle yang dapat menyalut

senyawa bioaktif hidrofob dalam propolis.

Hasil pemisahan propolis dengan wax nya optimal pada konsentrasi etanol

70%, sehingga propolis ini digunakan untuk penyalutan. Untuk menghasilkan

partikel nano digunakan gelombang ultrasonik terhadap produk, dan untuk

memisahkan partikel nano dilakukan proses mikrofiltrasi. Efisiensi penyalutan

propolis untuk senyawa polifenol hasilnya 67,05%, sementara untuk senyawa

flavonoid 93,9 %, . Dari hasil analisa distribusi ukuran partikel menggunakan

Particle Size Analyzer (PSA), produk nanofood sebelum mikrofiltrasi memiliki

diameter 1353.7 nm, sedangkan produk sesudah mikrofiltrasi memiliki diameter

316,1 nm

Kata Kunci : Nanofood Propolis, Casein micelle, senyawa hidrofob


viii

ABSTRACT

Name : Tony Supardi

Study Program : Chemical Engineering

Title : Production Nanofood Propolis By Encapsulation Cassein

Micelle

Propolis is a bee product that is widely available in Indonesia. Utilization

of propolis as a food of which serves a high economic value, because the propolis

has many content of bioactive compounds including flavonoids and polyphenols.

Propolis is hydrophobic, so it is not absorbed optimal, therefore, must be

processed first. To obtain a high-value product innovations will be made to the

processed product propolis, including by production nanofood propolis.

The purpose to production nanofood propolis is bioactive content can be

absorbed by the body optimally. Nanofood propolis using a encapsulation derived

from the protein casein micelle can encapsulate hydrophobic bioactive

compounds in propolis.

The results of purification propolis was optimal at 70% ethanol

concentration, so that propolis is used for encapsulated. nanoparticles produce

used ultrasonic waves to the product, and to separate the nano particles made

microfiltration process. Encapsulation efficiency propolis for polyphenolic

compounds is 67.05%, while for flavonoid compounds 93.9%. Analysis of

particle size distribution using a Particle Size Analyzer (PSA), a product nanofood

propolis before microfiltration has a diameter of 1353.7 nm, while the products

after microfiltration has a diameter of 316.1 nm

Keyword : Nanofood Propolis, Casein micelle, hydrophobic coumpound


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

LEMBAR PERNYATAAN ORISINALITAS…………………………………...iii

LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................... iv

KATA PENGANTAR ............................................................................................. v

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH…………………...vi

ABSTRAK ............................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ........................................................................................................... ix

DAFTAR GAMBAR .............................................................................................. xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii

1. PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2 Perumusan Masalah ......................................................................... 2

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................. 3

1.4 Batasan Masalah .............................................................................. 3

1.5 Sistematika Penulisan ...................................................................... 4

2. TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5

2.1 Propolis ............................................................................................ 5

2.1.1 Komposisi Propolis………………………………………..6

2.1.2 Potensi Propolis…………………………………………....7

2.2 Nanofood ........................................................................................ 10

2.2.1 Polisakarida………………………………………………11

2.2.2 Lipid / Asam Lemak…………………….………………..12

2.2.3 Protein……………………………………………………13

2.3 Analisa Sampel ............................................................................. 15

2.3.1 Spektrofotometri UV-Visible ............................................. 15

2.3.2 Pengukuran Total Flavonoid dengan Metode AlCl3 .......... 15

2.3.3 Pengukuran Kadar Polifenol Dengan Metode Follin-

Ciocalteau ......................................................................... 16

2.3.4 Elektroforesis SDS-PAGE…………………………….....17

2.3.5 Uji Kadar Protein Lowry…………………………………18

2.3.6. Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel Nano……………19

2.3.7. Pengukuran Morfologi Partikel Nano……………………19

2.4 State of The Art ............................................................................ 20

3. METODELOGI PENELITIAN ........................................................... 23

3.1 Rancangan Penelitian ..................................................................... 23

3.2 Alat dan Bahan Penelitian .............................................................. 24

3.2.1 Peralatan yang digunakan .................................................. 25

3.2.2 Bahan yang digunakan ....................................................... 26

3.3 Prosedur Penelitian ........................................................................ 27

3.3.1 Isolasi Kasein dari Susu Sapi ............................................ 27


x

3.3.2 Ekstraksi Propolis………………………………………...28

3.3.3 Penyalutan Ekstrak Propolis dengan Casein Micelle ......... 29

3.3.4 Metode Analisis ................................................................. 31

3.3.4. 1 Analisa Total Flavonoid ................................................... 31

3.3.4. 2 Analisa Total Polifenol ..................................................... 31

3.3.4. 3 Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Lowry ……...32

3.3.4. 4 Identifikasi Protein dengan metode Sodium Dodecyl

Sulphate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis

(SDS-PAGE)…………………………………………….32

3.3.4. 5 Analisa distribusi ukuran partikel dan morfologi partikel

Nano…………………………………………………….34

4. HASIL DAN PEMBAHASAN…………………………………………35

4.1 Ekstraksi Propolis dari Sarang Lebah……………………………35

4.2 Isolasi Casein Dari Susu Sapi……………………………………37

4.3 Penyalutan Propolis Menggunakan Cassein Micelle…………….38

4.3.1 Efisiensi Penyalutan Propolis………….....………….…..39

4.3.1.1 Hasil Uji Spektrometri……………………..…………….40

4.3.1.2 Hasil Uji (HPLC)…………………………….………….42

4.3.1.3 Hasil Uji SDS PAGE …………………………...………..43

4.4 Distribusi Ukuran partikel………………………………………..44

4.5 Morfologi Partikel Nanofood Propolis…………………………...45

5. KESIMPULAN…………………………………………………………..47

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 48

LAMPIRAN………………………………………………………………….….52


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Gambar Sarang Lebah ..................................................................... 6

Gambar 2.2 Senyawa Flavonoid yang terkandung dalam propolis .................... 7

Gambar 2.3 Pemecahan partikel oleh gelombang ultrasonik............................. 11

Gambar 2.4 Struktur Nanocochleates ................................................................ 13

Gambar 2.5 Gambar Struktur casein micelle .................................................... 14

Gambar 2.6 Alat Particle Size Analizer……………………………………….19

Gambar 2.7 Alat Transmission Electron Microscopy…………………………20

Gambar 3.1 Diagram alir penelitian pembuatan nanofood propolis

menggunakan penyalut casein micelle…………………………..23

Gambar 3.2 Diagram Alir Proses Isolasi Casein Dari Susu Sapi…...……........27

Gambar 3.3 Diagram Alir Proses Ekstraksi Propolis Dari Sarang Lebah ......... 28

Gambar 3.4 Proses Penyalutan Propolis Menggunakan Casein Micelle………30

Gambar 4.1 Pemisahan Propolis dengan waxnya……………………………..35

Gambar 4.2 Grafik Scanning Propolis Cibubur……………………………….36

Gambar 4.3 Pengendapan Casein……………………………………………..38

Gambar 4.4 Proses Penyalutan Propolis menggunakan Casein Micelle……....39

Gambar 4.5 Hasil Analisa HPLC…….………………………………………..42

Gambar 4.6 Identifikasi Protein dengan metode SDS PAGE…………………43

Gambar 4.7 Hasil Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel……………………44

Gambar 4.8 Morfologi nanopartikel menggunakan TEM Sebelum hasil

Mikrofiltrasi………………………………………...……………45

Gambar 4.9 Morfologi nanopartikel menggunakan TEM Sesudah hasil

Mikrofiltrasi……………………………………………………..46


xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 State Of The Art ............................................................................ 22

Tabel 3.1 Alat yang digunakan ...................................................................... 25

Tabel 3.2 Bahan yang digunakan ................................................................... 26

Tabel 4.1 Perhitungan Derajat Pemisahan Propolis dan Wax…………...…..37

Tabel 4.2 Hasil Analisa Spektrometri………...………………………….…40


1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pemanfaatan sumber daya alam hayati yang beragam dan memiliki nilai

ekonomis di negara-negara tropis seperti Indonesia, menjadi salah satu alternatif

pemecahan masalah ekonomi masyarakat Indonesia. Salah satu alternatif

pemanfaatan keberagaman dan ketersediaan sumber daya hayati adalah pemanfaatan

hayati sebagai bioaktif untuk makanan berfungsi tinggi, seperti produk yang

dihasilkan oleh lebah madu, yaitu madu, royal jelly, dan propolis. Propolis biasa

disebut lem lebah , yaitu suatu zat yang dihasilkan oleh lebah dan berfungsi untuk

menambal dan mensterilkan sarang lebah (Sabir A, 2005).

Propolis berasal dari pucuk daun-daun, batang maupun bunga yang

dikumpulkan lebah ditempat dimana lebah tersebut tinggal, untuk kemudian

dicampur dengan air liurnya, yang digunakan untuk menambal dan mensterilkan

sarangnya (Sabir A, 2005). Penelitian yang dilakukan, memberikan hasil kandungan

bioaktif propolis yang berbeda-beda pada tiap daerah bergantung pada lokasi dimana

lebah tinggal. Senyawa bioaktif organik yang ada dalam propolis hampir 50% adalah

senyawa flavonoid, dan terdapat pula senyawa lain seperti asam ferolat, dan

terpenoid. Flavonoid adalah senyawa organik yang berfungsi sebagai antibakteri dan

antikanker, asam ferulat berfungsi sebagai zat antibiotik, sedangkan terpenoid

berfungsi sebagai antivirus (Gonzalez et al, 2003). Propolis didapatkan dengan cara

ekstraksi terhadap sarang lebah, pelarut yang digunakan untuk ekstraksi adalah

larutan etanol, hasil ekstraksi ini dinamakan ekstrak etanol propolis (EEP) (Gonzalez

et al, 2003 ).

Penelitian tentang propolis hingga kini sangat intensif dilakukan, terutama

terhadap propolis yang berasal dari Brazil dan Cina. Penelitian dilakukan meliputi

kandungan propolis, manfaat dari propolis, dan sumber tanaman yang digunakan

lebah untuk membentuk propolis tersebut, seperti propolis asal Brazil, propolis

tersebut mengandung senyawa flavonoid tertentu yang berfungsi sebagai antikanker,


2

Universitas Indonesia

setelah diteliti, ternyata sumber tanaman yang digunakan lebah ditempat tersebut

adalah tumbuhan Baccharis dracunculifolia (Alecrim do Campo) yang hanya terdapat

di Brazil (Lotfy, 2006).

Produk olahan propolis kini banyak digunakan sebagai suplemen berbentuk

cair atau tablet, dengan sifat propolis yang sulit larut dalam air (hidrofob), kandungan

bioaktif yang memiliki sifat hidrofob tidak optimal dicerna oleh tubuh (Chen et al,

2006) , oleh sebab itu dibutuhkan inovasi dalam hal teknologi pengolahan propolis,

agar zat bioaktif propolis terserap oleh tubuh secara optimal. Inovasi dapat dilakukan

dengan penyalutan menggunakan casein micelle terhadap propolis dan menjadi

produk akhir berukuran nanopartikel. Nanopartikel adalah partikel yang memiliki

ukuran sekitar 10-1000 nm (Mohanraj & Chen, 2006).

. Salah satu aplikasi nanopartikel adalah sebagai sistem pengantaran zat aktif

(carrier), dengan cara melarutkan, menjebak, mengkapsulasi, atau menempelkan zat

aktif didalam matriksnya (Chen et al, 2006). Tujuan utama dalam melakukan

rancangan nanopartikel propolis adalah untuk mengatur ukuran partikel, dan sifat-

sifat morfologi dari permukaan. Berdasarkan alasan-alasan tersebut maka kajian

terhadap nanofood propolis perlu dikembangkan untuk dapat memberikan nilai lebih

terhadap propolis.

1.2 Perumusan Masalah

Masalah yang dikaji dalam penelitian kali ini adalah

Bagaimana membuat nanofood dari ekstrak etanol propolis dan menyalutnya

menggunakan casein micelle

Bagaimana efisiensi penyalutan propolis menggunakan casein micelle

.


3


1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah :

Mendapatkan produk nanofood propolis menggunakan penyalut casein

micelle

Menyelidiki efisiensi penyalutan zat aktif propolis, yaitu total flavonoid dan

total polifenol

1.4 Batasan Masalah

Batasan masalah dari penelitian ini adalah :

Propolis yang digunakan berasal dari Cibubur

Penyalut yang digunakan untuk menyalut propolis adalah casein micelle

Casein di isolasi dari susu sapi

Metode analisa kandungan bioaktif propolis yang digunakan adalah metode

aluminium klorida (AlCl3) untuk analisa total flavonoid, dan metode Follin-

Ciocalteau untuk analisa total polifenol

Identifikasi protein casein micelle menggunakan metode SDS-PAGE

Metode pengukuran distribusi partikel nano menggunakan alat Particel Size

Analizer (PSA), dan untuk mengetahui morfologi partikel menggunakan alat

Transmission Electronic Microscopy (TEM)


4


1.5 Sistematika Penulisan

Sistematika penulisan dalam skripsi ini dilakukan dengan membagi tulisan

menjadi lima bab, yaitu :

BAB 1 PENDAHULUAN

Bab ini berisi latar belakang penelitian, perumusan masalah

yang dibahas, tujuan dilakukannya penelitian, batasan masalah,

dan sistematika penulisan

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

Bab ini berisi tentang propolis, potensi propolis, nanofood

sebagai nanodelivery, metode analisis , state of the arts dari

penelitian ini.

BAB 3 METODE PENELITIAN

Bab ini berisi tentang metode pelaksanaan penelitian, model

penelitian, peralatan dan bahan yang digunakan dalam

penelitian, prosedur penelitian.

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Bab ini berisi tentang pembahasan hasil ekstraksi propolis dan

analisa derajat pemisahannya, isolasi casein dari susu sapi,

efisiensi penyalutan propolis menggunakan casein micelle

(total polifenol & total flavonoid), distribusi ukuran partikel

dan morfologi partikelnya

BAB 5 KESIMPULAN

Mendapatkan produk nanofood propolis dan menyalutnya

menggunakan casein micelle. Efisiensi penyalutan propolis

menggunakan casein micelle. Mengetahui distribusi ukuran

partikel dan morfologi nanofood propolis


5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Propolis

Propolis merupakan campuran resin yang dikumpulkan oleh lebah dari

kuncup pohon, cairan tanaman, dan sumber flora lain, kemudian dicampur dengan air

liurnya, yang digunakan untuk menambal dan mensterilkan sarangnya. Kata propolis

diambil dari bahasa Yunani yang terdiri atas pro yang berarti penjaga dari dan

polisyang berarti kota. Secara umum propolis berfungsi sebagai penjaga koloni lebah

dan produknya dari serangan mikroorganisme (Salatinoet al, 2005).

Propolis di dalam koloni lebah digunakan untuk menutup celah-celah kecil

pada sarang lebah (rata-rata kurang dari 6,35 mm) sedangkan celah yang lebih besar

ditutup dengan lilin lebah. Propolis juga berguna untuk menjaga suhu dalam sarang,

yaitu 35 ºC (Fajrina, 2009).Dinding heksagonal sarang lebah terbuat dari campuran

lilin lebah dan propolis, selain berfungsi menguatkan dinding sel, juga dipercaya

memberikan perlindungan dari mikroorganisme (Salatinoet al, 2005).

Warna dari propolis sangat bervariasi tergantung pada jenis tanaman yang

dikonsumsi lebah, pada umumnya warna propolis adalah kuning, coklat dan coklat

tua.Pada suhu 25-45 ºC, propolis bersifat sangat lengket, lentur, dan tidak keras.Di

atas suhu tersebut, propolis menjadi semakin lengket dan seperti permen

karet.Sedangkan pada suhu rendah, propolis mengeras dan rapuh.Pada suhu 60-70 ºC

propolis mulai mencair (Suranto, 2007).

Propolis didapatkan dari sarang lebah dengan cara diekstrak menggunakan

etanol, metode ekstraksinya adalah maserasi. Maserasi merupakan salah satu metode

ekstraksi untuk bahan-bahan yang tidak tahan panas, yaitu dengan merendam bahan

dengan pelarut tertentu dan dalam jangka waktu tertentu (Suranto, 2007). Hasil

ekstraksi dari sarang lebah, bukan hanya propolis yang terekstrak, tapi wax pun ikut

terekstrak, sehingga propolis perlu dimurnikan. Wax dianggap sebagai pengotor

karena memberikan warna gelap, dan rasa pahit pada propolis. Metode pengukuran


6


pemurnian yang digunakan adalah dengan mengukur rasio absorbansi (A310/A660)

pada alat spektrofotometer (Hamada et al, 1996)

Gambar 2.1 Sarang Lebah

2.1.1 Komposisi Propolis

Propolis merupakan produk alami yang memiliki potensi besar dalam

pengobatan manusia.Propolis memiliki komposisi yang sangat bervariasi, hal ini

dipengaruhi oleh perbedaan geografi, jenis makanan dari lebah, suhu, bahkan hari

ketika propolis dikumpulkan, (Salatino et al, 2000). Secara umum, komponen utama

dari propolis adalah senyawa flavonoid dan senyawa fenolat, termasuk caffeic acid

phenylethylester (lofty, 2006).

Flavonoid merupakan senyawa golongan polifenol yang kebanyakan terdapat

dalam tumbuhan, biji, kulit buah atau kulit, termasuk juga dalam propolis.Flavonoid

telah banyak digunakan dalam produk farmasi, kosmetik, dan makanan, baik senyawa

murni maupun sediaan herbal (misalnya ekstrak) dengan aktivitas biologis tertentu.


7


Ada berbagai macam senyawa flavonoid yang terkandung di dalam propolis

diantaranya yaitu: pinocembrin, acacetin, chrysin, rutin, catechin, naringenin,

galangin, dan quercetin(Volpi et al, 2006)

pinocembrin, acacetin, chrysin

rutin, catechin, naringenin

galangin, quercetin

Gambar 2.2 Senyawa Flavonoid yang ada dalam propolis (Volvi etal, 2006)

2.1.2. Potensi propolis

Dengan komposisi kimia propolis yang banyak mengandung senyawa

polifenol dan senyawa flavonoid, maka banyak sekali potensi propolis yang dapat


8


dimanfaatkan, seperti sebagai antimikroba, antiimflamasi, antikanker, dan

antioksidan.

1. Antimikroba

Antimikroba (AM) ialah obat atau antibiotik pembasmi mikroba,

khususnya mikroba yang merugikan manusia. Propolis yang memiliki

senyawabioaktif flavonoid memiliki efek antibiotik alami yang kuat untuk

menangkal infeksi yang disebabkan oleh jamur, bakteri, dan virus sehingga

efektif untuk mengobati penyakit-penyakit akibat mikroba tersebut (Lotfy,

2006).

a. Aktivitas Anti bakteri

Mekanisme antibakteri dalam mengendalikan bakteri ada beberapa

macam, yaitu memecah dinding sel, mendenaturasi protein sel,

menghambat kerja enzim, dan menghambat sintesis asam nukleat protein.

Dengan kandungan bioaktif propolis yang banyak, ekstrak propolis

memiliki aktivitas antibakteriterhadap Gram-positif , tetapi mempunyai

aktivitas terbatas terhadap strain Gram-negatif (Lotfy, 2006). Bakteri

yang berhasil di induksi oleh ekstrak propolis yaitu Staphylococcus

mutans, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Pseudomonas

aeruginosa, Bacillus cereus,S.sonnei ( Hudnal et al, 2007 )


9


b. Aktivitas anti virus

Aktivitas antivirus dilakukan percobaan melalui aktivitas in vitro

3-methyl-but-2-enyl cafeate yang diisolasi dari tunas poplar yang telah

diteliti dapat melawan virus Herpes simplex tipe-1 (Huleiheletal, 2002).

Penelitian menunjukkan isopentyl ferulated adalah senyawa kandungan

minor dari propolis, sangat efektif mereduksi sintesis virus-titer dan DNA

virus. Penelitian menghasilkan bahwa isopentyl ferulated (diisolasi dari

propolis) dapat menghambat secara signifikan aktivitas virus yang mudah

menular dan menginfeksi, seperti virus influenza A1 Honey Kong

(H3N2) secara in vitro . Pemberian secara teratur ekstrak aqueous

propolis menurunkan mortalitas dan meningkatkan rata-rata ketahanan

hidup tikus-tikus yang diinfeksi dengan virus influenza A/PR8/34 (H0N1)

(Huleihel et al, 1981).

c. Aktivitas anti fungi

Aktivitas antifungi propolis banyak dilakukan oleh peneliti,

diantaranya dengan mencobakan pada Candida albicans, Aspergillus

flavus, A.ochraceus, Penicillium notatum viridicatum, hasilnya adalah

ekstrak propolis memiliki aktivitas penghambatan terhadap fungi tersebut

(Hudnalet al , 2007).

2. Anti Inflamasi

Peradangan atau inflamasi adalah bagian dari respon biologi kompleks

jaringan pembuluh darah terhadap rangsangan berbahaya, seperti patogen, sel

yang rusak (luka), atau iritasi..Senyawa antiinflamasi yang ditemukan dalam

propolis adalah Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE).CAPEyang terdapat

dalam propolis mempunyai sifat anti-inflamasi, salah satunya mencobakan

pada T-sel (Lotfy, 2006).


10


3. Aktivitas Antikanker

Aktivitas antikanker dari propolis diteliti dapat menghambat sel

kanker HeLa (sel kanker serviks), Siha (sel kanker uterus), serta T47D dan

MCF7 (sel kanker payudara) dengan nilai berkisar 20 – 41 µg/ml. Artinya,

propolis dosis 20 – 41 µg/ml dapat menghambat aktivitas 50% sel kanker

dalam kultur (Pratiwi, 2009). Kandungan bioaktif propolis yang dapat

mencegah kanker yaitu senyawa caffeic acid phenethyl ester (CAPE) (Maruta,

2010).

4. Aktivitas Antioksidan

Antioksidan adalah senyawa yang mampu untuk menghambat dan

mencegah proses oksidasi, akan tetapi tidak dapat meningkatkan kualitas

produk yang sudah teroksidasi. Kandungan propolis yang banyak

mengandung senyawa polifenol bermanfaat sebagai antioksidan yang

melindungi sel tubuh dari kerusakan akibat radikal bebas dengan cara

mengikatzat radikal bebas. Senyawa bioaktif propolis yang memiliki

aktivitas antioksidan adalah pinocembrin, chrysin, galangin, dan caffeates

(Gregoris & Stevanato, 2009)

2.2 Nanofood

Suatu makanan dapat dikatakan sebagai nanofood ketika ukuran partikel

makanan tersebut berukuran nano, yaitu antara 10- 1000 nm (Mohanraj & Chen,

2006).Pembentukan partikel nano dapat menggunakan gelombang ultrasonic

(frekuensi diatas 16 khz), efek yang terjadi karena gelombang ultrasonik adalah

terjadinya kavitasi akustik. Kavitasi akustik adalah pembentukan, pengembangan,

dan pemecahan gelembung di dalam cairan yangdisebabkan oleh gelombang suara.

Kavitasi akustik dapat memecah partikel padatan menjadi lebih kecil. Hal ini terjadi


11


akibat ketidaksempurnaan permukaan partikel yang berperan sebagai inti bagi

pembentukan gelembung kavitasi padapermukaan yang selanjutnya saat pecah

menjadi gelombang kejut yang dapat memecah partikel menjadi lebih kecil, seperti

yang terlihat pada gambar 2.3.

Gambar 2.3 Pemecahan patikel oleh gelombang ultrasonic

( Sumber : http://www.hielscher.com/id/disperse.htm)

Salah satu aplikasi dari nanofood adalah sebagai “nano-delivery”, yaitu

makanan berukuran nanopartikel yang berfungsi sebagai pengantaran obat/bioaktif ke

tujuan atau target kemudian bioaktif dilepaskan ketika sudah sampai ke

sasaran.Adapun bahan dasar nanodelivery, diantaranya adalah polisakarida, lipid, dan

protein.

2.2.1 Polisakarida

Polisakarida adalah polimer dengan beberapa ratus hingga ribu monosakarida

yang dihubungkan dengan ikatan glikosidik (Fessenden, 1982).Bahan yang umum

digunakan untuk membuat nanodelivery dari polisakarida adalah kitosan. Kitosan

adalah biopolimer glokosamin linier yang terbentuk dari unit ulang 2-amino-2deoksi-


http://www.hielscher.com/id/disperse.htm

12


D-glukosa atau disebut (1,4)-2-amino-2-deoksi-D-glukosa dan ini merupakan nama

resmi kitosan yang mempunyai berat molekul rata-rata 120.000. Selain itu kitosan

memiliki sifat Biokompatibel artinya sebagai polimer alami sifatnya tidak

mempunyai efek samping, tidak beracun, tidak dapat dicerna, dan mudah diuraikan

oleh mikroba (biodegradable).

Aplikasi penggunaan nanodelivery kitosan digunakan untuk menyalut

senyawa doxorubicin (DOX).Senyawa DOX memiliki sifat hidrofilik ,untuk

membentuk nanopartikel dibentuk oleh gelasi ionik dari polisakarida kitosan (Janes et

al, 2001).

2.2.2 Lipid / Asam lemak

Asam lemak / lipid ialah istilah umum yang digunakan untuk

menjabarkan bermacam-ragam molekul-molekul yang disintesis

dari polimerisasi asetil-KoA dengan gugus malonil-KoA ataumetilmalonil-KoA di

dalam sebuah proses yang disebut sintesis asam lemak. Asam lemak terdiri

dari rantai hidrokarbon yang berakhiran dengan gugus asam karboksilat,

penyusunan ini memberikan molekul ujung yang polar dan hidrofilik, dan ujung

yang nonpolar dan hidrofobik yang tidak larut di dalam air (Fessenden, 1982).

Asam lemak yang biasa digunakan untuk membuat nanofood adalah

cochleates.Cochleates digunakan untuk mengangkut antigen dan peptida untuk

delivery vaksin. Struktur Cochleate tidak selalu seragam, sehingga baik dalam agregat

dari lembar ditumpuk dan cochleates dibuat dengan metode menjebak atau struktur

ukuran besar seperti jarum oleh metode Dialisis.Nanocochleatesdikembangkan

menjadi partikel lebih kecil tetapi dengan lebih konsisten, nanocochleates dapat

dibentuk dengan partikel rata-rata kurang dari 500 nm. Nanocochleates ini adalah

sangat cocok untuk penyalutan obat hidrofobik, seperti amfoterisin B. Amfoterisin B

adalah agen antijamur yang kuat, dalam model infeksi murine kandidiasis,

aspergillosis, dan kriptokokosis (Zarif,2002)


http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_lemak

http://id.wikipedia.org/wiki/Polimerisasi

http://id.wikipedia.org/wiki/Asetil-KoA

http://id.wikipedia.org/wiki/Gugus_fungsional

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Malonil-KoA&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Metilmalonil-KoA&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Sintesis_asam_lemak&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawa_alifatik

http://id.wikipedia.org/wiki/Asam_karboksilat

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Polaritas_kimia&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Hidrofilik

http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Hidrofob&action=edit&redlink=1

http://id.wikipedia.org/wiki/Kelarutan

13


Gambar 2.4 Struktur Nanocochleates

(http://www.pharmainfo.net/reviews/nanocochleates-novel-drug-delivery-technology)

2.2.3 Protein

Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling

utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan

polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain

dengan ikatan peptidae. Senyawa protein dapat digunakan untuk manakan molekul

pembawa (carier) bagi beberapa zat aktif.

, m Bahan nanodelivery berbasis protein yang banyak terdapat

dalamdigunakan adalah protein cassseincasein. Casein banyak terdapat pada susu

sapi, Casein banyakdari 35 gram protein per liter susu, hampir 80% penyusun protein

tersebut adalah casein yang tersusun membentuk micelle. Casein micelle misel inilah

yang memiliki fungsi sebagai sistem nano delivery bagi senyawa hidrofod, contohnya

adalah untuk menyalut vitamin D2 (Semoet al, 2006).


http://www.pharmainfo.net/reviews/nanocochleates-novel-drug-delivery-technology

14


Gambar 2.5 Gambar struktur casein micelle (Kitts et al, 2011)

Cassein micelle disusun oleh empat jenis casein, casein alpha 1, casein alpha

2, casein beta, dan casein kappa, dengan rasio 4:1:4:1. casein membentuk miselia

dengan interaksi hidropobik oleh jembatan kalsium fosfat dan serin fosfat. Susunan

casein berbentuk miselia sangat penting untuk kesetabilan koloid susu sehingga

mudah untuk disimpan dan mudah untuk dicerna, selain itu nutrisi yang tersimpan

didalam miselia tersebut dapat dengan mudah diberikan dari induk ke anaknya (Semo

et al, 2007).

Nanodelivery dengan basis protein yang lain , yaitu bovine serum albumin

(BSA), kegunannya adalah untuk mengirimkan zat bone morphogenetic protein-2

(BMP-2), yaitu zat yang berfungsi untuk merangsang factor pertumbuhan tulang.

Metode pembuatannya yaitu dengan proses coaservasi yang dimodifikasi dengan

dengan adsorpsi elektrostatik polyethylenimine kationik (PEI) (Zhang et al, 2008).

Adapula gelatin berfungsi sebagai alternatif untuk pembawa (carrier) sistem DNA.

Metode nanopartikel gelatin diproduksi dengan dua tahap desolvasi. Caranya yaitu

mengikat DNA oleh interaksi elektrostatik ke permukaan partikel ( Zwiorek et al,

2004)


15


2.3 Analisa sampel

2.3.1 Spektofotometri UV-Visible

Spektrofotometri adalah metode analisis zat berdasarkan interaksi materi

dengan radiasi ultramagnetik (Fessenden, 1982).Dasar dari spektofotometri UV-VIS

adalah absorpsi. Absorpsi dalam daerah ultraviolet dapat menyebabkan eksitasi

electron yang meliputi transisi electron π,σ,n,d,f, dan transfer muatan. Panjang

gelombang serapan merupakan perbedaan ukuran tingkat-tingkat energi dari electron

yang tereksitasi.Oleh karena itu puncak absorpsi (λmaks) dapat dihubungkan dengan

jenis-jenis ikatan yang ada dalam spesies.Sumber radiasi yang dipancarkan dan

seberapa besar radiasi yang diserap oleh larutan harus memenuhi hokum Lambert

Beer.Hukum lambert Beer menyatakan bahwa fraksi penyerapan sinar tidak

bergantung pada intensitas sumber cahaya, tetapi bergantung dengan banyaknya

molekul yang menyerap (Fessenden, 1982).

2.3.2 Pengukuran Total Flavonoid Dengan Metode AlCl3,

Pengukuran ini dimulai dengan melakukan hidrolisis terhadap sampel. Hal ini

bertujuan flavonoid dalam bentuk glikosida (flavonoid yang masih terikat dalam

gula) dapat terurai menjadi flavonoid dalam bentuk gugus aglikon (flavonoid tunggal)

karena analisis flavonoid akan lebih baik dalam bentuk aglikonnya (Chang et al,

2002).

Prinsip dari metode pewarnaan ini adalah AlCl3 membentuk kompleks asam

yang stabil dengan C-4 gugus keto, lalu dengan C-3 atau C-5 gugus hidroksil dari

flavon dan flavonol. Selain itu AlCl3 juga membentuk kompleks asam yang labil

dengan gugus ortodihidroksil pada cincin A atau cincin B dari flavonoid (Chang et

al.2002) sehingga akan mempunyai serapan maksimum pada panjang gelombang 415

nm.

Standar uji yang digunakan dalam analisa total flavonoid adalah quercetin,

perhitungan kadar total flavonoid sampel didapatkan dengan cara memasukan nilai


16


absorbansi larutan sampel ke dalam persamaan linieritas kurva standar flavonoid

yang telah dibuat.

Persamaannya yaitu : y = ax + b

Keterangan y = Absorbansi sampel

x = Kadar total flavonoid sampel (µg/mL)

a = Slope dari kurva standar

b = Intersep dari kurva standar

Kandungan total flavonoid sampel diekspresikan dengan microgram (µg) quercetin

𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝐹𝑙𝑎𝑣𝑜𝑛𝑜𝑖𝑑 µ𝑔 = 𝑉 𝑚𝐿 × 𝐶 µ𝑔

𝑚𝐿

V = Volume akhir sampel

C = Konsentrasi sampel

2.3.3 Pengukuran Kadar Polifenol Dengan Metode Follin-Ciocalteau

Uji kadar polifenol didasarkan pada prinsip reaksi oksidasi-reduksi dengan

menggunakan metode Follin-Ciocalteau. Reagen Follin-Ciocalteau merupakan

campuran asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat. Antioksidan dapat mereduksi

reagen sehingga terbentuk kompleks warna biru (kromatogen) dengan absorbansi

maksimum pada panjang gelombang 745-750 nm ( Asam fosfotungstat (P2W18O62-7

)

tereduksi menjadi H2P2W18O62-8

dan asam fosfomolibdat (H2P2Mo18O62-6

) tereduksi

menjadi H6P2Mo18O62-6

(Wuisan, 2007)

Uji kadar polifenol memiliki kelebihan, yaitu dapat menghitung secara

kuantitatif semua grup fenolik seperti antosianin, dan fenolik. Namun demikian, uji

kadar polifenol juga memiliki kelemahan, antara lain tidak mampu membedakan tipe-

tipe fenol yang terkandung (monomer/dimer/trimer). Selain itu, keberadaan protein ,

asam nukleat, dan asam askorbat dapat mempengaruhi uji polifenol (Häkkinen, 2000)


17


Standar uji yang digunakan dalam analisa total polifenol adalah asam galat,

perhitungan kadar total polifenol dari sampel didapatkan dengan cara memasukan

nilai absorbansi larutan sampel ke dalam persamaan kurva standar polifenol yang

telah dibuat (Wuisan, 2007). Kadar total polifenol sampel berbanding lurus dengan

absorbansi.

Persamaannya yaitu : y = ax + b

Keterangan y = Absorbansi sampel

x = Kadar total polifenol sampel(µg/mL)

a = Slope dari kurva standar

b = Intersep dari kurva standar

Kandungan total polifenol sampel diekspresikan dengan microgram (µg) asam galat

𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑃𝑜𝑙𝑖𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 µ𝑔 = 𝑉 𝑚𝐿 × 𝐶 µ𝑔

𝑚𝐿

V = Volume akhir sampel (mL)

C = Konsentrasi sampel (µ𝑔

𝑚𝐿)

2.3.4 Elektroforesis SDS - PAGE

Elektroforesis merupakan salah satu metode mengetahui kemurnian sampel

dimana sampel ditempatkan dalam medan listrik. Sampel akan ditempatkan dalam

medan listrik pada pH dan arus konstan. Protein pada setiap pH memiliki muatan

bersih rata - rata selain pH isoelektrik. Hal ini menyebabkan protein bergerak dalam

medan listrik. Mobilitas molekul protein akan berbanding terbalik dengan ukuran

molekul. Molekul yang memiliki berat 20 kDa akan memiliki mobilitas yang berbeda

dengan molekul 40 kDa. Gel poliakrilamid yang divariasikan kerapatan porinya

digunakan sebagai lintasan sampel protein (Alberts et al, 1994).

Pada elektroforesis SDS - PAGE, sampel didenaturasi terlebih dahulu dengan

deterjen Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). SDS akan mendenaturasi struktur sekunder


18


protein serta ikatan non disulfida yang dihubungkan dengan struktur tersier. Senyawa

ini mengikat daerah hidrofobik molekul protein sehingga menyebabkannya terurai

menjadi rantai polipeptida yang panjang. Molekul protein individu dilepaskan dari

asosiasinya dengan protein lain dan lipid, serta bebas terlarut pada larutan SDS

(Alberts et al, 1994).

SDS memberikan muatan negatif pada sampel protein sehingga protein dapat

bergerak menuju anoda saat diberi medan listrik. Selain itu juga akan membuat

agregat terlarut dan terkonversi menjadi rantai polipeptida tunggal sehingga tidak

menyumbat pori-pori gel dan molekul protein memiliki muatan yang seragam

sehingga pemisahan hanya bergantung pada ukuran molekul. Molekul dengan ukuran

yang mirip, akan lebih mudah dipisahkan jika menggunakan teknik SDS - PAGE

Berat molekul komponen protein pada sampel kemudian ditera berdasarkan protein

marker yang juga di-running, dan sudah diketahui pasti berat molekulnya (Scopes,

1993).

2.3.5 Uji Kadar Protein Lowry

Uji protein Lowry adalah biokimia assay untuk menentukan tingkat total

protein dalam suatu larutan. Konsentrasi total protein ditunjukkan oleh perubahan

warna larutan sampel secara proporsional dengan konsentrasi protein. Metode Lowry

merupakan pengembangan dari metode Biuret. Reaksi yang terlibat adalah kompleks

Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis

Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I) (Sudarmanto, 2008).

Ion Cu+ kemudian akan mereduksi pereaksi Folin-Ciocalteu, kompleks

phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan

heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping

asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif dan diukur

absorbansinya pada 750 nm. Kekuatan warna biru bergantung pada konsentrasi residu

tryptophan dan tyrosine-nya yang menunjukan konsentrasi total protein dalam

sampel. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode

Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya


19


berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak

interferensinya akibat kesensitifannya (Sudarmanto, 2008).

2.3.6. Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel Nano

Pengukuran distribusi partikel nano menggunakan particle size analyzer

(PSA), sampel yang ada didispersikan menggunakan pelarut yang sesuai, lalu akan

dilewatkan sinar photon yang berfungsi berinteraksi dengan partikel yang ada, dari

intensitas interaksi tersebut akan diterjemahkan kedalam diameter ukuran partikel di

dalam display data. (Susanti, 2010)

Gambar 2.6. Alat Particle Size Analizer (PSA)

2.3.7. Pengukuran Morfologi Partikel Nano

Karakterisasi morfologi partikel nano menggunakan teknik transmission

electron microscopy (TEM) untuk melihat objek gambar dari spesimen.Aplikasi dari

TEM yaitu untuk melihat visualisasi koloid cairan struktur nano yang membutuhkan

vitrifikasi yang cepat dari sampel, sehingga teknik ini disebut sebagai cryo-

TEM.(Yean Won, 2003)

Prinsip dari metode cryo TEM yaitu, elektron ditembuskan ke dalam obyek

pengamatan dan pengamat mengamati hasil tembusannya pada layar

display.spesimen yang ingin dilihat harus spesimen beku terhidrasi, dan disimpan


20


pada suhu nitrogen cair selama pengamatan tersebut (Yean Won, 2003).Analisis

TEM dilakukan di Lembaga Bio Molekular Eijkman, Jakarta.

Gambar 2.7.Alat Transmission Electron Microscopy (TEM)

2.4 State of The Arts

Keuntungan dari teknologi nano pada makanan atau obat-obatan, diantaranya

adalah membuat penyimpanan makanan lebih lama, dan tidak mudah rusak, rasa yang

tidak berubah, tidak terlalu mahal, mudah diserap oleh tubuh dan aman untuk di

konsumsi (Sjaikhurrizal, 2010).

Penelitian tentang nanofood sedang berkembang saat ini, seperti nanofood

dengan penyalut protein.Protein memiliki fungsi unik, selain proteinnya bermanfaat

bagi tubuh, protein pun dapat digunakan untuk menyalut senyawa bioaktif


21


tertentu.Dalam perkembangannya protein dapat berfungsi juga sebagai pembawa

makanan (carier) dan menyalut senyawa yang hidrofob (Semo et al, 2007).

Propolis yang memiliki banyak zat bioaktif didalamnya memiliki sifat

yanghidrofob sehingga tidak optimal diserap oleh tubuh (Hamada et al, 1996).Oleh

karena itu pertu ada perlakuan terhadap propolis sebelum dikonsumsi agar dapat

diserap optimal oleh tubuh, salah satunya adalah dengan membuat produk berukuran

nano (Chen et al, 2006).

Penelitian nanofood propolis hingga kini baru dilakukan oleh Dong-Myung

Kim, 2008, dimana penyalut yang digunakan adalah polimer sintetis, yaitu kopolimer

N-isopropylacrylamide (NIPAAM),N-vinyl-2-pyrrolidone (VP), poly(ethylenglycol)

monoacrylate (PEG-A) lalu disintesis dengan radikal bebas. Lalu ditambahkan

propolis kedalam polimer tersebut. Pada penelitian ini, metode pengeringan yang

digunakan yaitu liopilisasi

Penelitian nanofood dengan menggunakan penyalut protein banyak dilakukan,

terutama untuk senyawa yang hidrofob (Semo et al, 2007), oleh karena pada

penelitian kali ini akan dilakukan percobaan penelitian pembuatan nanofood propolis

dengan penyalut protein, karena propolis memiliki sifat hidrofob.


22


Polisakarida Lipid Protein Polymer

Doxorubicinkitosan ,Kevin,A Janes

et al (2001)

amphotericin Bcochleates, Leila Zarif

et al (2002)

Vaccinearchaeosomes,

Benvegnu, T (2009)

Bone

morphogenetic

protein-2 (BMP-2)

Albumin, Sufeng

Zhang,et al (2008)

Gene DNA

Gelatin, Laus

Zwiorek, et al

(2005)

Vit D2kasein, Efrat

Semo (2007)

PropolisPenelitian Yang

Dilakukan

(NIPAAM),N-vinyl-

2-pyrrolidone (VP),

Dong-Myung Kim

et al (2008)

Nano carriers

S

e

n

y

a

w

a

A

k

t

i

f

Gambar 2.8. State of The Art pembuatan nanofood propolis dan ruang lingkup

penelitian


23

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioproses Kimia Departemen Teknik

Kimia Universitas Indonesia, Depok. Diagram alir penelitian pembuatan nanofood

propolis dengan penyalut casein micelle, ditunjukkan gambar 3.1.

Gambar 3.1. Diagram alir penelitian pembuatan nanofood propolis menggunakan

penyalut casein micelle.

Analisa derajat

pemisahan propolis

dengan waxnya

Total flavonoid

Total Polifenol

Efisiensi

Penyalutan

Distribusi

Ukuran

Partikel

Penyalutan propolis

dengan casein

micelle

Morfologi

nanopartikel

Studi Literatur

Ekstraksi

Propolis dari

sarang lebah

Isolasi Casein dari

susu sapi


24


Tahapan awal penelitian adalah studi literatur yang dilakukan dengan

mempelajari jurnal publikasi nasional maupun internasional yang berkaitan dengan

penelitian propolis dan casein micelle sebelumnya. Langkah berikutnya adalah

pembuatan casein, dengan mengisolasinya dari susu sapi. Ekstraksi propolis

menggunakan pelarut etanol, kemudian hasil ekstrak propolis dianalisa derajat

pemisahanya dari wax. Metode pengukuran yang digunakan menggunakan alat

spektrofotometer dengan membandingkan absorbansi pada dua panjang gelombang

yaitu pada panjang gelombang 310 nm dan 660 nm (A310/A660). Pengujian kualitas

propolis diuji dengan dua parameter yaitu total flavonoid dan total polifenol.

Langkah selanjutnya adalah pembuatan nanofood dengan penyalut casein

micelle, metodenya adalah mencampurkan casein yang sudah ditambahkan Buffer pH

10 lalu ditambahkan propolis, diaduk sampai rata menggunakan magnetic stirrer

pada suhu 37 ºC di hotplate. Untuk menghasilkan partikel nano, hasil pencampuran di

lakukan proses ultrasonik selama 15 menit. Lalu produk di saring, lalu dianalisis

kandungan total flavonoid, total polifenol, distribusi ukuran partikel dan morfologi

partikel nano.

Analisis total flavonoid menggunakan metode alumunium klorida (AlCl3)

sample yang ditambahkan AlCl3 memberikan warna biru , lalu dibaca absorbansinya

pada alat spektrofotometer pada panjang gelombang 415 nm, standar yang digunakan

adalah quercetin. Sedangkan analisis total polifenol menggunakan metode Follin

Ciocalteu, sampel yang ditambahkan pereaksi Follin Ciocalteu memberikan warna

biru tua, lalu dibaca absorbansinya dengan alat spektrofotometer pada panjang

gelombang 765 nm, standar yang digunakan adalah asam alat. Pengukuran distribusi

ukuran partikel menggunakan alat Particel Size Analizer (PSA), untuk morfologi

partikel nano menggunakan alat transmission electron microscopy (cryo-TEM)

3.2. Alat dan Bahan Penelitian

Pada penelitian pembuatan nanofood propolis dengan penyalut casein micelle

digunakan alat dan bahan sebagai berikut :


25


3.2.1. Alat

Alat yang digunakan dalam pengujian ini dapat dilihat pada tabel 3.1.

Tabel 3.1. Alat yang digunakan

No. Alat Kegunaan

1 Erlenmeyer 250 mL Untuk wadak Ekstraksi Propolis

2 hotplate Untuk menjaga suhu reaksi

3 Labu ukur 10 mL Wadah untuk melarutkan

4 Labu ukur 50 mL Wadah untuk membuat larutan

5 Labu ukur 25 mL Wadah untuk mecampurkan

6 Tabung kerucut Wadah untuk mencampurkan

7 Kaca arloji Wadah untuk menimbang

8 Desikator Menyimpan mikrosfer hingga digunakan

9 Corong Alat bantu memasukkan cairan

10 Batang pengaduk Mengaduk larutan

11 Sentrifugasi Mengendapkan

12 Timbangan Menimbang propolis

13 Pipet tetes Untuk menera labu ukur dan menambahkan

pereaksi

14 Pipet ukur Menambahkan suatu larutan dengan volume

tertentu

15 Amicon 8050 stirred ultra-

filtration

Memfilter proses ultrafiltrasi

16 Spektrofotometer Membaca absorbansi sampel

17 Ultrasonic Untuk membuat partikel nano

18 cryogenic transmission

electron microscopy (cryo-

TEM)

Untuk melihat morfologi partikel nano

19 Mikropippet Memindahkan larutan secara kuantitatif

20 Particle Size Analizer (PSA) Mengukur Distrisbusi Ukuran Partikel


26


3.2.2. Bahan

Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini dapat dilihat pada

tabel 3.2:

Tabel 3.2. Bahan yang digunakan

No Bahan Kegunaan

1 Sarang Lebah Sebagai bahan baku untuk mendapatkan propolis

2 Etanol 96% Digunakan untuk mengekstraksi propolis

4 Tripotasium citrate Digunakan untuk pereaksi pembuatan nanofood

5 Buffer posfat Digunakan untuk pereaksi pembuatan nanofood

6 Kalsium klorida Digunakan untuk pereaksi pembuatan nanofood

7 Asam Klorida Digunakan untuk mempertahankan pH pada

pembuatan nanofood

8

Sodium Hidroksida Digunakan untuk mempertahankan pH pada

pembuatan nanofood

9 Pereaksi Follin Ciocalteu Digunakan untuk analisa total polifenol

10 Natrium karbonat Digunakan untuk pereaksi pada analisa total

polifeneol

11 Asam Gallat Standar Untuk analisa total polifenol

12 Aluminium klorida

Digunakan untuk pereaksi analisa total flavonoid

13 Potassium acetate Untuk Hidrolisis analisa total flavonoid

14 Quercetin Standar uji untuk analisa total flavonoid

15 Rennet Untuk pembuatan isolasi Kasein

16 Susu sapi Untuk bahan pembuatan casein

17 Aquades Untuk melarutkan atau mengencerkan sampel


27


3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1 Isolasi Casein Dari Susu Sapi

Tujuan dari tahapan ini adalah untuk mendapatkan casein dari susu sapi.

Susu sapi yang telah dipasterusiasi didinginkan hingga suhu 30°C. Kemudian

pHnya diturunkan hingga pH 6.4 menggunakan HCl 1 N, lalu susu didiamkan

selama 1 jam pada suhu 30°C. Untuk menggumpalkan kasein dalam susu,

ditambahkan Rennet. Untuk menghasilkan endapan dilakukan agitasi pada suhu

30 ° C selama 15 menit, lalu untuk meningkatkan ukuran partikel di inkubasi

pada 30 °C selama 15 menit tanpa agitasi. Suspensi yang terbentuk disaring

dengan kertas saring . Suspensi ditambahkan aquades pada suhu 70 ° C, dan

didiamkan pada suhu ini selama 5 menit untuk menonaktifkan chymosin (enzim

yang dihasilkan rennet). Endapan casein yang dihasilkan disaring dan supernatan

dibuang.

Gambar 3.2 Diagram Alir Proses Isolasi Casein Dari Susu Sapi

Susu hasil Pasteurisasi pada suhu 30 C,

diasamkan dengan HCl sampai pH 6,4

Ditambahkan Rennet lalu di agitasi pada suhu 30 C selama 15 menit, lalu

di inkubasi tanpa agitasi pada suhu 30 C selama 15 menit

Endapan yang terbentuk disaring, lalu endapan ditambahkan aquades pada

suhu 70 C,diamkan selama 5 menit, lalu endapaan disaring kembali

Endapan Casein


28


3.3.3. Ekstraksi Propolis

Proses ekstraksi propolis dari sarang lebah menggunakan pelarut etanol.

Sebanyak 130 gram sarang lebah madu ditambahkan 1 liter pelarut etanol 96%

lalu di maserasi selama 16 jam, kemudian di saring menghasilkan supernatant

dan ampas. Untuk menghasilkan pemisahan optimal supernatant propolis dari

waxnya, maka dilakukan variasi pengenceran pada propolis menggunakan

aquades, yaitu 40,60,65,70,80 % ekstrak etanol propolis. Kemudian larutan di

inkubasi pada suhu 50oC selama 30 menit. Untuk mempermudah proses

pengendapan larutan di simpan didalam freezer, selama satu malam. Dilanjutkan

inkubasi pada suhu ruang, sampai larutan menjadi jernih dan terbentuk dua

lapisan, lapisan atas yang jernih dan lapisan bawah yang viskos berwarna coklat

(Sahlan, 2010), lalu diukur derajat pemisahannya menggunakan

spektrofotometer, dengan rasio pada panjang gelombang 310 nm dan 660 nm

(A310/A660). (Hamada et al, 1996) Propolis yang memiliki derajat pemisahan

paling tinggi akan di salut menggunakan casein.

Gambar 3.3 Diagram Alir Proses Ekstraksi Propolis Dari Sarang Lebah

Sarang lebah 130 g dimaserasi dengan pelarut etanol 96%,

selama 16 jam lalu disaring menghasilkan supernatan

Diinkubasi kembali di Freezer selama 12 jam, akan

terbentuk dua lapisan. Lapisan atas yang jernih, dan

lapisan bawah cokelat tua, lalu saring dengan kertas saring

Hasil penyaringan dibaca Absorbansi masing-masing

propolis pada panjang gelombang 310 dan 660 nm,

Supernatan propolis diencerkan dengan aquades, beberapa

variasi pengenceran 40,60,65,70,80 % etanol, lalu

diinkubasi pada suhu 50 C selama 30 menit


29


3.3.3. Penyalutan Ekstrak Propolis dengan casein micelle

Perincian pembuatan nanofood propolis ini, yaitu 5 g casein ditambahkan

larutan buffer posfat pH 10 sebanyak 50 mL, lalu distirer selama 15 menit,

kemudian ditambahkan propolis 5 mL, lalu ditambahkan CaCl2 10% setiap 5

menit sebanyak enam kali, selama proses penambahan CaCl2 pH campuran

dijaga pada pH 7 menggunakan HCl 0,1 N atau NaOH 0,1 N. Untuk

menghasilkan campuran partikel berukuran nano, maka campuran di ultrasonic

selama 5 menit dengan intensitas 30%. . Lalu campuran disaring dengan kertas

saring Whatman No.42, untuk endapan yang tertinggal dilarutkan kembali

dengan Buffer, untuk supernatant dilakukan ultrafiltrasi dengan amicon ultra-15.

Endapat yang terdapat pada filter didispersikan dengan buffer posfat. Pada

campuran, endapan, dan supernatant dilakukan analisa total polifenol, total

flavonoid, kadar protein, dan identifikasi protein dengan SDS-Page.


30


Gambar 3.4. Proses Penyalutan Propolis Menggunakan Casein Micelle

Dilakukan mikrofiltrasi dengan kertas

saring Whatman No.42

Endapan ditimbang 4,0071

g, diencerkan dengan Buffer

Posfat 10 mL lalu di Vortex

Hasil Supernatan

dilakukan ultrafiltrasi

Endapan didispersikan

dengan Buffer Fosfat

sampai volume 14 mL

Hasil Ultrafiltrasi

dianalisa

Ditambahkan Propolis 5 mL sambil di

stirer

Ditambahkan CaCl2 10% 1 mL setiap 5

menit sebanyak enam kali

Campuran di ultrasonic selama 5 menit

dengan intensitas 30%

Ditimbang Casein dari Susu Sapi 5,0219

g ,lalu ditambahkan Buffer fosfat pH 10

50 mL

Distirer 15

menit


31


3.3.4. Metode analisis

Analisis yang akan dilakukan adalah analisis kandungan total flavonoid

menggunakan metode aluminium klorida, analisis total polifenol menggunakan

metode Follin Ciocalteu, Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Gel

Electrophoresis (SDS-PAGE), kadar protein dengan metode Lowry, analisa

distribusi ukuran partikel dengan Particle Size Analizer (PSA), analisa morfologi

partikel nano menggunakan cryo TEM

3.3.4.1 Analisa Total Flavonoid

Metode Aluminium klorida (AlCl3) digunakan untuk penentuan kadar

total flavonoid dalam ekstrak etanol propolis (EEP), maupun nanofood

propolis. Standar yang digunakan adalah quercetin, pertama dibuat kurva

kalibrasi untuk quercetin (pada konsentrasi 12,5 ; 25,0 ; 50,0 ; 80,0; dan 100

µgmL-1

dalam methanol). Sampel EEP dan nanofood propolis dipipet

sebanyak 0,5 mL, lalu ditambahkan methanol 1,5 mL, 0,1 mL 10%

AlCl3(m/v), 0,1 mL 1 M potassium acetate dan 2,8 mL aquades. Setelah di

inkubasi selama 30 menit pada suhu ruangan, lalu absorbansi sampel dapat di

ukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 415 nm.

3.3.4.2 Analisa Kandungan Total Polifenol

Penentuan kadar total polifenol menggunakan metode Follin

Ciocalteu. Standar yang digunakan adalah asam galat dengan konsentrasi 0 ;

50 ; 100 ; 150 ; 200; 250 ; µg mL-1

dilarutkan dengan methanol : aquades

(50:50, v/v). Untuk pengukuran sampel 0,5 mL sampel ditambahkan

pereaksi Follin sebanyak 5 mL dan 4 mL 1 M Na2CO3, lalu diaduk dan

didiamkan selama 15 menit pada suhu ruangan, selanjutnya absorbansinya

diukur dengan menggunakan Spektrofotometer pada panjang gelombang 765

nm.


32


3.3.4.3.Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Lowry

Pengujian kadar protein Metode Lowry menggunakan larutan Biuret

(1 ml larutan CuSO4 1% dan larutan 1 ml NaK-Tartrat 1% dimasukan ke

dalam 100 ml larutan Na2CO3 2%) dan reagen Folin Fenol Ciocalteu 1N.

Kurva standarnya menggunakan protein bovine serum albumin (BSA)

200µg/ml. Rentang waktu inkubasi antara memasukkan larutan biuret dan

reagen Folin adalah 3 menit, sedangkan rentang waktu inkubasi antara reagen

Folin dan pengukuran absorbansi adalah 12 menit. Setelah memasukan larutan

biuret dan Folin harus dicampur menggunakan vortex mixer. Serapan masing-

masing larutan diukur tepat pada menit ke-12 yang ditetapkan pada panjang

gelombang 750 nm.

Tabel 3.1 Penentuan kadar protein dengan metode Lowry

1 2 3 4 5

BSA (mL) 0 0,8 1,2 1,5 -

Sampel (mL) - - - - 0,5

Aquades (mL) 2 1,2 0,8 0,5 1,5

Biuret 5 mL

Follin 0,5 mL

3.3.4.4 Identifikasi Protein Dengan Metode Sodium Dodecyl Sulphate-

Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Plate pembentuk gel disusun seperti petunjuk yang diberikan. Gel

pemisah dibuat dengan cara menyiapkan tabung polipropilen 50 ml. Sebanyak

3.125 ml stok akrilamid dimasukkan dalam tabung, kemudian sebanyak 2.75

ml 1M Tris-pH 8.8 juga dimasukkan. Akuabides dimasukkan sebanyak 1.505

ml. SDS 10% kemudian dimasukkan sebanyak 75 ml. Sebanyak 6.5 ml

TEMED dimasukkan, kemudian tabung ditutup dan digoyang secara perlahan.


33


APS 10% dimasukkan sebanyak 75 ml, tabung. Larutan segera dituang ke

dalam plate pembentuk gel menggunakan mikropipet 1 ml (dijaga agar tidak

terbentuk gelembung udara), hingga batas yang terdapat pada plate. Aquades

perlahan ditambahkan di atas larutan gel dalam plate sehingga permukaan gel

tidak bergelombang. Gel dibiarkan memadat selama kurang lebih 30 menit

(ditandai dengan terbentuknya garis transparan di antara batas air dan gel

yang terbentuk). Air yang menutupi gel pemisah selanjutnya dibuang. Bila gel

pemisah telah memadat, gel penumpuk 3% disiapkan dengan cara yang sama,

tetapi dengan volume larutan yang meliputi : 30% acrylamide-bis sebanyak

0.45 ml, 1 M Tris-pH 6.8 sebanyak 0.38 ml, akuabides sebanyak 2.11 ml,

10% SDS sebanyak 30 ml, TEMED sebanyak 5 ml, dan 10% APS sebanyak

30 ml. Setelah gel penumpuk dimasukkan, maka selanjutnya sisiran

diletakkan di atasnya.

Plate yang sudah berisi gel dimasukkan ke dalam chamber

elektroforesis. Elektroda buffer dituang sampai bagian atas dan bagian bawah

gel terendam. Gelembung udara yang mungkin terbentuk pada dasar gel atau

di antara sumur sampel harus dihilangkan. Sampel dimasukkan ke dalam

dasar sumur gel secara hati-hati menggunakan Hamilton syringe. Syringe

dibilas sampai tiga kali dengan air atau dengan elektroda buffer sebelum

dipakai untuk memasukkan sampel yang berbeda pada sumur gel berikutnya.

Perangkat elektroforesis dihubungkan dengan power supply untuk

memulai pemisahan. Pemisahan dilakukan pada arus konstan 20 mA selama

kurang lebih 40-50 menit atau sampai tracking dye mencapai 0.5 cm dari

dasar gel. Bila pemisahan telah selesai, elektroda buffer dituang dan gel

diambil dari plate.

Tahapan ini memerlukan larutan staining untuk mewarnai protein pada

gel dan larutan destaining untuk menghilangkan warna pada gel dan

memperjelas pita protein yang terbentuk. Larutan staining 1 liter terdiri atas

Coomassie Blue R-250 sebanyak 1.0 g, metanol sebanyak 450 ml, akuades

sebanyak 450 ml dan asam asetat glasial sebanyak 100 ml. Larutan destaining


34


1 liter terdiri atas metanol sebanyak 100 ml, asam asetat glasial sebanyak 100

ml, dan akuades sebanyak 800 ml. Gel direndam dalam 20 ml larutan staining

sambil digoyang selama kurang lebih 15 menit. Setelah itu, larutan staining

dituang kembali pada wadahnya. Gel direndam dalam 50 ml larutan

destaining setelah dicuci dengan air beberapa kali, sambil digoyang selama

kurang semalaman atau sampai band protein terlihat jelas.

3.3.4.5 Analisa Distribusi Ukuran Partikel Dan Morfologi Partikel Nano

Untuk morfologi nanopartikel menggunakan alat transmission electron

microscopy (TEM), tekniknya adalah spesimen disusun dalam suatu

controlled environment vitrification system (CEVS) , suhu dan kelembaban

dikontrol untuk menghindari hilangnya senyawa yang volatil. Sampel

distabilkan di CEVS selama satu jam. Kemudian, ditempatkan spesimen

sampel pada grid tembaga TEM dan ditutupi dengan film karbon berlubang,

lalu diseka dengan kertas filter untuk membentuk sebuah film tipis (ketebalan

100-200 nm). Sampel akan menjadi beku setelah didinginkan oleh nitrogen

cair, lalu elektron ditembuskan ke dalam sampel yang ingin diamati, hasil

pengamatan dilihat pada layar display

Pengukuran distribusi partikel nano menggunakan particle size

analyzer (PSA), sampel yang ada didispersikan menggunakan pelarut yang

sesuai, lalu akan dilewatkan sinar photon yang berfungsi berinteraksi dengan

partikel yang ada, dari intensitas interaksi tersebut akan diterjamahkan

kedalam diameter ukuran partikel di dalam display data.


35

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Ekstraksi Propolis Dari sarang lebah

Metode yang digunakan untuk mengekstrak propolis dari sarang lebah adalah

metode maserasi. Maserasi merupakan salah satu metode ekstraksi untuk bahan-

bahan yang tidak tahan panas, yaitu dengan merendam bahan dengan pelarut tertentu

dan dalam jangka waktu tertentu. Pelarut yang digunakan dalam penelitian kali ini

adalah etanol 96% yang bersifat semi polar, sehingga senyawa -senyawa aktif dengan

kepolaran berbeda diharapkan dapat terekstrak dengan sempurna. Dalam metode

maserasi ini, selain propolis yang terekstrak, lilin (wax) dalam sarang lebah pun ikut

terekstrak, lilin lebah dianggap sebagai pengotor dalam ekstrak propolis, maka perlu

dilakukan pemisahan agar yang dihasilkan hanya propolis.

Pemisahan optimal propolis dilakukan dengan cara melakukan variasi

pengenceran terhadap hasil ektraksi menggunakan aquades, lalu dihitung rasio

absorbansinya pada panjang gelombang maksimumnya yaitu untuk propolis dan wax

nya, tujuan pemisahan ini adalah agar kelarutan wax terhadap etanol semakin

berkurang sehingga wax yang terkandung dalam propolis akan mengendap lalu

dipisahkan dengan cara disaring

Gambar 4.1 Pemisahan Propolis dengan Waxnya


36


Dari gambar 4.1 dapat dilihat bahwa wax terpisah dari propolisnya, setelah itu

disaring dan dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang

gelombang maksimum yang didapat. waxnya

Gambar 4.2. Grafik Scanning Propolis Cibubur


37


Dari gambar 4.2, didapat panjang gelombang maksimum untuk propolis 310

nm dan untuk wax dari propolis 660 nm, berikut data absorbansi hasil perhitungan

derajat pemisahan propolis dan wax

Tabel 4.1 Perhitungan Derajat Pemisahan Propolis dan Wax

Konsentrasi

Propolis FP

Abs 310

Abs310 x FP Abs 660

Derajat Pemisahan

(Abs 310/ Abs 660)

40% 10 0.588 5.880 0.022 267.273

60% 10 0.917 9.170 0.005 1834.000

65% 10 1.387 13.870 0.008 1733.750

70% 10 1.441 14.410 0.007 2058.571

80% 10 1.515 15.150 0.072 210.417

96% 10 1.614 16.140 0.011 1467.273

.

Dari table 4.1 didapatkan derajat pemisahan propolis cibubur optimal terdapat

pada propolis dengan konsentrasi etanol 70 %. Untuk propolis yang berasal dari

daerah lain memiliki hasil yang berbeda, Karena kandungan komposisi kimia dalam

propolis berbeda setiap daerah, tergantung dari makanan lebah tersebut tinggal.

4.2 Isolasi kasein dari susu sapi

Casein yang digunakan dari susu sapi karena kandungan casein dalam susu

sapi lebih besar dibandingkan dengan susu kambing, selain itu susu sapi lebih mudah

didapatkan. Casein didapatkan dengan menambahkan rennet pada susu sapi, sehingga

terbentuk endapan. Dalam rennet terdapat enzim chymosin yang menghidrolisis

ikatan spesifik pada kappa-casein susu, sehingga terjadi pemutusan ikatan, pada susu,

kappa-casein bertindak sebagai stabilizer (Kristy, 2008). Setelah aktivitas ini dirusak

oleh chymosin, akan terjadi koagulasi. sehingga casein dapat mengendap dan dapat

dipisahkan dengan cara disaring.


38


(A) (B)

Gambar 4.3 Pengendapan Casein.(4.A.) Susu Sapi sebelum penambahan

rennet (4.B) Casein yang mengendap

Gambar 4.3 adalah hasil pengendapan casein dari susu sapi, setelah

diendapkan, casein yang dihasilkan dibilas dengan aquades suhu 70 ºC, yang

berfungsi untuk menghilangkan enzim chymosin. Endapan yang dihasilkan disimpan

pada suhu 0 C, dan tertutup rapat, karena mudah diserang bakteri.

4.3 Penyalutan Propolis Menggunakan Cassein Micelle

Larutan yang digunakan untuk proses penyalutan adalah buffer posfat, Buffer

posfat berfungsi mempertahankan pH pada pH 7, dan berfungsi membentuk kembali

jembatan calcium posfat, dengan penambahan CaCl2 secara bertahap agar casein

dapat menyalut propolis. Propolis yang digunakan dalam proses penyalutan adalah

propolis dengan konsentrasi etanol 70%. Setelah proses pencampuran casein dan

propolis, untuk memperkecil campuran menjadi partikel nano digunakan gelombang

ultrasonic, sehingga terjadi kavitasi akustik. Kavitasi akustik menghasilkan

gelembung udara yang dapat memecahkan partikel yang ada dalam larutan.


39


Gambar 4.4.Proses Penyalutan Propolis menggunakan Casein Micelle

Gambar 4.4 merupakan produk hasil penyalutan berbentuk cairan kental. Pada

penelitian yang dilakukan Semo et al (2007), proses membentuk ukuran nano yang

digunakan adalah proses sentrifugasi bertekanan tinggi. Pada penelitian kali ini,

dilakukan modifikasi dengan menggunakan gelombang ultrasonic, dan hasilnya tidak

mempengaruhi aktifitas dari produk yang dihasilkan.

4.3.1 Efisiensi Penyalutan Propolis

Proses penyalutan propolis menggunakan casein micelle menghasilkan

ukuran partikel yang berbeda-beda. Untuk memisahkan partikel nano pada produk

penyalutan, dilakukan pemisahan menggunakan kertas saring Whatman No.42, dan

untuk mengetahui efisiensi penyalutan dilakukan ultrafiltrasi menggunakan amicon

ultra-15 (centrifugal filter device) terhadap supernatan hasil mikrofiltrasi. Efiseinsi

penyalutan diketahui dengan membandingkan hasil analisa propolis dan analisa

supernatant hasil ultrafiltrasi.

Analisa pertama yang dilakukan adalah analisa spektrometri dengan

mengetahui kandungan zat aktif ( total polifenol & total flavonoid) pada propolis dan

produk penyalutan. Untuk meyakinkan proses penyalutan dilakukan Analisa High

Performance Liquid Chromatography (HPLC), dan identifikasi protein menggunakan

SDS-PAGE. Analisa HPLC hanya dilakukan pada propolis dan supernatant hasil


40


ultrafiltrasi sehingga muncul perbedaan kromatogram dari kedua sampel tersebut.

Analisa SDS-PAGE untuk melihat perbedaan profil bend dari casein dan produk

nanofood yang dibuat.

4.3.1.1 Hasil Uji Spektrometri

Penguian spektrometri yang dilakukan menggunakan tiga parameter analisa,

yaitu kadar polifenol, kadar flavonoid, dan kadar protein. Metode yang digunakan

untuk mengukur polifenol adalah metode folin ciocalteau, dimana sampel bila ada

senyawa polifenol akan memberikan warna biru setelah penambahan pereaksi follin,

lalu absorbansinya diukur dengan spektrofotometer, hasil yang didapat dibandingkan

dengan standar uji yang digunakan, yaitu asam galat.

Untuk analisa flavonoid menggunakan metode aluminium klorida (AlCl3),

dimana sampel bila ada senyawa flavonoid akan memberikan warna kuning kehijauan

setelah penambahan AlCl3, hasil yang didapat dibandingkan dengan standar ujinya

yaitu quercetin. Untuk analisa kadar protein menggunakan metode Lowry, bila ada

protein akan memberikan warna biru setelah penambahan pereaksi follin, lalu

absorbansinya diukur dengan spektrofotometer, hasil nya dibandingkan dengan

standar uji yang digunakan, yaitu bovin serum albumin.

Tabel 4.2 Hasil Analisa Spektrometri

No Keterangan Kadar Polifenol

(µg)

Kadar

Flavonoid

(µg)

Kadar

Protein

(µg)

1 Casein 3815.78 22338.448 1979.820

2 Propolis 954.35 1846.153 169.530

3 Produk Penyalutan 2993.31 130799.985 1583.441

4 Endapan produk 1635.96 77846.152 13.606

5 Supernatant hasil mikrofiltrasi 1765.47 1107.682 10513.501

6 Dispersi Hasil ultrafiltrasi 949.12 270.764 783.934

7 Supernatant ultrafiltrasi 314.49 112.613 403.672

Efisiensi Penyalutan (𝑘𝑝−𝑘𝑠𝑢

𝑘 𝑝× 100%)

KP = Kadar Propolis

KSU = Kadar supernatant Ultrafiltrasi

67.05 % 93.90 % -


41


Dari tabel 4.2, untuk data selain propolis dan supernatant ultrafiltrasi, tidak

dilakukan perhitungan efisiensinya, karena larutan tersebut keruh dan dapat

mempengaruhi pengukuran absorbansi spektrofotometer, sehingga kadar yang

didapatkan bukan karena adanya senyawa polifenol ataupun flavonoid, tapi

disebabkan pengaruh dari kekeruhan larutan sampel. Begitu juga untuk kadar protein,

tidak dilakukan perhitungan efisiensinya karena sampel yang keruh.

Perhitungan efisiensi penyalutan propolis dilakukan dengan membagi kadar

zat aktif pada propolis dan kadar zat aktif pada supernatant ultrafiltrasi, sehingga

didapat persentase penyalutan popolis oleh casein micelle. Dari hasil percobaan,

efisiensi penyalutan terhadap senyawa polifenol sebesar 67,05%, dan efisiensi

terhadap senyawa flavonoid sebesar 93,90 %. Jadi senyawa flavonoid dalam propolis

lebih banyak yang tersalut oleh casein micelle, dibandingkan senyawa polifenol

Menurut Chen et al (2006), efisiensi penyalutan yang baik minimal 80%,

karena manunjukkan proses yang dilakukan tidak menghilangkan zat aktif yang ada.

Pada penelitian Semo et al (2007) didapatkan efisiensi 85% dengan penyalut casein

micelle untuk menyalut senyawa tunggal yaitu vitamin D2 . Pada penelitian ini

senyawa dalam propolis heterogen (Volvi et al ,2006), sehingga dengan efisiensi

senyawa polifenol yang sebesar 67, 05 % merupakan efisiensi yang tinggi.


42


4.3.1.2 Hasil Uji High Performance Liquid Chromatogrhapy (HPLC)

Untuk mendukung hasil efisiensi penyalutan, maka dilakukan analisa dengan

menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) pada propolis dan

supernatant ultrafiltrasi, berikut kromatogram hasil uji HPLC

(A) (B)

Gambar 4.5 Hasil analisa HPLC (A) Propolis (B) Supernatan hasli ultrafiltrasi

Dari gambar 4.2, dapat dilihat perbedaan kromatogram pada waktu retensi

yang sama dari propolis dan supernatant hasil ultrafiltrasi, perbedaan perubahan

karakteristik peak pada propolis dan supernatant hasil ultrafiltrasi, menandakan

terjadinya penyalutan propolis oleh casein micelle. Bukan karena terjadinya

pengenceran dari proses penyalutan.


43


4.3.1.3 Hasil Uji SDS PAGE

Pengujian SDS PAGE adalah identifikasi kualitatif protein berdasarkan berat

molekul senyawa protein dengan satuan kilo Dalton (kDa). Karena tiap protein

memiliki range berat molekul yang berbeda. Cassein memiliki berat molekul dengan

range 26-37 kDa (Sahu et al, 2008).

Berikut gambar hasil pengujian identifikasi protein dengan metode SDS

PAGE

M C 1 2 3 4 5

Gambar 4.6. Identifikasi Protein dengan metode SDS PAGE (C) Cassein, (M)

Marker (1) Produk (2)Endapan Produk (ampas)(3)Supernatan

Mikrofiltrasi, (4)Dispersi hasil ultrafiltrasi (5) Supernatan Ultrafiltrasi

Identifikasi protein digunakan untuk mengetahui bahwa protein yang ada

dalam penelitian ini adalah casein, selain itu juga untuk mengetahui perbedaan profil

protein yang terbentuk saat sebelum penyalutan dan sesudah penyalutan. Casein

175 kDa

80 kDa

58 kDa

46 kDa

30 kDa

25 kDa

17 kDa

7 kDa


44


memiliki berat molekul yang spesifik yaitu pada range 26- 37 kDa (Sahu et al, 2008),

dari gambar 4.6 terlihat garis bend di kisaran range tersebut, namun pada produk

penyalutan (1) ada bend yang hilang, itu menandakan casein telah mengalami

deformasi kembali menjadi bentuk miselia, sehingga dapat menyalut zat aktif

propolis. Untuk sampel 5 tidak terbentuk bend, karena sampel 5 adalah hasil proses

ultrafiltrasi dengan menggunakan Amicon Ultra 10.000 Da, artinya untuk protein di

atas 10 kDa tidak akan terfiltrasi, dan akan tertinggal di endapan.

4.4 Distribusi Ukuran Partikel

Pengukuran distribusi ukuran partikel nano menggunakan alat particle size

analyzer (PSA). Pengukuran distribusi partikel dilakukan untuk melihat perbedaan

ukuran terhadap produk sebelum milrofiltrasi dan sesudah mikrofiltrasi.

A B

Gambar 4.7. Hasil Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel (A) Produk sebelum

Mikrofiltrasi (B) Produk Setelah Ultrafiltrasi


45


Dari hasil pengukuran distribusi ukuran partikel menggunakan PSA, pada

produk sebelum mikrofiltrasi memiliki diameter ukuran partikel terbanyak sebesar

1353.7 nm, sedangkan untuk produk setelah ultrafiltrasi memiliki ukuran partikel

terbanyak sebesar 316,1 nm. Berdasarkan hasil tersebut, untuk menghasilkan produk

nanopartikel (<1000 nm)( Mohanraj & Chen, 2006) maka produk proses penyalutan

harus melalui proses mikrofiltrasi terlebih dahulu.

4.5 Morfologi Partikel Nanofood Propolis

Untuk melihat morfologi partikel nano dan penyaluran zak ektif dari propolis,

maka digunakan alat Transmission Electronic Microscopy (TEM). Penggambaran

TEM dilakukan pada produk sebelum mikrofiltrasi, dan produk setelah mikrofiltrasi,

tujuannya untuk membandingkan morfologi kedua produk dengan distribusi ukuran

partikel.

Gambar 4.8. Morfologi Nanopartikel Produk Sebelum Mikrofiltrasi

menggunakan TEM

Zat Aktif


46


Dari gambar 4.8 morfologi produk sebelum mikrofiltrasi terdapat

pengumpulan partikel yang belum terpecah dengan distribusi diameter ukuran

partikel 1353.7 nm, dan dapat dilihat bahwa zat aktif tidak tersebar merata pada

partikel, karena efisiensi dari proses penyalutan tidak sampai 100%.

Gambar 4.9. Morfologi Nanopartikel produk Setelah Mikrofiltrasi menggunakan

TEM

Dari gambar 4.9 dapat dilihat perbedaan morfologi dari produk sesudah

mikrofiltrasi. untuk produk setelah mikrofiltrasi partikel telah terpecah dengan

distribusi ukuran partikel 316,1 nm , dapat dilihat zat aktif tersebar merata pada

sebagian besar partikel.

Dari gambar 4.8 dan 4.9 dapat dibandingkan penyebaran zat aktifnya untuk

produk berukuran nano (<1000 nm) penyebaran zat aktif lebih merata pada

permukaan partikel dibandingkan produk berukuran lebih besar.

Zat Aktif


47

BAB V

KESIMPULAN dan SARAN

Kesimpulan

Propolis dapat dibuat produk nanofood dengan penyalut casein micelle

Efisiensi penyalutan propolis oleh casein micelle untuk senyawa flavonoid

93,9 %, untuk senyawa polifenol 67,05%

Saran

Dibutuhkan pengujian lanjutan untuk meyakinkan kualitas produk yang

dihasilkan yaitu pengujian persentase release zat aktif di dalam tubuh


48

DAFTAR PUSTAKA

Alberts Bruce, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and James D

Watson.Molecular Biology of the Cell, 3rd edition.New York: Garland

Science.( 1994).

Benvegnu, Thierry, LoïcLemiègre, and Sandrine Cammas-Marion.New Generation of

Liposomes Called Archaeosomes Based on Natural or Synthetic Archaeal

Lipids as Innovative Formulations for Drug Delivery.Recent Patents on Drug

Delivery & Formulation.3.( 2009). Pp 206-220

Bankova V, Christov R, Hegazi AG, Abd El Hady FK, Popov S.Chemical

composition of propolis from popular buds. International Symposium on

Apitherapy, Cairo 8-9th,March(1997)Pp 413-421.

Chang C, Yang M, Wen H, Chern J .Estimation of total flavonoid content in propolis

by two complementary colorimetric methods. J. Food Drug Analaysis,

10(2002).Pp 178-182

Chen,L, Gabriel E Remondetto and Muriel Subirade. Food Protein-based materials

as nutraceutical delivery system.Trends in food Science & technology17

.(2006) .Pp . 272-283

Fajrina, Intan Hapsariyani. Ketahanan Tablet PropolisTrigona spp. Sebagai

Antibakteri Terhadap Cairan Rumen In Vitro. (Skripsi) Progam Studi

Biokimia FMIPA IPB .(2009)

Fessenden & Fessenden. Kimia Organik edisi ketiga terjemahan Aloysius Hadyana

Pudjaatmaka. Erlangga. (1982).Hal 436-438

Gonzalez, Maria, Bernardo Guzman, Roxana Rudyk, Elida Romano, Maria Molina.

Spectrophotometric Determination of Phenolic Coumpounds in

Propolis.Argentine.Lat.Am.J.Pharm 22(3) (2003) Pp 243-247

Hamada, Shoich, Satoshi Iritani, Toshio Miyake. Purified Propolis-Extract, And Its

Preparation And Uses. United States Patent. 5.529.779.(1996)

Hudnall, Michael. Compotition Containing Fractionated Bee Propolis.United State

Patens 7.294.351 B2.(2007)


http://www.garlandscience.com/

http://www.garlandscience.com/

49


Huleihel , Mahmoud and Vladimir Isanu.Anti-Herpes Simplex Virus Effect of an

Aqueous Extract of Propolis.IMAJ .Vol 4, Supplement . (2002).Pp 923-926

Janes,Kevin, Marie P. Fresneau, Marazuela Ana, Angels Fabra et al. Chitosan

nanoparticcle as nano delivery for Doxorubicin.Journal of controlled release

elsevier 73(2001) Pp 255-267.

Kim, Dong Myung, Gee-Dong Lee, Seung-Hyun Aum, And Ho-Jun Kim.

Preparation of Propolis Nanofood and Application to Human Cancer.

Boil.Pharm Bull 31(9) (2008) Pp. 1704-1710.

Kitts, D. D., DU, K., SHIELDS, R. & WONG, P. Milk Protein [Online].

Landfood.com.Available:

http://www.landfood.ubc.ca/courses/fnh/301/protein/pro-33.html [Accessed

14 April 2011].

Lei, Dong, Xia,Suhua&Luo,,Yi &Diao.Targeting delivery oligonucleotide into

macrophages by cationic polysaccharide from Bletillastriata successfully

inhibited the expression of TNF-[alpha]. Journal of Controlled Release, 134

(30) Pp 214 – 220

Lotfy, Mahmoud. Biologycal Activity of Bee propolis in Health and Disease. Asian

Pacific Journal of Cancer Prevention,Vol 7 .(2006) Pp 22-31

Marquez N, Sancho R, Macho A, et al .Caffeic acid phenethyl ester inhibits T-cell

activation by targeting both nuclear factor of activated T-cells and NF-κB

transcription factors. J PharmacolExpTher (JPET), 308,(2004) Pp 993-1001.

Maruta, Hiroshi.The direct PAK1 inhibitor, TAT-PAK18, blocks preferentially the

growth of human ovarian cancer cell lines in which PAK1 is abnormally

activated by autophosphorylation at Thr 423.(2010).Pp 451-461

Mohanraj VJ and Y Chen.Nanoparticle-A Review. Tropical Journal of

Pharmaceutical Research 5 (2006)Pp561-573.

Roy, Nayan, SamiranMondal, RajibulA.Laskar, Saswati Basu . Boigenicsyntetis of Au

and Ag nanoparticles by Indian propolis and its constituents, colloids and

surface B : Biointerface 76(2010).Pp317-325


http://www.landfood.ubc.ca/courses/fnh/301/protein/pro-33.html

50


Sahu, Abisek, NareshKasoju, AndUtpal Bora. Fluorescen Study of the Curcumin –

Casein MicelleComplexation and Its Application as a Drug Nanocarrier to

Cancer Cells.Biomacromolecules Vol.9 (2008). Pp 2905-2912

Sahlan,Muhamad, &AnattaWahyuBudiman.Simple Extraction Method of Bioactive

Indonesian Propolis for Functional Cosmetics.Proceeding 25-26 November

2010.International Seminar on Cosmetics, Recent Development in Cosmetics

(2010)

Salatino, AntonioÉrica Weinstein Teixeira, GiuseppinaNegri and Dejair

Message.Origin and Chemical Variation of Brazilian Propolis.Evidence

Based Compl And Alt Medicine,Volume 2,1 (2005).Pp.33-38

Suranto, Adji. Dahsyatnya Propolis untuk Menggempur Penyakit. Gramedia Pustaka

Utama. (2010) Hal 30-35

Sabir, A. Aktivitasantibakteri flavonoid propolis Trigonasp terhadap bakteri

Streptococcus mutans (in vitro).Majalah Kedokteran Gigi Universitas

Airlangga.Vol 38 (2005). Hal 135-141.

Scope, R. K..Protein Purification, Principles, and Practice, 3rd Edition. Springer

VeriagNewyork. (1993) Pp : 15 - 21, 44 - 48, and 71 - 92.

Semo, Efrat ,EllinaKesselman, DganitDanino, YoavD.Livney . Casein micelle as a

natural nano-capsular vehicle for nutraceuticals, Food Hydrocolloids 21

(2007). Pp 936-942.

Sjaikhurrizal. Manfaat Dampak Positif Teknologi Nano Bagi Dunia Kedokteran

Farmasi dan Obat. Proceeding 28 Agustus 2010. Pameran Ritech

Expo.(2010)

Susanti, Lisa. PrinsipPenggunaan Particle Size Analizer. Nanotech Indonesia .(2010)

Volpi, Nicola, and GianlucaBergonzini.Analysis of flavonoids from propolis by on-

line HPLC-electrospray mass spectrometry.J Pharm Biomed Anal .42 (2006).

Pp 354-61

Wuisan, Christine. Penentuan Aktivitas Antioksi dan Rimpang Segar dan Rimpang

Bubuk Dengan Uji Kadar Polifenol dan Active Oxygen Method (AOM). FTP

IPB. (2007). Hal 12-13


http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Gianluca%20Bergonzini%22

51


You-Yeon Won.Imaging Nanostructured Fluids Using Cryo-TEM.Korean J. Chem.

Eng., 21(1), (2004) Pp296-302

Zarif, Leila,David S. Perlin. Amphoterin B Nanococholeates : From Cochleate

Technology. Drug Delivery Technology .Vol 2.(2002).Pp 4

Zhang Sufeng, Guilin Wang, and XiaoyueLin .Polyethylenimine-coated Albumin

Nanoparticles for BMP-2 Delivery.Biotechnol. Prog.24 (2008) Pp 945-956

Zwiorek, Kalus, Julia Kloeckner, Ernst Wagner, Gelatin Nanoparticles as a new and

simple gene delivery system. J Pharm PharmaceutSci 7(4). 2004. Pp 22-28


52

LAMPIRAN A

Penentuan Kadar Polifenol

Standar uji yang digunakan adalah Asam Galat

Tabel absorbansi standar uji

Konsentrasi

Standar

(µg/mL)

Abs765 nm

0 0

25 0.344

50 0.654

100 1.23

150 1.823

200 2.36

Kode Sampel Abs765nm

Konsentrasi

Total Polifenol

(µg/mL)

Volume

akhir

larutan

(ml)

Kadar

Total

Polifenol

(µg)

Propolis 2.1 190.869 5 954.35

Casein 0.7 63.596 60 3815.78

1 0.507 46.051 65 2993.31

2 2.5 163.596 10 1635.96

3 0.432 39.233 45 1765.47

4 0.475 43.142 22 949.12

5 0.284 25.778 12.2 314.49

Contoh Perhitungan konsentrasi total polifenol : y = 0,011x + 0,040

y = absorbansi sampel

x = Konsentrasi sampel

Dengan memsasukkan nilai absorbansi sampel pada persamaan linier yang

didapat dari standar uji, maka didapatkan konsentrasi sampel. Untuk mengetahui

kadar polifenol suatu larutan, maka konsentrasi dikalikan dengan volume akhir

larutan


53


LAMPIRAN B

Penentuan Kadar Flavonoid

Standar uji yang digunakan adalah Quercetin

Konsentrasi

Standar

(µg/mL)

Absorbansi415nm

0 0

25 0.008

50 0.019

100 0.032

150 0.045

200 0.068

Sampel Abs415nm

Konsentrasi Total

Flavonoid

(µg/mL)

Vol Akhir

Larutan(

mL)

Kadar Total

Flavonoid

(µg)

Propolis 0.120 369.231 5 1846.15

Casein 0.121 372.307 60 22338.45

1 0.654 2012.307 65 130799.99

2 2.530 7784.615 10 77846.15

3 0.008 24.615 45 1107.68

4 0.004 12.307 22 270.76

5 0.003 9.231 12.2 112.61

Contoh Perhitungan konsentrasi total flavonoid :

y = 0,000325 x + 0,000224

y = absorbansi sampel

x = Konsentrasi sampel

Dengan memsasukkan nilai absorbansi sampel pada persamaan linier yang

didapat dari standar uji, maka didapatkan konsentrasi sampel. Untuk mengetahui

kadar total flavonoid suatu larutan, maka konsentrasi dikalikan dengan volume akhir

larutan


54


LAMPIRAN C

Data High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

1. Kromatogram Propolis

2. Kromatogram Supernatan Hasil Ultrafiltrasi


55


LAMPIRAN D

Data Pengukuran Distribusi Ukuran Partikel Menggunakan Alat Particle Size

Analizer (PSA)

1. Sampel Produk sebelum mikrofiltrasi


56


2. Sampel Setelah Mikrofiltrasi


57


LAMPIRAN E

Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Fraksinasi dan Propolis.

Hasil Uji Aktivitas Antibakteri Hasil Fraksinasi dan Propolis. Ekstrak Racun Fraksi

Ammonium Sulfat 60% jenuh (F60), Propolis tanpa Casein (P), Propolis dengan

Casein (PC). Kontrol Positif (DC) Chloramphenicol 30g/cakram, Kontrol Negatif

(NC) Kosong. (1 ) Micrococcus luteus, (3) Staphylococcus aureus. (5) Basillus

subtilis


universitas indonesia pembuatan nanofood …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20292604-s1473-pembuatan...

Documents