uji toksisitas akut ekstrak kulit batang ...repository.usd.ac.id/17548/2/078114083_full.pdfuji...

UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK KULIT BATANG PULASARI ( Alyxiae Cortex) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY

TEST (BST)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Ridho Bertomi Panjaitan

NIM : 078114083

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2011

i


TEST (BST)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 078114083

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2011

ii

Persetujuan Pembimbing


TEST (BST)

Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 078114083

telah disetujui oleh:

Pembimbing

Yohanes Dwiatmaka, M.Si. tanggal ...................................

iii

Pengesahan Skripsi Berjudul


TEST (BST)

Oleh :


NIM : 078114083

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: ……………………….

Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan

Ipang Djunarko, M.Sc., Apt.

Panitia Penguji : Tanda Tangan

1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. ………………

2. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. ………………

3. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt. ………………

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Ich werde im Himmel hÖren!

Kupersembahkan karya kecilku untuk :

Yesus Kristus

Papa dan Mama

Adik-adikku

Semua orang yang telah terlibat dalam hidupku

Almamaterku

v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Ridho Bertomi Panjaitan

Nomor Mahasiswa : 078114083

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

UJI TOKSISITAS AKUT EKSTRAK KULIT BATANG PULASARI

(Alyxiae Cortex) DENGAN METODE BRINE SHRIMP LETHALITY

TEST (BST)

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan

data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau

media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya

maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya

sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 11 Juli 2011

Yang menyatakan,


vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, 11 Juli 2011

Penulis


vii

PRAKATA

Puji Syukur Penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat

dan rahmat-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana

Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi.

Sepanjang proses perkuliahan, penelitian hingga penyusunan skripsi,

Penulis telah menerima banyak dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu,

Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan waktu, bimbingan, pengarahan, masukan serta pelajaran tentang

hidup kepada Penulis dalam penyusunan skripsi.

3. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan

waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

4. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

5. Segenap dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

mengajar dan membimbing Penulis selama perkuliahan.

6. Ferdi Dwi Armanto sebagai teman satu tim atas kerjasama, bantuan,

kebersamaan, keceriaan, dan suka duka selama proses penyusunan skripsi.

7. Teman-teman FST 2007 atas kebersamaan yang tidak terlupakan.

viii

8. Mas Wagiran, Mas Sigit dan Mas Parlan serta laboran-laboran yang lain yang

telah membantu Penulis selama penelitian.

9. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah membantu

Penulis dalam menyelesaikan laporan akhir ini.

Penulis menyadari bahwa laporan akhir skripsi ini masih jauh dari kata

sempurna. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan kritik dan saran yang

membangun dari seluruh pihak. Penulis berharap semoga laporan akhir skripsi ini

dapat berguna bagi seluruh pihak, terutama dalam bidang farmasi.

Penulis

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... vi

PRAKATA ............................................................................................... vii

DAFTAR ISI ............................................................................................ ix

DAFTAR TABEL .................................................................................... xiii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xiv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xv

INTISARI ................................................................................................. xvi

ABSTRACT ............................................................................................... xvii

BAB I. PENGANTAR .......................................................................... 1

A. Latar Belakang .................................................................... 1

B. Perumusan Masalah ............................................................ 3

C. Keaslian Penelitian .............................................................. 4

D. Manfaat Penelitian .............................................................. 4

1. Manfaat teoritis ............................................................. 4

2. Manfaat praktis ............................................................. 4

x

E. Tujuan Penelitian ................................................................ 4

1. Tujuan umum ................................................................ 4

2. Tujuan khusus ............................................................... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ..................................................... 5

A. Tumbuhan Pulasari ............................................................. 5

1. Keterangan potani ........................................................... 5

2. Kandungan kimia ............................................................ 6

3. Khasiat ........................................................................... 6

B. Artemia salina ..................................................................... 6

1. Morfologi ..................................................................... 7

2. Lingkungan hidup artemia ............................................. 10

3. Cara penetasan telur ...................................................... 11

4. Penggunaan artemia pada metode BST .......................... 12

C. Toksisitas akut .................................................................... 15

D. Brine Shrimp Lethality Test (BST) ...................................... 16

E. Kanker ................................................................................ 17

F. Penyarian ............................................................................ 19

G. Alkaloid .............................................................................. 20

H. Landasan Teori ................................................................... 21

I. Hipotesis ............................................................................. 22

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ................................................ 23

A. Jenis Rancangan Penelitian ................................................. 23

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ....................... 23

xi

1. Variabel penelitian ........................................................ 23

2. Definisi operasional ....................................................... 23

C. Alat ..................................................................................... 24

D. Bahan .................................................................................. 25

E. Tata Cara Penelitian ............................................................ 26

1. Pengumpulan simplisia ................................................... 26

2. Pembuatan serbuk kulit batang pulasari ......................... 26

3. Maserasi ........................................................................ 26

4. Pembuatan air laut buatan .............................................. 28

5. Penetasan siste artemia .................................................. 29

6. Pelaksanaan uji BST ...................................................... 29

7. Pembuatan larutan sampel ............................................. 30

8. Uji toksisitas akut dengan metode BST .......................... 32

F. Analisis Data ........................................................................ 33

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 34

A. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan ................................. 34

B. Pembuatan Serbuk Kulit Batang Pulasari ............................ 35

C. Maserasi .............................................................................. 35

1. Pembuatan ekstrak petroleum eter ................................. 36

2. Pembuatan ekstrak etil asetat ......................................... 37

3. Pembuatan ekstrak air .................................................... 38

D. Pembuatan Air Laut Buatan ................................................ 39

E. Penetasan Siste Artemia ...................................................... 40

xii

F. Uji Toksisitas dengan Metode BST ..................................... 42

1. Analisis probit ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari 47

2. Analisis probit ekstrak etil asetat kulit batang pulasari ... 48

3. Analisis probit ekstrak air kulit batang pulasari .............. 50

G. Rangkuman Pembahasan ...................................................... 51

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 53

A. Kesimpulan ......................................................................... 53

B. Saran ................................................................................... 53

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 54

LAMPIRAN ............................................................................................. 57

BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 84

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan ...... 28

Tabel II. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak petroleum eter .................. 31

Tabel III. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etil asetat ......................... 31

Tabel IV. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak air ................................... 32

Tabel V. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak petroleum

eter kulit batang pulasari ................................................................ 45

Tabel VI. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etil asetat

kulit batang pulasari ................................................................... 46

Tabel VII. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak air kulit

batang pulasari ............................................................................. 46

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Larva artemia ............................................................................. 7

Gambar 2. Perubahan bentuk artemia ........................................................... 8

Gambar 3. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa .......................................... 9

Gambar 4. Artemia dewasa jantan dan betina ............................................... 10

Gambar 5. Mekanisme kerja NA+ dan K+ ATPase ...................................... 14

Gambar 6. Siklus sel .................................................................................... 19

Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak

petroleum eter kulit batang pulasari ........................................... 47


etil asetat kulit batang pulasari .................................................. 49


air kulit batang pulasari ............................................................. 50

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Tanaman Pulasari (Alyxia reinwardtii BL.) dari

CV. MERAPI FARMA HERBAL ........................................... 57

Lampiran 2. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak petroleum

eter yang akan digunakan dalam pengujian .............................. 58

Lampiran 3. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak petroleum

eter kulit batang pulasari .......................................................... 62

Lampiran 4. Perhitungan data statistik SPSS16.00 dengan menggunakan analisis

probit terhadap ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari ..... 63

Lampiran 5. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etil asetat

yang akan digunakan dalam pengujian .................................... 66

Lampiran 6. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etil asetat

kulit batang pulasari ................................................................ 70


probit terhadap ekstrak etil asetat kulit batang pulasari ............ 72

Lampiran 8. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak air yang akan

akan digunakan dalam pengujian ............................................. 74

Lampiran 9. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak air kulit

batang pulasari ........................................................................ 79


probit terhadap ekstrak air kulit batang pulasari ....................... 80

xvi

INTISARI

Masyarakat telah menggunakan kulit batang pulasari (Alyxiae Cortex)

sebagai obat antikanker. Oleh karena itu, dirasa perlu untuk melakukan penelitian yang bertujuan untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak kulit batang pulasari dan menjajaki kemungkinan sifat toksik ekstrak kulit batang pulasari terhadap artemia (Artemia salina L.).

Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian sederhana (post test only control group design). Metode yang digunakan yaitu Brine Shrimp Lethality Test (BST), terhadap 3 macam ekstrak yaitu ekstrak petroleum eter, ekstrak etil asetat dan ekstrak air dengan 5 peringkat konsentrasi pemejanan dan 5 kali replikasi. Ekstrak diperoleh dengan cara maserasi pada mesin pengaduk (shaker) selama 24 jam dengan kecepatan putar 130 rpm. Data persentasi kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis menggunakan analis probit untuk menghitung LC50. Ekstrak dikatakan toksik bila harga LC50 < 1000 µg/ml.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari bersifat tidak toksik terhadap larva artemia dengan LC50 sebesar 2078,18 μg/ml, sedangkan ekstrak etil asetat dan ekstrak air kulit batang pulasari bersifat toksik terhadap larva artemia dengan LC50 masing-masing sebesar 394,43 μg/ml dan 537,69 μg/ml.

Kata kunci : pulasari, LC50, Artemia salina , Brine Shrimp Lethality Test (BST), analisis probit, ekstrak, maserasi

xvii

ABSTRACT

The society have used pulasari bark (Alyxiae Cortex) as a anticancer drug.

Therefore, it is necessary to do research to determine the LC50 value pulasari bark extract and explore the possibility of toxic properties of pulasari bark extract to artemia (Artemia salina L.).

This research used Brine Shrimp Lethality Test (BST) method, with three kinds of extracts such as petroleum ether extract, ethyl acetate extract, and water extract with five concentration levels of injection and five times replication. Extract was obtained with maseration in shaker during 24 hours with rotational speed 130 rpm. Presentation data of artemia larvae mortality was analyzed with probit analysis to count LC50. Extract is toxic if LC50 value < 1000 µg/ml.

The result of this research shows that pulasari bark petroleum ether extract is not toxic to artemia larvae with LC50 2078.18 µg/ml, whereas pulasari bark ethyl acetate and water extract are toxic to artemia larvae with LC50 394.43 µg/ml and 537.69 µg/ml, respectively. Kata kunci : pulasari, LC50, Artemia salina , Brine Shrimp Lethality Test (BST), probit analysis, extract, maseration

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Penyakit kanker dikenal sukar disembuhkan dan dapat menyebabkan

kematian penderitanya jika tidak dirawat sejak awal. Berdasarkan data Riset

Kesehatan Dasar (Riskesdas) 2008, tumor atau kanker merupakan penyebab

kematian nomor 7 di Indonesia dengan presentasi 5,7 persen, prevalensi tumor

atau kanker di Indonesia adalah 4,3 per 1000 penduduk (Anonim, 2011).

Walaupun telah banyak ditemukan obat antikanker dan telah banyak dilakukan

kemoterapi, namun hasilnya belum memuaskan dan biayanya juga sangat mahal.

Hal inilah yang mendorong masyarakat untuk melakukan pengobatan

menggunakan bahan alam atau obat tradisional (Anonim, 2010a).

Pencarian obat-obat antikanker terus dilakukan. Salah satunya yaitu kulit

batang pulasari (Alyxiae Cortex) yang secara empirik digunakan antara lain untuk

penurun demam, obat batuk, obat pusing dan obat disentri (Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 1983). Hal ini berkaitan dengan kandungan kimia

kulit batang pulasari yaitu: kumarin, tanin, alkaloid dan saponin (Syamsuhidayat

dan Hutapea, 1981).

Untuk mengetahui apakah kulit batang pulasari memiliki senyawa

bioaktif yang berpotensi sebagai antikanker (memiliki efek sitotoksik), maka perlu

dilakukan penelitian tentang nilai Lethal Contrentation-50 (LC50). LC50 adalah

kadar yang menyebabkan kematian 50% hewan uji pada pejanan selama waktu

2

tertentu (Lu, 1995). Berdasarkan LC50 dapat diketahui tingkat aktivitas suatu

senyawa. Apabila nilai LC50 suatu senyawa hasil isolasi atau ekstrak tanaman

kurang dari 1000 µg/ml, maka seyawa tersebut dapat diduga memiliki efek

sitotosik (Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols, and McLaughlin, 1982).

Metode yang sering digunakan untuk mengetahui potensi efek sitotoksik

suatu senyawa adalah Brine Shrimp Lethality Test (BST). Kelebihan metode ini

adalah cukup praktis, murah, sederhana, cepat, tapi tidak mengesampingkan

kekuatannya untuk skrining awal tanaman berpotensi antikanker dengan

menggunakan hewan uji larva artemia (Artemia salina L.). Prinsip metode ini

adalah uji toksisitas akut terhadap artemia dengan penentuan nilai LC50 setelah

perlakuan 24 jam (Meyer, et al., 1982). Artemia digunakan sebagai hewan uji

karena memiliki kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA-

dependent RNA polimerase artemia serupa dengan yang terdapat pada mamalia

dan organisme yang memiliki ouabaine-sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase,

sehingga senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut

dapat terdeteksi (Solis, Wright, Anderson, Gupta, and Philipson, 1993).

Metode BST tidak spesifik untuk pengujian antikanker dan sebagian aksi

fisiologis, namun metode ini dapat memonitor kemungkinan adanya efek

sitotoksik dengan waktu dan biaya penelitian yang lebih sedikit dibandingkan

dengan pengujian sitotoksisitas menggunakan biakan sel kanker. Senyawa yang

bersifat toksik pada uji BST belum tentu bersifat sitotoksik, sehingga perlu

dilakukan uji tingkat lanjut dengan menggunakan sel kanker. Namun, suatu

senyawa yang bersifat sitotoksik akan bersifat toksik bila diuji dengan metode

3

BST (Meyer, et al., 1982). Maka diharapkan metode BST dapat digunakan

sebagai langkah awal untuk menentukan senyawa yang memiliki efek sitotoksik.

Kulit batang pulasari mengandung beberapa jenis senyawa, diantaranya

golongan alkaloid. Smets (2001) menyatakan bahwa alkaloid yang berasal dari

tanaman vinca dan colchicine memiliki mekanisme sitotoksik dengan berperan

sebagai tubulin inhibitor.

Menurut Mursyidi (1990), alkaloid sukar larut dalam air tetapi larut dalam

pelarut organik yang relatif non polar dan tidak campur dengan air. Sebaliknya,

dalam bentuk garam alkaloid larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik.

Oleh karena itu, ekstraksi terhadap kulit batang pulasari dilakukan menggunakan

tiga pelarut, yaitu : petroleum eter, etil asetat dan air yang dipilih berdasarkan

perbedaan sifat kepolarannya. Petroleum eter merupakan senyawa organik dan

bersifat non polar yang berfungsi menyari senyawa-senyawa yang bersifat non

polar. Etil asetat merupakan senyawa organik dan bersifat kurang polar

dibandingkan air dapat pula disebut bersifat semi polar. Diharapkan etil asetat

berfungsi menyari senyawa-senyawa yang bersifat semi polar. Air merupakan

pelarut yang paling polar dibandingkan kedua pelarut. Diharapkan senyawa-

senyawa yang bersifat polar akan terlarut ke dalam pelarut air (Harborne, 1987).

1. Perumusan masalah

Permasalahan pada penelitian ini adalah :

1. Apakah ekstrak kulit batang pulasari toksik terhadap larva artemia dan

berapakah nilai LC50?

4

2. Mengetahui ekstrak manakah yang paling toksik diantara ekstrak

petroleum eter, ekstrak etil asetat dan ekstrak air kulit batang pulasari

terhadap larva artemia yang ditunjukkan dengan LC50 paling kecil?

2. Keaslian penelitian

Berdasarkan penelusuran pustaka yang dilakukan oleh peneliti uji

toksitas akut ekstrak kulit batang pulasari dengan metode BST belum pernah

dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis, yaitu dapat memberikan informasi tentang

toksisitas akut ekstrak kulit batang pulasari.

b. Manfaat praktis, yaitu dapat memberikan informasi tentang

kemungkinan pengobatan alternatif kanker menggunakan kulit batang

pulasari.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menjajaki kemungkinan

potensi kulit batang pulasari sebagai obat antikanker.

2. Tujuan khusus

Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak

kulit batang pulasari dan mengetahui ekstrak yang paling toksik diantara ekstrak

petroleum eter, ekstrak etil asetat dan ekstrak air kulit batang pulasari terhadap

larva artemia.

5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tumbuhan Pulasari

1. Keterangan botani

Tumbuhan pulasari (Alyxia stellata Auct.) termasuk dalam famili

apocynaceae. Dikenal dengan nama lain Alyxia reinwardtii BL. Dikenal di

beberapa daerah dengan nama: akar mempelas hari, empelas hari, mempelas hari,

palasari, pulasari (Sumatra), talatari (Aceh), arey palasari, arey pulasari, palasari,

pulasari, das plasare (Madura), adas pulasari (Jakarta), pulasari (Bali), pulasari,

calpari (Makasar), calapari (Bugis), balasari (Buton) dan purasane

(Ambon)(Anonim, 2010c).

Tumbuhan pulasari ini berupa semak yang menanjak atau merambat,

tinggi 5 m sampai 10 m, dalam keadaan subur, batang utama dapat sebesar lengan

dan menjalar ditanah, dari batang utama timbul cabang-cabang sebesar ibu jari.

Cabang-cabang utama tidak berdaun, hanya dibagian atas terdapat daun-daun

yang terpusar 3 sampai 4 helai bersama-sama; helai daun berbentuk gelondong

atau lonjong dengan pangkal daun dan ujung daun meruncing, lebar daun 1 cm

sampai 2,5 cm dan panjang daun 3 cm sampai 10 cm, tangkai daun tebal dan

panjang 0,5 cm sampai 1 cm; penulangan daun menyirip dnga banyak cabang-

cabang, helai daun tipis. Perbungaan malai terdapat pada ketiak daun satu atau

berpasangan, panjang tangkai (gagang) malai 4 mm sampai 6 mm dan berbunga 3

sampai 6 buah; bunga kecil, warna putih, berkelipatan lima; kelopak terbagi

6

dalam bagian-bagian kelopak berbentuk bundar telur dan sempit; mahkota

berbentuk corong dan berwarna putih (Anonim, 2010b).

2. Kandungan kimia

Kulit batang pulasari mengandung kumarin, tanin, alkaloid, saponin,

minyak atsiri dan polifenol (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1981).

3. Khasiat

Kulit batang pulasari sering digunakan untuk mengobati beberapa

keluhan penyakit, digunakan sebagai bahan tunggal maupun campuran dalam

bentuk ramuan jamu. Secara empirik pulasari digunakan antara lain untuk obat

disentri, sariawanan, merangsang nafsu makan, obat batuk, obat mulas, obat

kencing nanah, untuk mengobati demam pada anak-anak, obat kejang usus, darah

yang tidak berhenti keluar, obat radang lambung, mengatasi haid tidak teratur,

keputihan dan kanker (Syamsuhidayat dan Hutapea, 1981).

B. Artemia

Artemia (Artemia salina L.) adalah udang yang termasuk dalam famili

Artemiidae, merupakan udang-udangan tingkat rendah yang hidup sebagai

zooplankton, yang menghuni perairan-perairan yang berkadar garam tinggi.

Artemia dapat digunakan di laboratorium bioassay untuk menentukan toksisitas

dengan perhitungan konsentrasi yang menimbulkan 50% anggota populasi hewan

uji mati (LC50), yang telah dilaporkan untuk racun dan ekstrak tanaman

(Mudjiman, 1989).

7

1. Morfologi

a. Telur

Istilah untuk telur artemia adalah siste, yaitu telur yang telah

berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh

cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi

embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan

mempermudah pengapungan. Oleh karena itu, ia sangat tahan menghadapi

keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).

b. Larva

Apabila siste artemia direndam dalam air laut bersuhu 25ºC, maka akan

menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah larva

yang juga dikenal dengan istilah nauplius (gambar 1). Dalam perkembangan

selanjutnya, larva akan mengalami 15 kali perubahan bentuk atau

metamorphosis. Setiap kali larva mengalami perubahan bentuk merupakan

satu tingkatan. Larva tingkat I dinamakan instar I, tingkat II dinamakan instar

II, tingkat III dinamakan instar III, demikian seterusnya sampai instar XV.

Setelah itu berubahlah menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

8

Gambar 1. Larva artemia ( Mudjiman, 1989)

Larva yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I (gambar

2). Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan

cadangan. Oleh karena itu mereka masih belum perlu makan. Anggota

badannya terdiri dari sepasang sungut kecil (antenule atau antena I) dan

sepasang sungut besar (antena atau antena II). Di bagian sungut besar terdapat

sepasang mandibulata (rahang) yang kecil, sedangkan di bagian ventral

(perut) terdapat labrum (Mudjiman, 1989).

Gambar 2. Perubahan bentuk artemia (Mudjiman, 1989)

Sekitar 24 jam setelah menetas, larva akan berubah menjadi instar II

(gambar 2). Pada tingkatan instar II, larva udah mulai mempunyai mulut,

saluran pencernaan dan dubur. Oleh karena itu, mereka mulai mencari

makanan. Bersamaan dengan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai

habis. Pengumpulan makanannya mereka lakukan dengan menggerakkan

antena II-nya. Selain itu, untuk mengumpulkan mengumpulkan makanan,

antena II terebut juga berguna untuk bergerak (Mudjiman, 1989).

9

Pada tingkatan selanjutnya mulai terbentuk sepasang mata majemuk,

selain itu berangsur-angsur tumbuh tunas-tunus kakinya. Setelah menjadi

instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah

masa larva, dan berubah menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

Gambar 3. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa ( Mudjiman, 1989)

c. Artemia dewasa

Artemia dewasa bentuknya telah sempurna dan menyerupai udang

kecil dengan ukuran panjang sekitar 1 cm, dengan kaki yang sudah lengkap

sebanyak 11 pasang yang secara khusus torakopoda (gambar 3). Baik pada

yang jantan maupun yang betina, antena I-nya (antenula) tetap saja sebagai

sungut, yang fungsinya sebagai alat peraba. Pada artemia jantan antena II

berubah menjadi alat penjepit yang membesar dan berotot yang kegunaannya

untuk berpegangan pada betina waktu menjelang perkawinan. Pada betina,

antenna II-nya mengalami penyusutan yang akhirnya berubah menjadi alat

10

peraba. Di belakang kaki torakopoda yang jantan terdapat sepasang alat

kelamin luarnya (penis), sedangkan pada yang betina terdapat sepasang

indung telur (ovarium) yang terletak disebelah kanan dan kiri saluran

pencernaan (gambar 4)(Mudjiman, 1989).

Gambar 4. Artemia dewasa jantan dan betina (Mudjiman, 1989)

2. Lingkungan hidup artemia

a. Suhu

Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6ºC atau

lebih dari 35ºC, tetapi hal ini sangat tergantung pada ras dan kebiasaan tempat

hidup mereka. Pertumbuhan artemia yang baik berkisar pada suhu antara

25ºC-30ºC (Mudjiman, 1989).

b. Kadar garam

Perkembangan artemia yang membutuhkan kadar garam yang tinggi

sebab pada kadar garam yang tinggi itu musuh-musuhnya tidak dapat hidup

lagi, sehingga artemia akan dapat aman tanpa ganguan. Untuk pertumbuhan

telur, ternyata dibutuhkan air yang kadar garamnya lebih rendah dari pada

11

suatu batas tertentu. Batas ini berlainan untuk tiap jenis artemia (Mudjiman,

1989).

Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia

dalam air ternyata juga sangat tinggi. Apabila kandungan ion natrium

dibandingkan dengan ion kalium di dalam air laut adalah 28, maka artemia

masih dapat bertahan pada perbandingan antara 8-173 (Mudjiman, 1989).

c. Oksigen terlarut

Artemia dapat hidup dan menyesuaikan diri pada tempat yang kadar

oksigennya rendah maupun yang mengalami kejenuhan oksigen (Mudjiman,

1989).

d. pH

Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum

jelas namun berpengaruh terhadap penetasan telur. Apabila pH untuk

penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasan akan menurun (Mudjiman,

1989).

3. Cara penetasan telur

Telur artemia dapat ditetaskan dalam air laut biasa (kadar garam 30

permil). Untuk mencapai hasil penetasan yang baik diperlukan air berkadar

garam 5 permil, yang dibuat dengan cara pengenceran air laut biasa dengan air

tawar. Agar pH air laut yang diencerkan tidak turun namun tetap antara 8-9

maka perlu ditambahkan natrium hidrokarbonat sebanyak 2g/l. Selain itu,

dapat juga digunakan air laut buatan yang berkadar garam 5 permil

(Mudjiman, 1989).

12

Terjadinya pemecahan cangkang telur dibantu oleh kegiatan enzim,

yaitu enzim penetasan. Enzim ini berkerja pada pH > 8 (antara 8-9). Suhu air

selama penetasan hendaknya tetap, yaitu berkisar antara 25ºC-30ºC. Kadar

oksigennya harus lebih dari 2mg/l. Untuk itu air perlu diaerasi (diberi udara/

oksigen). Sebagai sumber udara dapat digunakan penghembus udara (blower)

atau aerator, yaitu pompa udara untuk aquarium (Mudjiman, 1989).

4. Penggunaan artemia pada metode BST

Artemia secara luas telah digunakan untuk pengujian aktivitas

farmakologi ekstrak suatu tanaman. Artemia juga merupakan hewan uji yang

digunakan untuk praskrining aktivitas antikanker di National Cancer Institude

(NCI), Amerika Serikat. Uji BST dengan hewan uji artemia dapat digunakan

untuk skrining awal terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat

sebagai antitumor karena uji ini mempunyai kolerasi yang positif dengan

potensinya sebagai antitumor maupun fisiologis aktif tertentu (Anderson,

Goets, dan Laughlin, 1991).

Penggunaan artemia ini memang tidak spesifik untuk antitumor

maupun fisiologis aktif tertentu, namun beberapa penelitian terdahulu

menunjukkan adanya korelasi yang signifikan terhadap beberapa bahan, baik

berupa ekstrak tanaman, atas aksinya sebagai antitumor secara lebih cepat

dibandingkan dengan prosedur pemeriksaan sitotoksik yang umum, misalnya

dengan biakan sel tumor. Melihat adanya potensi sebagai antitumor tersebut,

maka penelitian lanjutan dapat dilakukan, yaitu dengan mengisolasi senyawa

berkhasiat yang terdapat di dalam ekstrak disertai dengan monitoring

13

aktivitasnya dengan uji larva udang atau metode yang lebih spesifik sebagai

antitumor (Meyer, et al., 1982).

Artemia salina digunakan sebagai hewan uji karena memiliki

kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA

polimerase artemia serupa dengan yang terdapat pada mamalia dan organisme

yang memiliki ouabaine-sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase, sehingga

senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut dapat

terdeteksi (Solis, et al., 1993).

DNA-dependent RNA polymerase merupakan DNA yang

mengarahkan proses transkripsi RNA yang bergantung pada RNA

polymerase. Enzim ini membuka pilinan kedua untai DNA sehingga terpisah

dan mengkaitkannya dengan bersama-sama nukleotida RNA pada saat

nukleotida-nukleotida ini membentuk pasangan basa di sepanjang cetakan

DNA. Eukariotik mempunyai 3 macam RNA polymerase, yaitu mRNA

(messenger RNA) yang merupakan pembawa kode genetik dari DNA ke

ribosom, tRNA (transfer RNA) yang berfungsi untuk menterjemahkan kodon

dan mengikat asam amino yang akan disusun menjadi protein dan

mengangkutnya ke ribosom, serta rRNA (ribosomal RNA) yang bersamaan

dengan protein membentuk ribosom. Jika RNA polymerase tersebut dihambat,

maka DNA tidak dapat mensintesis RNA dan RNA tidak dapat terbentuk

sehingga sintesis protein juga dihambat. Protein merupakan komponen utama

semua sel. Protein berfungsi sebagai unsur struktural, hormon,

immunoglobulin, serta terlibat dalam kegiatan transport oksigen, kontraksi

14

otot, dan lainnya (Nuswantari, 1998). Jika protein tidak terbentuk,

metabolisme sel dapat terggangu, sehingga pada akhirnya akan menyebabkan

kematian sel.

Artemia juga memiliki ouabaine-sensitive Na+ dan K+ dependent

ATPase. Na+ dan K+ dependent ATPase merupakan enzim yang mengkatalisis

hidrolisis ATP menjadi ADP serta menggunakan energi untuk mengeluarkan

3Na+ dari sel dan mengambil 2K+ ke dalam, tiap sel bagi tiap mol ATP

dihidrolisis. Na+ K+ ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh. Aktivitas

enzim ini dihambat oleh ouabaine. Adanya ouabaine menyebabkan

keseimbangan ion Na+ dan K+ tetap terjaga (homeostatis). Selain itu,

sekarang ini ouabaine juga digunakan untuk terapi jantung. Di dalam jantung,

Na+ K+ ATPase secara tak langsung mempengaruhi transport Ca2+ karena Na+

ekstrasel akan ditukar dengan Ca2+ intrasel. Jika kerja Na+ K+ ATPase

dihambat, maka lebih sedikit Ca2+ intrasel dikeluarkan dan Ca2+ intrasel

meningkat, sehingga memudahkan kontraksi otot jantung (Ganong, 1995).

Gambar 5. Mekanisme kerja NA+ dan K+ ATPase (Michael, 2007)

15

Jika suatu senyawa bekerja mengganggu kerja salah satu enzim ini

pada artemia dan menyebabkan kematian artemia, maka senyawa tersebut

bersifat toksik dan dapat menyebabkan kematian sel mamalia (Solis, et al.,

1993).

Keuntungan penggunaan artemia sebagai hewan uji adalah

kesederhanan dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat, dan konsentrasi kecil

sudah dapat menimbulkan aktivitas biologis (Meyer, et al., 1982).

C. Toksisitas Akut

Toksisitas dapat didefinisikan sebagai kemampuan suatu zat untuk

menimbulkan kerusakan (Katzung, 1987). Uji toksisitas akut merupakan uji

dengan pemberian suatu senyawa pada hewan uji pada suatu saat atau uji

ketoksikan suatu senyawa yang diberikan dengan dosis tunggal pada hewan uji

tertentu dan pengamatan dilakukan selama 24 jam. Maksud dari toksisitas akut

yaitu untuk menentukan suatu gejala dan tingkat kematian hewan uji akibat

pemberian senyawa tersebut. Pengamatan aktivitas biologi uji toksisitas akut

berupa pengamatan gejala klinik, kematian hewan uji atau pengamatan organ

(Loomis, 1978).

Uji toksisitas akut dilakukan untuk mempersempit kisaran dosis dan

terakhir dilakukan uji toksisitas akut untuk mendapatkan persentase kematian.

Data yang diperoleh dari uji toksisitas akut dapat berupa data kuantitatif yang

dinyatakan dengan LD50 (median lethal dose) atau LC50 (median lethal

consentration). Harga LD50 dan LC50 suatu senyawa harus dilaporkan sesuai

16

dengan lamanya pengamatan. Bila lama pengamatan tidak ditunjukkan, maka

dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Loomis, 1978).

Parameter yang digunakan untuk menunjukan adanya aktivitas biologis

suatu senyawa pada Artemia salina adalah kematian. Keuntungan penggunaan

artemia sebagai hewan uji adalah kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu yang

relatif singkat dan konsentrasi kecil sudah dapat menimbulkan aktivitas biologi

(Meyer et al., 1982).

D. Brine Shrimp Lethality Test (BST)

Brine Shrimp Lethality Test merupakan salah satu metode pengujian awal

aktifitas antikanker suatu senyawa dengan menggunakan hewan uji Artemia

salina (artemia) selama 24 jam. Uji toksisitas akut dengan hewan uji artemia ini

dapat digunakan sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarahkan pada

uji sitotoksik karena ada kaitannya antara uji tosiksitas akut dengan uji sitotoksik

jika harga LC50 dari uji toksisitas akut lebih kecil dari 1000 µg/ml. Parameter

yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologis suatu senyawa pada

artemia adalah kematian (Meyer et al., 1982).

Tingkat toksisitas dari ekstrak dapat ditentukan dengan melihat harga

LC50. Nilai LC50 dihitung dengan analisis probit. Dari persentase data kematian

larva artemia dikonversikan ke nilai probit untuk menghitung harga LC50. Apabila

harga LC50

17

dapat dilanjutkan dengan pengujian antikanker menggunakan biakan sel kanker.

Cara ini akan menghemat waktu dan biaya penelitian (Meyer et al., 1982).

E. Kanker

Kanker merupakan suatu penyakit sel dengan cirri gangguan atau

kegagalan mekanis pengaturan multiplikasi dan fungsi homeostasis lainnya pada

organism multiseluler (Nafrialdi dan Ganiswarna, 1995). Sel-sel kanker akan terus

membelah diri, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti

hukum-hukum pembiakan. Sel-sel kanker dapat menyusup ke jaringan sekitarnya

(invasi) dan dapat menyebar ke seluruh jaringan (metastasis). Selain itu sel kanker

juga kehilangan fungsinya dan bersifat destruksif/merusak sel lainnya (Schunack,

Mayer dan Haake, 1990).

Tahap-tahap pembentukan sel kanker adalah :

1. Inisiasi, yaitu tahap pembentukan metabolit reaktif yang mampu berkaitan

secara kovalen dengan DNA sehingga menyebabkan terjadinya mutasi

pada DNA.

2. Promosi, yaitu ekspresi mutasi yang dapat menyebabkan perubahan fungsi

seluler (ekspresi gen dan fungsi reseptor) serta pertumbuhan neoplasma

(sel yang pertumbuhannya tidak normal)

3. Progresif, yaitu manifestasi pertumbuhan dan perkembangan tumor

menjadi ganas (kanker) dengan invasi dan metastasis.

18

Pada organisme eukariotik, terdapat empat fase dalam siklus sel, yaitu :

a. Fase Gap (G1) atau fase pascamitosis merupakan fase awal di mana terjadi

sintesis asam ribonukleat dan protein.

b. Fase Sintesis (S) dimana terjadi replikasi identik dari DNA sehingga

dihasilkan dua set komplit DNA.

c. Fase Gap (G2) atau fase pramitosis merupakan fase persiapan untuk

memasuki fase mitosis.

d. Fase Mitosis (M) merupakan fase dimana material inti diturunkan identik

kepada sel anak, yang ditandai dengan pembagian kromosom dan

dihasilkan dua sel anakan.

Untuk selanjutnya sel dapat memasuki fase G0 dan dapat juga masuk

kembali ke fase G1. Hormon pertumbuhan, cyclins dan Cdk (cyclin dependent

kinase) merupakan sinyal transduksi yang dapat memacu sel untuk memasuki

daur sel kembali, sedangkan protein penekan tumor (misalnya p53), dan Cdk

inhibitor akan memacu sel untuk memasuki fase istirahat (G0). Pada sel kanker,

tidak terdapat p53 atau jumlah p53 kurang (antara lain karena terjadinya mutasi

p53), sehingga sel kanker tidak dapat memasuki fase G0 dan sel tersebut akan

memasuki siklus sel dalam jangka waktu yang tidak terbatas, sehingga sel akan

terus membelah (Schunack et al., 1990).

19

Gambar 6. Siklus sel ( Michael, 2007)

Karsinogenik dapat merangsang pembentuk kanker. Beberapa

karsinogen yang diduga dapat menaikan resiko terjadinya kanker antara lain

senyawa kimia (zat karsinogen), faktor fisika (radiasi bom atom dan radioterapi

agresif), virus (virus hepatitis B dan C), dan hormon (Dalimartha,2003).

F. Penyarian

Pemilihan penyari dalam penyarian merupakan hal yang harus

dipertimbangkan. Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif

yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa

lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa aktif

berkhasiat yang diinginkan (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan

Republik Indonesia, 1985).

20

Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari

simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok, di luar pengaruh cahaya

matahari langsung. Ekstrak kering harus mudah digerus menjadi serbuk

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1985).

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam penyari. Penyari akan

menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat

aktif. Zat aktif akan larut karena adanya beda konsentrasi antara larutan di dalam

dan di luar sel. Larutan yang lebih pekat akan terdesak keluar. Peristiwa ini

berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di

luar sel (Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986 ).

G. Alkaloid

Alkaloid adalah senyawa basa nitrogen yang terdapat dalam tumbuhan.

Kebanyakan alkaloid menunjukkan aktivitas fisiologis tertentu sehingga metabolit

sekunder ini banyak digunakan sebagai obat. Pada umumnya alkaloid

mengandung satu atom nitrogen, akan tetapi beberapa alkaloid (ergometrina,

fisostigmina, kafeina) mempunyai lebih dari satu nitrogen dalam molekulnya.

Atom nitrogen dapat sebagai amin primer maupun amin sekunder (Mursyidi,

1990).

Kebanyakan alkaloid berupa zat padat, rasa pahit dan sukar larut dalam

air, tetapi mudah larut dalam kloroform, eter dan pelarut organik lain yang relatif

non polar dan tidak campur dengan air. Sebaliknya, garam alkaloid larut dalam

air, tetapi tak larut dalam pelarut organik (Mursyidi, 1990).

21

Peran alkaloid bagi tumbuhan penghasil, antara lain sebagai zat racun

yang melindungi tumbuhan dari gangguan serangga dan hewan, produk akhir

reaksi detoksifikasi hasil metabolisme, faktor pengatur pertumbuhan dan

persediaan unsur nitrogen yang mungkin diperlukan bagi pertumbuhan (Mursyidi,

1990).

H. Landasan Teori

Kulit batang pulasari mengandung beberapa jenis senyawa, diantaranya

golongan alkaloid. Smets (2001) menyatakan bahwa alkaloid yang berasal dari

tanaman vinca dan colchicine memiliki mekanisme sitotoksik dengan berperan

sebagai tubulin inhibitor.

Menurut Mursyidi (1990), alkaloid sukar larut dalam air tetapi larut dalam

pelarut organik yang relatif non polar dan tidak campur dengan air. Sebaliknya,

dalam bentuk garam alkaloid larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik.

Ekstraksi terhadap kulit batang pulasari dilakukan menggunakan pelarut

petroleum eter, etil asetat dan air yang dipilih berdasarkan perbedaan sifat

kepolarannya. Petroleum eter merupakan senyawa organik dan bersifat non polar

yang berfungsi menyari senyawa-senyawa yang bersifat non polar. Etil asetat

merupakan senyawa organik dan bersifat kurang polar dibandingkan air dapat

pula disebut bersifat semi polar. Diharapkan etil asetat berfungsi menyari

senyawa-senyawa yang bersifat semi polar. Air merupakan pelarut yang paling

polar dibandingkan kedua pelarut. Diharapkan senyawa-senyawa yang bersifat

polar akan terlarut ke dalam pelarut air.

22

I. Hipotesis

Terjadi perbedaan toksisitas antara ekstrak petroleum eter, ekstrak etil

asetat dan ekstrak air dari kulit batang pulasari yang dapat ditunjukan dengan

metode BST.

23

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan menggunakan

rancangan penelitian sederhana (post test only control group design).

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

Variabel- variabel dalam penelitian ini adalah :

a. Variabel bebas :

Konsentrasi dari ekstrak kulit batang pulasari.

b. Variabel tergantung :

% kematian larva artemia.

c. Variabel terkontrol :

1. Faktor lingkungan percobaan, yaitu sinar lampu 5 Watt, suhu

penetasan, yaitu 25º C-30ºC, pH air laut buatan, yaitu 8-9, dan

kadar garam 5 permil.

2. Faktor hewan uji yaitu umur larva artemia (48 jam).

2. Definisi operasional

a. Ekstrak air kulit batang pulasari diperoleh dengan cara maserasi serbuk

kulit batang pulasari dengan pelarut aquadest menggunakan mesin

pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm) selama 24 jam lalu

disaring dengan kertas saring.

24

b. Ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari diperoleh dengan cara

maserasi serbuk kulit batang pulasari dengan pelarut petroleum eter

menggunakan mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm)

selama 24 jam lalu disaring dengan kertas.

c. Ekstrak etil asetat kulit batang pulasari diperoleh dengan cara maserasi

serbuk kulit batang pulasari dengan pelarut etil asetat menggunakan

mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm) selama 24

jam lalu disaring dengan kertas.

d. Lethal Contrentation-50 (LC50) adalah kadar ekstrak kulit batang

pulasari yang menyebabkan kematian 50% artemia pada pejanan

selama 24 jam.

e. Larva artemia merupakan larva usia 48 jam setelah penetasan telur

artemia.

C. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi seperangkat alat

gelas (Pyrex), termometer, blender, mikropipet (Socorex ISBA S.A), timbangan

analitik, flakon, aquarium khusus BST, flakon, aerator, lampu penerang, pipet

Pasteur, vaccum rotary evaporator (Janke & Kunkel), dan oven

25

D. Bahan

a. Bahan utama

Kulit batang pulasari kering diperoleh dari PT. Merapi Farma Herbal,

Jl. Cangkringan, km 2 Dhuri, Tirtomartani, Kalasan, Yogyakarta.

b. Bahan untuk ekstraksi

Bahan yang digunakan untuk penyarian yaitu untuk ekstrak air kulit

batang pulasari digunakan aquadest yang diperoleh dari Laboratorium

Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, untuk

ekstrak petroleum eter di peroleh dari PT. Brata Chem, untuk ekstrak etil

asetat di peroleh dari PT. Brata Chem.

c. Bahan untuk BST

Bahan yang digunakan untuk uji BST antara lain telur Artemia salina

leach (Brine Shrimp Egg, Ocean Star International Inc.), air laut buatan

berkadar garam 5 per mil, ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari, ekstrak

etil asetat kulit batang pulasari, ekstrak air kulit batang pulasari dan ragi

Saccharomyces cerevisae.

d. Bahan untuk air laut buatan

Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan

berderajad teknis, yaitu natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium

klorida, kalsium klorida, kalium klorida, dan natrium bikarbonat, serta

aquadest, aquadest bebas karbon dioksida dan aquadest panas.

26

E. Tata Cara Penelitian

1. Pengumpulan simplisia

Simplisia yang digunakan berupa kulit batang pulasari kering yang

didapat dari PT. Merapi Farma.

2. Pembuatan serbuk kulit batang pulasari

Kulit batang pulasari dipotong kecil-kecil dengan ukuran kurang lebih

sama kemudian diblender hingga diperoleh ukuran yang lebih kecil. Setelah itu

serbuk diayak menggunakan ayakan tepung. Serbuk diayak sampai sehingga

diperoleh serbuk halus.

3. Maserasi

a. Pembuatan ekstrak petroleum eter

Serbuk halus kulit batang pulasari ditimbang sebanyak 100 g dan

dimasukan dalam bejana tertutup dan dimaserasi dengan direndam dalam

petroleum eter sebanyak 750 ml. Bejana kemudian dilapisi alumunium foil lalu

diletakan dalam mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm)

selama 24 jam lalu disaring dengan kertas. Maserat disimpan dan ditampung

dalam suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 750 ml

petroleum eter menggunakan shaker 130 rpm selama 24 jam kemudian

disaring dengan kertas saring. Maserat kemudian digabung dengan maserat

hasil maserasi 24 jam pertama, sedangkan ampas dimaserasi lagi sampai filtrat

hasil penyaringan jernih. Seluruh filtat hasil remaserasi digabung dan diuapkan

pelarutnya dengan vaccum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.

27

Ekstrak kental yang didapat diuapkan diatas penangas air sampai diperoleh

ektrak kering.

b. Pembuatan etil asetat

Ampas hasil maserasi dikeringkan dari petroleum eter kemudian

dimasukan dalam bejana tertutup dan dimaserasi dengan direndam dalam

kloroform sebanyak 750 ml. Bejana kemudian dilapisi alumunium foil lalu

diletakan dalam mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm)

selama 24 jam lalu disaring dengan kertas. Maserat disimpan dan ditampung

dalam suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 750 ml

kloroform menggunakan shaker 130 rpm selama 24 jam kemudian disaring

dengan kertas saring. Maserat kemudian digabung dengan maserat hasil

maserasi 24 jam pertama, sedangkan ampas dimaserasi lagi sampai filtrat hasil

penyaringan jernih. Seluruh filtrat hasil remaserasi digabung dan diuapkan

pelarutnya dengan vaccum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental.

Ekstrak kental yang didapat diuapkan diatas penangas air sampai diperoleh

ektrak kering.

c. Pembuatan ekstrak air

Ampas hasil maserasi dikeringkan dari kloroform kemudian

dimasukan dalam bejana tertutup dan dimaserasi dengan direndam dalam air

sebanyak 750 ml. Bejana kemudian dilapisi alumunium foil lalu diletakan

dalam mesin pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm) selama 24 jam

lalu disaring dengan kertas. Maserat disimpan dan ditampung dalam suhu

kamar, sedangkan ampasnya dimaserasi lagi dengan 750 ml air menggunakan

28

shaker 130 rpm selama 24 jam kemudian disaring dengan kertas saring.

Maserat kemudian digabung dengan maserat hasil maserasi 24 jam pertama,

sedangkan ampas dimaserasi lagi sampai filtrat hasil penyaringan jernih.

Seluruh filtat hasil remaserasi digabung dan diuapkan pelarutnya dengan

vaccum rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental

yang didapat diuapkan diatas penangas air sampai diperoleh ektrak kering.

4. Pembuatan air laut buatan

Bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berkadar

garam 5 per mil yaitu 5 g natrium klorida; 1,3 g magnesium sulfat; 1 g

magnesium klorida; 0,3 g kalsium klorida; 0,2 g kalium klorida; dan 2 g

natrium bikarbonat dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan-bahan sebagian

dilarutkan dalam sebagian aquadest dalam labu takar 1 liter. Khusus untuk

magnesium sulfat dilarutkan dalam air panas, sedangkan natrium bikarbonat

dilarutkan dengan air bebas karbon dioksida. Lalu ditambah aquadest sampai

volume 1 liter (Mudjiman, 1989).

Tabel I. Bahan-bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan

No Bahan Jumlah (g) 1 NaCl 5,0 2 MgSO4 1,3 3 MgCl2 1,0 4 CaCl2 0,3 5 KCl 0,2 6 NaHCO3 2,0 7 Aquadest Sampai 1 liter

(Mudjiman, 1989).

Bahan-bahan tersebut ditimbang, lalu dilarutkan dalam sebagian

aquadest pada labu takar 1 liter. Khusus untuk magnesium sulfat dilarutkan

29

dengan menggunakan air panas dan natrium klorida dilarutkan dalam air bebas

karbon dioksida, kemudian ditambahkan aquadest sampai volume tepat 1 liter.

Air laut buatan berkadar garam 5 per mil dan pH antara 7,3-8,4 merupakan

media hidup yang sesuai untuk larva artemia.

5. Penetasan siste artemia

Tempat penetasan siste artemia berupa aquarium dengan kaca gelap

yang terbagi menjadi dua bagian dengan suatu sekat berlubang pada bagian

bawahnya. Salah satu bagian adalah area yang terang, sedangkan bagian lain

adalah area yang gelap tempat siste artemia ditaburkan. Suhu penetasan

berkisar antara 25ºC-30ºC, pH antara 7,3-8,4. Air laut buatan dengan kadar

garam 5 permil diaerasi selama 1 jam. Air laut buatan dimasukan dalam

aquarium khusus BST. Kemudian siste artemia ditaburkan di area gelap secara

merata dan diberi penerangan. Setelah 24 jam, siste akan menetas menjadi

nauplius yang aktif bergerak menuju ke tempat terang. Larva yang akan

digunakan adalah larva yang telah berumur 48 jam

Setelah siste artemia menetas, pada aquarium harus ditambahkan lagi

air laut buatan yang telah diaerasi selama 1 jam agar larva artemia yang baru

menetas tidak kekurangan aquadest dan oksigen.

6. Pelaksanaan uji BST

a. Ekstrak petroleum eter dibuat seri konsentrasi 1000, 1400, 1960, 2744, dan

3841 μg/ml. Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu,

dilakukan pengujian terhadap kelompok kontrol, yaitu petroleum eter

dengan jumlah yang sama dengan jumlah ekstrak petroleum eter yang

30

ditambahkan dalam tiap-tiap flakon. Dilakukan lima kali replikasi untuk

masing-masing seri konsentrasi.

b. Ekstrak etil asetat dibuat seri konsentrasi 200, 280, 392, 549, dan 796

μg/ml. Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu, dilakukan

pengujian terhadap kelompok kontrol, yaitu etil asetat dengan jumlah yang

sama dengan jumlah ekstrak etil asetat yang ditambahkan dalam tiap-tiap

flakon. Dilakukan lima kali replikasi untuk masing-masing seri konsentrasi.

c. Ekstrak air dibuat seri konsentrasi 100, 200, 400, 800, dan 1600 μg/ml.

Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu, dilakukan

pengujian terhadap kelompok kontrol, yaitu petroleum eter dengan jumlah

yang sama dengan jumlah ekstrak petroleum eter yang ditambahkan dalam

tiap-tiap flakon. Dilakukan lima kali replikasi untuk masing-masing seri

konsentrasi.

7. Pembuatan larutan sampel

a. Pembuatan larutan A dan larutan B

Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat dengan

menimbang 100,0 mg ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari kemudian

dilarutkan dalam petroleum eter sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi

1 μg/μl dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan

dalam petroleum eter sampai 10,0 ml.

b. Pembuatan larutan sampel ekstrak petroleum eter

Dari larutan B, dibuat seri konsentrasi ekstrak 1000, 1400, 1960, 2744,

dan 3841 μg/ml.

31

Tabel 2. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak petroleum eter

Konsentrasi larutan stok

(C1) (μg/ml)

Volume larutan stok yang diambil

(V1) (ml)

Volume air laut buatan yang ditambahkan

(V2) (ml)

Konsentrasi larutan sampel yang diujikan

(C2) (μg/ml)

10000

0,5 5 1000 0,7 5 1400

0,98 5 1960 1,3 5 2744

1,92 5 3842 c. Pembuatan larutan C dan larutan D

Larutan C dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat dengan

menimbang 100,0 mg ekstrak etil asetat batang pulasari kemudian dilarutkan

dalam etil asetat sampai 10,0 ml. Larutan D dengan konsentrasi 1 μg/μl dibuat

dengan mengambil 1,0 ml dari larutan C kemudian dilarutkan dalam etil asetat

sampai 10,0 ml.

d. Pembuatan larutan sampel ekstrak etil asetat

Dari larutan D, dibuat seri konsentrasi ekstrak 200, 280, 392, 549, dan

796 μg/ml.

Tabel 3. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak etil asetat


(C1) (μg/ml)


(V1) (ml)


(V2) (ml)


(C2) (μg/ml)

1000 1 5 200

1,4 5 280

10000 0,196 5 392 0,275 5 549 0,384 5 768

32

e. Pembuatan larutan E dan larutan F

Larutan E dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat dengan

menimbang 100,0 mg ekstrak air batang pulasari kemudian dilarutkan dalam

aquadest sampai 10,0 ml. Larutan F dengan konsentrasi 1 μg/μl dibuat dengan

mengambil 1,0 ml dari larutan E kemudian dilarutkan dalam aquadest sampai

10,0 ml.

f. Pembuatan larutan sampel ekstrak air

Dari larutan B, dibuat seri konsentrasi ekstrak 100, 200, 400, 800, dan

1600 μg/ml.

Tabel 4. Seri konsentrasi larutan sampel ekstrak air


(C1) (μg/ml)


(V1) (ml)


(V2) (ml)


(C2) (μg/ml)

1000 0,5 5 100 1,5 5 200

10000 0,2 5 400 0,4 5 800 0,8 5 1600

8. Uji toksisitas akut dengan BST

Sepuluh ekor larva artemia yang telah berumur 48 jam diambil,

dimasukkan dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu yang

sebelumnya telah dikeringanginkan, kemudian ditambahkan air laut buatan

sebanyak 3 ml. Lalu ditambah 1 tetes suspensi ragi (3mg ragi dalam 5ml ALB)

sebagai makanan dan air laut buatan sampai 5 ml. Setiap pengujian selalu

disertai dengan kontrol dan tiap konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi.

Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva

33

yang mati dihitung untuk mengetahui nilai probit dan dianalisis untuk

mengetahui harga LC50 (Meyer, et al., 1982).

F. Analisis Data

Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis

menggunakan analis probit untuk menghitung LC50. Perhitungan statistik

dilakukan dengan menggunakan program statistik SPSS.

% kematiaan ditentukan dengan rumus Abbot :

% Kematian = % �� % ��

�� % �� x 100%

34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan

Kulit batang pulasari kering diperoleh dari PT. Merapi Farma Herbal.

Kulit batang pulasari yang digunakan berwarna coklat muda dengan ukuran 3

sampai dengan 5 cm, tebal 0,2 sampai dengan 0,5 cm dan bebas dari jamur.

Pemilihan ini bertujuan agar kulit batang pulasari yang digunakan memiliki umur

yang relatif sama sehingga kadar senyawa aktifnya tidak berbeda secara bermakna

(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia, 1985).

Kulit batang pulasari kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari

secara tidak langsung dengan ditutup menggunakan kain hitam agar senyawa aktif

yang terdapat didalamnya tidak rusak oleh sinar matahari langsung. Pengeringan

bertujuan untuk mempermudah pembuatan serbuk, menurunkan kadar air

sehingga tidak ditumbuhi jamur, dan menjamin agar kualitasnya tetap baik

sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama. Reaksi enzimatis serta

perubahan kimiawi juga dapat diminimalkan, sehingga senyawa aktif yang

terkandung dalam kulit batang pulasari tidak hilang terurai (Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 1986).

Pengeringan dapat dihentikan jika kadar air yang terkandung dalam

simplisia kurang dari 10% karena reaksi enzimatis yang dapat menguraikan

senyawa aktif sudah tidak berlangsung (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan

Makanan Republik Indonesia, 1985). Untuk mengetahui kapan proses

pengeringan dihentikan juga dapat dilakukan dengan mematahkan kulit batang

35

pulasari sampai patah. Jika kadar air dalam kulit batang masih tinggi, maka kulit

batang tersebut masih lembab dan tidak mudah dipatahkan.

B. Pembuatan Serbuk Kulit Batang Pulasari

Simplisia yang telah kering kemudian diserbuk menggunakan blender.

Pembuatan serbuk ini bertujuan untuk memperluas permukaan yang kontak

dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses

penyarian lebih banyak dan penyarian dapat berlangsung lebih sempurna

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986). Dalam penelitian ini,

digunakan metode maserasi dengan pengadukan terus menerus menggunakan

shaker sehingga semakin halus serbuk kulit batang pulasari maka semakin baik

penyariannya. Oleh karena itu, masing-masing simplisia perlu ditetapkan derajat

halus yang paling tepat untuk memperoleh hasil penyarian yang baik. Pada

penelitian ini digunakan pengayak dengan no mesh 11 yang artinya dalam 1 inci

tercapat 11 lubang. Pengayak ini digunakan karena dihasilkan serbuk yang dapat

digunakan pada metode maserasi dengan pengadukan, di mana proses penyarian

berjalan dengan baik.

C. Maserasi

Penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula

berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga di dalam cairan penyari

terdapat zat aktif. Maserasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan

merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari. Penyarian dengan cara maserasi

perlu dilakukan pengadukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar serbuk

36

simplisia sehingga dengan pengadukan tersebut tetap terjaga adanya perbedaan

konsentrasi yang sebesar-besarnya antara larutan dalam sel dengan larutan diluar

sel. Makin besar perbedaan konsentrasi, makin besar pula daya dorong untuk

memindahkan massa dari dalam sel ke dalam cairan penyari (Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, 1986).

Maserasi dilakukan dengan memasukkan ke dalam bejana 10 bagian

simplisia dengan derajat halus yang cocok kemudian dituangi dengan 75 bagian

cairan penyari. Maserasi dengan menggunakan mesin pengaduk yang berputar

terus menerus dilakukan 6 sampai 24 jam (Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, 1986). Dalam penelitian ini digunakan 100 gram serbuk kulit batang

pulasari dan 750 ml pelarut yang dimasukkan dalam Erlenmeyer yang ditutup

dengan aluminium foil. Hal ini bertujuan agar larutan penyari tidak menguap

terlebih dahulu, sehingga penyarian dapat maksimal. Lalu diletakkan pada mesin

pengaduk (shaker) dengan laju konstan (130 rpm) selama 2 x 24 jam, dengan tiap

24 jam mengganti pelarut. Penyarian dilakukan dengan laju 130 rpm. Pada

kecepatan tersebut semua serbuk tergojog sempurna sehingga dapat diasumsikan

sebagai putaran yang optimum. Penyarian dilakukan selama 2 x 24 jam untuk

memastikan bahwa zat aktif yang terkandung dalam serbuk kulit batang pulasari

sudah tersari dengan sempurna.

1. Pembuatan ekstrak petroleum eter

Pada maserasi menggunakan pelarut petroleum eter didapatkan

maserat sebanyak 1200 ml. Untuk mendapatkan ekstrak petroleum eter kering

maka pelarut diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga kental

37

(± 100 ml), kemudian dipekatkan di waterbath dengan suhu 60° C

menggunakan cawan porselen yang sebelumnya telah ditara. Vaccum rotary

evaporator digunakan karena dengan alat ini tekanan dapat diatur (180 mmHg

untuk petroleum eter), sehingga hanya petroleum eter saja yang menguap,

senyawa lain yang terkandung di dalam ekstrak diharapkan tidak ikut

menguap. Suhu 60° C merupakan suhu optimal untuk penguapan di atas

waterbath. Jika suhu terlalu tinggi, dapat menyebabkan senyawa aktif yang

terdapat didalamnya rusak.

Dari penyarian ini didapatkan 2,27 g ekstrak kering dengan rendemen

sebesar 2,27%. Cawan porselen yang berisi ekstrak kemudian ditutup dengan

aluminium foil lalu dimasukkan dalam desikator. Dalam desikator tidak ada

air dan udara yang masuk, yang dapat memungkinkan terjadinya perubahan

senyawa dalam ekstrak tersebut atau dapat merusak senyawa oleh adanya

bakteri atau jamur. Selain itu, dapat juga menarik sisa air yang mungkin masih

tertinggal dalam ekstrak karena proses pengeringan yang kurang sempurna.

2. Pembuatan ekstrak etil asetat

Ampas hasil maserasi dikeringkan dari petroleum eter dengan

menggunakan oven pada suhu 60° C, pengeringan ini dilakukan untuk

menghilangkan sisa petroleum eter sehingga dapat dilanjutkan dengan

maserasi menggunakan pelarut etil asetat. Pada maserasi menggunakan pelarut

etil asetat didapatkan maserat sebanyak 1100 ml. Untuk mendapatkan ekstrak

etil asetat kering maka pelarut diuapkan menggunakan vaccum rotary

evaporator hingga kental (± 100 ml), kemudian dipekatkan di waterbath

38

dengan suhu 60° C menggunakan cawan porselen yang sebelumnya telah

ditara. Vaccum rotary evaporator digunakan karena dengan alat ini tekanan

dapat diatur (240 mmHg untuk etil asetat), sehingga hanya etil asetat saja yang

menguap, senyawa lain yang terkandung di dalam ekstrak diharapkan tidak

ikut menguap. Suhu 60° C merupakan suhu optimal untuk penguapan di atas

waterbath. Jika suhu terlalu tinggi, dapat menyebabkan senyawa aktif yang

terdapat didalamnya rusak.








3. Pembuatan ekstrak air

Ampas hasil maserasi dikeringkan dari etil asetat dengan mengunakan

oven pada suhu 60° C, pengeringan ini dilakukan untuk menghilangkan sisa

etil asetat sehingga dapat dilanjutkan dengan maserasi menggunakan pelarut

air. Pada maserasi menggunakan pelarut air didapatkan maserat sebanyak

1130 ml. Untuk mendapatkan ekstrak air kering maka pelarut diuapkan

menggunakan vaccum rotary evaporator hingga kental (± 100 ml), kemudian

dipekatkan di waterbath dengan suhu 60° C menggunakan cawan porselen

yang sebelumnya telah ditara. Vaccum rotary evaporator digunakan karena

39

dengan alat ini tekanan dapat diatur (75 mmHg untuk etil asetat), sehingga air

saja yang menguap, senyawa lain yang terkandung di dalam ekstrak

diharapkan tidak ikut menguap. Suhu 60° C merupakan suhu optimal untuk

penguapan di atas waterbath. Jika suhu terlalu tinggi, dapat menyebabkan

senyawa aktif yang terdapat didalamnya rusak.








D. Pembuatan Air Laut Buatan

Pembuatan ALB bertujuan untuk menyesuaikan lingkungan hidup

artemia sehingga hampir sama dengan air laut alami. Untuk membuat ALB

diperlukan natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium

klorida, kalium klorida, dan natrium bikarbonat. Semua bahan dilarutkan dengan

aquadest kecuali natrium bikarbonat yang dilarutkan dengan air bebas

karbondioksida dan magnesium sulfat yang dilarutkan dalam aquadest panas agar

lebih mudah larut. Penetasan siste sangat dipengaruhi oleh pH karena pemecahan

cangkang siste dibantu oleh kegiatan enzim penetasan yang membutuhkan pH

40

antara 8 sampai 9. Larutan natrium bikarbonat dalam air bebas karbondioksida

dicampurkan terakhir agar tidak terjadi kekeruhan.

Jika semua bahan telah larut, larutan tersebut kemudian dipindahkan

dalam labu ukur 1000 ml dan ditambahkan aquadest sampai tanda. Setelah itu,

labu digojog hingga larutan tercampur.

Air laut buatan yang dibuat memiliki kadar garam 5 per mil yang artinya

dalam 1 ml aquadest mengandung 5 mg natrium klorida. Diperlukan kadar 5 per

mil karena pada kadar tersebut, siste artemia menetas secara optimal (Mujiman,

1989). Peningkatan kadar garam yang mendadak dari 5 permil menjadi 35 permil

juga tidak akan mempengaruhi kehidupan artemia, sebab mereka mempunyai

toleransi yang tinggi terhadap perubahan kadar garam. Bahkan dapat lebih dari 35

permil, misalnya sampai 140 permil. Hal ini disebabkan karena artemia

mempunyai kelenjar garam, yang dapat mengatur penyesuaian diri terhadap

perubahan kadar garam. Dalam penelitian ini tidak diperlukan air laut berkadar

garam tinggi karena kondisi penelitian sudah dikendalikan (tidak ada pemangsa

artemia).

E. Penetasan Siste Artemia

Air laut buatan yang akan digunakan untuk menetaskan siste diaerasi

dahulu selama 2 jam. Aerasi ini bertujuan untuk memberikan oksigen yang cukup

bagi kelangsungan hidup artemia. Aquarium yang digunakan adalah aquarium

khusus BST, yang terdiri dari dua bagian, yaitu bagian gelap dan bagian terang,

yang dipisahkan oleh sekat berlubang. Air laut buatan yang telah diaerasi

41

dituangkan ke dalam aquarium pada bagian sekat gelap, dengan ketinggian di atas

sekat bagian bawah. Hal ini dilakukan agar ketika siste telah disebarkan tidak

mengalir ke bagian terang. Siste artemia disebarkan ke bagian gelap.

Sebelum penetasan (sebelum siste ditaburkan dalam aquarium), siste

direndam 1 jam dalam aquadest. Perendaman ini dimaksudkan agar terjadi

penyerapan air ke dalam siste. Siste artemia yang kering, yaitu yang menpunyai

kadar air kurang dari 10% berisi embrio dalam keadaan diapauze, yaitu dalam

keadaan metabolisme terhenti untuk sementara. Dengan perendaman terjadi

penyerapan air sehingga dalam waktu satu jam kadar air dalam siste diperkirakan

sudah mencapai lebih dari 65%, yang mengakibatkan metabolisme embrio yang

semula berada dalam keadaan diapauze menjadi aktif kembali. Setelah direndam

kemudian siste disaring, ditiriskan dan didiamkan selama satu jam untuk

mengurangi sisa-sisa aquadest. Larva yang aktif akan bergerak dari tempat yang

gelap menuju tempat yang terang (fototaksis positif).

Setelah menetas, larva dapat bertahan hidup selama ± 2 hari tanpa diberi

makanan. Larva yang baru menetas berwarna kemerah-merahan karena masih

mengandung makanan cadangan. Setelah 24 jam menetas, cadangan makanan

larva habis. Seiring dengan itu, larva mempunyai mulut, saluran pencernaan dan

dubur. Oleh karena itu, larva mulai membutuhkan lebih banyak makanan untuk

kelangsungan hidupnya.

Suspensi ragi diberikan sebagai makanan larva tersebut. Sebelum dibuat,

ragi dipanaskan terlebih dahulu dengan oven bersuhu 100° C selama 10 menit

untuk menghindari adanya jamur dan bakteri yang dapat tumbuh pada ragi dan

42

dapat mengganggu penelitian. Hal ini penting agar kematian artemia benar-benar

disebabkan oleh bahan uji, yaitu ekstrak kulit batang pulasari dengan berbagai

konsentrasi, bukan karena jamur atau bakteri.

Larva yang digunakan untuk penelitian ini adalah larva yang berumur 48

jam karena larva berada dalam keadaan paling peka pada saat berumur 48 jam.

Hal ini disebabkan karena pada umur 48 jam organ-organ pada artemia sudah

terbentuk lengkap. Dengan terbentuknya mulut, artemia dapat meminum ALB

yang sudah diberi ekstrak kulit batang pulasari dengan berbagai konsentrasi,

sehingga kematian artemia benar-benar disebabkan karena ekstrak kulit batang

pulasari dalam berbagai konsentrasi tersebut.

F. Uji Toksisitas dengan Metode BST

BST merupakan salah satu metode skrining bioaktivitas suatu ekstrak

atau senyawa murni dengan hewan uji larva artemia. Sampel yang digunakan

adalah ekstrak petroleum eter dengan konsentrasi 1000, 1400, 1960, 2744, dan

3841 μg/ml, ekstrak etil asetat dengan kosentrasi 200, 280, 392, 549, dan 796

μg/ml dan ekstrak air dengan konsentrasi 100, 200, 400, 800, dan 1600 μg/ml.

Konsentrasi tersebut didapat setelah dilakukan orientasi dengan kadar 10, 100,

1000 μg/ml.

Setelah pengujian, didapatkan jumlah larva yang mati, yang kemudian

digunakan untuk menghitung persentase kematian larva tersebut. Dari data

persentase kematian ini diambil konsentrasi yang memberikan nilai persentase

kematian larva antara 20%-80% sebagai konsentrasi terendah dan konsentrasi

43

tertinggi. Digunakan persentase kematian larva antara 20%-80% karena dengan

persentase kematian tersebut sudah dapat memberikan kurva yang lebih linier,

sehingga LC50 yang didapatkan pada uji BST ini lebih dapat menggambarkan hasil

yang sebenarnya. Selanjutnya untuk mendapatkan lima seri konsentrasi dengan

kelipatan yang sama, yang merupakan syarat probit dapat dihitung dengan rumus

F (lampiran 3).

Sebelum memulai uji toksisitas, semua flakon dan alat yang digunakan

dicuci dengan sabun untuk membersihkan kotoran-kotoran yang mungkin masih

melekat di flakon, lalu dibilas aquadest dan direndam menggunakan aquadest

panas untuk menghilangkan sisa-sisa sabun yang mungkin masih tertinggal.

Sebelum pencucian flakon, sejumlah 5 ml aquadest diambil menggunakan pipet

volume, dimasukkan dalam flakon, kemudian diberi tanda. Penggunaan pipet

volume dimaksudkan agar konsentrasi ekstrak kulit batang pulasari tepat. Tiap-

tiap flakon ditandai setinggi 5 ml untuk memudahkan dalam penambahan ALB

sampai 5 ml.

Air laut buatan yang akan digunakan untuk pengujian diaerasi selama 2

jam. Aerasi ini bertujuan untuk memberikan oksigen yang cukup bagi

kelangsungan hidup artemia, sehingga jika terdapat artemia yang mati bukan

disebabkan karena kekurangan oksigen. Sebelum artemia dimasukkan dalam

flakon, sejumlah larutan uji (ekstrak kulit batang pulasari) sesuai dengan

konsentrasinya masing-masing dimasukkan dalam flakon yang sudah kering dan

bersih, lalu dikeringuapkan menggunakan waterbath dengan suhu kurang dari

60°C untuk menghindari rusaknya zat aktif. Selain larutan uji, dilakukan juga

44

pada kontrol yang berisi pelarut dengan jumlah sesuai masing-masing konsentrasi.

Pelarut harus diuapkan agar tidak mempengaruhi kematian larva.

Setelah pelarut menguap semua, ke dalam tiap flakon perlakuan maupun

flakon kontrol ditambahkan ALB sebanyak 3 ml lalu divortex. Hal ini dilakukan

untuk memastikan sampel uji terdistribusi merata ke dalam ALB. Kemudian tiap

flakon diisi 10 larva yang diambil menggunakan pipet tetes. Larva artemia yang

digunakan untuk uji yaitu larva yang berumur 48 jam setelah menetas. Larva yang

berumur 48 jam dalam keadaan paling peka karena dinding selnya masih lunak

sehingga hanya diperlukan konsentrasi sampel yang kecil untuk menimbulkan

efek yang diamati.

Setelah itu, ke dalam tiap flakon ditambahkan suspensi ragi sebagai

sumber makanan. Penambahan makanan ini penting, untuk memastikan bahwa

kematian larva bukan disebabkan karena kekurangan makanan. Meyer et al.

(1982) memaparkan konsentrasi suspensi ragi yang digunakan, yaitu 3 mg ragi

dilarutkan dalam 5 ml ALB.

Tiap flakon cukup diberi satu tetes suspensi ragi, tidak boleh berlebihan.

Hal ini disebabkan karena sebagai filter feeder (penyaring makanan), artemia

menelan apa saja yang berukuran kecil. Artemia tidak bisa membedakan antara

makanan dan bukan makanan. Jika pemberian makanan terlalu banyak, jumlah

yang ditelan semakin banyak. Apabila terjadi demikian maka makanan yang

belum sempat dicernakan akan terdesak oleh makanan baru yang terus menerus

masuk dalam jumlah yang banyak. Dengan demikian, makanan itu akan keluar

lagi dari usus dalam keadaan belum tercerna dengan baik dan belum sempat

45

diserap sarinya oleh usus. Hal ini dapat menyebabkan kematian artemia, sehingga

jumlah kematian larva yang didapatkan bukan merupakan hasil yang sebenarnya

Setelah itu, ke dalam masing-masing flakon di tambah ALB lagi sampai tanda

garis 5 ml. Flakon-flakon tadi diletakkan dekat lampu, dalam kardus yang ditutupi

kain strimin dan terhindar dari cahaya matahari langsung. Ditutup kain strimin

agar serangga kecil tidak masuk flakon, tetapi tidak mempengaruhi kadar oksigen.

Setelah 24 jam, larva yang hidup dihitung. Dikatakan hidup jika larva

masih bergerak aktif, sekecil apapun gerakan tersebut. Larva tidak mungkin diam,

sebab selain berfungsi sebagai alat gerak, antena II pada larva juga berfungsi

sebagai alat pernafasan. Setelah jumlah larva yang hidup diketahui, jumlah larva

yang mati dapat dihitung. Kemudian dihitung persen kematian pada masing-

masing konsentrasi perlakuan dan kontrol. Kontrol digunakan untuk mengoreksi

kematian larva yang bukan disebabkan oleh pengaruh ekstrak kulit batang

pulasari. Hasil percobaan (tabel 5, 6 dan 7) menunjukkan persentase kematian

larva pada rentang 20%-80%.

Tabel 5 . Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari

Konsentrasi (μg/ml)

% kematian larva artemia

1000 25 1400 30 1960 44 2744 59 3842 80

46

Tabel 6 . Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etil asetat kulit batang pulasari



200 22 280 36 392 49 549 61 768 80

Tabel 7 . Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak air kulit batang pulasari



100 20 200 28 400 36 800 58

1600 78

Data yang didapat (tabel 5, 6 dan 7) kemudian dianalisis dengan analisis

probit menggunakan Program SPSS 16.00 untuk mendapat nilai LC50. Pada

penelitian ini digunakan analisis probit agar didapatkan kurva yang berbentuk

garis lurus sehingga penentuan nilai LC 50 lebih tepat. Jika hanya memplotkan

persentase kematian larva (nilai y) dengan logaritma konsentrasi (nilai x) maka

akan didapatkan kurva berbentuk sigmoid sehingga dalam penentuan nilai LC50

dapat menjadi kurang tepat. Dalam analisis probit didapatkan kurva yang

berbentuk garis lurus karena konsentrasi sampel ditransformasikan menjadi

logaritma konsentrasi sebagai variabel tetap (nilai x) dan persentase kematian

larva ditransformasikan menjadi nilai probit sebagai variabel tergantung (nilai y).

47

1. Analisis probit ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari

Setelah dianalisis dengan analisis probit diperoleh persamaan garis linier

yaitu y = 2,587x—8,581 dan dapat digambarkan kurva hubungan antara nilai

probit dengan log konsentrasi ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari

(gambar 7).

Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari

Dari hasil analisis probit diperoleh suatu tabel yang mencantumkan nilai

LC50 yang dihasilkan, yaitu sebesar 2078,18 μg/ml dengan kisaran batas bawah

sebesar 1873,68 μg/ml dan kisaran batas atas sebesar 2317,91 μg/ml (lampiran 4).

Dari gambar 7 juga didapatkan nilai Rsq yang merupakan koefisien

determinasi yang mengukur tingkat ketepatan dari regresi linier sederhana, yaitu

merupakan presentase sumbangan X terhadap variasi (naik atau turunnya) Y. Dari

analisis, didapatkan nilai Rsq sebesar 0,957 yang berarti bahwa persentase

48

sumbangan X yaitu konsentrasi ekstrak petroleum eter kulit batang pulasari

terhadap variasi Y yaitu respon (jumlah kematian artemia) sebesar 95,7%.

Dari nilai Rsq dapat dihitung nilai R, yaitu akar pangkat dari Rsq. Dari

penelitian ini didapatkan nilai R sebesar 0,9783. Nilai R merupakan koefisien

korelasi dalam hubungan dua variabel X dan Y yang mengukur kuatnya hubungan

antara X dan Y. Dari tabel nilai R, dengan taraf kepercayaan 95% pada derajad

bebas 3 dapat dilihat nilai R sebesar 0,878 sehingga didapatkan nilai R penelitian

lebih besar daripada nilai R tabel. Hal ini menunjukkan hubungan korelasi yang

linier antara konsentrasi dengan nilai probit. Meningkatnya konsentrasi diikuti

dengan meningkatnya nilai probit (respon).

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak petroleum eter kulit batang

pulasari mempunyai nilai LC50 > 1000 μg/ml, yaitu sebesar 2078,18 μg/ml, yang

berarti bahwa ekstrak tersebut bersifat tidak toksik terhardap larva artemia.

2. Analisis probit ekstrak etil asetat kulit batang pulasari

Setelah dianalisis dengan analisis probit diperoleh persamaan garis linier

yaitu y = 2,638x—6,849 dan dapat digambarkan kurva hubungan antara nilai

probit dengan log konsentrasi ekstrak etil asetat kulit batang pulasari (gambar 8).

49

Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak etil asetat kulit batang pulasari

Dari hasil analisis probit diperoleh suatu tabel yang mencantumkan nilai

LC50 yang dihasilkan, yaitu sebesar 394,43 μg/ml dengan kisaran batas bawah

sebesar 355,71 μg

uji toksisitas akut ekstrak kulit batang ...repository.usd.ac.id/17548/2/078114083_full.pdfuji...

Documents