uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah ... · daftar lampiran ... keterangan botani ......

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Presti Arma Edytianingsih

NIM : 058114156

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

ii

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK HEKSAN

DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Presti Arma Edytianingsih

NIM : 058114156

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2009

v

Kupersembahkan karya sederhanaku ini untuk :

Papa dan mamaku tercinta atas kasih sayang dan

do’anya

Adik Yurna yang tersayang

Sahabatku Eri

Kekasihku Satya

Orang-orang yang menyayangiku

Dan Almamaterku

vii

PRAKATA

Atas berkat rakhmat Allah SWT dan karunia – Nya skripsi yang berjudul ”Uji

Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

terhadap Kultur Sel SiHa” ini dapat diselesaikan. Skripsi ini dibuat untuk memenuhi

salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Farm) pada Program Studi

Farmasi di Universitas Sanata Dharma.

Penulisan skripsi ini tidak mungkin terwujud tanpa adanya bimbingan, bantuan,

dan dukungan dari berbagai pihak, maka pada kesempatan ini, penulis mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Ibu Rita Suhadi, M. Si, Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Ibu Renny Kusumastuti, M. P. sebagai dosen pembimbing yang telah

banyak meluangkan waktu, tenaga, dan atas segala masukan, bimbingan,

serta saran dalam penyusunan skripsi ini.

3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M. Si dan Ibu Dewi Setyaningsih, M. Sc, Apt

selaku dosen penguji yang telah berkenan menguji dan memberikan

masukan dan saran, serta bimbingan dalam penyempurnaan skripsi ini.

4. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta, atas bantuan dan dukungannya selama ini.

5. Ibu Haryati, Mas Anif, Mbak Yuli, dan segenap karyawan LPPT UGM

Yogyakarta yang telah membantu pelaksanaan penelitian skripsi ini.

6. Papa, mama, dan adek Yurna yang tersayang, atas kasih sayang, do’a,

dukungan, motivasi, dan semangat selama ini.

viii

7. Satya ayangku, atas segala perhatian, cinta, pengertian, pengorbanan, do’a,

semangat, dan pendampinganmu selama skripsi ini dibuat.

8. Seluruh keluarga besarku, atas semangat dan do’a kalian sehingga

terselesaikan skripsi ini.

9. Sinta ‘Lele’, Erlin, Rini, terima kasih atas semua kebersamaan kita, duka

cita, dan bantuan sehingga penelitian dan skripsi kita terselesaikan dengan

lancar.

10. Sahabat-sahabatku tersayang, Eri ‘Kucing’ ,Ticha, Shinta, Ina, Rillya,

Pipit, terima kasih atas semangat serta ejekan-ejekan kalian yang

membuatku terpacu menyelesaikan semuanya, I love u so much all.

11. Teman-temanku, Mbak Nur, Mbak Nita, Mbak Agnes, Rizka, Chrisye, dan

semua teman angkatan 2005 atas semua semangat kalian.

12. Semua pihak yang telah membantu penyusunan skripsi ini yang tidak

dapat disebutkan satu persatu.

Atas segala bantuan yang telah diberikan selama ini, penulis

mengucapkan banyak terima kasih. Penulis juga menyadari sepenuhnya

bahwa penulisan skripsi ini tidak terlepas dari keterbatasan dan

kekurangan penulis. Oleh karena ini, diharapkan kritik dan saran yang

membangun demi penyempurnaan skripsi ini. Besar harapan penulis

bahwa skripsi ini dapat bermanfaat bagi perbendaharaan dan

perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

x

INTISARI

Penyakit kanker merupakan salah satu penyakit yang ditakuti karena banyak

mengakibatkan kematian di seluruh dunia. Banyak studi telah dikembangkan untuk

memperoleh senyawa antikanker dari bahan alam, salah satunya yaitu daun sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav). Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui berapa

LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental eksploratif. Uji sitotoksisitas

dilakukan dengan memberi perlakuan terhadap sel SiHa dengan ekstrak heksan daun sirih

merah dengan kadar tertentu. Metode uji sitotoksisitas yang digunakan adalah metode

MTT dan direct counting (perhitungan langsung). Data yang diperoleh berupa persen

kematian sel dan harga LC50 yang kemudian diolah dengan analisis probit dan Z-test.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak heksan daun sirih merah bersifat

sitotoksik terhadap sel SiHa. Harga LC50 yang diperoleh dari ekstrak heksan daun sirih

merah dengan metode MTT sebesar 102,24 µg/ml dan dengan metode direct counting

sebesar 83,95 µg/ml. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa ekstrak heksan daun

sirih merah diperkirakan mengandung senyawa yang memiliki aktivitas anti kanker.

.

Kata kunci: daun sirih merah, kanker, sel SiHa, sitotoksisitas, LC50

xi

ABSTACT

Cancer is one of the most feared disease in the world because of its mortality

rates. There have been many studies and research to found an anti-cancer substance from

nature, and one of them are celebes pepper. The aim of this research is to find out LC50

value of the hexan extract of celebes pepper to the culture of SiHa cell.

This research took form of an experimental explority research. The cytotoxic

assay was conducted by giving the SiHa cell with hexan extract of celebes pepper in a

certain quantity. MTT method and direct counting method were used in this cytotoxic

assay. The result data, such as the cell mortality percentage and the LC50 value, then be

analyzed with probit analisys method and Z-test.

It was shown that hexan extract of celebes pepper have a cytotoxic form of

influence to the SiHa cell. The value of LC50 obtain from the hexan extract of celebes

pepper with MTT method is 102,24 µg/ml and with direct counting method is 83,95

µg/ml. With this results, it could be conclude that apparently hexan fraction of celebes

pepper have an anti-cancer substance.

Keys : celebes pepper leaves, cancer, SiHa cell, cytotoxicity, LC50 value

xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. .. ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................................................... iii

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................................. iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ............................................................................... v

PRAKATA ............................................................................................................... vii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................... ix

INTISARI ................................................................................................................. x

ABSTRACT ............................................................................................................... xi

DAFTAR ISI ............................................................................................................ xii

DAFTAR TABEL .................................................................................................... xv

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ xvi

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................ xvii

BAB I PENGANTAR ............................................................................................ 1

A. Latar Belakang ................................................................................................ 1

1. Permasalahan ........................................................................................ 3

2. Keaslian penelitian ................................................................................ 3

3. Manfaat penelitian ................................................................................ 3

B. Tujuan ............................................................................................................. 4

1. Tujuan umum .................................................................................... 4

2. Tujuan khusus .................................................................................... 4

xiii

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................... 5

A. Tanaman Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)............................. 5

1. Keterangan botani ................................................................................. 5

2. Sinonim ................................................................................................. 5

3. Deskripsi ............................................................................................... 5

4. Habitat .................................................................................................. 5

5. Kandungan kimia .................................................................................. 6

6. Khasiat dan penggunaan ....................................................................... 6

7. Penelitian tanaman sirih merah ............................................................. 6

B. Minyak atsiri ....................................................................................................... 7

C. Metode Penyarian ..................................................................................... 7

D. Kanker……………. .................................................................................. 8

1. Definisi ................................................................................................ 8

2. Kanker servix .............................................................................. 9

3. Sel SiHa ...................................................................................... 9

E. Uji Sitotoksisitas ....................................................................................... 9

1. Metode MTT ........................................................................................ 10

2. Metode direct counting ............................................................... 10

F. Landasan Teori ......................................................................................... 11

G. Hipotesis ................................................................................................... 12

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 13

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................................... 13

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ......................................... 13

1. Variabel .................................................................................................... 13

2. Definisi operasional ................................................................................. 13

C. Alat dan Bahan ................................................................................................... 14

1. Alat .................................................................................................... 14

2. Bahan .................................................................................................... 14

D. Tata Cara Penelitian ........................................................................................... 15

xiv

1. Determinasi tanaman ............................................................................ 15

2. Pengumpulan daun sirih merah............................................................. 16

3. Pembuatan ekstrak heksan daun sirih merah ........................................ 16

4. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................... 16

5. Pembuatan larutan uji ........................................................................... 18

6. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah ............................... 18

E. Analisis Hasil ...................................................................................................... 20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................... 22

A. Determinasi Tanaman ........................................................................................ 22

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah ........................................................................ 22

C. Ekstraksi ............................................................................................................ 23

D. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa .......................... 25

1. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Pada Sel SiHa dengan metode

MTT..................................................................................... ..................... 25


direct counting....................................................................... ................... 27

E. Analisis hasil ...................................................................................................... 28


MTT...................................................................................... .................... 28


direct counting....................................................................... ................... 31

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 39

A. Kesimpulan ......................................................................................................... 39

B. Saran .................................................................................................................. 39

DAFTAR PUSTAKA .............................................................................................. 40

LAMPIRAN ............................................................................................................. 43

BIOGRAFI PENULIS ............................................................................................. 68

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah........................ 24

Tabel II. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

berbagai konsentrasi dengan metode MTT..........................

29

Tabel III. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT...............

30

Tabel IV. Data uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa metode direct

counting.................................................................................

32

Tabel V. Data uji sitotoksisitas terhadap sel Vero metode direct

counting.

32

Tabel VI. Data % kematian sel SiHa dengan perlakuan ekstrak

heksan daun sirih merah........................................................

33

Tabel VII. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan ekstrak

heksan daun sirih merah........................................................

34

Tabel VIII. Data analisis Z-test pada sel SiHa......................................... 36

Tabel IX. Data analisis Z-test pada sel Vero......................................... 36

xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Reaksi pembentukan formazan........................................... 26

Gambar 2. Sel SiHa yang mati (i) dan sel SiHa yang hidup (ii)

setelah pemberian trypan blue di bawah pengamat

mikroskop dengan perbesaran 100x....................................

27

Gambar 3. Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah

pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x...............

28

Gambar 4. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan sirih merah

terhadap % kematian sel SiHa pada metode

MTT....................................................................................

29


terhadap harga probit pada metode

MTT....................................................................................

31

Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah

terhadap probit pada sel SiHa pada metode direct

counting...............................................................................

33

Gambar 7. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah

terhadap harga probit pada sel Vero pada metode direct

counting...............................................................................

35

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Foto daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).........

43

Lampiran 2. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun

sirih merah terhadap sel SiHa dengan

metode MTT........................................................................

44

Lampiran 3. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan

daun sirih merah dengan

metode Direct Counting......................................................

46

Lampiran 4. Analisis Statistik Z-test Ekstrak Heksan Daun

Sirih Merah pada Metode Direct Counting.........................

54

Lampiran 5. Hasil uji KLT ekstrak heksan daun sirih merah..................

56

Lampiran 6. Foto alat-alat yang digunakan dalam penelitian..................

63

Lampiran 7. Harga probit sesuai dengan persentasenya..........................

66

Lampiran 8. Hasil Determinasi Tumbuhan 67

1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker termasuk penyakit yang sangat ditakuti karena penyakit ini sulit

disembuhkan, bahkan bisa menyebabkan kematian. Kanker merupakan penyakit

yang disebabkan karena adanya sel abnormal.

Saat ini di Indonesia kanker telah menjadi masalah kesehatan

masyarakat yang besar, yang perlu ditanggulangi secara menyeluruh, terpadu,

efektif, efisien, dan ekonomis. Kanker dapat menyerang seluruh lapisan

masyarakat, walaupun yang terbanyak pada usia lanjut (Sukardja, 2000).

Carsinoma servix uteri merupakan jenis kanker ganas yang paling sering

diketemukan diantara kanker ginekologis. Sesuai dengan namanya carcinoma

servix uteri (kanker leher rahim) adalah kanker yang menyerang jaringan pada

servix uteri (leher rahim), suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang

merupakan pintu masuk ke arah rahim.

Di negara-negara maju carcinoma servix uteri menempati urutan setelah

kanker payudara, kanker kolorektum, dan kanker endometrium. Sedangkan di

negara-negara sedang berkembang carcinoma servix uteri menempati urutan

pertama. Menurut data histopatologi Indonesia tahun 1988, dari semua jenis

kanker wanita, kanker servix menduduki urutan pertama (18,2%) (Swandarini,

1998). Sampai saat ini penyebab penyakit carcinoma servix uteri belum secara

pasti dapat diketahui, diduga banyak faktor yang berperan dalam proses

kejadiannya.

2

Banyak usaha yang telah dilakukan untuk menyembuhkan penyakit ini.

Umumnya, pengobatan kanker dilakukan dengan obat-obatan sintesis dan radiasi

tetapi terapi yang digunakan tersebut banyak menimbulkan efek samping yang

merugikan penderita. Oleh karena itu, kini banyak dilakukan penelitian-penelitian

untuk mencari alternatif pengobatan kanker terutama yang menggunakan bahan-

bahan alam (Ganiswara & Nafrialdi, 1995).

Salah satu bahan alam yang dapat digunakan untuk pengobatan kanker

servik ini adalah sirih merah. Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

merupakan salah satu tanaman yang memiliki berbagai khasiat. Secara empiris

dengan cara merebus daun sirih merah yang masih segar, daun sirih merah

digunakan untuk mengobati kanker, kencing manis, ambeien, peradangan,

hepatitis, maag, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit

sembuh, TBC, lemah sahwat, jantung koroner, darah tinggi, dan asam urat

(Sudewo, 2005).

Kemudian telah dilakukan uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa (sel kanker

leher rahim) dengan ekstrak etanol daun sirih merah dan didapatkan kesimpulan

bahwa ekstrak etanol daun sirih merah memiliki efek sitotoksik dengan harga

LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah, 2008). Etanol merupakan penyari yang

bersifat polar sehingga menyari senyawa-senyawa polar pada daun sirih merah.

Selanjutnya pada penelitian ini digunakan penyari heksan yang bersifat non polar

untuk mengetahui apakah senyawa non polar, seperti minyak atsiri yang akan

tersari dari daun sirih merah tersebut juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel

SiHa. Diduga senyawa monoterpen dan carvacrol pada minyak atsiri yang

3

terkandung dalam daun sirih merah memiliki aktivitas sebagai antikanker (Daris,

2008)

1. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang yang ada maka dirumuskan

permasalahan sebagai berikut :

a. apakah ekstrak heksan daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik

terhadap kultur sel SiHa?

b. seberapa besar harga LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

kultur sel SiHa?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian

mengenai uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur

sel SiHa.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi

ilmiah dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat,

kegunaan, dan efek sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

terhadap kultur sel SiHa.

b. Manfaat praktis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai

pembuktian secara ilmiah penggunaan ekstrak heksan daun sirih merah

sebagai obat antikanker dari bahan alam.

4

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak heksan

daun sirih merah memiliki efek sitotoksik.

2. Tujuan khusus

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui seberapa besar harga

LC50 dari ekstrak heksan daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa.

5

BAB II

PENELAAH PUSTAKA

A. Tanaman Sirih Merah

1. Keterangan botani

Familia : Piperaceae (suku sirih-sirihan)

Genus : Piper

Spesies : Piper crocatum Ruiz & Pav. (Anonim, 2008b)

2. Sinonim

Piper ornatum N. E. Br

3. Deskripsi

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna

hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung

dengan bagian atas meruncing, bertepi rata, dan permukaannya mengkilap

dan tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun

bagian atas hijau bercorak putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna

merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma

wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap

buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

4. Habitat

Sirih merah tergolong langka karena tidak tumbuh di setiap tempat

atau daerah. Sirih merah tidak dapat tumbuh subur di daerah panas.

Sementara itu, di tempat berhawa dingin sirih merah dapat tumbuh dengan

6

baik. Tanaman sirih merah akan tumbuh dengan baik jika mendapatkan 60-

70% cahaya matahari (Sudewo, 2005).

5. Kandungan kimia

Berdasarkan penelitian yang dilakukan menunjukkan bahwa sirih

merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan

minyak atsiri (Sudewo, 2005).

6. Khasiat dan penggunaan

Efek zat aktif yang terkandung dalam daun sirih merah dapat

merangsang saraf pusat dan daya pikir. Daun sirih merah juga mampu

mengatasi penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ

tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, tifus,

leukemia, TBC, lemah syahwat, ambeien, batuk, maag kronis, jantung

koroner, darah tinggi, dan asam urat (Sudewo, 2005).

7. Penelitian tanaman sirih merah

Berdasarkan pemeriksaan menggunakan uji tabung dan KLT dapat

diketahui bahwa daun sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, senyawa

polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

Penelitian yang lain adalah uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun

sirih merah terhadap sel SiHa menghasilkan harga LC50 sebesar 200,6 µg/ml

(Nur’aniyah, 2008), sel HeLa 1.143,1 µg/ml (Atmaningsih, 2008), sel Raji

395,5 µg/ml (Dwikusumaningtyas, 2008), sel T47D 587,7 µg/ml (Neritika,

2008), dan sel Myeloma 434,1 µg/ml (Meri, 2008). Berdasarkan penelitian-

7

penelitian di atas dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah

memiliki efek sitotoksik.

B. Minyak Atsiri

Kandungan kimia lainnya yang terdapat di daun sirih merah adalah

minyak atsiri, seperti hidroksikavicol, kavi-col, kavibetol, allylprokatekol,

carvacrol, eugenol, p-cymene, cineole, caryofelen, kadimen estragol, ter-penena,

dan fenil propada (Anonim, 2008b).

Pada umumnya, minyak atsiri alami dapat dibagi menjadi dua kelompok

kimia konstituen, yaitu hydrocarbon yang terdiri dari terpen (monoterpen,

sesquiterpen, dan diterpen) dan komponen oxygenated yang terdiri dari ester,

aldehide, keton, alkohol, fenol, dan oxide (Anonim, 2009).

Carvacrol Cavicol Cineol

C. Metode Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan

yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Faktor yang dapat mempengaruhi

kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan

batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim,

1986).

8

Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Prinsip perkolasi

adalah sebagai berikut:

Serbuk simplisia ditempatkan dalam suatu bejana silinder, yang bagian

bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari dialirkan dari atas ke bawah

melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan melarutkan zat aktif sel-sel yang

dilalui sampai mencapai keadaan jenuh. Gerak ke bawah disebabkan oleh

kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di atasnya, dikurangi dengan daya

kapiler yang cenderung untuk menahan.

Alat yang digunakan untuk perkolasi adalah perkolator. Cairan yang

digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif

yang keluar dari perkolator disebut perkolat, sedang sisa setelah dilakukannya

penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).

D. Kanker

1. Definisi

Secara karakterisktik, kanker adalah populasi-populasi sel yang

mengalami pertumbuhan tak terkendali. Kanker cenderung menginvasi

struktur-struktur yang bersebelahan dan dapat mengganggu fungsi-fungsi

normal jaringan-jaringan yang mengelilinginya. Penyebaran menyeluruh dari

kanker dinamai metastatis (George, 1999). Kanker dapat menyerang berbagai

sel pada seluruh organ di dalam tubuh, dari kepala sampai ujung kaki

(Sinardi, 2000). Kanker terjadi karena pemaparan berulang-ulang oleh satu

9

atau lebih karsinogen yang memicu perubahan sel dan menginisiasi

transformasi menjadi sel ganas (Meleka, 1983).

2. Kanker cervix

Kanker servik (Cervical Cancer) merupakan kanker yang terjadi

pada servik uterus, suatu daerah pada organ reproduksi wanita yang

merupakan pintu masuk ke arah rahim yang terletak antara rahim (uterus)

dengan liang senggama (vagina) (Anonim, 2008a).

Kanker cervix kebanyakan terjadi sebagai squamosa carsinoma

yaitu sekitar 95% dan sedikit terjadi pada sel endocervical columnal sebagai

adenosquamosa carsinoma yaitu sekitar 5%. Faktor-faktor penyebab kanker

cervix antara lain berhubungan seks pada usia dini, pasangan seks berganti-

ganti, perokok dan terpapar oleh Human Papilloma Virus (HPV) dan virus

herpes simplek II. Pada metastasis melalui sistem limfatik, jarang terjadi

metastasis yang jauh (King, 2000).

3. Sel SiHa

Sel SiHa adalah salah satu kanker cervix yang menyebabkan

kematian yang tinggi pada wanita. Sel SiHa diperoleh dari fragmen sampel

jaringan primer dari suatu carsinoma cervix dan merupakan squamosa yang

tidak terdiferensiasi. Morfologi sel SiHa mirip dengan sel epitelial dan sel ini

mengandung Human Papilloma Virus 16 (HPV-16) (Anonim, 2008c).

E. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas adalah uji in vitro dengan menggunakan kultur sel yang

digunakan dalam evaluasi keamanan obat, kosmetika, zat tambahan makanan,

10

pestisida, dan digunakan juga untuk mendeteksi adanya aktivitas anti neoplastik

dari suatu senyawa (Freshney, 1986).

Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker

dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi tersebut

meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 190-528 µg/ml;

Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 = 528-1197

µg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 = 1259-2515

µg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate LC50 = 2528-

4939 µg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak LC50 > 5000

µg/ml (Mazzio,2009).

1. Metode MTT

Salah satu metode yang digunakan untuk mengetahui viabilitas sel

pada uji sitotoksisitas adalah dengan menggunakan metode MTT. Pada

metode MTT, garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazolium bromida), diabsorbsi ke dalam sel dan direduksi melalui

reaksi yang ada di mitokondria untuk membentuk formazan. Produk

formazan terakumulasi di sel karena tidak dapat menembus membran sel

(Barille, 1997). Metode ini cepat, sensitif, akurat dan dapat mengukur sampel

dalam jumlah banyak (Doyle & Griffiths, 2000).

2. Metode Direct Counting

Metode yang paling umum dilakukan untuk penghitungan sel yang

akurat dan efisien adalah dengan menggunakan haemocytometer. Dalam

metode ini digunakan suatu bilik hitung dengan kedalaman 0,1 mm dan

11

persegi untuk mempermudah penghitungan. Menggunakan zat warna seperti

trypan blue, penghitungan sel yang hidup dan sel yang tidak hidup dapat

dilakukan. Sampling yang akurat, pengenceran dan pengisian bilik secara

tepat sangat penting. Pengisian yang berlebihan, adanya gelembung udara dan

bilik hitung yang kurang bersih menyebabkan kesalahan penghitungan.

Kesalahan statistik dapat dikurangi dengan menghitung cukup sel dengan

replikasi yang tetap. Penghitungan dengan haemocytometer adalah metode

yang paling sederhana dan versatile dengan keuntungan yaitu memberikan

pengukuran langsung (aktual sel) (Doyle and Griffiths, 2000).

F. Landasan Teori

Penelitian terhadap daun sirih merah yang merupakan salah satu

tanaman yang diketahui secara empiris memiliki khasiat untuk mengobati kanker

menjadi sangat menarik dilakukan untuk menemukan alternatif lain dalam

pengobatan kanker terutama yang menggunakan bahan-bahan alam (back to

nature).

Penelitian terhadap ekstrak etanol daun sirih merah telah membuktikan

bahwa senyawa polar dari daun sirih merah memiliki potensi sebagai antikanker.

Dan penelitian terhadap ekstrak heksan daun sirih merah diharapkan akan

menambah pengetahuan tentang khasiat senyawa non polar daun sirih merah

sebagai antikanker seperti minyak atsiri.

Metode perkolasi diketahui efektif untuk mengekstrak suatu tanaman

sehingga seluruh zat aktif pada tanaman tersari dengan sempurna. Pelarut heksan

12

akan melarutkan zat aktif yang bersifat non polar yang terkandung dalam daun

sirih merah tersebut.

G. Hipotesis

Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) dapat

memberikan efek sitotoksik pada sel SiHa.

13

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian

eksperimental eksploratif.

B. Variable dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel bebas

Kadar ekstrak heksan daun sirih merah (µg/ml).

b. Variabel tergantung

Persentase kematian sel SiHa.

c. Variabel pengacau terkendali

1) Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan

dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama.

2) Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium

RPMI 1640-serum.

3) Kematian alami sel dapat dikendalikan dengan kontrol dan pemberian

nutrisi.

2. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak heksan daun sirih

merah terhadap kultur sel SiHa.

b. Daun sirih merah adalah helain daun (lamina) dari daun sirih merah.

14

c. Ekstrak heksan adalah hasil perkolasi serbuk daun sirih merah dengan

penyari heksan.

d. Sel SiHa adalah kultur sel kanker cervix yang menyebabkan kematian

yang tinggi pada wanita dan mengandung Human Papilloma Virus 16

(HPV-16).

e. LC50 ialah konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah yang mampu

membunuh atau menyebabkan kematian sejumlah 50% kultur sel SiHa dan

dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat

gelas, perkolator, autoklaf, alumunium foil, kertas saring, Waterbath, Oven,

inkubator CO2 (Memmer), timbangan analitik (Denver Instrument XL-610),

tissue, glove, masker, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical (Nunc),

tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge, mikropipet, membran

dialisis (Sigma), lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well plate

(Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),

haemocytometer (Neubauer), ELISA reader.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain :

a. Bahan utama : daun sirih merah segar

b. Bahan untuk ekstraksi : heksan

15

c. Uji sitotoksisitas :

1) Kultur sel SiHa dan sel Vero yang diperoleh dari stok Laboratorium

Hayati Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

2) Medium pencuci sel : RPMI 1640 (Gibco), Natrium bikarbonat, dan

hepes.

3) Medium penumbuh sel : RPMI 1640 (Gibco), FBS (Fetal Bovine

Serum) 10 %, Penisilin-Streptomisin 1 % (Gibco), Fungison 0,5 %

(Gibco), M199

4) Pewarna Trypan blue (Sigma)

5) DMSO (Dimetil Sulfoksida)

6) Reagen Stopper : SDS (sodium dodesil sulfat) dalam HCl 0,01 N

(Merck)

7) MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

(Sigma)

8) Tripsin 0,5 %

9) Aquabidest

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun sirih

merah segar, yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi,

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

16

2. Pengumpulan daun sirih merah

Bahan yang digunakan berupa daun sirih merah, diambil dari tanaman

sirih merah di Dusun Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.

3. Pembuatan ekstrak daun sirih merah

a. Pembuatan serbuk

Daun sirih merah yang telah dikumpulkan selanjutnya dicuci

dengan air mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang melekat,

kemudian dipotong kecil-kecil dan ditiriskan sampai sisa-sisa air

menghilang. Selanjutnya daun dikeringkan dalam lemari pengering

dengan suhu 50⁰ C. Setelah kering, daun diserbuk menggunakan mesin

penyerbuk.

b. Pembuatan ekstrak heksan daun sirih merah

Memasukkan 100 gram serbuk daun sirih merah ke dalam

perkolator. Rendam dengan penyari heksan 400 ml selama 24 jam.

Kemudian teteskan penyari heksan sampai habis, tambahkan lagi penyari

heksan dan teteskan sampai tetesan menjadi bening. Ekstrak heksan yang

dihasilkan didestilasi menggunakan evaporator kemudian diuapkan

dengan pemanasan di bawah 50oC sehingga didapatkan ekstrak kental

daun sirih merah.

4. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

a. Identifikasi minyak atsiri (cineol, caryophylen, cavicol, carvacrol)

Mengambil ekstrak heksan daun sirih merah dilarutkan dalam

heksan (50 mg/ml) lalu di vortex. Kemudian totolkan ekstrak heksan

17

daun sirih merah dan pembanding cineol, caryophylen, cavicol, dan

carvacrol pada silika GF 254, masukkan ke dalam chamber berisi fase

gerak toluene : etil asetat (93 : 7). Elusi ditunggu hingga batas (10 cm)

kemudian dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Deteksi

bercaknya dengan cara menyemprot asam sufat dan vanillin kemudian

panaskan di atas kompor listrik hingga terlihat warnanya.

b. Identifikasi tannin



daun sirih merah dan pembanding tannin pada silika GF 254, masukkan

ke dalam chamber berisi fase gerak butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5).

Elusi ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber

dan ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya dengan cara menyemprot

reagen FeCl3.

c. Identifikasi flavonoid



daun sirih merah dan pembanding rutin pada selulosa, masukkan ke

dalam chamber berisi fase gerak etil asetat : asam asetat : asam formiat :

air (100:11:11:27). Elusi ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian

dikeluarkan dari chamber dan ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya

dengan uap amonia.

18

d. Identifikasi alkaloid



daun sirih merah dan pembanding kinin pada selulosa, masukkan ke

dalam chamber berisi fase gerak metanol : amonia (100:1,5). Elusi

ditunggu hingga batas (10 cm) kemudian dikeluarkan dari chamber dan

ditunggu hingga kering. Deteksi bercaknya dengan cara menyemprot

reagen dragendorff.

5. Pembuatan larutan uji

Membuat sediaan ekstrak induk dengan menimbang ekstrak kental

100 mg lalu dilarutkan dengan pelarut DMSO 200 µl dan diaduk sampai

larut, kemudian ditambahkan RPMI 800 µl. Dari sediaan ekstrak induk

tersebut dibuat sediaan uji dengan konsentrasi ekstrak heksan daun sirih

merah yang diinginkan.

6. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

a. Panen sel SiHa

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari),

media diganti dengan RPMI baru, sel siha menempel di dinding flask

sehingga harus dilepaskan dengan cara menambahkan tripsin kemudian

diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam

tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10

ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan

pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian

19

dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah

medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,0x104 sel/100 µl

dan siap dipakai untuk penelitian lebih lanjut.

b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan

kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate.

Masukkan ekstrak uji dengan konsentrasi masing-masing ke dalam

sumuran dan setiap konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali. Untuk

kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh.

Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37oC,

dalam inkubator dengan aliran 5% CO2.

Setelah diinkubasi, medium RPMI diganti dengan yang baru

sebanyak 200 µl, kemudian ke dalam masing-masing sumuran

ditambahkan 10 µl MTT 5 µg/ml, lalu diinkubasikan 3,5 jam pada suhu

37oC, dalam inkubator dengan aliran 5% CO2. Sel hidup akan bereaksi

dengan MTT dan membentuk warna ungu. Reaksi dihentikan dengan

menambahkan 100 µl reagen stopper pada setiap sumuran dan inkubasi

semalam pada suhu kamar. Serapan setiap sumuran dibaca deangan

ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm. Besarnya serapan

berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Dilakukan replikasi

sebanyak 3 kali.

20

c. Uji sitotoksisitas dengan metode direct counting

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan

kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan ke dalam sumuran 96 well plate.

Masukkan ekstrak uji dengan konsentrasi masing-masing ke dalam

sumuran dan setiap konsentrasi direplikasi sebanyak 3 kali. Untuk

kontrol digunakan 100 µl suspensi sel SiHa dalam media penumbuh.

Selanjutnya plate diinkubasi dalam inkubator dengan aliran 5% CO2

selama 24 jam pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, medium tiap sumuran

diambil diganti dengan tripsin, kemudian diresuspensi dan ditambah 50

µl Trypan blue, diresuspensi lagi untuk homogenisasi diambil 10 µl

untuk pengamatan. Ditempatkan dalam haemocytometer, sel siap

dihitung dengan counter dibawah mikroskop. Dilakukan replikasi

sebanyak 3 kali. Metode ini juga dilakukan pada sel Vero.

E. Analisis hasil

Uji sitotoksisitas dilakukan dengan menggunakan metode MTT dan direct

counting. Pada metode MTT, serapan akan terbaca serta menunjukkan jumlah sel

yang hidup dan hasil akhir uji sitotoksisitas yaitu persentase kematian sel yang

dihitung menggunakan modifikasi rumus Abbot, dengan rumus berikut:

%100% xA

BAselkematian

−=

Keterangan :

A = Rata-rata absorbansi kelompok kontrol negatif

B = Rata-rata absorbansi kelompok perlakuan

21

Sedangkan pada metode direct counting. Harga persentase kematian dapat

ditentukan dengan menghitung jumlah sel hidup ditambah jumlah sel hidup

dikurangi jumlah sel hidup, kemudian dibagi dengan jumlah sel hidup ditambah

jumlah sel mati dikalikan 100%.

% Kematian sel = ��

�� x 100%

Untuk menghitung harga LC50 menggunakan analisis probit (Mursyidi,

1985). Analisis probit merupakan salah satu analisis regresi untuk mengetahui

hubungan konsentrasi-respon (persen kematian sel) agar diperoleh persamaan

garis lurus sehingga dapat digunakan untuk menentukan LC50. Sedangkan untuk

menganalisis signifikansi antara perlakuan dan kontrol dilakukan pengolahan data

dengan statistik Z-test.

22

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran tanaman

sebelum digunakan dalam suatu penelitian. Determinasi tanaman dilakukan di

Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta. Hasil yang diperoleh dari determinasi menyatakan bahwa tanaman

yang digunakan dalam penelitian adalah benar tanaman sirih merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav).

B. Pengumpulan daun sirih merah

Penelitian ini menggunakan daun dari tanaman sirih merah yang dipetik

dari pekarangan rumah warga di Dusun Ngangkrik, Sleman, Yogyakarta.

Pengambilan daun sirih merah hanya dari satu pohon dan sekali panen dengan

tujuan meminimalkan variasi kandungan kimia. Dipilih daun yang tidak terlalu

muda dan tidak terlalu tua agar didapat kandungan senyawa aktif yang optimal.

Setelah dipetik, daun sirih merah dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel pada permukaan daun, seperti

tanah, debu, serangga, dan lain-lain. Kemudian daun dipotong kecil-kecil dan

dikeringkan. Daun dipotong kecil-kecil untuk mempersempit lebar daun sehingga

cepat kering. Sedangkan pengeringan adalah untuk mengurangi kandungan air

yang terdapat dalam sampel. Pengeringan menggunakan lemari pengering dengan

suhu 50 ⁰C selama 24 jam. Daun dinilai sudah kering apabila mudah dipatahkan

atau diremuk. Selanjutnya dilakukan penyerbukan daun sirih merah menggunakan

23

mesin penyerbuk. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat

kontak dengan cairan penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia

dapat tersari secara maksimal.

C. Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan metode perkolasi menggunakan alat

perkolator dengan larutan penyari heksan. Prinsip metode ini adalah mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi secara berulang-ulang

sampai perkolat menjadi bening. Bening disini diperkirakan bahwa semua

senyawa dalam daun sirih merah sudah tersari seluruhnya.

Serbuk simplisia dibasahi dengan cara direndam selama 24 jam,

perendaman serbuk ini dimaksudkan agar susunan sel serbuk akan dapat larut

dalam cairan penyari, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, dengan adanya perbedaan

konsentrasi zat aktif di dalam dan di luar sel, sehingga menyebabkan zat aktif di

dalam sel terdesak ke luar sel. Sisa perkolasi harus sampai bening, apabila belum

bening ditambahkan cairan penyari lagi dan dialirkan sampai benar-benar bening

sehingga zat aktif tersari sempurna.

Ekstrak yang diperoleh dievaporasi menggunakan vaccum rotary

evaporator agar didapat ekstrak pekat. Proses evaporasi bertujuan untuk

menguapkan pelarut dari ekstrak tersebut sehingga didapat ekstrak yang pekat.

Vaccum rotary evaporator menguapkan pelarut pada tekanan rendah dan suhu di

bawah titik didih sehingga tidak akan merusak senyawa dalam ekstrak. Ekstrak

pekat yang diperoleh disimpan dalam vial.

24

Cairan penyari yang digunakan adalah heksan karena heksan pelarut non

polar yang akan menyari senyawa-senyawa non polar yang ada pada daun sirih

merah. Pemilihan penyari heksan disini juga untuk mengetahui potensi sitotoksik

senyawa non polar pada daun sirih merah. Selain itu, heksan juga memiliki titik

didih rendah yaitu 69⁰C sehingga tidak diperlukan pemanasan tinggi untuk

menguapkannya. Senyawa-senyawa non polar yang kemungkinan akan tersari

dari daun sirih merah tersebut adalah minyak atsiri, yang terdiri dari monoterpen,

sesquiterpen dan senyawa fenolik. Untuk mengetahui kebenarannya maka dibuat

profil kromatografi lapis tipis (KLT) dari ekstrak daun sirih merah ini.

Tabel II. Profil KLT ekstrak heksan daun sirih merah

Uji Baku

pembanding

Hasil

Minyak

atsiri

Cineol +

Caryophylen -

Cavicol -

Carvacrol -

Alkaloid Kinin -

Tanin -

Flavonoid Rutin -

Pada hasil profil KLT di atas menyatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih

merah positif mengandung minyak atsiri jenis cineol, sedangkan jenis minyak

atsiri yang lain yaitu caryophylen, cavicol, carvacrol hasilnya negatif. Hal ini

mungkin disebabkan karena kadarnya di dalam ekstrak heksan daun sirih merah

sangat kecil sehingga tidak dapat terdeteksi menggunakan KLT. Untuk senyawa

alkaloid dan flavonoid juga negatif karena senyawa tersebut bersifat polar

sehingga tidak tersari dengan penyari heksan yang non polar.

25

KLT memang memiliki sensitifitas yang rendah dengan batas deteksi 0,1-

0,01 µg, sehingga sulit mendeteksi senyawa dengan kadar yang kecil. Untuk

mendeteksi senyawa dengan kadar yang kecil mungkin bisa digunakan

kromatografi gas yang lebih sensitif dengan batas deteksi 0,1-0,01 ng

(Wijesekera, 1991). Kromatografi ini juga sesuai untuk mendeteksi senyawa

seperti minyak atsiri yang mudah menguap.

D. Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

Uji sitotoksisitas dilakukan untuk mengetahui potensi ketoksikan ekstrak

daun sirih merah terhadap kultur sel SiHa. Dengan uji ini dapat diketahui harga

LC50 (Lethal Concentration 50%) ekstrak daun sirih merah, yaitu konsentrasi

ekstrak daun sirih merah yang mampu mematikan 50% dari populasi kultur sel

SiHa. Pada penelitian ini, digunakan 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan

kelompok perlakuan. Kelompok kontrol adalah sel SiHa tanpa perlakuan ekstrak

heksan daun sirih merah, sedangkan kelompok perlakuan adalah sel SiHa dengan

perlakuan ekstrak heksan daun sirih merah. Masing-masing kelompok dilakukan

replikasi sebanyak 3 kali.

1. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT

Metode uji sitotoksisitas yang mulanya digunakan adalah metode

MTT, karena metode ini menggunakan ELIZA reader untuk pembacaan

absorbansinya sehingga akurasinya tinggi. Absorbansi yang terbaca

sebanding dengan jumlah sel yang masih hidup. Selain itu metode ini juga

aman, sederhana, dan cepat. Aman karena tidak menggunakan bahan-bahan

berbahaya, sederhana karena perlakuan terhadap sampel relatif mudah, serta

cepat karena hanya memerlukan waktu beberapa menit untuk menguji sampel

yang jumlahnya banyak.

Prinsip metode MTT adalah terjadinya reduksi garam tetrazolium

MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl

merupakan garam larut air

sel metabolik aktif yang terdapat di mitokondria sel sehingga terbentuk

formazan berwarna ungu.

MTT (kuning)

Gambar

Intensitas warna yang terbentuk dibaca absorbansinya menggunakan

ELIZA reader pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang

terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang

absorbansi berarti semakin banyak sel yang hidup, dan sebaliknya, semakin

kecil absorbansi berarti semakin sedikit sel yang hidup.

sel yang hidup masih memiliki enzim yang beraktivitas untuk mereduksi

MTT menjadi kristal formazan yang berwarna ungu.


yang jumlahnya banyak.


dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) yang

erupakan garam larut air berwarna kuning oleh enzim dehidrogenase pada


formazan berwarna ungu.

MTT (kuning) fomazan (ungu)

Gambar 1. Reaksi pembentukan formazan


pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang

terbaca berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup. Semakin besar


kecil absorbansi berarti semakin sedikit sel yang hidup. Hal itu dikarenakan


istal formazan yang berwarna ungu.

26



diphenyltetrazolium bromide) yang

berwarna kuning oleh enzim dehidrogenase pada


fomazan (ungu)


pada panjang gelombang 550 nm. Intensitas warna yang

hidup. Semakin besar


Hal itu dikarenakan


27

2. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode Direct

Counting

Metode direct counting yaitu metode yang dilakukan dengan

menghitung langsung jumlah sel hidup dan sel mati menggunakan mikroskop

dengan bantuan haemocytometer. Metode ini disebut juga metode Trypan

Blue karena menggunakan trypan blue untuk mewarnai kultur sel. Sel yang

mati telah kehilangan integritas membrannya sehingga sel mati akan

menyerap reagen dan berwarna biru, sedangkan sel hidup akan tetap bening

dan bercahaya karena masih memilki sitoplasma yang utuh.

Gambar 2. Sel SiHa yang mati (i) dan sel SiHa yang hidup (ii) setelah

pemberian trypan blue di bawah pengamatan mikroskop dengan perbesaran

100x

Kelebihan metode ini adalah sederhana, mudah dilakukan, dan

ekonomis. Kelemahan dari metode ini adalah membutuhkan waktu yang lama

dan subjektivitasnya tinggi. Oleh karena itu, dilakukan penetapan sebanyak

tiga kali. Trypan blue ditambahkan di sumuran tidak secara serempak tetapi

satu per satu sesaat sebelum penghitungan kultur sel karena trypan blue juga

bisa diserap oleh sel hidup bila sel hidup terpapar terlalu lama.

(i)

(ii)

Uji sitotoksisitas

sel vero. Sel vero merupakan sel normal dari ginjal ker

untuk mengetahui apakah

potensi membunuh sel normal atau tidak.

(i)

Gambar 3. Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah

pengamatan mikroskop dengan perbesaran 100x

1. Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT

Nilai absorba

merah dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing

konsentrasi ekstrak daun sirih merah adalah sebagai berikut :

Uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah juga dilakukan pada

sel vero. Sel vero merupakan sel normal dari ginjal kera. Hal ini bertujuan

untuk mengetahui apakah ekstrak heksan daun sirih merah mempunyai

potensi membunuh sel normal atau tidak.

(ii)

Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah


E. Analisis hasil

Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT

Nilai absorbansi hasil uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih

dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing

konsentrasi ekstrak daun sirih merah adalah sebagai berikut :

28

heksan daun sirih merah juga dilakukan pada

a. Hal ini bertujuan

heksan daun sirih merah mempunyai

Kontrol sel SiHa (i) dan kontrol sel Vero (ii) di bawah


Uji sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan metode MTT

ekstrak heksan daun sirih

dengan metode MTT dari perlakuan dan kontrol pada masing-masing

29

Tabel III. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

semua konsentrasi dengan metode MTT


terhadap % kematian sel SiHa pada metode MTT

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-2 -1 0 1 2 3 4

% kem

atian

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs %kematian (MTT)

Konsentrasi

ekstrak heksan

daun sirih

merah (µg/ml)

Absorbansi Rata-rata

absorbansi

%

kematian

sel SiHa Penetapan

I

Penetapan

II

Penetapan

III

2000 0,407 0,395 0,384 0,395 71,15

1000 0,384 0,375 0,380 0,380 72,24

500 0,350 0,344 0,344 0,346 74,73

250 0,423 0,406 0,423 0,417 69,54

125 0,792 0,732 0,724 0,749 45,29

62,5 0,937 0,941 0,974 0,951 30,53

31,25 0,916 0,962 0,974 0,951 30,53

15,625 0,985 0,989 1,001 0,992 27,54

7,813 1,009 1,016 1,033 1,019 25,57

3,906 1,019 0,986 1,008 1,004 26,66

1,953 0,932 0,952 0,983 0,956 30,17

0,977 0,974 0,944 1,004 0,974 28,85

0,488 0,991 1,001 0,986 0,993 27,47

0,244 0,978 0,995 0,987 0,987 27,90

0,122 0,964 0,932 0,981 0,959 29,95

kontrol 1,178 1,474 1,454 1,369

30

Tabel II merupakan data % kematian sel SiHa dari semua konsentrasi

yang digunakan dalam uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

dengan metode MTT. Dari tabel tersebut didapatkan kurva log konsentrasi

ekstrak heksan daun sirih merah terhadap % kematian (Gambar 4). Kemudian

untuk mendapatkan harga LC50 dilakukan penghitungan menggunakan

analisis probit (Mursyidi, 1985), yaitu dengan membuat persamaan regresi

linier antara log konsentrasi dengan nilai probit dari persen kematian, dan

dipilih titik dari konsentrasi 3,906 sampai 1000 µg/ml (Tabel III).

Tabel IV. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT

Konsentrasi

ekstrak

heksan daun

sirih merah

(µg/ml)

Rata-rata

absorbansi

%

kematian

sel SiHa

Log

konsentrasi

Harga

probit

1000 0,380 72,24 3 5,58

500 0,346 74,73 2,69 5,67

250 0,417 69,54 2,39 5,52

125 0,749 45,29 2,09 4,87

62,5 0,951 30,53 1,79 4,5

31,25 0,951 30,53 1,49 4,5

15,625 0,992 27,54 1,19 4,42

7,813 1,019 25,57 0,89 4,36

3,906 1,004 26,66 0,59 4,39

31


terhadap harga probit pada metode MTT

Dari data tersebut didapatkan persamaan y = 0,623x + 3,748 (Gambar

5) dan diperoleh harga LC50 pada sel SiHa dengan metode MTT sebesar

102,24 µg/ml.

Dilihat dari % kematian sel pada beberapa konsentrasi tidak

menunjukkan semakin tinggi kosentrasi semakin kecil absorbansi yang

terbaca karena banyak sel yang mati, hal ini kemungkinan dikarenakan oleh

ekstrak itu sendiri. Dalam hal ini, kurang dikendalikannya kriteria pemilihan

daun sirih merah saat pemanenan dan juga proses pembuatan ekstrak daun

sirih merah itu sendiri yang kurang sesuai.

2. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Heksan Daun Sirih Merah dengan Metode Direct

Counting

Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih

merah terhadap sel SiHa dan sel Vero menggunakan metode direct counting

adalah jumlah sel hidup dan jumlah sel mati baik pada perlakuan atau kontrol.

y = 0,623x + 3,748

R² = 0,834

0

1

2

3

4

5

6

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

harga probit

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs harga probit

32

Pada uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa dibuat delapan konsentrasi ekstrak

daun sirih merah, yaitu 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, dan 25 µg/ml.

Sedangkan pada uji sitotoksisitas terhadap sel vero dibuat juga delapan

konsentrasi ekstrak daun sirih merah, yaitu 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200,

dan 100 µg/ml.

Tabel V. Data uji sitotoksisitas terhadap sel SiHa metode direct counting

Konsentrasi

ekstrak

heksan daun

sirih merah

(µg/ml)

Sel SiHa

Penetapan I Penetapan II Penetapan III

Hidup

Mati

Hidup

Mati

Hidup

Mati

300 0 41 0 40 0 41

250 5 37 5 38 5 37

200 14 30 13 31 14 30

150 20 28 20 28 21 28

100 26 26 26 26 26 26

75 31 23 32 23 33 22

50 39 19 38 20 39 19

25 47 17 45 16 46 17

kontrol 76 0 76 0 76 0

Tabel VI. Data uji sitotoksisitas terhadap sel Vero metode direct counting

Konsentrasi

ekstrak

heksan daun

sirih merah

(µg/ml)

Sel Vero


Hidup

Mati

Hidup

Mati

Hidup

Mati

800 0 42 0 42 0 43

700 5 37 6 37 6 37

600 13 34 13 33 13 33

500 19 30 18 30 18 30

400 26 26 26 26 26 26

300 31 23 32 23 33 23

200 37 20 8 20 38 20

100 44 18 45 18 46 17

kontrol 75 0 75 0 75 0

33

Dari kedua tabel di atas menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol

baik sel SiHa maupun sel Vero tidak terjadi kematian sel. Hal itu berarti

kematian pada kelompok perlakuan memang disebabkan oleh ekstrak heksan

daun sirih merah itu sendiri. Dari data kematian sel di atas dapat dihitung %

kematian sel oleh ekstrak daun sirih merah.

Tabel VII. Data % kematian sel SiHa dengan perlakuan ekstrak heksan

daun sirih merah konsentrasi

ekstrak

heksan

(µg/ml)

Persen kematian sel SiHa (%) Probit

Penetapan I Penetapan II Penetapan

III

Rata-rata

300 100 100 100 100

250 88,0952 88,3721 88,0952 88,1875 6,18

200 68,1818 70,4545 68,1818 68,9394 5,50

150 58,3333 58,3333 57,1429 57,9365 5,20

100 50 50 50 50 5

75 42,5926 41,8182 40 41,4703 4,80

50 32,7586 34,4828 32,7586 33,3333 4,56

25 26,5625 26,2295 26,9841 26,5920 4,39

Gambar 6. Kurva log konsentrasi ekstrak heksan daun sirih merah terhadap

harga probit pada sel SiHa pada metode direct counting

y = 1,603x + 1,916

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Harga probit

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs harga probit (Sel SiHa)

Tabel VIII. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan

konsentrasi

ekstrak

heksan

(µg/ml)

Penetapan I

800 100

700 88,0952

600 72,3404

500 61,2245

400 50

300 42,5926

200 35,0877

100 29,0323

Gambar 7. Kurva log konsentrasi

Dilihat tabel data di atas, semakin tinggi konsentrasi semakin besar

persen kematian sel, itu berarti semakin tinggi konsentrasi semakin toksik

ekstrak heksan daun sirih merah terhadap sel. Untuk men

dibuat persamaan regresi linier

. Data % kematian sel Vero dengan perlakuan ekstrak

daun sirih merah

Persen kematian sel Vero (%)

Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata

100 100 100

0952 86,0465 86,0465 86,7294

72,3404 71,7391 71,7391 71,9395

61,2245 62,5 62,5 62,0748

50 50

42,5926 41,8182 41,0714 41,8274

35,0877 34,4828 34,4828 34,6844

29,0323 28,5714 26,9841 28,1959

log konsentrasi ekstrak daun sirih merah terhadap

probit pada sel Vero



heksan daun sirih merah terhadap sel. Untuk mendapatkan

buat persamaan regresi linier antara log konsentrasi dengan nilai probit dari

34

ekstrak heksan

Probit

Rata-rata

100

86,7294 6,13

71,9395 5,58

62,0748 5,31

50 5

41,8274 4,80

34,6844 4,61

28,1959 4,42

terhadap harga



dapatkan harga LC50

antara log konsentrasi dengan nilai probit dari

35

persen kematian. Dari hasil pengolahan data, diperoleh harga LC50 pada sel

SiHa dengan metode direct counting sebesar 83,95 µg/ml dan harga LC50 pada

sel Vero sebesar 290,40 µg/ml.

Menurut National Institute of Health (NIH), senyawa antikanker

dikategorikan dalam lima klasifikasi berdasarkan nilai LC50. Klasifikasi

tersebut meliputi Kategori 1, senyawa antikanker dengan strongest LC50 = 190-

528 µg/ml; Kategori 2, senyawa antikanker dengan moderate to strong LC50 =

528-1197 µg/ml; Kategori 3, senyawa antikanker dengan moderate LC50 =

1259-2515 µg/ml; Kategori 4, senyawa antikanker dengan weak to moderate

LC50 = 2528-4939 µg/ml; dan Kategori 5, senyawa antikanker dengan weak

LC50 > 5000 µg/ml (Mazzio,2009), baik dengan metode MTT atau direct

counting dapat dilihat bahwa ekstrak heksan daun sirih merah ini sangatlah

toksik karena nilai LC50 < 190 µg/ml, lebih kecil dari range nilai LC50 pada

kategori 1 (190-528 µg/ml). Sebaiknya dilakukan uji sitotoksik ekstrak heksan

daun sirih merah lebih lanjut menggunakan metode yang berbeda, dan untuk

lebih memastikan kebenarannya digunakan minimal 3 metode uji sitotoksisitas.

Dalam penelitian ini sebenarnya peneliti ingin mengetahui apakah

ekstrak heksan daun sirih merah tersebut aman untuk sel normal atau tidak,

akan tetapi di laboratorium tidak tersedia sel normal dari manusia sehingga

digunakan sel Vero yang merupakan sel normal dari ginjal kera. Karena sel

SiHa diambil dari leher rahim (cervix) manusia, maka data LC50 yang

diperoleh tidak dapat dibandingkan. Hal ini dikarenakan sel SiHa dengan sel

Vero berasal dari organ dan spesies yang berbeda, itu berarti keduanya

36

memiliki karakteristik yang berbeda pula sehingga responnya terhadap ekstrak

pun akan berbeda.

Tabel IX. Data analisis Z-test pada sel SiHa

Konsentra

si

(µg/ml)

Rata-rata sel

SiHa

Proporsi

sel mati

perlakuan

(P1)

Proporsi

sel mati

kontrol

(P2)

P0

Z

hitung

kesimpulan

hidup

mati

300 0 41 1

0

0,35 10,85 Berbeda bermakna

250 5 37 0,88 0,31 14,09 Berbeda bermakna







KONTROL 76 0

Tabel X. Data analisis Z-test pada sel Vero

Konsentra

si

(µg/ml)

Rata-rata sel

Vero

Proporsi

sel mati

perlakuan

(P1)

Proporsi

sel mati

kontrol

(P2)

P0

Z

hitung

kesimpulan

hidup

mati

800 0 42 1

0









KONTROL 75 0

Sedangkan analisis statistika Z-test digunakan untuk menguji apakah ada

perbedaan yang signifikan antara perlakuan dan kontrol. Dari hasil perhitungan

menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan antara kontrol dengan

37

perlakuan, sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak daun sirih merah mempunyai

efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

Pada penelitian sebelumnya, uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih

merah terhadap sel SiHa menghasilkan LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah,

2008), sedangkan LC50 pada penelitian ini lebih kecil yaitu 83,9460 µg/ml.

Semakin kecil LC50 berarti semakin toksik senyawa tersebut terhadap sel SiHa,

karena hanya dengan konsentrasi yang kecil sudah bisa membunuh 50% populasi

sel, sehingga bisa dikatakan bahwa ekstrak heksan daun sirih merah lebih bersifat

sitotoksik dibanding ekstrak etanolik daun sirih merah. Hal ini bisa disebabkan

oleh karena perbedaan pelarut yang digunakan, pada penelitian sebelumnya

digunakan pelarut etanol sedangkan penelitian ini menggunakan pelarut heksan.

Dimana pelarut etanol merupakan pelarut dengan kepolaran tinggi yang bisa

menyari seluruh senyawa dalam daun sirih merah sedangkan pelarut heksan

merupakan pelarut dengan kepolaran rendah yang hanya menyari senyawa dengan

kepolaran rendah seperti minyak atsiri. Dan apabila yang berpotensi sitotoksik

adalah senyawa dengan kepolaran rendah maka penggunaan pelarut heksan akan

memperbesar konsentrasi senyawa sitotoksik sehingga nilai LC50 menjadi lebih

kecil.

Selain pelarut, pemilihan metode penyarian juga mempengaruhi besar

kecilnya LC50. Pada penelitian sebelumnya digunakan metode maserasi,

sedangkan penelitian ini menggunakan metode perkolasi, sehingga bisa diartikan

bahwa metode perkolasi lebih baik dibanding metode maserasi. Hal itu

dikarenakan pada metode perkolasi pelarut dialirkan terus menerus sehingga

38

pelarut selalu berganti baru dan akan meningkatkan perbedaan derajat konsentrasi

yang membuat senyawa dalam daun sirih merah tersebut tersari secara optimal.

Selain berbagai perbandingan hasil dan keunggulan metode penelitian ini

dengan penelitian sebelumnya, ternyata baik penelitian ini maupun penelitian

sebelumnya juga memiliki kelemahan, yaitu tidak menggunakan kelompok

kontrol negatif dari pelarut yang digunakan, yaitu DMSO dan heksan. Telah

diketahui bahwa batas ketoksikan DMSO hanya 10% (Violante, 2002) sehingga

DMSO dikhawatirkan ikut berperan serta dalam kematian sel. Sedangkan penyari

heksan, dalam hal ini ekstrak pekat yang digunakan belum tentu benar-benar

pekat, tidak diketahui berapa banyak penyari heksan yang masih tertinggal di

dalam ekstrak pekat tersebut.

39

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak heksan daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) memiliki efek

sitotoksik terhadap kultur sel SiHa.

2. Harga LC50 dengan metode MTT sebesar 102,24 µg/ml.

3. Harga LC50 dengan metode direct counting sebesar 83,95 µg/ml.

B. Saran

1. Perlu digunakan kromatografi gas untuk mendeteksi secara kualitatif dan

kuantitatif senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun sirih merah

terutama untuk senyawa-senyawa yang mudah menguap seperti minyak atsiri.

2. Penelitian lebih lanjut digunakan sel normal dari organ yang sama.

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut menggunakan metode yang berbeda,

seperti acid phospate, neutral red. Dan sebaiknya digunakan lebih dari 3

metode untuk memastikan kebenarannya.

4. Perlu digunakan kontrol negatif dari pelarut yang digunakan, seperti DMSO

dan heksan.

5. Perlu dilakukan isolasi senyawa minyak atsiri daun sirih merah dilanjutkan

dengan uji sitotoksik untuk mengetahui senyawa yang spesifik berpotensi

sitotoksik.

40

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia,

Jakarta.

Anonim, 2008a, http://www.infopenyakit.com/2008/07/penyakit-kanker-leher-

rahim-serviks.html, diakses 27 Oktober 2008

Anonim, 2008b, http://www.plantamor.com/spcdtail.php?recid=2092, diakses 27

Oktober 2008

Anonim, 2007c, SiHa Cell, http://www.bs.izs.it/cataloghi/cellule/308.htm, diakses

pada September 2007

Anonim, 2009, Essential Oil Constituent,

http://www.abundanthealth4u.com/Essential_Oils_Constituents_s/41.ht

m, diakses pada 31 Juli 2009

Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Barille, F.A., 1997, In Vitro Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43,

Academic Press, Valencia, Spanyol.

Coll, J. C., Bowdeen, B. F., 1986, The Application of Vacuum Liquid

Chromatography to The Separation of Terpene Mixture, Volume 49,

Nomer 5, 934-936, Journal of Natural Product.

Daris, Azwar, 2009, Fitokimia Mencegah Penyakit Degeneratif,

http://www.isfinational.or.id/pt-isfi-penerbitan/126/476-fitokimia

mencegah-penyakit-degeneratif.html, diakses pada 31 Juli 2009.

Dwikusumaningtyas, E., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih

Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical

Research, John Willey and Sons Ltd, New York, 12-16, 47-50, 402 –

415.

41

De Muth, James E., 1999, Basic Statistics And Pharmaceutical Statistical

Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-

73, IRL Press, Washington DC.

Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam

Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686-

687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia,

Jakarta.

George, H.F., George, J. H., 1999, Biologi, edisi 2, 123, Penerbit Erlangga,

Bandung.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2nd edition, School of Biological Sciences,

University of Surrey, England.

Macdonald F. and Ford C.H.J., 1997, Molecular Biology of Cancer, edisi I, 1-2,

Bios Scientific Publisher Ltd, Oxford OX4 IRE, UK.

Mazzio, E. A., 2009, In Vitro Screening for The Tumoridical Properties of

International Medicinal Herbs, Phytother Res. , NIH Public Access.

Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, 101-102, 157, Penerbit Ghalia

Indonesia, Jakarta.

Meleka, F.M., 1983, Dimensions of the Cancer Problem, 5-9, Karger, New York.

Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum

Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi,

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper

crocatum Ruiz & Pav) Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

42

Sinardi F., Yuswanto Ag., 2000, Kanker, 1-5, Penerbit Universitas Sanata

Dharma, Yogyakarta.

Stahl, E., 1969, Thin Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, 2 th. Ed.

97 -101, Springer Verlag, Berlin.

Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, cet I, 39-41, P.T.

Agromedia Pustaka, Jakarta.

Suffness, M., dan Pezzuto, J.M., 1991, Assay Related to Cancer Drug Discovery,

Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Volume VI, 71-

133, Academic Press, London.

Violante, 2002, Journal Evaluation of The Cytotoxicity Effect of DMSO on CaCo2

Colon Tumor Cell Culture, 1600, Biological and Pharmaceutical

Bulletin Volume 25 No. 12

Wallin, R. F., Arscott, E. F., 1998, A Practical Guide to ISO: Cytotoxicity, an MD

and DI.

Wijesekera, 1991, The Medical Plant Industry, 101, CRC Press, New York.

Foto daun sirih merah (

Lampiran 1

Foto daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

43

Ruiz & Pav)

44

Lampiran 2

Data uji sitotoksisitas fraksi heksan daun sirih merah terhadap sel SiHa

dengan metode MTT

Tabel 11. Data absorbansi fraksi heksan daun sirih merah berbagai

konsentrasi dengan metode MTT

01020304050607080

-2 -1 0 1 2 3 4

% kem

atian

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs %kematian (MTT)

Konsentrasi

fraksi heksan

daun sirih

merah (µg/ml)

Absorbansi Rata-rata

absorbans

i

%

kematia

n sel

SiHa

Penetapa

n I

Penetapa

n II

Penetapan

III

2000 0,407 0,395 0,384 0,395 71,15

1000 0,384 0,375 0,380 0,380 72,24

500 0,350 0,344 0,344 0,346 74,73

250 0,423 0,406 0,423 0,417 69,54

125 0,792 0,732 0,724 0,749 45,29

62,5 0,937 0,941 0,974 0,951 30,53

31,25 0,916 0,962 0,974 0,951 30,53

15,625 0,985 0,989 1,001 0,992 27,54

7,813 1,009 1,016 1,033 1,019 25,57

3,906 1,019 0,986 1,008 1,004 26,66

1,953 0,932 0,952 0,983 0,956 30,17

0,977 0,974 0,944 1,004 0,974 28,85

0,488 0,991 1,001 0,986 0,993 27,47

0,244 0,978 0,995 0,987 0,987 27,90

0,122 0,964 0,932 0,981 0,959 29,95

kontrol 1,178 1,474 1,454 1,369

45


terhadap % kematian sel SiHa pada metode MTT

Tabel XII. Data uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah

dengan konsentrasi terpilih dengan metode MTT


terhadap harga probit pada metode MTT

y = 0,623x + 3,748

R² = 0,834

0

1

2

3

4

5

6

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

harga probit

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs harga probit

Konsentrasi

ekstrak

heksan daun

sirih merah

(µg/ml)

Rata-rata

absorbansi

%

kematian

sel SiHa

Log

konsentrasi

Harga

probit

1000 0,380 72,24 3 5,58

500 0,346 74,73 2,69 5,67

250 0,417 69,54 2,39 5,52

125 0,749 45,29 2,09 4,87

62,5 0,951 30,53 1,79 4,5

31,25 0,951 30,53 1,49 4,5

15,625 0,992 27,54 1,19 4,42

7,813 1,019 25,57 0,89 4,36

3,906 1,004 26,66 0,59 4,39

46

Lampiran 3

Data uji sitotoksisitas fraksi heksan daun sirih merah dengan metode Direct

Counting

Tabel 13. Data penghitungan hidup dan mati sel SiHa dengan direct counting

Konsentrasi

fraksi heksan

daun sirih

merah

(µg/ml)

Sel SiHa


Hidup

Mati

Hidup

Mati

Hidup

Mati

300 0 41 0 40 0 41

250 5 37 5 38 5 37

200 14 30 13 31 14 30

150 20 28 20 28 21 28

100 26 26 26 26 26 26

75 31 23 32 23 33 22

50 39 19 38 20 39 19

25 47 17 45 16 46 17

kontrol 76 0 76 0 76 0

� Perhitungan % kematian sel

�� ! �� !� �� ! �� " #$$�

1. Kontrol

Penetapan I = �%&�$��%&

%&�%& �" #$$� = 0

Penetapan II = �%&�$��%&

%&�%& �" #$$� = 0

Penetapan III = �%&�$��%&

%&�%& �" #$$� = 0

2. Konsentrasi 300 µg/ml

Penetapan I = �$�'#��$

$�'# �" #$$� = 100 %

47

Penetapan II = �$�'#��$

$�'# �" #$$� = 100 %

Penetapan III = �$�'#��$

$�'# �" #$$� = 100%


Penetapan I = �(�)%��(

(�)% �" #$$� = 88,0952 %

Penetapan II = �(�)*��(

(�)* �" #$$� = 88,3721 %

Penetapan III = �(�)%��(

(�)% " #$$� = 88,0952 %


Penetapan I = �#'�)$��#'

#'�)$ �" #$$� = 68,1818 %

Penetapan II = �#)�)#��#)

#)�)# �" #$$� = 70,4545 %

Penetapan III = �#'�)$��#'

#'�)$ �" #$$� = 68,1818 %


Penetapan I = �+$�+*��+$

+$�+* �" #$$� = 58,3333 %

Penetapan II = �+$�+*��+$

+$�+* �" #$$� = 58,3333 %

Penetapan III = �+#�+*��+#

+#�+* �" #$$� = 57,1429 %


Penetapan I = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %

Penetapan II = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %

Penetapan III = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %

48


Penetapan I = �)#�+)��)#

)#�+) �" #$$� = 42,5926 %

Penetapan II = �)+�+)��)+

)#�+) �" #$$� = 41,8182 %

Penetapan III = �))�++��))

))�++ �" #$$� = 40 %


Penetapan I = �),�#,��),

),�#, �" #$$� = 32,7586 %

Penetapan II = �)*�+$��)*

)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %

Penetapan III = �),�#,��),

),�#, �" #$$� = 32,7586 %


Penetapan I = �'%�#%��'%

'%�#% �" #$$� = 26,5625 %

Penetapan II = �'(�#&��'(

'(�#& �" #$$� = 26,2295 %

Penetapan III = �'&�#%��'&

'&�#% �" #$$� = 26,9841 %

49

konsentrasi

fraksi heksan

(µg/ml)

Persen kematian sel SiHa (%) Probit

Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata-rata

300 100 100 100 100

250 88,0952 88,3721 88,0952 88,1875 6,18

200 68,1818 70,4545 68,1818 68,9394 5,50

150 58,3333 58,3333 57,1429 57,9365 5,20

100 50 50 50 50 5

75 42,5926 41,8182 40 41,4703 4,80

50 32,7586 34,4828 32,7586 33,3333 4,56

25 26,5625 26,2295 26,9841 26,5920 4,39

Konsentrasi Log konsentrasi probit

250 2,4 6,18

200 2,3 5,50

150 2,18 5,20

100 2 5

75 1,88 4,80

50 1,7 4,56

25 1,4 4,39

y = Bx + A

y = 1,603x + 1,916

y = 1,603x + 1,916

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

Harga probit

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs harga probit (Sel SiHa)

50

y = probit 50 % = 5

5 = 1,603x + 1,916

3,084 = 1,603x

x = 1,924

LC50 = antilog 1,924

= 83,9460 µg/ml

Tabel. Data penghitungan hidup dan mati sel Vero dengan direct counting

Konsentrasi

fraksi heksan

daun sirih

merah

(µg/ml)

Sel Vero


Hidup

Mati

Hidup

Mati

Hidup

Mati

800 0 42 0 42 0 43

700 5 37 6 37 6 37

600 13 34 13 33 13 33

500 19 30 18 30 18 30

400 26 26 26 26 26 26

300 31 23 32 23 33 23

200 37 20 8 20 38 20

100 44 18 45 18 46 17

kontrol 75 0 75 0 75 0

� Perhitungan % kematian sel

�� ! �� !� �� ! �� " #$$�

1. Kontrol

Penetapan I = �%(�$��%(

%(�%( �" #$$� = 0

Penetapan II = �%(�$��%(

%(�%( �" #$$� = 0

51

Penetapan III = �%(�$��%(

%(�%( �" #$$� = 0


Penetapan I = �$�'+��$

$�'+ �" #$$� = 100 %

Penetapan II = �$�'+��$

$�'+ �" #$$� = 100 %

Penetapan III = �$�'+��$

$�'+ �" #$$� = 100 %


Penetapan I = �(�)%��(

(�)% �" #$$� = 88,0952 %

Penetapan II = �&�)%��&

&�)% �" #$$� = 86,0465 %

Penetapan III = �&�)%��&

&�)% �" #$$� = 86,0465 %


Penetapan I = �#)�)'��#)

#)�)' �" #$$� = 72,3404 %

Penetapan II = �#)�))��#)

#)�)) �" #$$� = 71,7391 %

Penetapan III = �#)�))��#)

#)�)) �" #$$� = 71,7391 %


Penetapan I = �#,�)$��#,

#,�)$ �" #$$� = 61,2245 %

Penetapan II = �#*�)$��#*

#*�)$ �" #$$� = 62,5 %

Penetapan III = �#*�)$��#*

#*�)$ �" #$$� = 62,5 %


52

Penetapan I = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %

Penetapan II = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %

Penetapan III = �+&�+&��+&

+&�+& �" #$$� = 50 %


Penetapan I = �)#�+)��)#

)#�+) �" #$$� = 42,5926 %

Penetapan II = �)+�+)��)+

)#�+) �" #$$� = 41,8182 %

Penetapan III = �))�+)��))

))�+) �" #$$� = 41,0714 %


Penetapan I = �)%�+$��)%

)%�+$ �" #$$� = 35,0877 %

Penetapan II = �)*�+$��)*

)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %

Penetapan III = �)*�+$��)*

)*�+$ �" #$$� = 34,4828 %


Penetapan I = �''�#*��''

''�#* �" #$$� = 29,0323 %

Penetapan II = �'(�#*��'(

'(�#* �" #$$� = 28,5714 %

Penetapan III = �'&�#%��'&

'&�#% �" #$$� = 26,9841 %

53

konsentrasi

fraksi heksan

(µg/ml)

Persen kematian sel Vero (%) Probit

Penetapan I Penetapan II Penetapan III Rata-rata

800 100 100 100 100

700 88,0952 86,0465 86,0465 86,7294 6,13

600 72,3404 71,7391 71,7391 71,9395 5,58

500 61,2245 62,5 62,5 62,0748 5,31

400 50 50 50 50 5

300 42,5926 41,8182 41,0714 41,8274 4,80

200 35,0877 34,4828 34,4828 34,6844 4,61

100 29,0323 28,5714 26,9841 28,1959 4,42

Konsentrasi Log konsentrasi probit

700 2,85 6,13

600 2,78 5,58

500 2,7 5,31

400 2,6 5

300 2,48 4,80

200 2,3 4,61

100 2 4,42

y = Bx + A

y = 1,806x + 0,551

y = probit 50 % = 5

5 = 1,806x + 0,551

4,449 = 1,806x

x = 2,463

y = 1,806x + 0,551

0

1

2

3

4

5

6

7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

harga probit

Log konsentrasi

Log konsentrasi vs harga probit(sel Vero)

54

LC50 = antilog 2,463 = 290,4023 µg/ml

Lampiran 4

Analisis Statistik Z-test Fraksi Heksan Daun Sirih Merah

pada Metode Direct Counting

Rumus :

-. � �/-/ � �0-01/�10

2 � 3/�3043.�# � 3.�1/ � 3.�# � 3.�10

Hipotesis :

Hi =proporsi jumlah sel mati pada kontrol dan perlakuan berbeda bermakna

H0=proporsi jumlah sel mati pada kontrol dan perlakuan tidak berbeda bermakna

Keputusan :

Taraf kepercayaan 95% → Z tabel(0,05) = 1.96

H0 ditolak jika Z hitung > 1.96

Tabel 14. Z-test sel SiHa

Konsentrasi

(µg/ml)

Rata-rata sel

SiHa Proporsi

sel mati

perlakuan

(P1)

Propors

i sel

mati

kontrol

(P2)

P0

Z

hitung kesimpulan

hidup mati

300 0 41 1

0









KONTROL 76 0

55

Tabel 15. Z-test sel Vero

Konsentrasi

(µg/ml)

Rata-rata sel

vero Proporsi

sel mati

perlakuan

(P1)

Propors

i sel

mati

kontrol

(P2)

P0

Z

hitung kesimpulan

hidup mati

800 0 42 1

0









KONTROL 75 0

56

Lampiran 5. Hasil uji KLT ekstrak heksan daun sirih merah

Keterangan gambar :

Cp = standarcaryophyllen

Ca = standar cavicol

H = ekstrak heksan daun

sirih merah

Fase diam = silika GF 254

Fase gerak = toluen:etil asetat

(93:7)

Deteksi = semprot asam sulfat

dan vanilin

Cp Ca H

57

Keterangan gambar :

Cr = standar carvacrol


sirih merah


Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7)

Deteksi = semprot asam sulfat dan

vanilin

Cr H

58

Keterangan gambar :

Ci = standar cineol


sirih merah


Fase gerak = toluen:etil asetat (93:7)

Deteksi = semprot asam sulfat dan

vanilin

Ci H

59

Keterangan gambar :

T = standar tannin

H = ekstrak heksan

daun sirih merah


Fase gerak = BAW (4:1:5)

Deteksi = reagen FeCl3

T H

60

Keterangan gambar :

K = standar kinin

H = ekstrak heksan

daun sirih merah


Fase gerak = metanol:amonia

(100:1,5)

Deteksi = semprot

dragendorff

HK

61

Keterangan gambar :

R = standar rutin


sirih merah

Fase diam = selulosa

Fase gerak = etil asetat:asan asetat:

asam formiat:air

(100:11:11:27)

Deteksi = uap amonia

H R

62

Uji Baku pembanding Hasil

Minyak atsiri Cineol +

Caryophylen -

Carvacrol -

Alkaloid Kinin -

Tanin -

Flavonoid Rutin -

63

Lampiran 6

Foto alat-alat yang digunakan dalam penelitian

perkolator

evaporator

64

mikroskop Cell counter dan haemocytometer

Laminar air flow (LAF)

inkubator

65

Tabung conical, tissue culture flask, 96-well

plate

96-well plate dengan perlakuan

66

Lampiran 7

HARGA PROBIT SESUAI DENGAN PERSENTASENYA

Persentase Probit

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3,77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,69 4,72

40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,84 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

99 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,65 7,75 8,88 8,09

(Mursyidi, 1985)

68

BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama Presti Arma Edytianingsih yang lahir pada

tanggal 19 Mei 1987 di Magelang, Jawa Tengah. Penulis

merupakan putri pertama dari pasangan Eddy Saptono dan Esti

Hari Isniyati. Penulis memulai pendidikan formalnya di TK

Masyitoh 6 Magelang pada tahun 1991. Penulis melanjutkan

pendidikan dasar di SD Negeri Cacaban 4 Magelang pada tahun 1993-1999.

Kemudian dilanjutkan di SLTP Negeri 6 Magelang pada tahun 1999-2002.

Penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2 Magelang pada tahun 2002-

2005, lalu melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta pada tahun 2005.

uji sitotoksisitas ekstrak heksan daun sirih merah ... · daftar lampiran ... keterangan botani ......

Documents