uji konfirmasi narkoba

Uji konfirmasi merupakan uji lanjutan dari uji screening narkotika /

psikotropika dimana uji konfirmasi merupakan pemeriksaan yang lebih akurat

karena hasil yang diperoleh merupakan hasil yang sudah definitif menunjukkan

jenis zat narkotika / psikotropika dalam suatu sampel yang dianalisis. Dalam uji

konfirmasi narkotika / psikotropika, sampel yang digunakan adalah sampel urine

pasien yang dicurigai mengandung zat narkotika / psikotropika. Penggunaan

sampel urine dikarena dalam sampel urine obat, racun, dan metabolit ada dalam

konsentrasi yang lebih besar dibandingkan dalam darah. Sebelum melakukan uji

konfirmasi terhadap jenis narkotika / psikotropika, dilakukan suatu pemisahan zat

narkotika / psikotropika terlebih dahulu dari sampel yang akan dianalisis.

Pemisahan tersbut dilakukan dengan menggunakan proses ekstraksi.

Ekstraksi merupakan proses pemisahan analit dari suatu matriks sampel

menggunakan pelarut dimana analit tersebut sangat larut dalam pelarut yang

digunakan namun zat pengotornya tidak larut. Dalam proses ekstraksi, setelah

analit dalam sampel larut dalam pelarut organik yang digunakan, kemudian

dilakukan suatu proses penguapan untuk menghilangkan pelarut tersebut sehingga

diperoleh analitnya saja untuk selanjutnya dianalis, dimana hal ini disebut dengan

tahap isolasi. Dalam proses ekstraksi, syarat untuk pelarut sesuai yang dapat

digunakan yaitu memiliki kakuatan mengekstraksi yang baik sehingga analit yang

akan diekstraksi dapat dipisahkan sepenuhnya dari matriks sampel dan zat

pengotor, kelarutannya rendah dalam air, memiliki kerapatan yang rendah dalam

air, memiliki volalitas moderat agar mudah diuapkan saat akan memperoleh analit

yang larut dalam pelarut tersebut namun pelarut tersebut tidak boleh terlalu

volatile sehingga pada saat digunakan untuk melarutkan analit atau preparasi

sampel pelarut tersebut tidak cepat menguap seluruhnya, bersifat stabil dan tidak

mudah terbakar, murah, kemurniannya tinggi, tidak mengabsorpsi sinar UV atau

tdak memiliki aktivitas elektrokimia sehingga tidak mengganggu proses analisis

analit.

Dalam praktikum yang dilakukan, proses ekstraksi dilakukan untuk

memperoleh obat – obat golongan Amfetamin dan Opiat dari sampel urine yang

selanjutkan akan dianalisis dengan menggunakan spektrofotodensitometri. Dalam

proses analisis obat golongan Amfetamin, yang menjadi sasaran dalam proses

analisis yaitu amfetamin, metamfetamin, methylendioxy amfetamin (MA) dan

methylendioxy metamfetamin (MDMA). Sedangkan untuk obat golongan Opiat,

yang menjadi sasaran dalam proses analisis yaitu kodein dan morfin.

Ada beberapa metode ekstraksi, yaitu ekstraksi padat – cair, ektraksi cair –

cair, dan ekstraksi fase padat (Solid Phase Extraction/ SPE). Dalam praktikum

yang dilakukan, metode ekstraksi yang digunakan yaitu ekstraksi cair – cair dan

ekstraksi fase padat (SPE).

Ekstraksi cair – cair merupakan ekstraksi suatu analit yang didasarkan atas

distribusi zat terlarut dengan perbandingan tertentu antara dua pelarut yang tidak

saling bercampur. Dalam proses ektraksi cair – cair terdapat beberapa tahap, yaitu

adjust pH (penyesuaian pH), partition, dan separated phase. Pada proses

pengerjaannya, sampel urine yang akan dianalisis diambil sebanyak 1 ml dan

dimasukkan ke dalam tabung centrifuge, kemudian ditambahkan dengan buffer

fosfat pH 9,3 sebanyak 1 ml dengan tujuan untuk mengkondisikan pH sampel

agar sesuai dengan pH yang baik untuk proses ekstraksi (basa) karena semakin

tinggi pH larutan akan semakin tinggi pula jumlah analit yang akan dperoleh..

Setelah itu ditambahkan dengan 2 ml campuran kloroform – isopropanol yang

sebelumnya telah dicampurkan dengan perbandingan 3:1, dimana campuran

kloroform – isopropanol berfungsi sebagai pelarut yang akan membuat analit

dalam sampe diperoleh kembali dengan jumlah yang lebih tinggi dibandingkan

dengan menggunakan yang lain. Sampel urine, buffer fosfat pH 9,3 dan campuran

kloroform – isopropanol dalam tabung centrifuge tersbut kemudian di vortex

dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit agar terbentuk emulsi yang

sempurna sehingga analit atau sasaran zat dalam proses analisis dapat larut

dengan baik hingga selanjutnya dilakukan proses centrifugasi dengan kecepatan

3000 rpm selama 10 menit untuk memperoleh hasil pemisahan antara fase

kloroform dan fase airnya. Fase kloroform merupakan fraksi yang mengandung

analit yang diinginkan. Setelah proses centrifuge, fase kloroform akan berada

dibagian bawah tabung centrifuge karena kloroform memiliki berat jenis yang

lebih besar dibandingkan dengan berat jenis air. Fase kloroform tersbut kemudian

di pipet dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Sedangkan fase air

yang tersisa dalam tabung centrifuge diekstraksi kembali. Hal ini dilakukan

karena diduga dalam fase air tesbut masih terdapat analit / zat yang diinginkan.

Oleh karenanya, dilakukan kembali penambahan buffer fosfat dengan pH yang

lebih tinggi dari pH buffer fosfat sebelumnya yaitu 10,5 untuk memaksimalkan

perolehan analit yang terdapat dalam fase air tersbut. Kemudian ditambahkan

campuran kloroform – isopropanol kembali dan dilakukan proses vortex dan

centrifugasi dengan waktu dan kecepatan yang sama. Dari proses tersebut juga

akan diperoleh fase kloroform dimana fase kloroform ini ditambahkan pada fase

kloroform pertama yang terdapat dalam tabung reaksi untuk selanjutnya

dipindahkan ke dalam botol vial dan di uapkan pada suhu 60 - 700C

menghilangkan pelarut – pelarut organik yang sebelumnya digunakan untuk

proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.

Ekstraksi fase padat adalah suatu teknik preparasi sampel yang mengacu

pada peristiwa pelepasan senyawa kimia dari sampel cairan yang mengalir karena

adanya retensi pada suatu padatan penyerap, yang kemudian diikuti dengan

perolehan kembali analit yang diinginkan melalui proses elusi. Pada praktikum

yang dilakukan, ekstraksi fase padat menggunakan fase diam berupa kolom SPE

Accubond II Evidex Catridge serta fase gerak berupa pelarut organik yang sesuai.

Prinsip pengerjaan ekstraksi fase padat terdiri dari tahapan condition, application,

retention, rinse, dan elution. Namun, pada tahap pertama sebelum dilakukan

tahapan condition, sampel yang akan dianalisis dipreparasi terlebih dahulu.

Karena pada saat praktikum jenis zat narkotika / psikotropika yang akan dianalisis

adalah Amfetamin dan Opiat, maka proses ekstraksi fase padat ini dilakukan

dengan dua pelarut yang berbeda. Untuk preparasi sampel dengan target analisis

Amfetamin, 5 ml urine ditambahkan dengan 3 ml K2HPO4 0,1 M pH 6 untuk

mngkondisikan pH sampel urine agar sesuai dengan pH yang baik untuk proses

ekstraksi. Sedangkan untuk preparasi sampel dengan target analisis Opiat, 5 ml

urine ditambahkan dengan 0,5 ml HCl dalam botol vial yang kemudia ditutup

dengan aluminium foil dan dipanaskan pada penangas air dengan suhu 1200C

selama 15 menit. Penambahan HCl pada sampel urine dengan proses pemanasan

ini dilakukan dengn tujuan untuk mendestruksi protein pengotor yang terdapat

pada sampel karena umumnya apabila suatu sampel urine mengandung Opiat,

maka dalam sampel urine tersebut akan banyak protein yang mengikat Opiat

sehingga untuk mempermudah proses analisis Opiat, protein yang Opiat tersebut

harus didestruksi terlebih dahulu. Kemudian ditambahkan 0,75 ml NaOH 10 N

yang menyebabkan pH urine menjadi basa (pada saat praktikum pH urine menjadi

13). Untuk mengkondisikan pH urine pada pH yang sesuai untuk proses ekstraksi

yaitu berkisar antara 6,5 – 7,5 maka sampel urine ditambahkan dengan 2,5 ml

asam fosfat 0,5 M. Namun pada saat praktikum, ketika ditambahkan 2,5 ml asam

fosfat 0,5 M ternyata pH urine menjadi 1. Oleh karenanya, sampel urine

ditambahkan kembali dengan NaOH 10 N hingga pH sampel urine berkisar antara

6,5 – 7,5. Selanjutnya dilakukan tahap SPE condition yang merupakan tahap

untuk menyesuaikan kondisi lingkungan kolom yang akan menjadi tempat

mengalirnya sampel yang akan diekstraksi. Untuk target analisis Amfetamin dan

Opiat, SPE condition dilakukan dengan tahapan yang sama yaitu menambahkan 6

ml metanol dengan 6 ml K2HPO4 0,1 M pH 6, dimana methanol berfungsi sebagai

fase gerak yang akan membantu proses elusi sedangkan K2HPO4 0,1 M pH 6

berfungsi untuk menjaga pH kolom agar sama dengan pH sampel yang akan

diekstraksi, sehingga perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika

sampel dimasukkan dapat dihindari. Tahapan selanjutnya setelah SPE condition

adalah tahapan retention yang merupakan tahapan dimana terjadi suatu proses

penghambatan matriks dan analit serta tahapan rinse yang merupakan pencucian

matriks dari sampel yang dianalisis. Tahapan retention dan rinse untuk target

analisis Amfetamin, dilakukan dengan memasukkan sampel urine sehingga

matriks dan Amfetamin akan tertahan pada fase padat kolom. Kemudian

ditambahkan 3 ml air yang merupakan tahapan awal untuk menghilangkan

matriks yang tertahan pada fase padat. Selanjutnya ditambahkan 3 ml asam asetat

0,1 M sebanyak 3 ml untuk mencuci sisa matriks yang masih tertahan di dalam

kolom dimana matriks ini akan dihilangkan dari dalam kolom dengan

penambahan 3 ml methanol. Sedangkan untuk target analisis Opiat, tahapan

retention dan rinse dilakukan dengan penambahan 3 ml K2HPO4 0,1 M kemudian

disusul dengan sampel urine yang dimasukkan ke dalam kolom. Selanjutnya

dilakukan penambahan 3 ml air, 3 ml sodium asetat 0,1 M pH 4,5 dan 3 methanol

dimana penambahan 3 zat ini ke dalam kolom mempunyai tujuan yang sama

seperti pada tahapan rinse untuk Amfetamin sehingga yang tersisa dikolom hanya

analit yang diinginkan. Setelah tahapan retention dan rinse, dilakukan proses

elusi, dimana proses elusi dilakukan ntuk mengambil analit tersebut dari kolom

dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Untuk Amfetamin,

ditambahkan ke dalam kolom 3 ml campuran kloroform, isopropyl alkohol dan

HCl dengan perbandingan 60:40:1. Sedangkan untuk Opiat, ditambahkan ke

dalam kolom 3 ml campuran kloroform, isopropyl alkohol, dan Na4OH dengan

perbandingan 78:20:2. Dengan pelarut yang sesuai tersebut, akan diperoleh

kembali analit yang diinginkan dari dalam kolom tersebut secara maksimal.

Masing – masing eluat yang diperoleh kemudian diuapkan pada suhu 650C untuk

menghilangkan pelarut – pelarut organik yang sebelumnya digunakan untuk

proses elusi sehingga diperoleh analit murni dari target yang diinginkan.

Analit yang telah diperoleh baik dengan ekstraksi cair – cair maupun SPE

direkonstitusi dengan methanol sebanyak 25l dengan tujuan untuk melarutkan

analit tersebut sehingga diperoleh dalam bentuk cairan sehingga memudahkan

analit untuk selanjutnya dilakukan uji konfirmasi dengan metode KLT –

Spektrodensitometri.

Setelah diperoleh analit dari sampel urine yang akan dianalisis, kemudian

analisis analit tersebut dilanjutkan pada uji konfirmasi. Dalam praktikum yang

dilakukan, uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan metode KLT

(Kromatografi Lapis Tipis) Spektrofotodensitometri. Hal pertama yang dilakukan

dalam uji konfirmasi dengan KLT Spektrodensitometri adalah menyiapkan plat

lapis tipis yang akan digunakan untuk menotolkan noda analit yang telah

diperoleh sebelumnya. Preparasi plat lapis tipis sangat penting untuk dilakukan

karena akan menentukan hasil dari proses selanjutnya dari uji konfirmasi ini. Plat

lapis tipis yang digunakan mengandung silika gel yang berperan sebagai fase

diam. Plat umumnya berukuran 20X20 cm, namun pada praktikum yang

dilakukan, plat yang diperlukan berukuran 10 X 10 cm, sehingga harus dilakukan

pemotongan terlebih dahulu sebelum plat tersebut digunakan. Dalam pemotongan

plat, ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain:

- Alas yang digunakan untuk memotong plat harus bersih, halus serta

terbuat dari keramik atau kaca.

- Alat pemotong yang digunakan harus tajam dan tidak boleh berkarat.

- Dalam pemotongan plat, tidak harus dipaksakan pemotongan tersebut

dilakukan dalam sekali tahap pemotongan. Pengulangan pemotongan

boleh dilakukan hingga plat benar – benar terputus dengan sempurna.

Hal tersebut dilakukan agar diperoleh plat yang tidak bergerigi, dan bebas

dari kontaminasi sebab plat yang bergerigi dapat mengganggu proses elusi

sehingga menghasilkan elusi analit yang tidak lurus sempurna (miring), berekor

(tailing) serta terbentuk jalur elusi baru. Plat yang telah dipotong dengan baik,

harus diberi identitas berupa kode arah elusi dipojok kanan atau kiri atas dengan

menggunakan pensil dan tidak boleh menggunakan ballpoint. Walapun pensil dan

ballpoint sama – sama mengandung bahan kimia, tetapi bahan kimia yang

terkandung dalam pensil masih bisa ditoleransi oleh plat dibanding bahan kimia

yang terkandung dalam ballpoint. Selain itu, apabila menggunakan ballpoint, saat

plat dicuci dengan menggunakan methanol, kemungkinan tinta dari ballpoint

tersebut akan luntur dan mengotori plat. Fungsi dari pemberian kode arah elusi

adalah agar proses pencucian plat dan proses elusi dapat berjalan kearah yang

sama, sebab apabila arah pencucian plat dengan arah elusi berbanding terbalik,

akan menyebabkan kotoran plat yang telah dibawa ke bagian atas plat saat

pencucian plat dengan methanol akan turun kembali ke daerah uji saat proses elusi

yang menyebabkan analit yang dielusikan akan terelusi bersama pengotor –

pengotor tersebut sehingga mengganggu proses analisis analit. Selain itu, plat

yang telah dipotong harus diberi batas atas dengan menggunakan pensil sekitar 1

cm dengan tujuan agar titik akhir elusi dari masing – masing noda dapat diamati

dengan jelas. Selain itu juga untuk memastikan agar masing – masing noda tidak

menyentuh pengotor – pengotor hasil pencucian plat yang terkumpul dibagian atas

plat.

Sebelum digunakan, plat yang telah dipotong tersebut dicuci dan

diaktivasi. Pencucian harus dilakukan sebab plat kemungkinan mengandung

pengotor karena faktor internal maupun eksternal. Faktor internal yang dimaksud

adalah pada saat proses pembuatan plat tersebut, sedangkan faktor eksternal

adalah pada saat penyimpanan plat itu sendiri. Pencucian dilakukan dengan

menggunakan larutan methanol yang merupakan pelarut polar / semi polar yang

dapat melarutkan banyak senyawa. Arah proses pencucian harus disesuaikan

dengan kode arah elusi yang telah ditetepkan sebelumnya karena methanol itu ikut

bermigrasi bersama pengotor kearah pencucian. Sebenarnya larutan yang lebih

baik digunakan untuk proses pencucian plat adalah fase geraknya sendiri karena

fase geraknya tersebut akan secara langsung membawa zat yang dianggap sebagai

pengotor oleh fase gerak itu sendiri sehingga plat tersebut akan terbebas dari

semua pengotor yang dapat mengganggu proses elusi. Sedangkan apabila

menggunakan methanol, zat yang tidak larut dalam methanol namun merupakan

pengotor bagi fase gerak, maka pada saat proses elusi analit dengan fase geraknya

tersebut proses elusi akan diganggu oleh pengotor tersebut. Namun, dalam

praktikum yang dilakukan, pencucian dilakukan dengan menggunakan methanol

mengingat methanol merupakan pelarut yang umum digunakan dan mudah

diperoleh dipasaran serta dapat melarukan banyak zat.

Tahap selanjutnya dilakukan proses aktivasi plat dengan pemanasan plat

pada suhu 600C selama 10 menit di dalam oven. Hal ini bertujuan untuk

menghilangkan uap air dan pengotor yang menempel pada sisi aktif plat karena

methanol yang digunakan untuk pencucian plat terdiri atas campuran air dan

methanol sehingga kemungkinan air tersebut terjerat dalam silika gel dan

menyebabkan silika gel tersebut menjadi jenuh dan harus diaktivasi. Oleh

karenanya proses aktivasi dilakukan dengan menghilang air yang terjerat dalam

silika gel tersebut sehingga silika gel tersebut tidak jenuh dan agar plat dapat

memberikan respon baseline yang lebih baik serta mengurangi ratio gangguan

(noise ratio).

Setelah aktivasi plat dilakukan, kemudian dilakukan pembuatan larutan

pengembang. Larutan pengembang yang digunakan dalam praktikum ini adalah

larutan pengembang sistem TB. Larutan pengembang TB dibuat dengan

mencampurkan sikloheksana, toluene, dan dietilamin dengan perbandingan

75:15:10 dalam sebuah labu ukur.

Selanjutnya, dilakukan pembuatan senyawa standar dengan konsentrasi 50

ng/l. Karena pada saat praktikum telah tersedia larutan standar dengan

konsentrasi 1000 ng/l, maka larutan standar dengan konsentrasi 1000 ng/l

tersebut diencerkan menjadi konsentrasi 50 ng/l dengan cara 0,25 ml larutan

standar 1000 ng/l diencerkan dalam labu ukur 5 ml dengan menggunakan

methanol hingga tanda batas labu ukur, sehingga diperoleh larutan standar

pembanding 5 ng/l yang diinginkan.

Setelah dilakukan pembuatan larutan standar dengan konsentrasi 50 ng/l,

kemudian dibuat larutan standar pembanding untuk sistem TB. Larutan standar

pembanding untuk sistem TB dibuat dari larutan teofilin, papaverin,

dekstrometorfan, dan bromheksin yang masing – masing larutan tersebut

berkonsentrasi 1 mg / ml kecuali larutan dektrometorfan yang memiliki

konsentrasi 2 mg/ml. Oleh karenanya sebelum keempat larutan tersebut

dicampurkan, larutan dekstrometorfan harus diencerkan terlebih dahulu hingga

diperoleh larutan standar pembanding dekstrometorfan 1 ml /ml. Pengenceran

larutan dekstrometorfan 2 mg / ml dilakukan dengan memipet 2,5 ml larutan

dektrometorfan 2 mg / ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 5 ml kemudian

ditepatkan hingga tanda batas dengan methanol da dihomogenkan hingga

diperoleh larutan Dektrometorfan 1 mg / ml. Pembuatan larutan standar

pembanding untuk sistem TB dilakukan dengan mencampurkan masing – masing

0,5 ml larutan teofilin 1 mg / ml, papaverin 1 mg / ml, dektrometorfan 1 mg / ml,

serta bromheksin 1 mg /ml dalam sebuah botol vial dan kemudian dihomogenkan.

Tahapan selanjutnya adalah penjenuhan chamber. Sebelum dijenuhkan,

dipilih terlebih dahulu chamber yang sesuai dengan ukuran plat. Karena Plat yang

digunakan berukuran 10 X 10 cm, maka chamber yang digunakan adalah chamber

dengan ukuran 10 X 10. Kemudian penjenuhan chamber dilakukan dengan cara

memasukkan 10 ml larutan pengembang TB ke dalam chamber yang telah di

berisi sebuah kertas saring kemudian chamber ditutup rapat dengan penutupnya

selama kurang lebih 30 menit. Fungsi penambahan kertas saring ke dalam

chamber saat proses penjenuhan chamber adalah untuk mengetahui chamber

tersebut sudah jenuh atau belum. Apabila chamber telah jenuh, maka kertas saring

dalam chamber tersebut akan terbasahi seluruhnya oleh larutan pengembang TB.

Bersamaan dengan proses penjenuhan chamber, dilakukan proses

penotolan larutan standar, analit sampel yang sebelumnya telah direkonstitusi

dengan methanol, serta larutan standar pembanding sistem TB pada plat yang

telah dicuci dan diaktivasi dengan menggunakan alat penotolan semi otomatis

Linomart. Dikatakan sebagai alat penotolan yang semi otomatis, karena pada

proses aspirasi bahan uji ke dalam syringe linomart masih dilakukan secara

manual oleh petugas tetapi untuk proses penotolah bahan uji dilakukan secara

otomatis oleh linomart itu sendiri melalui proses setting komputerisasi yang

sebelumnya telah dilakukan sehingga petugas hanya perlu penempatan plat pada

meja linomart. Karena plat yang digunakan berukuran 10 X 10 cm dan jarak

penotolan satu senyawa dengan senyawa lainnya adalah 1 cm, maka pada plat

tersebut akan terdapat 9 titik penotolan. Titik penotolan 1 sampai 5 diisi dengan

larutan standar, titik penotolan 6 sampai 8 diisi dengan analit dari sampel, dan

titik penotolan 9 diisi dengan larutan standar pembanding untuk sistem TB. Pada

titik penotolan 1 sampai 5, ditotolkan larutan standar dengan konsentrasi yang

berbeda – beda, yaitu 200 ng/l, 400 ng/l, 600 ng/l, 800 ng/l, dan 1000 ng/l.

Karena larutan standar yang tersedia memiliki konsentrasi 50 ng/l, maka tiap

titik penotolan (dari titik penotolan 1 sampai 5) memiliki jumlah penotolan yang

berbeda – beda sesuai konsentrasi larutan standar pada setiap titik penotolan yang

telah dipaparkan sebelumnya. Jumlah penotolan pada setiap titik pada titik

penotolan 1 sampai 5, antara lain;

- Titik penotolan 1 : Konsentrasi larutan standar 200 ng/l, maka penotolan

larutan standar 50 ng/l dilakukan sebanyak 4 kali.









Selanjutnya, pada titik penotolan 6 sampai 8 diisi oleh analit dari sampel

yang dianalisis. Pada titik penotolan ke 6 diisi oleh analit yang diperoleh melalui

proses ekstraksi SPE dengan target sasaran analisis Amfetamin, pada titik

penotolan 7 diisi oleh analit yang diperoleh melalui proses ekstraksi SPE dengan

target sasaran analisis Opiat dan titik penotolan 8 diisi oleh analit yang diperoleh

melalui proses ekstraksi LLE dengan target sasaran analisis Opiat. Masing –

masing analit dari sampel tersebut ditotolkan sebanyak 50 l. Sedangkan pada

titik penotolan 9 ditotolkan 2 l larutan standar pembanding TB.

Apbila proses penotolan telah selesai dilakukan, kemudian plat

dikeringkan pada oven dengan suhu 6001

uji konfirmasi narkoba

Documents