uji autentifikasi daging kambing terhadap...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

CEMARAN DAGING BABI MENGGUNAKAN REAL-

TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI

AFRI YANTI

1113102000081

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JULI 2017

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP

CEMARAN DAGING BABI MENGGUNAKAN REAL-

TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

AFRI YANTI

1113102000081

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JULI 2017

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

LEMBAR PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Afri Yanti

NIM : 1113102000081

Tanda Tangan

Tanggal : 17 Juli 2017

iv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama : Afri Yanti

NIM : 1113102000081

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi

Menggunakan Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Disetujui oleh:

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D.

NIP: 197308222008012007 NIP: 196905112003121001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt.

NIP: 197404302005012003

v UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh

Nama : Afri Yanti

NIM : 1113102000081

Program Studi : Strata-1 Farmasi



Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai

bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I : Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. ( )

Pembimbing II : Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. ( )

Penguji I : Dr. Endah Wulandari, M.Biomed. ( )

Penguji II : Imam Prabowo, M.Farm., Apt. ( )

Ditetapkan di : Ciputat

Tanggal : 17 Juli 2017

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Afri Yanti

Program Studi : Farmasi



Daging kambing merupakan salah satu jenis daging yang banyak terdapat di

Indonesia dan dikonsumsi oleh sejumlah luas populasi. Adanya kasus peredaran

daging yang tercampur dengan daging babi sangat meresahkan masyarakat Muslim.

Untuk mengantisipasi meningkatnya kasus tersebut, maka perlu dilakukan

autentifikasi daging kambing terhadap cemaran daging babi. Pengembangan teknik

analisis berbasis DNA menggunakan real-time PCR telah menjadi salah satu teknik

analisis yang cepat, sensitif, dan efisien. Amplifikasi DNA menggunakan real-time

PCR memerlukan primer yang spesifik dan pewarna fluoresensi. Primer kambing dan

babi yang digunakan ditargetkan pada sekuens DNA mitokondria dengan UPL probe sebagai pewarna fluoresensi. Proses isolasi DNA menggunakan kit komersial.

Kelompok sampel simulasi daging A yaitu campuran antara daging kambing dan

daging babi dengan konsentrasi daging kambing 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan

0,1%. Kelompok sampel simulasi daging B yaitu campuran antara daging kambing

dan daging babi dengan konsentrasi daging babi 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan

0,1%. Isolat DNA yang diperoleh yaitu memiliki konsentrasi terendah 6,36 ng/μl,

sedangkan konsentrasi terbesar yaitu 35,26 ng/μl. Adapun kemurnian isolat DNA

yang terendah dan tertinggi yaitu masing-masing 1,50 dan 2,02. Hasil kurva

amplifikasi menunjukkan masing-masing primer telah spesifik. Primer kambing dapat

mendeteksi daging kambing hingga konsentrasi 0,1% dalam campuran daging babi.

Demikian pula dengan primer babi, dapat mendeteksi daging babi hingga konsentrasi

0,1% dalam campuran daging kambing.

Kata Kunci: Real-time PCR, daging, UPL probe

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Afri Yanti

Programe Study : Pharmacy

Title : Authentication of Goat Meat to Contamination of Pork Meat

Using Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)

Goat meat is one type of meat that is widely available in Indonesia and consumed by

a large number of population. The existence of cases of circulation of meat mixed

with pork is very disturbing Muslim community. To anticipate the increased cases, it

is necessary to authenticate goat meat to contaminate pork meat. The development of

DNA-based analysis techniques using real-time PCR has become one of the fastest,

most sensitive, and efficient analysis techniques. DNA amplification using real-time

PCR requires a specific primer and fluorescence dye. The goat and pig primers used

are targeted at mitochondrial DNA sequences with UPL probes as fluorescence dyes.

The process of DNA isolation using a commercial kit. The simulated group of meat A

is a mixture of goat meat and pork with 100% goat meat concentration; 50%; 10%;

1%; 0.5%; and 0.1%. Group of simulated samples of B meat is a mixture of goat meat

and pork with 100% pork concentration; 50%; 10%; 1%; 0.5%; and 0.1%. The

obtained DNA isolate has the lowest concentration is 6.36 ng/μl, while the largest

concentration is 35,26 ng/μl. The purity of the lowest and highest DNA isolates are

1.50 and 2.02 respectively. The result of the amplification curve shows that each

primary has been specific. Primary goats can detect goat meat up to a concentration

of 0.1% in pork mix. Similarly with pig primers, it can detect pork to a concentration

of 0.1% in a mixture of goat meat.

Keyword: Real-time PCR, meat, UPL probe

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Keanugrahan inspirasi dari Allah SWT menjadi kekuatan kepada penulis untuk

segera menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, tiada kata yang terindah selain

ucapan syukur tak terhingga karena penulis dapat menyelesaikan skripsi ini yang

berjudul “Uji Autentifikasi Daging Kambing Terhadap Cemaran Daging Babi

Menggunakan Real-time PCR (Polymerase Chain Reaction)”. Sholawat dan salam

semoga tercurah kepada Rasulullah SAW, pembawa cahaya Islam. Skripsi ini

diajukan kepada Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan,

UIN Syarif Hidayatullah.

Dalam penulisan skripsi ini, banyak pihak yang telah membantu hingga skripsi

ini dapat penulis tuntaskan. Oleh karena itu, penulis berterima kasih kepada

1. Dr. Zilhadia, M.Si., Apt. dan Chris Adhiyanto, M.Biomed., Ph.D. yang ikhlas

membimbing, mendidik, dan menerima penulis dengan baik untuk berkonsultasi;

2. Dr. Arief Sumantri, SKM, M. Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;

3. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta;

4. Nelly Suryani, Ph.D., Apt., selaku Sekretaris Program Studi Farmasi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta sekaligus dosen Penasehat Akademik yang selalu setia

memberikan arahan dan bimbingan dengan sabar;

5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah memberikan

ilmu pengetahuan dan bimbingan selama penulis menempuh pendidikan farmasi

di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta;

6. Masyarakat dan Pemerintah Sumsel yang telah memberikan beasiswa sehingga

memicu semnagat belajar;

7. Kakak-kakak laboran yang telah membantu dalam melakukan penelitian;

8. Bu Frida dan tim yang telah bersedia membantu dalam penyelesaian real-time

PCR;

9. Kakak-kakak sejawat (Kak Vesty dan Kak Safizah) yang telah menyumbangkan

materi dan pikiran;

10. Teman anggota tim analisis halal (Rizki), dan teman-teman seperjuangan yang

selalu setia menginsipirasi untuk menyelesaikan penelitian ini;

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada keluarga: ibu (Halipah), ayah (A.

Rahman), dan adik-adik tercinta yang selalu mendukung penulis melalui doa dan

memotivasi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini.

Semoga skripsi ini dapat bermanfaat, baik sebagai sumber informasi maupun

sumber inspirasi, bagi para pembaca.

Jakarta, Juli 2017

Penulis

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini

Nama : Afri Yanti

NIM : 1113102000081

Program Studi : Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilm Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya,

dengan judul

UJI AUTENTIFIKASI DAGING KAMBING TERHADAP CEMARAN DAGING

BABI MENGGUNAKAN REAL-TIME PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Lybrary Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada tanggal : 17 Juli 2017

Yang menyatakan,

(Afri Yanti)

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS................................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v

ABSTRAK ............................................................................................................. vi

ABSTRACT ........................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................... viii

HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI....................................................... ix

DAFTAR ISI .......................................................................................................... x

DAFTAR TABEL.................................................................................................. xii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xiv

DAFTAR SINGKATAN ....................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah ................................................................................ 4

1.3 Tujuan Penelitian.................................................................................. 4

1.4 Manfaat Penelitian................................................................................ 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5

2.1 Babi dan Keharamannya ..................................................................... 5

2.2 Sel ......................................................................................................... 5

2.3 Deoxyribonucleic Acid (DNA) ............................................................. 7

2.3.1 Definisi DNA ............................................................................. 7

2.3.2 Sifat Fisika DNA ....................................................................... 9

2.3.3 DNA Mitokondria ....................................................................... 10

2.3.4 Isolasi DNA ................................................................................ 12

2.3.5 Uji Kuantitatif DNA ................................................................... 13

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................................... 14

2.4.1 Komponen PCR ......................................................................... 14

2.4.2 Tahapan PCR .............................................................................. 17

2.5 Real-time PCR ...................................................................................... 19

BAB III METODE PENELITIAN ...................................................................... 22

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................. 22

3.1.1 Tempat Penelitian ....................................................................... 22

3.1.2 Waktu Penelitian ......................................................................... 22

3.2 Alat dan Bahan ..................................................................................... 22

3.2.1 Alat.............................................................................................. 22

3.2.2 Bahan .......................................................................................... 22

3.3 Alur Kerja ............................................................................................. 23

3.4 Prosedur Kerja ...................................................................................... 23

3.4.1 Preparasi Sampel ........................................................................ 23

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.2 Isolasi DNA ................................................................................ 23

3.4.3 Analisis Isolat DNA .................................................................... 24

3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI ......................... 24

3.4.5 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR ....................... 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN............................................................... 27

4.1 Analisis Isolat DNA ............................................................................. 27

4.2 Analisis Uji Spesifisitas Primer ............................................................ 30

4.3 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing dan Primer Babi

pada Real-time PCR ............................................................................. 31

4.3.1 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing pada Real-

time PCR ..................................................................................... 32

4.3.2 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Babi pada Real-time

PCR ............................................................................................. 35

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 39

5.1 Kesimpulan ........................................................................................... 39

5.2 Saran ..................................................................................................... 39

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 40

LAMPIRAN .......................................................................................................... 46

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1 Primer (Macrogen®) dan UPL (Roche®) ................................................ 23

Tabel 3.2 Pengaturan Program Amplifikasi Real-time PCR .................................. 26

Tabel 4.1 Isolat DNA .............................................................................................. 29

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Skema Representasi Sel Eukariotik dengan Organel Sel ................... 6

Gambar 2.2 Struktur Basa Nitrogen DNA ............................................................. 8

Gambar 2.3 Struktur DNA Double Helix ............................................................... 8

Gambar 2.4 Mitokondrion ....................................................................................... 11

Gambar 2.5 Struktur DNA Mitokondria pada Manusia ......................................... 11

Gambar 2.6 Nanospektrofotometer ........................................................................ 13

Gambar 2.7 Tahapan PCR ...................................................................................... 18

Gambar 2.8 Amplifikasi Eksponensial DNA pada PCR ........................................ 19

Gambar 2.9 Fase Kurva Amplifikasi PCR ............................................................. 21

Gambar 4.1 Kurva Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC

Menggunakan Primer Kambing ........................................................... 33

Gambar 4.2 Amplifikasi Simulasi Sampel A .......................................................... 35


Menggunakan Primer Babi................................................................... 36

Gambar 4.4 Amplifikasi Simulasi Sampel B .......................................................... 37

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Kerangka Penelitian ............................................................................ 46

Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA ............................................ 47

Lampiran 3 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe ............................ 52

Lampiran 4 Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer ................................. 53

Lampiran 5 Campuran Reaksi Master Mix untuk Amplifikasi DNA .................... 54

Lampiran 6 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI ................................ 55

Lampiran 7 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi A (1), dan Simulasi A

(2) Mengunakan Primer Kambing ..................................................... 57

Lampiran 8 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi B (1), dan Simulasi B

(2) Mengunakan Primer ..................................................................... 59

Lampiran 9 Gambar Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian .............. 61

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

AFL : Arbitrary Fluorescence Level

ATP : Adenosine Triphosphate

CP : Crossing Point

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythmidine Triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic Acid

kDa : Kilo Dalton

mtDNA : Mitochondrial Deoxyribonucleic Acid

NLS : Nuclei Lysis Soluition

PCR : Polymerase Chain Reaction

PPS : Protein Precipitation Solution

RNA : Ribonucleic Acid

rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid

RT-PCR : Real Time Polymerase Chain Reaction

Tm : Melting Temperature

tRNA : Transfer Ribonucleic Acid

SDS : Sodium Dedocyl Sulfate

UPL : Universal Probe Library

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Makanan adalah kebutuhan esensial manusia. Makanan merupakan suatu

senyawa yang berfungsi sebagai nutrisi tubuh baik mikronutrisi maupun makronutrisi

yang penting bagi tubuh untuk dapat melangsungkan proses biokimia,

mempertahankan kehidupan, menstimulasi pertumbuhan, serta menghasilkan energi

(Pereira dan Vicente, 2012).

Salah satu sumber nutrisi dapat berasal dari daging hewan. Meskipun

berdasarkan data epidemiologi menunjukkan bahwa konsumsi daging berhubungan

dengan peningkatan resiko penyakit gangguan metabolik tergantung pada tingkat

kandungan kolesterol saturated fatty acid (SFA), namun konsumsi daging juga

penting untuk kesehatan seperti untuk menjaga jaringan syaraf dan mata selama fase

kehidupan manusia (Dario Pighin et al., 2016). Di antara jenis daging yang sering

dikonsumsi yaitu daging merah seperti daging sapi, daging kambing, dan daging babi.

Namun, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi keputusan seseorang untuk

memilih jenis daging yang dikonsumsi seperti faktor etnik, budaya, kesehatan,

ekonomi, dan agama.

Indonesia merupakan negara yang memiliki keanekaragaman etnik, budaya, dan

agama. Beberapa agama seperti Islam, Hindu, dan Budha melarang untuk

mengonsumsi daging sapi atau babi serta produk turunannya. Beberapa produk

daging menjadi tabu untuk dikonsumsi. Saat ini, agama mayoritas di Indonesia adalah

Islam. Dalam Islam, terdapat konsep makanan yang dihalalkan dan diharamkan.

Makanan halal berarti makanan yang diizinkan di bawah hukum Islam, sebaliknya

haram berarti makanan yang dilarang di bawah hukum Islam (Laelasari, 2014).

Isu halal dalam makanan sangat penting dalam Islam. Kehalalan suatu produk

dinilai tidak hanya dari produk jadi, tetapi juga dari sumber material, proses

pengolahan, pengemasan, serta distribusi hingga siap dikonsumsi konsumen.

2


Kontaminan dapat terjadi secara sengaja (kecurangan pedagang) maupun tidak

sengaja (karena proses pengolahan).

Konsep halal telah terdapat dalam Al-Qur’an dan Sunnah. Salah satu Ayat Al-

Qur’an yang menyatakan keharusan mengonsumsi yang halal yaitu terdapat dalam

QS. Al-Baqarah: 168. Prinsip halal yang diterapkan dalam memilih makanan yaitu

memilih makanan yang hiegenis, aman, mempertimbangkan aspek kesehatan, dan

ramah lingkungan. Hal ini berarti prinsip halal dapat diterima tidak hanya untuk

Muslim, melainkan juga non-Muslim.

Saat ini kesadaran masyarakat akan pentingnya menjaga kesehatan semakin

meningkat. Salah satu aspek yang mempengaruhi kesehatan adalah makanan yang

dikonsumsi. Konsumen mulai mencari makanan yang dapat menjaga kesehatan,

mencegah penyakit, dan meningkatkan status mental dan kualitas hidup (Ahmad,

1996; Hasler, 1998; Milner, 1999; Poulsen, 1999). Isu kehalalan produk pangan

mempengaruhi kepercayan konsumen terhadap makanan yang dikonsumsi.

Ayat Al-Qur’an yang menyebut tentang beberapa jenis makanan yang

diharamkan antara lain terdapat dalam QS. Al-Baqarah:173, Al-Maidah: 3, dan An-

Nahl:115. Dalam QS. Al-Baqarah:173 dijelaskan bahwa daging babi dan daging yang

disembelih tidak sesuai syari’at Islam diharamkan untuk dikonsumsi kecuali dalam

keadaan terpaksa dan tidak melampaui batas. Oleh karena itu, telah jelas bahwa setiap

Muslim diharamkan mengonsumsi daging babi dan juga turunannya.

Alasan dasar keharaman ini adalah najis dan dapat menimbulkan efek

berbahaya. Hal ini menjadikan pentingnya perlindungan konsumen dari cemaran

daging babi terhadap jenis daging lain melalui sertifikasi halal untuk menjamin

kehalalan produk yang dikonsumsi. Di Indonesia, sertifikasi halal diberikan oleh

Majelis Ulama Indonesia (MUI). Namun, masih sering ditemukan kasus beredarnya

daging ilegal yang meresahkan masyarakat. Hal ini dilakukan pedagang untuk

meningkatkan omset penjualan karena daging babi jauh lebih murah dibandingkan

daging lainnya.

Kasus pencampuran dengan daging babi dapat terus meningkat jika tidak

ditangani dan diantisipasi dengan baik. Adanya pencampuran tersebut tidak hanya

3


melanggar aspek kehalalan tetapi juga dapat mengurangi nilai gizi yang terdapat pada

daging dan menimbulkan gangguan kesehatan terutama bagi individu yang

mengalami reaksi alergi pada daging babi. Campuran daging tersebut sulit untuk

dibedakan secara organoleptis serta memiliki kesamaan matriks jaringan yang sangat

kompleks.

Salah satu daging yang banyak terdapat di Indonesia dan dikonsumsi oleh

sejumlah luas populasi yaitu daging kambing. Tetapi, karena harganya yang relatif

lebih mahal dibandingkan beberapa jenis daging lain, daging kambing sering

dicampur dengan daging yang lebih murah seperti daging babi. Untuk itu, diperlukan

metode analisis yang cepat, sensitif, dan akurat untuk mengidentifikasi keaslian

daging kambing yang ada di pasaran sehingga dapat melindungi konsumen dari

produk ilegal untuk alasan ekonomi, agama, dan kesehatan akibat pencampuran atau

penukaran label produk.

Determinasi keaslian komponen produk merupakan analisis yang penting untuk

menjamin komposisi makanan. Saat ini telah berkembang teknik analis berbasis DNA

yaitu teknik real-time PCR. Teknik real-time PCR merupakan teknik analisis yang

sangat sensitif dan spesifik untuk deteksi dan kuantifikasi DNA dalam jumlah kecil,

efisien, dan cepat (Aw TG dan Rose JB, 2012). Selain itu, teknik molekular PCR dari

squens DNA target berpotensi untuk mengidentifikasi jenis sampel yang berbeda dan

juga sensitif untuk produk mentah maupun produk yang telah dimasak (Catuthraw,

2009; Fumiere et al., 2009; Yancy et al., 2009).

Identifikasi DNA sampel menggunakan real-time PCR memerlukan pewarna

fluoresens. Pewarna fluoresens yang sering digunakan yaitu SYBR Green dan

Hydrolysis Probe (Izzah, 2014). Pewarna lain yaitu Universal ProbeLybrary (UPL).

UPL probe memiliki fleksibelitas, ketersediaan, dan penerimaan yang sama seperti

SYBR Green, serta memiliki spesifisitas seperti Hydrolysis Probe (Roche®, 2009).

UPL probe mudah dirancang TaqMan real-time PCR assay sehingga dapat dilakukan

running pada kondisi PCR yang identik yang esensial untuk analisis real-time PCR

(Ishii, Satoshi et al., 2013).

4


Analisis real-time PCR juga memerlukan primer yang spesifik. Uji spesifisitas

primer dapat dilakukan dengan Database NCBI dipilih menu BLAST. Pengujian

spesifisitas primer dilakukan untuk menentukan kemampuan primer dalam

membedakan DNA. Untuk mengonfirmasi bahwa primer tersebut spesifik terhadap

spesies daging yang dianalisis, maka dilakukan pengujian menggunakan real-time

PCR. Pada kenyataannya, spesifisitas primer tersebut dipengaruhi oleh kondisi

running PCR termasuk konsentrasi primer dan probe yang digunakan (Akhmad,

2016).

Oleh karena itu, uji ini bertujuan untuk mengidentifikasi kemungkinan adanya

cemaran daging babi terhadap daging kambing dengan teknik real-time PCR. Hasil

penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan untuk autentifikasi daging kambing

yang tercemar daging babi.

1.2 Rumusan Masalah

Penelitian tentang pengembangan metode uji autentifikasi daging kambing

terhadap cemaran daging babi mengunakan real-time PCR sangat penting dilakukan

mengingat belum adanya penelitian tersebut. Pengembangan metode ini dimaksudkan

untuk memberi informasi penggunaan primer dan probe, kondisi running real-time

PCR, sehingga diperoleh serangkaian metode yang optimal untuk autentifikasi daging

kambing.

1.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian adalah mengautentifikasi daging kambing terhadap cemaran

daging babi menggunakan real-time PCR.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini yaitu tersedianya metode analisis untuk

mengidentifikasi kemungkinan adanya cemaran daging babi terhadap daging

kambing dengan teknik real-time PCR. Hasil penelitian ini diharapkan dapat

diaplikasikan untuk identifikasi kehalalan daging kambing.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Babi dan Keharamannya

Babi merupakan hewan mamalia sejenis ungulata yang masuk dalam famili

Suidae. Hewan ini berasal dari Eurasia. Keharaman babi telah dijelaskan dalam Al-

Quran sebagai sumber hukum Islam yang mutlak. Adapun salah satu ayat Al-Quran

yang menyebutkan keharaman babi yaitu QS. Al-Maidah ayat 3: "Diharamkan

bagimu (memakan) bangkai, darah, daging babi, (daging hewan) yang disembelih

atas nama selain Allah, yang tercekik, yang dipukul, yang jatuh, yang ditanduk, dan

yang diterkam binatang buas, kecuali yang sempat kamu menyembelihnya, dan

(diharamkan bagimu memakan hewan) yang disembelih untuk berhala." (QS. al-

Ma'idah [5]: 3).

Meskipun memiliki keragaman etnik dan geografi, setiap Muslim meyakini dan

mengikuti agama Islam. Segala sesuatu yang diharamkan dalam Islam berarti dilarang

dan tidak diizinkan dalam Islam (Riaz dan Chaudry, 2004). Sumber hukum Islam

yang paling utama yang menjadikan rujukan adalah Al-Quran. Namun, beberapa

ilmuan mempunyai upaya untuk menjelaskan atau justifikasi terkait pemahaman

keharaman babi dalam pandangan ilmiah (Riaz dan Chaudry, 2004).

Babi merupakan vektor patogenik cacing diantaranya Trichinella spiralis dan

Taenia solium untuk masuk ke dalam tubuh manusia. Infeksi yang disebabkan oleh

cacing tersebut berbahaya bagi kesehatan. Selain itu, komposisi asam lemak dari

lemak daging babi diketahui inkompatibel dengan lemak manusia dan sistem

biokimia (Awan, 1988; Hussaini dan Sakr, 1983; Sakr, 1993). Hal ini dapat

menimbulkan berbagai penyakit gangguan metabolisme seperti hiperkolesterolimia

yang dapat memicu penyakit kardiovaskular.

2.2 Sel

Semua organisme terdiri dari sel. Semua jaringan termasuk manusia

terorganisir dari kumpulan sel. Oleh karena itu, sel merupakan unit fundamental dari

6


kehidupan. Jika sel mati, jaringan juga akan mati dan tidak dapat berfungsi

(Chatterjea dan Shinde, 2012). Istilah sel pertama kali digunakan oleh Robert Hooke

pada tahun 1665, untuk menjelaskan struktur potongan tipis gabus di bawah

mikroskop. Setelah beberapa abad, istilah sel digunakan untuk menyatakan dasar

minimum suatu jasad hidup yang mampu melakukan perbanyakan sendiri (Yuwono,

2009).

Sel yang terdapat di alam dapat dibagi menjadi dua tipe yang secara struktural

berbeda yaitu sel prokariotik dan eukariotik. Sel prokariotik tidak memiliki nukleus

sehingga materi genetiknya (DNA) terkonsentrasi pada suatu daerah yang disebut

nukleoid tanpa membran nukleus yang membatasi daerah tersebut dengan organel

lainnya. Sedangkan sel eukariotik (gambar 2.1) memiliki nukleus sesungguhnya yang

dibungkus oleh membran nukleus (Chatterjea dan Shinde, 2012).

Gambar 2.1 Skema Representasi Sel Eukariotik dengan Organel Sel (Sumber:

Sherwood, 2010).

Semua sel tersusun atas komponen-komponen kimiawi utama yaitu protein,

asam nukleat, lemak, dan polisakarida. Asam nukleat merupakan suatu polimer

nukleotida yang berperan dalam penyimpanan serta pemindahan informasi genetik

7


dalam sel (Yuwono, 2009). Terdapat dua tipe asam nukleat dalam sel organisme yaitu

asam deoksiribonukleat atau DNA, dan asam ribonukleat atau RNA. Kedua asam

nukleat tersebut dapat dibedakan berdasarkan gula dan basa nitrogen penyusunnya

(Chatterjea dan Shinde, 2012). DNA yang terdapat pada nukleus disebut DNA

kromosomal, sedangkan DNA yang tidak terdapat di dalam sel dan di luar nukleus

yaitu DNA mitokondria, DNA kloroplas, DNA plasmid, ketiganya disebut DNA

ekstrakromosomal (Fatchiyah et al. 2011).

Baik DNA maupun RNA tersusun atas adenin, guanin, sitosin, tetapi timin

hanya ada pada DNA, sedangkan urasil hanya ada pada RNA. Pada DNA gulanya

adalah deoksiribosa, sedangkan pada RNA gulanya adalah ribosa. Perbedaan antara

kedua bentuk gula tersebut terletak pada atom karbon nomor 2 (Yuwono, 2009).

2.3 Deoxyribonucleic Acid (DNA)

2.3.1 Definisi DNA

Setiap sel hidup menyimpan informasi genetik dalam bentuk molekul DNA

Helix ganda-panjang, tidak bercabang, rantai polimer yang berpasangan, terbentuk

dari empat tipe monomer yang sama. Tiap rantai ini disebut sebagai DNA chain, atau

DNA strand. Rantai tersebut bersifat antiparalel terhadap rantai yang lain, dan ikatan

hidrogen antara basa dari nukleotida menghubungkan kedua rantai tersebut.

Monomer DNA disebut sebagai nukleotida, yang teridiri dari molekul gula pentosa

(deoksiribosa), gugus fosfat, dan basa nitrogen. Basa nitrogen tersebut dapat berupa

adenin (A), guanin (G), sitosin (C), atau timin (T) (gambar 2.2). Nukleotida-

nukleotida ini kemudian tersambung dengan ikatan kovalen antara gula dan fosfat

rantai punggung gula-fosfat dengan seri basa yang menonjol (gambar 2.3) (Albert et

al., 2015).

Adenin Guanin

8


Timin Sitosin

Gambar 2.2 Struktur Basa Nitrogen DNA (Sumber: Chatterjea dan Shinde, 2012).

Gambar 2.3 Struktur DNA Double Helix (Albert et al., 2015).

Ikatan antarnukleotida menghasilkan rantai DNA dengan polaritas kimia. Gula

sebagai block memiliki gugus fosfat pada posisi karbon 5’, gugus hidroksil pada

posisi karbon 3’, dan basa pada posisi karbon 1’. Hal ini menjadikan subunit DNA

memiliki orientasi yang sama. Polaritas rantai DNA diindikasikan oleh ujung-3’ dan

ujung-5’, turunan dari orientasi gula deoksiribosa (Albert et al., 2015). Struktur DNA

double helix terbentuk karena basa nitrogen masing-masing nukleotida dalam satu

9


rangkaian berpasangan dengan masing-masing nukleotida dalam rangkaian lainnya

melalui ikatan hidrogen (Gaffar, 2007). Basa dengan dua cincin (purin) berpasangan

dengan basa dengan tiga cincin (pirimidin): adenin (A) selalu berpasangan dengan

timin (T), dan guanin (G) dengan sitosin (C). Pasangan A dan T terbentuk dengan dua

ikatan hidrogen, sedangkan G dan C dengan tiga ikatan hidrogen (Albert et al., 2015).

2.3.2 Sifat Fisika DNA

Dua untai DNA double helix dapat dipisahkan atau dibuka selama proses

replikasi DNA, transkripsi RNA, dan rekombinasi genetik. Pemisahan untai ganda

DNA dapat dilakukan secara in vitro dan disebut denaturasi DNA. Denaturasi terjadi

ketika ikatan hidrogen antara basa-basa nitrogen terputus dan pasangan basa terpisah

ketika DNA diberi perlakuan dengan suhu leleh. Temperatur ketika DNA

terdenaturasi separuhnya disebut melting temperature (Tm DNA). Pada temperatur

ini, absorbansi DNA pada 260 nm meningkat menjadi 18,5%, yaitu separuh dari 37%

absorbansi DNA terdenaturasi sempurna. Fenomena ini disebut sebagai efek

hiperkromik (Chatterjea dan Rana, 2012).

Nilai Tm tergantung pada komposisi molekul DNA dan kondisi yang digunakan

untuk melakukan denaturasi. Jika DNA berada dalam larutan yang kurang lebih sama

dengan kondisi fisiologi sel, maka nilai Tm berkisar 85-95°C. Oleh karena itu, dalam

kondisi fisiologis sel yang normal molekul DNA bersifat stabil. Namun, ada beberapa

hal yang menentukan nilai Tm suatu molekul DNA (Yuwono, 2009).

Nilai Tm tergantung pada jumlah pasangan basa G-C karena ikatan G-C

mempunyai 3 ikatan hidrogen sehingga lebih stabil daripada A-T yang hanya

mempunyai dua ikatan hidorogen. Ketergantungan nilai Tm terhadap komposisi basa

bersifat linear, yaitu meningkat 0,4° untuk tiap persen peningkatan kandungan G-C.

Selain ditentukan oleh kandungan G-C, nilai Tm juga dipengaruhi oleh kondisi

denaturasi yaitu kekuatan ionik larutan. Nilai Tm meningkat 16,6° untuk tiap sepuluh

kali peningkatan konsentrasi kation monovalen. Namun, terdapat senyawa yang dapat

menurunkan nilai Tm yaitu urea dan formamide. Formamide dapat menurunkan nilai

Tm sampai sekitar 40°C. Urea dan formamide dapat membentuk ikatan hidrogen

10


dengan basa-basa DNA dan berkompetisi untuk membentuk pasangan (Yuwono,

2009).

Faktor lain yang dapat menyebabkan denaturasi DNA yaitu derajat keasaman

(pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dan perbandingan kandungan antara basa

nukleotida G-C terhadap A-T. Tingginya kandungan G-C akan memperlambat proses

denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan A-T akan menyebabkan pita DNA

mudah putus/patah (Fatchiyah et al. 2011).

Denaturasi DNA merupakan suatu proses yang dapat balik (reversible) dalam

kondisi yang sesuai. Proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan

terdenaturasi disebut renaturasi. Renaturasi dapat terjadi jika konsentrasi garam

(NaCl) di dalam suspensi DNA cukup tinggi yaitu 0,15-0,15 M. Ion Na+ yang bersifat

positif dapat menetralkan gugus fosfat DNA yang bermuatan negatif sehingga tidak

terjadi saling tolak-menolak antara untaian DNA yang satu dengan untaian DNA

yang lain. Suhu renaturasi juga harus cukup tinggi tetapi harus di bawah suhu

denaturasi, biasanya sekitar 20-25°C di bawah nilai Tm (Yuwono, 2009).

2.3.3 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan pusat produksi energi di dalam sel. Mitokondria

(gambar 2.4) biasanya terdapat dalam jumlah banyak didalam sel dan polimorfis, dan

bentuknya tergantung pada keseimbangan antara fusi dan fisi masing-masing

mitokondria (Herman, dan Shaw, 1998). Mitokondria merupakan tempat terjadinya

fosforilasi oksidatif yang penting untuk memproduksi ATP. ATP sangat penting

dalam berbagai fungsi biokimia. Mitokondria memiliki genom subselular organel

yang terpisah dari kromatin nuklear, disebut DNA mitokondria (mtDNA), yang

sangat umum digunakan dalam studi filogenetik molekular (Moritz et al., 1987).

Molekul DNA mitokondria (mtDNA) berukuran lebih kecil daripada kromosom

nuklear. Pada sel hewan, mtDNA berukuran lebih kecil dari 20000 bp (16596 bp ada

manusia) dan merupakan dupleks yang sirkular. Tiap mitokondrion biasanya

memiliki 2 hingga 10 kopi molekul mtDNA, dan jumlahnya dapat meningkat hingga

ratusan ketika sel mengalami diferensiasi pada masa embrio (Nelson dan Cox, 2005).

11


Gambar 2.4 Mitokondrion. Beberapa protein mitokondrial dan RNA dikode oleh

salah satu dari kopi DNA mitokondria (Sumber: Nelson dan Cox, 2005).

Gambar 2.5 Struktur DNA Mitokondria pada Manusia (Sumber: Passarge, 2007).

Umumnya, mtDNA hewan memiliki jenis gen yang sama yaitu mengandung 13

gen yang mengkode protein fosforilasi (URF1, URF2, URF3, URF4, URF5, URF6,

URFA6L, URF4L, Cytochrome oxidase unit I, Cytochrome oxidase unit II,

Cytochrome oxidase unit III, Cytochromeb, dan ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA

yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; dan 22 gen pengkode tRNA yang diperlukan untuk

translasi protein yang dikode oleh mtDNA (Keddie et al., 1998; Solihin, 1994).

12


Sejumlah gen mtDNA digunakan sebagai target untuk mendeteksi atau

mengisolasi spesies hewan yang berbeda dalam bentuk daging. Beberapa hal yang

mendukung penggunaan mtDNA sebagai target untuk analisis dibandingkan DNA

nukleus yaitu mtDNA memiliki ribuan kopi per sel dan memiliki beberapa titik

mutasi yang membedakan spesies yang berdekatan. DNA mitokondria merupakan

warisan maternal dan oleh karena itu bebas dari heterozigositas (Lockley and

Bardsley, 2000).

2.3.4 Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA.

DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada

mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah

laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan

dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Pada saat

melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan didapatkan DNA dalam

bentuk rantai yang panjang (Fatchiyah et al. 2011).

Tahap pertama isolasi DNA yaitu proses pengeluaran DNA dari nukleus,

mitokondria, maupun organel lain dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya

dilakukan dengan penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA

rusak. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang

murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamilalkohol (Fatchiyah et al.

2011).

Tahap berikutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau

kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain

termasuk debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. Kontaminan yang biasa

ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses lanjutan

seperti PCR, di mana terjadi hambatan aktivitas Taq polimerase, atau kontaminan

lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA secara

kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga

tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi (Fatchiyah et al. 2011).

13


Tahap berikutnya adalah proses presipitasi DNA dengan menggunakan etanol

absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut dalam etanol

dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap

dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain (Fatchiyah et al. 2011).

2.3.5 Uji Kuantitatif DNA

Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis (gambar 2.6) merupakan

salah satu spektrofotometer UV-Vis yang mempunyai teknologi nano, DNA yang

murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena adanya basa purin dan basa

pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada panjang gelombang 260

nm, sedangkan kontaminan protein atau fenol akan menyerap cahaya pada 280 nm,

sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm

dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA

berkisar 1,8-2,0. Untuk mengukur konsentrasi DNA, digunakan rumus sebagai

berikut (Fatchiyah et al. 2011).

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

Keterangan

Å260 = nilai absorbansi pada 260 nm

50 = larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 µg untai ganda

DNA per ml.

Gambar 2.6 Nanospektrofotometer (Sumber: Fatchiyah et al. 2011).

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi polymerase atau dikenal sebagai polymerase chain reaction (PCR),

merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk mengamplifikasi nukleotida secara

14


in vitro. Metode PCR dapat dapat meningkatkan jumlah urutan DNA sebanyak ribuan

bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa

nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap n siklus

PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan

PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target

dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target (Fatchiyah et al. 2011).

2.4.1 Komponen PCR

Pada reaksi PCR diperlukan cetakan DNA, primer spesifik, enzim DNA

polimerase yang termostabil, bufer PCR, ion Mg2+, dan gene cycler (Fatchiyah et al.

2011).

a. Cetakan DNA

Ukuran target amplifikasi DNA biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp)

atau 1 kB. Hasil amplifikasi yang efisien adalah antara 100-400 bp. Walaupun

kemungkinan hasil amplifikasi lebih dari 1 kB, tetapi prosesnya kurang efisien,

karena produk yang panjang rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja

enzim DNA polimerase, dan waktu yang diperlukan lebih lama. Hal ini dapat

menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan (Fatchiyah et al. 2011).

Kemurnian DNA target sangat penting, karena ketidakmurnian suspensi DNA

dapat mempengaruhi reaksi amplifikasi dan dapat menghambat kerja enzim DNA

polimerase. Namun, pada kondisi tertentu, amplifikasi PCR masih dapat bekerja

dalam suspensi kasar. Pemilihan target yang akan diamplifikasi perlu memperhatikan

kestabilan genetik dari daerah/urutan nukleotida yang ditargetkan. Perubahan atau

hilangnya sebagian urutan target akan berakibat pada hilangnya reaktivitas. Elemen

genetik bisa hilang saat isolasi atau pemindahan serial. Sebaiknya amplifikasi segera

dilakukan setelah isolasi DNA telah selesai (Fatchiyah et al. 2011).

b. Primer

15


Primer disusun dari urutan nukleotida yang dapat didownload dari pusat

GeneBank, dan dapat disintesis berdasarkan susunan nukleotida yang sudah tersusun

dan telah ditentukan. Ketentuan penyusunan primer adalah primer disusun dari urutan

nukleotida sepanjang 15-32 bp pada ujung-5’ pita DNA cetakan maupun

komplemennya (Fatchiyah et al. 2011).

Suhu annealing sangat tergantung pada primer dengan Tm tertentu. Penentuan

formula primer ditentukan secara teoritikal oleh Tm asam nukleat sebagai berikut.

Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)

TA* = Tm - 5°C

Keterangan:

Tm = mealtingtemperature (°C)

* Suhu annealing yang digunakan biasanya 5°C dibawah Tm (Muladno, 2010).

c. Taq DNA Polimerase

Enzim ini bersifat termostabil dan diisolasi dari Thermos aquaticus. Aktivitas

polimerisasi DNA dari ujung-5’ ke ujung-3’, dan aktivitas enzimatik ini mempunyai

waktu paruh sekitar 40 menit pada suhu 95°C. Biasanya untuk setiap 100 µl volume

reaksi, ditambahkan 2,0-2,5 unit Taq polimerase. Penggunaan enzim ini harus

memperhatikan proses penyimpanan (selalu di freezer pada suhu -20°C), dan pada

saat pengambilan tidak boleh terlalu lama dalam suhu ruang, usahakan selalu dalam

kotak berisi water-ice agar suhu tetap 4°C. Hal ini dilakukan untuk meminimalkan

kerusakan enzim yang mungkin terjadi akibat pengaruh perubahan suhu (Fatchiyah et

al. 2011).

d. Bufer PCR dan Konsentrasi Mg2+

Bufer standar untuk PCR terdiri atas 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 8,3), dan

1,5 mM MgCl2. Bufer standar ini bekerja dengan baik untuk cetakan DNA dan

primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimal dengan kombinasi yang

lain.

16


Konsentrasi ion magnesium dalam bufer PCR merupakan faktor yang sangat

kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, suhu

disosiasi untai cetakan DNA, dan produk PCR. Konsentrasi optimal ion magnesium

sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi cetakan DNA yang tidak mengandung

konsentrasi agen pengkhelat yang tinggi, seperti EDTA atau fosfat. Ion Mg2+ bebas

yang terlalu rendah atau tidak ada, biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR,

sedangkan bila terlalu banyak akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.

e. Nukleotida (dNTP)

Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 µM. Pada

konsentrasi ini, penting untuk mengatur konsentrasi keempat dNTP pada titik

estimasi Km yaitu untuk setiap dNTP 50 mM, harus selalu diatur pH 7,0. Konsentrasi

yang tinggi akan menimbulkan ketidakseimbangan dengan enzim polimerase,

sedangkan pada konsentrasi rendah akan memberikan ketepatan dan spesifisitas yang

tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan

tidak akan mengubah secara bebas.

f. PCR Gene Cycler

PCR gene cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer

sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi sebagai macam tipe alat

PCR gene cycler dari berbagai perusahaan. Walaupun nama alat berbeda, tetapi

prinsip kerjanya sama.

Alat ini secara tepat meregulasi suhu dan siklus waktu yang dibutuhkan untuk

reprodusibilitas dan keakuratan reaksi amplifikasi. Siklus PCR terbagi atas tiga

langkah utama, yaitu denaturasi DNA (92-95°C, selama 30-60 detik), primer

annealing (50-62°C, selama 30-60 detik), dan ekstensi (70-72°C, selama 30-120

detik). Siklus ini berulang 30-35 kali. Siklus utama ini diawali terlebih dahulu dengan

denaturasi awal, misalnya 94°C selama 5 menit. Langkah ini dilakukan untuk

memaksimalkan proses denaturasi tidak sempurna akan menyebabkan kegagalan

17


proses PCR. Setelah siklus utama berakhir, maka ditambah program ekstensi final

dengan suhu 70-72°C, selama 7-10 menit.

2.4.2 Tahapan PCR

Proses PCR merupakan siklus yang berulang meliputi denaturasi, annealing,

dan ekstensi oleh enzim DNA polimerase (gambar 2.7). Sepasang primer

oligonukleotida yang spesifik digunakan untuk membuat hibrid dengan ujung-5’

menuju ujung-3’ untai DNA target dan mengamplifikasi untuk urutan yang

diinginkan (Fatchiyah et al. 2011).

a. Denaturasi

Denaturasi untai ganda DNA merupakan langkah yang kritis selama proses

PCR. Suhu yang tinggi pada awal proses menyebabkan pemisahan untai ganda DNA

menjadi dua untai cetakan DNA tunggal. Suhu pada tahap denaturasi adalah 92-95°C

selama 30-60 detik, dengan suhu 94°C merupakan pilihan standar (Fatchiyah et al.

2011).

b. Annealing

Pada langkah ini, terjadi proses pengenalan/penempelan primer cetakan DNA,

suhu annealing ditentukan oleh susunan primer. Optimalisasi suhu annealing dimulai

dengan menghitung melting temperature (Tm) dari ikatan primer dan cetakan DNA,

sedangkan suhu annealing (TA) adalah 5°C lebih kecil dari Tm primer yang

sebenarnya. Amplifikasi akan lebih efisien apabila suhu annealing tidak kurang dari

37°C agar tidak terjadi mispriming. Oleh karena itu, pada suhu sekitar 55°C akan

dihasilkan amplifikasi produk yang mempunyai spesifisitas yang tinggi. Primer ini

akan menempel pada urutan nukleotida yang sesuai dengan urutan primer itu sendiri,

dan menempel pada suhu posisi ujung-5’ dari untai DNA target yang telahterurai

pada proses sebelumnya (Fatchiyah et al. 2011).

c. Ekstensi

18


Pada langkah ini, terjadi proses polimerisasi untuk pembentukan untai DNA

baru, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA

target yang akan bergerak dari ujung-5’ menuju ujung-3’ dari untai tunggal DNA.

Waktu yang dibutuhkan tergantung panjang pendeknya ukuran DNA yang

digandakan sebagai produk amplifikasi. Pada setiap satu kilobase (1000 bp) yang

akan diamplifikasi diperlukan waktu 1 menit; bila kurang dari 500 bp, hanya

diperlukan waktu 30 detik; dan pada kisaran 500 tetapi kurang dari 1 kb, akan

memerlukan waktu 2 menit di setiap siklusnya. Adapun suhu ekstensi yaitu 70-72°C

(Fatchiyah et al. 2011).

Gambar 2.7 Tahapan PCR (Sumber: Chatterjea dan Shinde, 2012).

Ketiga tahapan tersebut terjadi dalam satu siklus. Setelah tiap siklus, strand

DNA baru yang telah disintesis menjadi template dalam siklus berikutnya seperti

yang terlihat pada gambar 2.8. Produk mayor dari reaksi eksponensial ini adalah

19


segmen dari doble-stranded DNA yang ujungnya berupa ujung-5’ dari dua primer

dan panjangnya merupakan jarak antarprimer. Setelah amplifikasi, jumlah kopi akhir

target sequence yaitu dinyatakan dalam rumus berikut:

di mana n merupakan jumlah siklus, 2n merupakan produk pertama yang dihasilkan

setelah siklus pertama dan produk kedua dihasilkan setelah siklus kedua dengan

panjang yang tak ditentukan batasnya dan x adalah jumlah kopi dari original

template. Biasanya, setelah siklus 30 PCR akan menjadi sekitar 230 kali amplifikasi,

diasumsikan efisiensi 100% selama tiap siklus. Efisien PCR akan bervariasi dari

template ke template dan sesuai dengan optimasi yang dilakukan (Lazaro dan

Hernandez, 2013).

Gambar 2.8 Amplifikasi Eksponensial DNA pada PCR (Sumber: Lazaro dan

Hernandez, 2013).

2.5 Real-time PCR

Real-time PCR memiliki beberapa kelebihan dibandingkan dengan metode PCR

konvensional, di antaranya lebih cepat, tingkat kontaminasi lebih rendah, lebih

sensitif, spesifisitas tinggi, dan standardisasi lebih mudah. Real-time PCR digunakan

(2n-2n)x

20


untuk uji kuantitatif RT-PCR yang dikombinasikan dengan perlengkapan yang relatif

dan kompetitif RT-PCR sehingga akurat, presisi, dan relatif mudah digunakan. Real-

time PCR secara otomomatis melakukan amplifikasi produk reaksi untuk tiap sampel

dalam setiap siklus. Data analisis berupa standard curve generation dan kalkulasi

jumlah kopi, yang ditampilkan secara otomatis (Chatterjea dan Shinde, 2012).

Umumnya, real-time PCR didasarkan pada deteksi fluoresens yang dihasilkan

oleh molekul reporter yang mengikat double-strand DNA yang meningkat sebagai

hasil reaksi. (Garrido et al., 2009). Sinyal fluoresens akan meningkat seiring dengan

bertambahnya amplifikasi DNA PCR dalam reaksi. Reaksi selama fase eksponensial

dapat dipantau dengan mencatat jumlah emisi fluoresens pada setiap siklus.

Peningkatan hasil amplifikasi PCR pada fase eksponensial berhubungan dengan

jumlah inisiasi target gen. Makin tinggi tingkat ekspresi target gen maka deteksi

emisi fluoresens makin cepat terjadi (Pardal, 2010).

Kuantitas urutan DNA target dicapai dengan menentukan jumlah siklus

amplifikasi. Jumlah siklus amplifikasi diperlukan untuk menghasilkan produk PCR

berdasarkan fluoresensi di awal fase eksponensial PCR serta untuk melewati garis

ambang fluoresensi/siklus threshold (Ct). Jumlah siklus yang diperlukan untuk

mencapai ambang batas disebut Ct. Siklus Ct adalah prinsip dasar dari real-time PCR

dan sebagai bagian yang sangat penting untuk memperoleh data yang akurat. Nilai Ct

real-time PCR sangat berkorelasi dengan kuantitas urutan DNA target (Giglio et al.

2003).

Kurva amplifikasi pada real-time PCR terdiri dari tiga fase yang berbeda

(gambar 2.9). Fase pertama disebut fase inisiasi, yang terjadi selama siklus PCR

pertama ketika pancaran fluoresens tidak bisa dibedakan dari baseline. Selama fase

eksponensial atau fase log, terjadi peningkatan eksponensial fluoresens, sebelum fase

plateau tercapai. Pada fase terakhir, reagen telah berhenti bereaksi, dan tidak ada

peningkatan fluoresens yang teramati. Hanya pada fase eksponensial memungkinkan

untuk kuantifikasi (Lazaro dan Hernandez, 2013).

Terdapat dua metode umum untuk menganalisis produk dalam real-time PCR,

yaitu: pertama, pewarna fluoresens non-spesifik yang berinterkalasi dengan double-

21


stranded DNA, contoh pewarna metode ini yaitu SYBR Green Dye; dan kedua, probe

sequence-specific DNA yang terdiri dari oligonukleotida yang dilabeli dengan

reporter fluoresens yang mendeteksi hanya setelah hibridisasi probe dengan sequence

komplementer, contohnya yaitu TaqMan Probe. Umumnya, metode sequence specific

memiliki tingkat spesifisitas yang lebih tinggi (Pelosi et al., 2013).

Saat ini, terdapat telah metode Universal ProbeLibrary, yaitu metode yang

didasarkan pada hanya 165 short hydrolysis probe yang dilabeli pada ujung-5’

dengan fluorescein (FAM) dan pada ujung-3’ dengan dark quencher dye. Luas

cakupan trankrip UPL probe yaitu hanya 8-9 nukleotida dan sequence yang telah

dipilih. Untuk menjaga spesifisitas dan Tm proses hibridisasi real-time PCR probe

memerlukan locked nucleic acids (LNA) yang ternkoporasi ke dalam sequence tiap

UPL probe. LNA merupakan analog DNA nukleotida dengan kekuatan binding lebih

tinggi dibandingkan DNA nukleotida standar (Roche, 2009).

Gambar 2.9 Fase Kurva Amplifikasi PCR. Merah: kurva amplifikasi sampel positif.

Biru: threshold. Hitam: baseline. (Sumber: Lazaro dan Hernandez, 2013).


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kimia Analisis Obat, Laboratorium

Kimia Analisis Pangan dan Obat Halal, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium

Biologi, dan Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran dan Imu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.1.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Februari 2017 hingga Juli 2017.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real-time PCR (LightCycler® 480-Roche); multiwell plate 96 (Roche);

collection tube 1,5 ml; spektrofotometer UV DNA (DeNovix®); timbangan analitik;

mikrotips 10 µl, 200 µl, dan 1000 µl (Genfollower); mikropipet 0,5-10 µl (1660550-

Biorad); mikropipet 20-200 µl (Biorad); mikropipet 100-1000 µl (1660553-Biorad);

PCR tube dan microcentrifuge tube volume 1,5 µl (Biogenix); microcentrifuge

(Wiggenhauser); vortex (Wiggenhauser); filter tube; pisau steril; aluminium foil;

autoklaf ; blender; dan alat gelas (Pyrex).

3.2.2 Bahan

Daging kambing segar dan daging babi segar; satu set Genomic DNA

Purification Kit (Wizard®-Promega) (meliputi; Nucleic Lysis Solution, RNase,

Protein Precipitation Solution, DNA Rehidration Solution); LC 480 Probe Master

(terdiri dari: Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP mix, MgCl2 6,4 mM); aqua

bidest (IKA Pharmindo); isopropanol dan etanol 70% (Merck); primer (Macrogen®)

23


dan UPL (Roche®) babi seperti yang digunakan Vesty (2017), sedangkan primer

(Macrogen®) dan UPL (Roche®) diperoleh dari software ProbeFinder (tabel 3.1).

Tabel 3.1 Primer (Macrogen®) dan UPL (Roche®)

Nama Primer Urutan Basa

Kambing Forward 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’

Reverse 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’

UPL 5’-(FAM)-CAGCCACC-3’

Babi Forward 5’-TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG-3’

Reverse 5’-TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT-3’

UPL 5’-(FAM)-GACCCAGA-3’

3.3 Alur Kerja

a. Preparasi sampel

b. Isolasi DNA

c. Analisis isolat DNA

d. Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI

e. Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Preparasi Sampel

Masing-masing daging segar dipotong halus dengan pisau steril yang berbeda

untuk tiap sampel. Kemudian sampel diblender satu per satu hingga sangat halus,

setiap selesai diblender, blender dicuci bersih untuk menghindari kontaminasi.

Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 20 mg dan dimasukkan dalam tube.

3.4.2 Isolasi DNA

DNA diisolasi menggunakan Wizard® Genomic DNA Purification Kit

(Promega). Metode isolasi DNA mengikuti metode Vesty (2017).

24


a. Pelisisan Sel

Sampel sebanyak 20 mg ditambahkan 600 µl Nucleic Lysis Solution.

Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi pada suhu 65°C selama 30 menit.

b. Pemisahan RNA dan Presipitasi Protein

Campuran yang telah diinkubasi ditambahkan 3 µl RNase Solution dan

dihomogenkan serta diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Campuran tersebut

ditambahkan 200 µl Protein Precipitation Solution dan divortex, kemudian

didiamkan dalam ice selama 5 menit lalu disentrifugasi pada 13.000×g selama 4

menit.

c. Presipitasi dan Rehidrasi DNA

Supernatan dipindahkan ke dalam tube yang mengandung 600 µl isopropanol

pada suhu ruang dan dihomogenkan. Campuran dihomogenkan dan disentrifugasi

pada 13.000×g selama 1 menit. Supernatan dihilangkan dan ditambahkan 600 µl

etanol 70% lalu dihomogenkan. Campuran disentrifugasi pada 13.000×g selama 1

menit. Etanol dihilangkan dan pellet dibiarkan kering selama 15 menit. DNA

direhidrasi dalam 100 µl DNA Rehydration Solution selama 1 jam pada suhu 65°C.

3.4.3 Analisisis Isolat DNA

Isolat DNA dianalisis menggunakan spektrofotometer UV DNA (DeNovix®)

untuk mengetahui kuantitas dan kemurnian isolat DNA. Isolat DNA diukur sesuai

protokol dari (DeNovix®) dengan cara pada layar spektrofotometer UV DNA

(DeNovix®) dipilih Nucleic Acid. Sample port dibersihkan dengan tisu steril.

Sebanyak 1 µl DNA Rehydration Solution sebagai blanko diteteskan pada sample

port. Sample port dibersihkan dengan tisu steril. Sampel isolat sebanyak 1 µl

diteteskan ke bagian sample port dan ditekan tombol measure. Kemudian akan

muncul data kemurnian dan kuantitas DNA.

3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI

25


Uji spesifisitas dilakukan dengan Database NCBI dipilih menu BLAST. Pada

halaman BLAST dipilih menu nucleotide blast. Kemudian data urutan primer yang

diuji dimasukkan dalam kolom Enter Query Squence. Selanjutnya, diklik tombol

BLAST.

3.4.5 Amplifikasi DNA Menggunakan Real-time PCR

a. Pembuatan Primer 50 µM dari Larutan Induk 100 µM

Larutan induk primer dengan konsentrasi 100 µM masing-masing dipipet

sebanyak 50 µl dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube volume 1,5 ml.

Selanjutnya, ke dalam masing-masing tube ditambahkan 50 µl aquabidest. Larutan

dihomogenkan dengan menaik-turunkan pegas pada mikropipet.

b. Pembuatan Primer 5 µM dari Larutan Induk 50 µM

Larutan induk primer dengan konsentrasi 50 µM masing-masing dipipet

sebanyak 3 µl dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube volume 1,5 ml.

Selanjutnya, ke dalam masing-masing tube ditambahkan 27 µl aquabidest. Larutan

dihomogenkan dengan menaik-turunkan pegas pada mikropipet.

c. Pembuatan Universal ProbeLybrary Master Mix

Semua proses pencampuran dan pemipetan dilakukan dalam ruang gelap.

Volume total master mix yang dibuat sesuai dengan penelitian Vesty (2017). Master

mix dibuat dengan volume total 20 µl yang terdiri dari 5 µl DNA sampel; 3,8 µl

aquabidest; 0,4 µl primer forward 10 µM; 0,4 µl primer reverse 10 µM; 0,4 µl UPL

10 µM; dan 10 µl LightCycler® 480 probe master (enzim Taq DNA Polymerase,

dNTPmix, dan 6,4 mM MgCl2).

d. Loading Sampel dan UPL Master Mix (Roche, 2009)

Sebanyak 5 µl DNA sampel dan 15 µl master mix dipipet kemudian

dimasukkan ke dalam multiwell plate. Selanjutnya campuran dihomogenkan dengan

menaik-turunkan pegas mikropipet dan ditutup dengan sealing foil.

26


e. Amplifikasi Real-time PCR

Program LyghtCycler® 480 Real-time PCR yang akan digunakan dipilih

Program Dual Color Hydrolysis Probe-UPL Probe 96-II seperti yang tertera pada

tabel 3.2.

Tabel 3.2 Pengaturan Program Amplifikasi Real-time PCR


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini merupakan analisis kualitatif untuk mengautentifikasi daging

kambing terhadap cemaran daging babi menggunakan real-time PCR. Dengan adanya

produk amplifikasi sebelum batas siklus amplifikasi yang telah ditentukan, dapat

dikatakan sampel positif mengandung DNA kambing atau DNA babi sesuai dengan

primer yang digunakan.

4.1 Analisis Isolat DNA

Prosedur isolasi DNA yang diharapkan adalah dapat menghasilkan DNA yang

memiliki kuantitas dan kualitas yang tinggi serta semurni mungkin untuk amplifikasi

dengan waktu pengerjaan yang efisien. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan

isolasi DNA menggunakan kit komersial. Keunggulan dari metode ini adalah

sederhana serta efisien baik tempat maupun waktu. Metode ini memiliki reagen yang

lengkap dan tidak membutuhkan banyak pelarut.

Prinsip isolasi DNA dengan kit komersial ini sama dengan isolasi DNA secara

umum. Tahapan isolasi DNA yaitu pengeluaran DNA dari nukleus dan mitokondria

dengan cara dilisiskan kemudian DNA dipisahkan dari kontaminan lain (Fatchiyah et

al., 2011). Pelisisan tersebut dilakukan dengan penambahan bufer lisis yaitu Nucleic

Lysis Solution berisi senyawa kimia yang dapat merusak integritas barier dinding sel.

Senyawa kimia tersebut antara lain EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid), Tris

HCl, NaCl (Natrium Klorida), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) (Fatchiyah et al.,

2011; Utami et al., 2012).

EDTA berfungsi untuk melindungi DNA dari aktivitas endogenous nuclease

karena EDTA merupakan agen pengkhelat ion yang diperlukan sebagai kofaktor

sebagian besar nuclease dengan cara mengikat kation divalen (Muladno, 2010).

Sedangkan SDS merupakan deterjen kationik yang dapat melarutkan komponen lipid

dan merusak struktur sekunder dan tersier protein yang terdapat pada membran sel

(Kesmen et al., 2009).

28


Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau

kontaminan yang tidak diinginkan seperti RNA, protein, polisakarida, dan lipid.

Reagen yang digunakan untuk menghilangkan RNA adalah enzim RNase yang dapat

mendegradasi RNA tanpa merusak struktur DNA (Fatchiyah et al., 2011). Sedangkan

untuk mengendapkan protein ditambahkan Protein Precipitation Solution (PPS). PPS

biasanya mengandung garam berkonsentrasi tinggi seperti 0,25 M natrium asetat atau

0,1 M natrium klorida, ammonium asetat, ammonium sulfat; pelarut organik seperti

fenol, kloroform atau isoamil alkohol (Fatchiyah et al., 2011).

Proses presipitasi protein dengan penambahan garam dengan konsentrasi yang

tinggi mengakibatkan kelarutan protein akan turun dan mengendap jika konsentrasi

garam jenuh. Mekanisme ini dinamakan salting-out. Pada konsentrasi tinggi,

kekuatan ionik garam semakin kuat sehingga garam lebih dapat mengikat molekul

air. Dengan demikian, tidak cukup banyak air yang terikat pada protein sehingga gaya

tarik-menarik antarprotein lebih menonjol daripada antar air dan protein (Fatchiyah et

al., 2011). Sedangkan ketika ditambahkan pelarut organik, molekul air yang terikat

dengan protein berkurang, dan terjadi presipitasi protein. Pelarut organik mengurangi

konstanta dielektrik medium yang memicu presipitasi protein (Vasudevan et al.,

2011).

Pemisahan DNA dari presipitat protein yaitu dengan sentrifugasi (Fatchiyah et

al., 2011). Prinsip sentrifugasi didasarkan pada fenomena bahwa partikel yang

tersuspensi di dalam suatu wadah akan mengendap ke dasar suatu wadah karena

pengaruh gravitasi (Yuwono, 2009). Presipitat protein dibuang dan diambil bagian

supernatan.

Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA

dengan menggunakan isopropanol. Alternatif lain, yaitu dengan penambahan etanol

absolut. Isopropanol kurang polar dibandingkan etanol absolut sehingga separuh

volume isopropanol menghasilkan efisiensi presipitasi yang sama dengan etanol

absolut. Hal ini membantu untuk proses pengerjaan dengan volume sampel yang

banyak (Madhad dan Sentheil, 2014). DNA tidak larut dalam etanol maupun

isopropanol sehingga akan terjadi presipitasi DNA (Madhad dan Sentheil, 2014).

29


Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan mengendap dan

terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain (Fatchiyah et al., 2011). Beberapa

garam dan molekul kecil kurang larut dengan isopropanol sehingga perlu dilakukan

pencucian kembali dengan etanol 70% (Ausubel, 2003). Kemudian dilakukan

pencucian kembali DNA yang diperoleh dengan penambahan etanol 70%. Pelet DNA

dikeringkan dan diresuspensi dengan DNA Rehydration Solution yang mengandung

Tris HCl dan EDTA.

Isolat DNA yang diperoleh dianalisis menggunakan spektrofotometri UV DNA

pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. DNA dapat menyerap cahaya UV pada

260 nm, sedangkan kontaminan protein akan menyerap cahaya pada 280 nm. Oleh

karena itu, kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm

dibagi 280 nm (Å260/Å280) dan nilai kemurnian DNA berkisar 1,8-2,0 (Fatchiyah et

al., 2011).

Tabel 4.1 Isolat DNA

No. Sampel Daging Konsentrasi

(ng/µl)

Kemurnian

(Å260/Å280) Kambing Babi

Kontrol

1 100% - 22,53 1,70

2 - 100% 6,36 1,75

Simulasi A

3 100% - 19,32 1,60

4 50% 50% 25,26 1,54

5 10% 90% 11,25 2,02

6 1% 99% 13,78 1,88

7 0,5% 99,5% 9,28 1,97

8 0,1% 99,9 11,67 1,80

Simulasi B

9 - 100% 10,86 1,96

10 50% 50% 25,26 1,54

11 90% 10% 21,25 1,50

12 99% 1% 35,26 1,80

13 99,5% 0,5% 14,11 1,61

14 99,9 0,1% 30,08 1,67

30


Pengukuran kemurnian DNA (tabel 4.1) menunjukkan bahwa DNA yang

dihasilkan dari metode kit komersial masih terdapat pengotor lain ditunjukkan oleh

nilai rasio Å260/Å280 di bawah 1,8. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh adanya

kontaminan protein karena kurangnya proses pencucian menggunakan isopropanol

(Akhmad, 2016). Isopropanol dapat meningkatkan kemurnian DNA dengan

mengoptimalkan proses pembuangan residu protein (Bettelheim et al., 2013). Namun,

isolat DNA yang memiliki kemurnian di atas 1,0 masih dapat diterima dan dapat

dilanjutkan ke proses amplifikasi pada real-time PCR (Kusumadewi et al., 2012).

Kadar isolat DNA terendah yang diperoleh 6,36 ng/µl. Konsentrasi isolat yang

rendah kemungkinan dikarenakan sampel yang digunakan berupa jaringan sehingga

DNA relatif lebih sulit diisolasi daripada DNA dari sampel cairan tubuh. Selain itu,

elemen genetik ini bisa hilang saat proses isolasi atau pemindahan serial (Fatchiyah et

al., 2011). Namun, konsentrasi isolat DNA tersebut masih dapat dilanjutkan hingga

ke tahap amplifikasi DNA pada real-time PCR. Hal ini dikarenakan real-time PCR

cukup sensitif dan dapat mendeteksi sampai dengan kadar 1 pg (Cai et al., 2011).

Pada kelompok simulasi A, campuran daging yang memiliki konsentrasi DNA

dari yang terbesar hingga yang terkecil berturut-turut yaitu daging kambing 50% >

100% > 1% > 0,1% > 10% > 0,5%. Sedangkan kelompok simulasi B yaitu daging

babi 1% > 0,1% > 50% > 10% > 0,5% > 100%. Masing-masing suspensi DNA

tersebut terdapat DNA kambing dan babi sehingga perbedaan konsentrasi tersebut

kemungkinan dapat mempengaruhi hasil amplifikasi DNA.

4.2 Analisis Uji Spesifisitas Primer

Penelitian ini mengunakan dua pasang primer yang berbeda. Masing-masing

primer dianalisis menggunakan Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) dan

ditentukan data spesies yang memiliki kecocokan 100% terhadap urutan sekuens

primer yang dianalisis (lampiran 5). Primer kambing yang digunakan didesain dengan

menggunakan software ProbeFinder (Roche®), sedangkan primer babi seperti yang

digunakan pada penelitian Vesty (2017), masing-masing dengan target gen DNA

mitokondria.

31


Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtDNA sebagai target untuk

analisis dibandingkan DNA nukleus yaitu mtDNA memiliki ribuan kopi per sel dan

memiliki beberapa titik mutasi yang membedakan spesies yang berdekatan (Lockley

and Bardsley, 2000). Kecepatan mutasi yang sangat tinggi dari DNA mitokondria

(sepuluh kali lebih besar daripada DNA nukleus) membantu titik mutasi untuk

terakumulasi dengan sangat cepat, sehingga menghasilkan diskrimanasi presisi yang

lebih tepat (DiPinto et al., 2005).

Primer kambing yang digunakan yaitu untuk mengamplifikasi gen DNA

mitokondria daerah 12S rRNA. Gen 12S rRNA mengkode protein esensial

mitokondria sebagai rRNA yang diperlukan dalam translasi intramitokondria

(Andrews et al., 1999; Foury et al., 1998; dalam Legros et al., 2004). Desain primer

spesifik untuk gen mitokondria daerah 12S rRNA telah berhasil digunakan untuk

membedakan antara DNA daging kambing dan domba menggunakan PCR

konvensional dengan sensitivitas tinggi (Saderi et al., 2013). Hasil BLAST

menunjukkan bahwa kedua primer kambing yang digunakan memiliki kecocokan

100% dari primer forward dan reverse untuk kambing (Capra hircus) saja tidak

terhadap babi (Sus scrofa). Demikian pula primer babi forward dan reverse memiliki

kecocokan 100% untuk babi saja tidak terhadap kambing.

4.3 Amplifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing dan Babi pada Real-

time PCR

Amplifikasi DNA dilakukan terhadap daging kambing, daging babi, dan

simulasi campuran antara daging kambing dan babi, menggunakan real-time PCR

dengan UPL probe. UPL probe diketahui telah berhasil digunakan dalam berbagai

studi qPCR (Segawa et al., 2013). UPL probe hanya terdiri 8-9 nukleotida dengan

dilabeli pewarna fluoresens (FAM) pada ujung 5’ dan quencher pada ujung 3’. UPL

probe memiliki fleksibelitas, ketersediaan, dan penerimaan yang sama seperti SYBR

Green, serta memiliki spesifisitas seperti Hydrolysis Probe (Roche®, 2009). UPL

probe mudah dirancang TaqMan real-time PCR assay sehingga dapat dilakukan

32


running pada kondisi PCR yang identik yang esensial untuk analisis real-time PCR

(Ishii, Satoshi et al., 2013).

Konsentrasi akhir UPL probe yang digunakan pada penelitian ini yaitu 0,2 µM

sesuai dengan rentang konsentrasi yang cocok untuk Hydrolysis Probe yaitu 0,05-0,2

µM. Konsentrasi probe optimal merupakan konsentrasi terendah yang menghasilkan

CP terendah dan fluoresens adekuat untuk konsentrasi target yang digunakan

(Roche®, 2009). Sedangkan konsentrasi akhir primer yang digunakan yaitu 0,1 µM,

masih dalam rentang konsentrasi primer yang direkomendasikan yaitu 0,05-0,3 µM

(Lazaro dan Hernandez, 2013). Hal ini sesuai didasarkan pada hasil optimasi Vesty

(2017).

Konsentrasi primer yang lebih tinggi dapat memicu terjadinya mispriming,

primer-dimer, dan terakumulasinya produk non-spesifik, sedangkan konsentrasi yang

terlalu rendah dapat mengakibatkan primer exhaustion (Lazaro dan Hernandez,

2013). Primer-dimer merupakan proses saling berikatannya primer yang

teramplifikasi dan terkuantifikasi sehingga menghasilkan data false-positive (Pestana

et al., 2010). Sedangkan mispriming adalah penempelan primer diluar sekuens DNA

target (Izzah, 2014). Munculnya primer-dimer dan produk non-spesifik dapat

dikurangi dengan optimasi kondisi running (Altshuler, 2006).

Analisis kurva amplifikasi dilakukan terhadap nilai CP (crossing point, siklus

PCR) yaitu siklus di mana fluoresens mencapai threshold. Hal ini berhubungan

dengan siklus di mana terjadi peningkatan fluoresens yang signifikan secara statistik

yang pertama kali terdeksi. Oleh karena itu, nilai CP berhubungan dengan jumlah

DNA yang terdapat pada sampel (Lazaro dan Hernandez, 2013). Semakin tinggi

DNA yang terekstrak maka semakin cepat mencapai garis basement-threshold saat

proses amplifikasi berjalan (Apllied Biosystems, 2015).

4.3.1 Ampilifikasi DNA Menggunakan Primer Kambing pada Real-time PCR

a. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC Menggunakan

Primer Kambing

33


Pengujian spesifisitas primer perlu dilakukan untuk menentukan kemampuan

primer dalam membedakan DNA daging target dengan daging lain (Akhmad, 2016).

Untuk mengonfirmasi spesifisitas primer kambing, maka dilakukan amplifikasi

terhadap daging kambing (kontrol positif), daging babi (kontrol negatif), dan no

template control (NTC) sebagai blanko seperti yang tertera pada gambar 4.1.

Parameter yang diamati adalah pola kurva amplifikasi. Perpotongan kurva amplifikasi

yang dihasilkan dengan basement-threshold menghasilkan nilai CP. Spesifisitas

primer ditunjukkan oleh tidak adanya amplifikasi dari DNA lain, dalam hal ini DNA

dari daging babi (Akhmad, 2016).


Menggunakan Primer Kambing.

Keterangan: PK K (primer kambing terhadap daging kambing); PK B (primer kambing

terhadap daging babi); NTC (no template control).

Berdasarkan pola kurva amplifikasi (gambar 4.1), hanya DNA daging kambing

yang teramplifikasi, sedangkan DNA daging babi dan NTC tidak teramplikasi. Nilai

CP hanya muncul pada daging kambing yaitu 12,61. Hal ini mengindikasikan bahwa

34


primer kambing yang digunakan telah spesifik terhadap DNA daging kambing dan

tidak terjadi primer-dimer, mispriming, maupun produk non-spesifik.

Hasil analisis kurva amplifikasi telah sesuai dengan hasil BLAST yang

menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward dan reverse untuk

kambing saja tidak terhadap babi. Kondisi running yang dipakai dapat mendeteksi

DNA daging kambing dengan hasil amplifikasi yang baik sampai siklus 45.

Sehingga, dapat dikatakan bahwa adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging

lain sebelum siklus ke-45 mengindikasikan hasil positif adanya daging kambing

(Akhmad, 2016). Primer kambing dapat digunakan untuk analisis selanjutnya.

b. Amplifikasi DNA Sampel Simulasi A Menggunakan Primer Kambing

Kelompok simulasi A terdiri dari campuran antara daging kambing dan daging

babi yang dibuat yaitu masing-masing dengan konsentrasi daging kambing 100%;

50%; 10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%. Tujuan dari amplifikasi kelompok simulasi A

adalah untuk mengetahui kemampuan primer kambing dalam mendeteksi daging

kambing yang dicampur dengan daging babi.

Hasil amplifikasi (gambar 4.2) menunjukkan bahwa semua kelompok simulasi

A teramplifikasi. Sedangkan pada sampel babi 100% dan NTC tidak teramplifikasi.

Adapun nilai CP dari yang paling kecil hingga yang terbesar berturut-turut yaitu

14,88; 17,92; 21,85; 23,63; 24,00; 26,06 dengan konsentrasi daging kambing masing-

masing yaitu 100%; 50%; 10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%.

Berdasarkan literatur, semakin tinggi DNA yang terekstrak maka semakin cepat

mencapai garis basement-threshold saat proses amplifikasi berjalan (Apllied

Biosystems, 2015). Semakin banyak amplikon yang terbentuk, maka akan semakin

meningkatkan akumulasi fluoresens yang terbaca. Akumulasi fluoresens tersebut

akan membentuk kurva sigmoidal (Akhmad, 2016).

Jika dihubungkan dengan hasil tahap konfirmasi spesifisitas primer kambing

(kontrol), adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging lain sebelum siklus ke-

45 mengindikasikan hasil positif adanya daging kambing. Dengan kata lain,

35


kelompok sampel A positif mengandung daging kambing. Primer kambing dapat

mendeteksi daging kambing 0,1% dalam campuran dengan daging babi.

Gambar 4.2 Amplifikasi Simulasi Sampel A.

Keterangan: NTC PK (no template control); PK B 100 (primer kambing terhadap daging babi

100%); PK K 100 (primer kambing terhadap daging kambing 100%); PK K 50 (primer

kambing terhadap daging kambing 50%); PK K 10 (primer kambing terhadap daging

kambing 10%); PK K 1% (primer kambing terhadap daging kambing 1%); PK K 0,5 (primer

kambing terhadap daging kambing 0,5%); PK K 0,1 (primer kambing terhadap daging

kambing 0,1%).

4.3.2 Ampilifikasi DNA Menggunakan Primer Babi pada Real-time PCR

a. Amplifikasi DNA Daging Kambing, Daging Babi, dan NTC Menggunakan

Primer Babi

Amplifikasi DNA menggunakan primer babi dilakukan terhadap daging babi

(kontrol positif), daging kambing (kontrol negatif), dan NTC (blanko). Hal ini

bertujuan untuk mengonfirmasi spesifisitas primer babi yang digunakan. Hasil

amplifikasi (gambar 4.3) menunjukkan hanya daging babi yang teramplifikasi dengan

nilai CP yaitu 24,78.

Hasil amplifikasi mengindikasikan bahwa primer babi yang digunakan telah

spesifik terhadap DNA daging babi dan tidak terjadi primer-dimer maupun

36


mispriming. Hasil analisis kurva amplifikasi telah sesuai dengan hasil BLAST yang

menunjukkan bahwa kecocokan 100% dari primer forward dan reverse untuk babi

saja tidak terhadap kambing.


Menggunakan Primer Babi.

Keterangan: PB K (primer babi terhadap daging kambing); PB B (primer babi terhadap

daging babi); NTC PB (no template control primer babi).

Kondisi running yang dipakai dapat mendeteksi DNA daging babi dengan hasil

amplifikasi yang baik sampai siklus 45 (gambar 4.3). Oleh karena itu, dapat dikatakan

bahwa adanya produk hasil amplifikasi pada DNA daging lain sebelum siklus ke-45

mengindikasikan hasil positif adanya daging babi (Akhmad, 2016). Primer babi dapat

digunakan untuk analisis selanjutnya.

b. Amplifikasi DNA Sampel Simulasi B Menggunakan Primer Babi

Kelompok simulasi B terdiri dari campuran antara daging kambing dan daging

babi yang dibuat yaitu masing-masing dengan konsentrasi daging babi 100%; 50%;

10%; 1%; 0,5%; dan 0,1%. Tujuan amplifikasi kelompok simulasi B adalah untuk

37


mengetahui kemampuan primer babi dalam mendeteksi DNA daging babi dalam

campuran daging kambing dan babi dengan konsentrasi daging babi seperti yang

telah ditentukan. Hal ini didasarkan pada pola kurva amplifikasi (Akhmad, 2016).

Gambar 4.4 Amplifikasi Simulasi Sampel B.

Keterangan: NTC PB (no template control primer babi); PB K 100 (primer babi terhadap

daging kambing 100%); PB B 100 (primer babi terhadap daging kambing 100%); PB B 50

(primer babi terhadap daging babi 50%); PB B 10 (primer babi terhadap daging babi 10%);

PB B 1 (primer babi terhadap daging babi 1%; PB B 0,5 (primer babi terhadap daging babi

0,5%); PB B 0,1 (primer babi terhadap daging babi 0,1%).

Berdasarkan pola kurva amplifikasi (gambar 4.4), semua kelompok simulasi B

teramplifikasi. Sedangkan pada daging kambing 100% dan NTC tidak terjadi

amplifikasi. Nilai CP pada kelompok simulasi B dari yang terkecil hingga terbesar

berturut-turut yaitu 20,92; 22,89; 23,75; 30,76; 32,49; dan 32,90 dengan konsentrasi

daging kambing masing-masing yaitu 100%; 50%; 0,1%; 10%; 1%; dan 0,5%.

Secara teoritis, semakin tinggi DNA yang terekstrak maka semakin cepat

mencapai garis basement-threshold saat proses amplifikasi berjalan (Apllied

Biosystems, 2015). Namun, terdapat beberapa faktor yang dapat mempengaruhi hasil

amplifikasi sehingga dapat memberikan hasil yang berbeda. Faktor tersebut antara

38


lain adanya pengaruh komponen lain, baik yang disebabkan karena pengaruh saat

isolasi DNA, pemindahan serial, maupun pengaruh saat proses amplifikasi real-time

PCR (Dadkhah et a.l, 2012; Camma et al., 2012). Hal ini diperkirakan sebagai faktor

yang mempengaruhi hasil amplifikasi yang telah diperoleh. Adapun konsentrasi DNA

campuran babi 0,1% yaitu 30,08 ng/µl; lebih besar dibandingkan babi 10% dan 0,5%

yaitu masing-masing 21,25 dan 14,11. Hal ini kemungkinan mempengaruhi nilai CP

campuran babi 0,1% muncul lebih awal.

Berdasarkan tahap konfirmasi spesifisitas primer babi, bahwa adanya produk

hasil amplifikasi sebelum siklus ke-45 dapat dikatakan positif adanya daging babi.

Jadi, dapat disimpulkan bahwa kelompok simulasi B positif mengandung daging

babi. Primer babi yang digunakan dapat mendeteksi campuran dengan daging babi

hingga konsentrasi daging babi 0,1%.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan sebagai berikut.

a. Metode isolasi DNA menggunakan kit komersial dapat menghasilkan DNA

genom yang murni dan kuantitas yang cukup baik untuk analisis autentifikasi

daging kambing terhadap cemaran daging babi.

b. Analisis amplifikasi DNA menggunakan primer kambing dan primer babi

dengan target gen DNA mitokondria dapat digunakan untuk mengautentifikasi

daging kambing terhadap cemaran babi.

5.2 Saran

a. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan sampel daging kambing yang

beredar di pasaran tradisional.

b. Perlu dilakukan analisis kuantitatif pada simulasi campuran daging kambing

dan babi dengan konsentrasi yang lebih kecil untuk mengetahui limit

konsentrasi DNA daging yang dapat teramplifikasi.

c. Perlu dilakukan penentuan konsentrasi daging kambing berdasarkan analisis

nilai CP pada kurva amplifikasi.


DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, S. 1996. Research and Development on Functional Foods in Malaysia.

Nutrition Reviews. Vol. 54 No.11, p. S169.

Akhamd, Murtaqi Arif. 2016. Pengembangan Analisis Listeria monocytogenes untuk

Jajanan Pempek Dengan Real-time Polymerase Chain Reaction(RT-PCR).

Thesis. Bogor: Institut Pertanian Bogor.

Alberts, Bruce et al.. 2015. Molecular Biology of The cell 6th Edition. New York:

Garland Science.

Altshuler ML. 2006. PCR Troubleshooting: The Essential Guide. Caister Academic

Press. Moscow.

Applied Biosystems (AB). 2015. Essentials of Real Time PCR. US.

Ausubel, F. M. et al. 2003. Current Protocols in Molecular Biology. USA: John

Willey & Sons, Inc.

Awan, J. A. 1988. Islamic Food Laws. I. Phylosophy of the Prohibition of Unlawful

Foods. Sci. Technol. Islam. World, 6(3), 151.

Aw, T.G., dan Rose, J.B.2012. Detection of Phatogens in Water: from Phylochips to

qPCR to Pyrosequencing. Curr. Opin. Biotechnol. 23: 422-430.

Bettelheim FA, et al.. 2013. Introduction to General, Organic, and Biochemistry.

Australia: Brooks/Cole.

Bintang, Maria. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta: Erlangga.

Bridge,D., Cunningham,C.W., Schierwater,B., Desalle, R. and Buss, L.W.1992.

Class-Level Relationships in the Phylum Cnidaria: Evidence from

Mitochondrial Genome Structure. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89, 8750–8753.

Cai, H. et al.. 2012. Real-time PCR Assays for Detection and Quantitation of Porcine

and Bovine DNA inGelatine Mixtures and Gelatin Capsules. USA: Journal of

Food Composition and Analysis. 25:83-87.

Camma C, Domenico MD, Monaco F. 2012. Development and Validation of Fast

Real-time PCR Assays for Species Identification in Raw and Cooked Meat

Mixtures. Food Control. 23: 400-404.

41


Cawthraw, S., Saunders, G. C., Martin, T. C., Sawyer, J., Windl, O., & Reaney, S. D.

2009. Real-time PCR Detection and Identification of Prohibited Mammalian

and Avian Material in Animal Feeds. Journal of Food Protection. 72,

1055e1062.

Chatterjea, MN, dan Shinde, Rana. 2012. Medical Biochemistry Eighth Edition. New

Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers (P) Ltd.

C. Garrido, M. Carbú, F. J. Fernández-Acero, N. Boonham, et al. 2009. Development

of Protocols for Detection of Colletotrichum Acutatum and Monitoring of

Strawberry Anthracnose Using Real-time PCR. Plant Pathology. Vol. 58, pp.

43-51.

C. S. Pelosi, M. V. Lourenco, M. Silva, A. Z. Santos, S. C. Franca, dan M. Marins.

2013. Development of a Taqman real-time PCR assay for detection of leifsonia

xyli subsp xyli,” Tropical Plant Pathology. vol. 38, no. 4, pp. 343-345.

Dadkhah H, Bassami MR, Hashemi S, Shahraz F, Hosseini H, Karatzas KAG,

Khaksar R. 2012. Evaluation and Comparison Of SYBR Green I Real-time

PCR and Taqman Real-Time PCR Methods for Quantitative Assay of Listeria

Monocytogenes in Nutrient Broth and Milk. African Journal of Microbiology

Research. 69: 1908-1917.

Di Pinto A, Forte VT, Conversano MC, Tantillo GM (2005) Duplex polymerase

chain reaction for detection of pork meat in horse meat fresh sausages from

Italian retail sources. Food Control 16:391–394.

Fatchiyah, et al. 2011. Biologi Molekular: Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Fumière, O., Veys, P., Boix, A., von Holst, C., Baeten, V., & Berben, G. 2009.

Methods of Detection, Species Identification and Quantification of Processed

Animal Proteins in Feedingstuffs. Biotechnology, Agronomy, Society and

Environment. 13, 57e68.

Hasler, C.M. 1998. Functional Foods: Their Role in Disease Prevention and Health

Promotion. Food Technology. Vol. 52 No. 11, pp. 63-70.

Gaffar, Shabrani. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA

Universitas Padjajaran.

42


Giglio S, Monis PT, Saint CP. 2003. Demonstration of Preferential Binding of SYBR

Green I to Specific DNA Fragments in Real-time Multiplex PCR. Nucleic Acids

Res. 31:e136.

Hermann, GJ, dan Shaw, JM. 1998. Mitochondrial Dynamics in Yeast. Annu Rev Cell

Dev Biol.14:265-303.

Higgs, J. D. (2000). The Changing Nature of Red Meat: 20 Years of Improving

Nutritional Quality. Trends in Food Science & Technology. 11(3), 85–95.

http://dx.doi.org/ 10.1016/S0924-2244(00)00055-8.

Hussaini, M. M., dan Sakr, A. H. 1983. Islamic dietary Laws and Practices. Islamic

Food and Nutrion Council of America. Bedford Park, IL.

Ishii, satoshi et al. 2013. Simultaneous Quantification of Multiple Food- and

WaterbornePathogens by Use of Microfluidic Quantitative PCR. Division of

Environmental Engineering, Faculty of Engineering, Hokkaido University,

Sapporo, Hokkaido, Japana; Transdisciplinary Research Integration Center,

NationalInstitute of Polar Research, Tokyo, Japan.

Izzah, Afifah Nurul. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metoode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin dan DNA Gelatin Babi dengan

Menggunakan Real-time PCR. Skripsi. Jakarta: UIN Syarif Hidayatullah.

Keddie, E.M., Higazi,T. and Unnasch, T.R. 1998. The MitochondrialGenome of

Onchocerca volvulus: Sequence, Structure and Phylogenetic Analysis. Mol.

Biochem. Parasitol. 95, 111–127.

Kesmen, Z., Gulluce, A., Yetim, H. 2009. Identification of Meat Species by Taqman-

based Real-time PCR Assay. Meat Science 82: 444-449.

Kusumadewi et al.. 2013. Analisis DNA Jaringan Lunak Manusia yang Terpapar

Formalin dalam Interval Waktu 1 Bulan Selama 6 Bulan pada Lokus D13S317

dengan Metode STR-PCR. Surabaya: JBP Vol.14 (2): 115-121.

Laelasari, Ela. 2014. Islam dan Keamanan Pangan. Ciputat: UIN Press.

Lazaro, David Rodriguez, dan Hernandez, Marta. 2013. Real-time PCR in Food

Science: Introduction. Curr Issue Mol Bio. 15: 25-38.

http://dx.doi.org/

43


Legros, Frederic et al.. 2004. Organization and Dynamics of Human Mitochondrial

DNA. Paris: Institue de Myologie.

Lockley, A.K., dan Bardsley, R.G. 2000. DNA-based Methods for Food

Authentication. Trends Food Sci. Technol. 11: 67-77.

Madhad, Vaibhavi J., dan Sentheil, K. P. 2014. The Rapid and Non-enzimatic

Isolation of DNA from The Human Peripheral Whole Blood Suitable for

Genotyping. India: Department of Biotechnology Saurashtra University.

Milner, J.A. 1999. Functional Foods and Health Promotion. Journal of Nutrition. Vol.

129 No. 7, p. S1395.

Moritz,C., Dowling,T.E. and Brown,W.M. 1987. Evolution of Animal Mitochondrial

DNA: Relevance for Population Biology and Systematics. Annu. Rev. Ecol.

Syst., 18, 269–292.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: IPB Press.

Nelson, David L., dan Cox, Michael M. 2005. Lehninger Principles of Biochemistry

Fourth Edition. USA: University of Wisconsin Press.

Ngili, Yohanis. 2013. Biokimia Dasar. Bandung: Rekayasa Sains.

Pardal, SJ. 2010. Menguji Ekspresi Gen Menggunakan Real-time PCR. Warta

Penelitian dan Pengembangan Pertanian. 32:13-14.

Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics. Third Editions. New York:

Thieme.

Pereira, P.M.C.C., dan Vicente, A.F.R.B. 2013. Meat Nutritional Composition and

Nutritive Role in The Human Diet. Portugal: Centro de Investigacao Egas

Moniz. Meat Science 93 (2013) 586–592.

Pestana EA, Belak S, Diallo A, Crowther JR, Viljoen GJ. 2010. Early, Rapid, and

Sensitive Veterinary Molecular Diagnostics Real-Time PCR Application.

Springer. Dordrecht.

Pighin, Dario et al. 2016. A Contribution of Beef to Human Health: A Review of the

Role of the Animal Production Systems. Riview Article. Hindawi Publishing

Corporation The Scientific World Journal.

44


Poulsen, J.B. 1999. Danish Consumers’ Attitudes Towards Functional Foods. MAPP

Working Paper No. 62, TheAarhus School of Business, Aarhus University,

Aarhus.

Riaz, Mian N., dan Chaudry, Muhammad M. 2004. Halal Food Production. New

York: CRC Press LLC.

Roche. 2009. Real Time Ready Universal ProbeLibrary: Redefining and

Revolutionizing Real-time qPCR Assays. Roche Diagnostic GmbH. Germany.

Diakses dari www.universalprobelybrary.com pada tanggal 23 Februari 2017

pukul 23.37.

Sabrani, Gaffar. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molecular. Bandung: Universitas

Padjajaran.

Saderi, M., Saderi, A. H., dan Rahimi, G. 2013. Identification of Bovine, Ovine and

Caprine Pure and Binary Mixtures of Raw and Heat Processed Meats Using

Species Specific Size Markers Targeting Mitochondrial Genome. Iran:

Department of Genetics and Animal Breeing, Faculty of Animal Science and

Fisheries, Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University.

Sakr, A. H. 1993a. Current Issues of Halal Foods in Nourth America. Light,

May/June. 3(3), 22-24.

Sakr, A. H. 1994b. Halal and Haram Definied. In: Understanding Halal Foods-

Fallacies and Facts. Foundation for Islamic Knowledge. Bedford Park, IL.

Schoenian, S. 2014. Small Ruminant Info Sheet. The truth about grain: feeding grain

to small ruminants.

Segawa T, Takeuchi N, Rivera A, Yamada A, Yoshimura Y, Barcaza G,Shinbori K,

Motoyama H, Kohshima S, Ushida K. 2013. Distribution of antibiotic

resistance genes in glacier environments. Environ. Microbiol. Rep. 5:127–134.

Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam

Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor: FMIPA-

IPB.

Sherwood, Lauralee. 2010. Human Physiology From Cells to Systems. United State:

Brooks/Cole, Cengage Learning.

http://www.universalprobelybrary.com/

45


Triana, Vesty Anis. 2017. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Sosis Sapi

yang Beredar di Wilayah Bumi Serpong Damai Menggunakan Metode Real

Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Skripsi. Jakarta: UIN Syarif

Hidayatullah.

Tribun News. 2016. “Terungkap, Konsumen Daging Oplosan Sapi Dicampur babi

dari Berbagai Kalangan”. 2 Juni. Jawa Barat. Diakses dari

www.jabar.tribunnews.com pada tanggal 14 Maret 2017 pukul 21.05.

Utami, Annisa et al. 2012. Variasi Metode Isolasi DNA Daun Temulawak (Curcuma

xanthorrhiza Roxb.). Bogor: Departemen Biokimia FMIPA IPB.

Vasudevan, DM et al.. 2011. Textbook of Biochemistry for Medical Students Sixth

Edition. New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers P (LTD).

Yancy, H. F., Washington, J. D., Callahan, L., Mason, J. A., Deaver, C. M., Farrell,

D. E., et al.. 2009. Development, Evaluation, and Peer Verification of a Rapid

Real-time PCR Method for the Detection of Animal Material. Journal of Food

Protection, 72, 2368e2374.

Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta: Erlangga.

http://www.jabar.tribunnews.com/


Lampiran 1 Kerangka Penelitian

Daging Babi

Isolasi DNA

Isolat DNA

Analisa Isolat DNA dengan

Spektrofotometri UV DNA (Denovix®)

Amplifikasi dengan Real-time PCR

Analisa Kurva Amplifikasi

Real-time PCR (Kualitatif)

Kurva amplifikasi naik? Ada nilai CP?

Kesimpulan

Tidak

Ya

Positif

Negatif

Daging Kambing

47


Lampiran 2 Konsentrasi dan Kemurnian Isolat DNA

No. Sampel Konsentrasi

Kontrol

1 Daging

kambing

Konsentrasi (ng/µl) = 22,53

Kemurnian (Å260/Å280) = 1,70

2 Daging

babi


Kemurnian (Å260/Å280)= 1,75

48


Simulasi A

3 Daging

kambing

100%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,60

4 Daging

kambing

50%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,54

5 Daging

kambing

10%


Kemurnian (Å260/Å280) = 2,02

49


6 Daging

kambing

1%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,88

7 Daging

kambing

0,5%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,97

8 Daging

kambing

0,1%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,80

50


Simulasi B

9 Daging

babi

100%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,96

10 Daging

babi 50%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,54

11 Daging

babi 10%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,50

51


12 Daging

babi 1%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,80

13 Daging

babi

0,5%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,61

14 Daging

babi

0,1%


Kemurnian (Å260/Å280) = 1,67

52


Lampiran 3 Perhitungan Pembuatan Larutan Primer dan Probe

1. Pembuatan larutan primer 50 µM dari larutan induk 100 µM

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 100 µM = 100 µl x 50 µM

V1 = 5000 µl µM

100 µM

= 50 µl

Jadi, 50 µl diambil dari masing-masing primer 100 µM dan ditambahkan 50 µl

ddH2O.

2. Pembuatan larutan primer 5 µM

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 50 µM = 30 µl x 5 µM

V1 = 150 µl µM

50 µM

= 3 µl

Jadi, 3 µl diambil dari masing-masing primer 50 µM dan ditambahkan 27 µl

ddH2O.

3. Rekomendasi primer yaitu 0,05-0,3 µM, dipilih konsentrasi 0,1 µM.

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 5 µM = 20 µl x 0,1 µM

V1 = 2 µl µM

5 µM

= 0,4 µl

4. Rekomendasi konsentrasi probe (LightCyler® 480) adalah 0,05-0,2 µM, dipilih

konsentrasi 0,2 µM.

V1 x M1 = V2 x M2

V1 x 10 µM = 20 µl x 0,2 µM

V1 = 4 µl µM

10 µM

= 0,4 µl

53


Lampiran 4 Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

1. Primer Kambing

Primer kambing forward

Tm = 2°C (2+8) + 4°C (4+6) = 60°C

Primer kambing reverse

Tm = 2°C (5+6) + 4°C (6+4) = 62°C

Tm rata-rata primer kambing

Tm = (60+62)/2 = 61°C

2. Primer Babi

Primer kambing forward

Tm = 2°C (1+9) + 4°C (10+0) = 60°C

Primer kambing reverse

Tm = 2°C (5+9) + 4°C (2+9) = 72°C

Tm rata-rata primer kambing

Tm = (60+72)/2 = 66°C

Rumus Tm = 2°C (A+T) + 4°C (G+C)

54


Lampiran 5 Campuran Reaksi Master Mix untuk Amplifikasi DNA

Konsentrasi

Awal

Konsentrasi

Akhir

Jumlah yang

Digunakan

Primer Forward 5 µM 0,1 µM 0,4 µl

Primer Reverse 5 µM 0,1 µM 0,4 µl

UPL 10 µM 0,2 µM 0,4 µl

Lightcycler®480

Hydrolysis Probe

2x 1x 10 µl

ddH2O - - 3,8 µl

DNA Template - - 5 µl

Total Volume Reaksi 20 µl

55


Lampiran 6 Uji Spesifisitas Primer dengan Database NCBI

1. Primer Kambing

Primer Forward: 5’-CGCCGTATTCCTGTTAGCTT-3’

Primer Reverse: 5’-ACCAGGGTTGGTAAATCTCGT-3’

2. Primer Babi

Primer Forward: 5’-TGGGGTGTTTAGTGGGTTTG-3’

56


Primer Reverse: 5’-TCCTTGTACTATTCTCACCAGACCT-3’

57


Lampiran 7 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi A (1), dan Simulasi A (2)

Menggunakan Primer Kambing

58


Keterangan:

NTC PK : no template control primer kambing

PK B 100 : primer kambing terhadap daging babi 100%

PK K 100 : primer kambing terhadap daging kambing 100%




PK K 0,5 : primer kambing terhadap daging kambing 0,5%

PK K 0,1 : primer kambing terhadap daging kambing 0,1%

59


Lampiran 8 Kurva Amplifikasi DNA Kontrol, Simulasi B (1), dan Simulasi B (2)

Menggunakan Primer Babi

60


Keterangan:

NTC PB : no template control primer babi

PB K 100 : primer babi terhadap daging kambing 100%

PB B 100 : primer babi terhadap daging babi 100%




PB B 0,5 : primer babi terhadap daging babi 0,5%

PB B 0,1 : primer babi terhadap daging babi 0,1%

61


Lampiran 9 Alat dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian

Spektrofotometri UV

DNA (Denovix®)

Mikropipet dan tip

Daging kambing

Daging babi

Reagen yang

digunakan

Multiwellplate

Mikropipet

uji autentifikasi daging kambing terhadap...

Documents