4.1 Pembahasan

Di laboratorium virologi Balai Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan

Hasil Perikanan Kelas I Jakarta II ini melakukan pemeriksaan virus WSSV (White Spot

Sydrome Virus), TSV (Tautra Syndrome Virus), KHV (Koi Herpes Virus). Pemeriksaan

WSSV dan TSV pada udang serta KHV pada jenis ikan carper (mas, koi, dan koki) ini

dilakukan dengan biologi molekuler metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Dalam

melakukan metode ini dipeerlukan peralatan dan bahan yang khusus dalam biologi

molekuler. Dari pemeriksaan tigas jenis virus ini memiliki perbedaan bahan dan metode

walaupun tahapan biologi molekuler yang dilakukan sama yaitu ekstraksi, amplifikasi, dan

elektroforesis.

Dalam melakukan pemeriksaan biologi molekuler dengan metode PCR ini alat dan

bahan yang digunakan merupakan alat dan bahan yang harganya relatif mahal serta dalam

melakukan metode PCR harus dengan ketelitian tinggi dalam pengerjaannya. Hal yang

penting dalam metode PCR ini adalah kecepatan, spesifitas dan sensitifitasnya. PCR sangat

spesifik karena dapat mendeteksi mikroorganisme pada tingkatan DNA/ RNA. DNA/RNA

virus dapat diketahui secara cepat dan sampel yang akan diuji dapat dalam jumlah banyak.

PCR juga, sangat sensitif karena mampu mendeteksi satu partikel virus dalam sel yang

terinfeksi dengan cara meningkatkan jumlah DNAnya.

Di BKIPM Kelas I Jakarta II proses yang dilakukan dalam biologi molekuler bertahap

dari mulai ekstraksi, amplifikasi,dan elektrofeoresis. Ekstraksi DNA/RNA atau bisa juga

disebut isolasi ini merupakan teknik mendasar yang harus diketahui dan dikuasai dalam

mempelajari teknik biologi molekuler. Tujuan dari ekstraksi DNA/RNA memisahkan

DNA/RNA dari komponen sel lainya (protein, karbohidrat, lamak, dll) sehingga DNA/RNA

yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi

molekuler tahap berikutnya atau teknik lainnya.

Ekstraksi yang dilakukan di BKIPM Kelas I Jakarta II adalah ekstraksi DNA dengan

lysis buffer dan ektraksi RNA dengan RNA extraction. Tahapan ekstraksi DNA dan RNA ini

berbeda dan mempunyai tujuannya masing-masing dimana ekstraksi DNA ini digunakan

untuk mendeteksi WSSV dan KHV sedangkan ekstraksi RNA untuk mendeteksi TSV.

Prisnsip utama dalam Eksraksi atau isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),

ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian

DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal

yang perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA

tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan bisa

dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan

fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Ekstraksi DNA ekstraksi yang digunakan untuk WSSV dan KHV dimana awalnya

mengambil bagian contoh uji sesuai dengan ketentuan (Tabel 5), dimasukkan ke dalam

mikrotube 1,5 mL dan ditambahkan 500µL lysis buffer. Lysis buffer ini berfungsi sebagai

perusak dinding sel tanpa harus merusak DNA yang diinginkan. Oleh karena itu perusakan

dinding sel umumnya dilakukan dengan cara memecahkan dinding sel. Menggerus sampai

halus sampel DNA yang telah dilarutkan dengan lysis buffer, penggerusan ini dilakukan

untuk penghancuran sel, membran inti yang mana membantu fungsi lysis buffer yang bekerja

secara kimiawi. Inkubasi selama 10 menit dengan suhu 950C menggunakan dry block heating

thermostat. Inkubasi ini bertujuan untuk mencegah pengendapan atau bisa dibilang

melarutkan lysis buffer. Sentrifugasi pada 12000rcf selama 10 menit, dengan adanya

sentrifugasi ini maka akan tejadi pemisahan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan

cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,

sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Subtansi yang berda dibawah

disebut supernatan dan yang dibawah disebut pellet, ambil 200µL supernatan dan pindahklan

ke dalam mikrotube baru serta lakukan penambahan 400µL alkohol 95%. Ethanol/Alkohol

tidak melarutkan DNA dan berat jenis alkohol yang lebih ringan dari air membuat DNA naik

dan melayang-layang di permukaan. Lakuakan vortex cepat untuk menghomogenkan cairan

yang ada dalam mikrotube, setelah itu sentrifugasi kembali pada 12000rcf selama 5 menit

sehingga didapat kembali supernatan dan pellet yang mana supernatan tahap ini dibuang ke

botol limbah cair. Keringkan supernatan diatas tissu bersih, hal ini bertujuan mengeringkan

pellet dari sisa-sisa buffer maupun etanol. Tahap terakhir pemberian 100µL TE buffer yang

berfungsi melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak.

Dalam buffer TE mengandung EDTA yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang

mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim

nuclease (Sudarsono, 1996).

Tabel 5. Jumlah Contoh Uji WSSV

Contoh Uji Jumlah/berat contoh Uji

Plasmid DNA WSSV 2 kopi

Tangkai amat induk udang 1 tangkai

≤ PL 12 25-50 ekor

PL 12-30 Udang tanpa hepatopancreas/ kepala

Pleopod, Periopod 2 potongan

Otot 20 mg

Endapan Kolam/ tambak 200mg

Insang 20 mg

Air kolam/ tambah 2 mL

Ekstraksi RNA bertujuan sama dengan ekstaksi DNA dimana untuk mendapatkan

DNA/RNA murni hanya saja cara pengekstraksian yang berbeda dan juga bahan yang

digunakan. Di awalnya juga pengambilan bagian sampel/contoh uji (Tabel 5) Tahap akhirnya

pun sama yaitu pemebrian TE buffer yang berfungsi melarutkan, hanya saja dalam ekstraksi

RNA ini yang dilarutkan adalah RNA yang dihasilkan dan juga menjaga RNA agar tidak

mudah rusak.

Tabel 6. Jumlah Contoh Uji TSV

Contoh Uji Jumlah/berat contoh Uji

Plasmid DNA TSV 2 kopi

≤ PL 12 10 ekor

PL 12-30 5 ekor

Insang Udang Dewasa 2-3 potongan

Insang Induk Udang ½ bagian

Insang PL20-udang ukuran 5 kg 50 mg

Hepatopankreas/hemolimp 20 mg

Proses setelah ekstraksi adalah proses amplifikasi, dimana proses amplifikasi ini ada 2

metode yang dilakukan yaitu amplifikasi dengan IQ 2000 dan amplifikasi dengan metode

OIE. Amplifikasi IQ 2000 digunakan untuk amplifikasi DNA WSSV sedangkan Amplifikasi

(OIE) digunakan untuk amplifikasi RNA TSV dan amplifikasi DNA KHV.

Amplifikasi menggunakan IQ 2000 yang mana prosedurnya telah ada di bab

sebelumnya dan juga terlampir (Lampiran 2). Untuk melakukan amplifikasi hasil ekstraksi

template DNA/sampel DNA sangatlah penting.

Pembuatan campuran reagen di dalam PCR chamber, yang terlebih dahulu hidupkan

lampu UV selama 5 menit, setalah 5 menit matikan lampu UV dan hidupkan lampu neon.

Dalam pembuatan reagen ini harus menghindari kontaminasi dari luar maka dari itu

dilakukan di dalam PCR chamber yang mana alat-alat telah disterilisasikan menggunakan

sinar UV.

Amplifikasi dengan IQ 2000 ada 2 tahap, yaitu mempersiapkan:

1. First PCR

Komposisi : First PCR Premix =7,5µL

IQzyme DNA polymerase = 0,5µL

Total volume campuran reagen =8µL

Komposisi ini berlaku untuk satu mikrotube dimana sudah termasuk perhitungan

untuk kontrol positif, kontrol negatif dan contoh uji/sampel. Selanjutnya divortex yang mana

bertujuan untuk membuat campuran reagen tersebut tercampur dengan baik atau disebut

homogen, melakukan spin down setelah vortex bertujuan untuk menurunkan cairan yang

menempel pada dinding mikrotube.

2. Nested PCR

Membuat campuran reagen pada tube baru dengan membuat kode/label huruf “N”

pada tube yang nanti ditambahkan pada tiap-tiap tube tahap awal yang sedang diamplifikasi.

Komposisi Nested PCR : Nested PCR premix =14µL

IQzyme DNA plymerase=1µL

Total campuran reagen=15µL

Tambahkan campuran nested PCR pada masing-masing hasil amplifikasi Firast PCR,

vortex, spin down, dan amplifikasi pada thermal cycler.

Untuk amplifikasi dengan IQ 2000 bisa diambil contoh dari hasil kegiatan pertama

yang mana contoh uji berjumlah 4 buah. Dengan jumlah template DNA 4 buah maka butuh

mikrotube 6 (1 Kp+1 Kn+4 template DNA) buah untuk amplifikasi ini. Komposisi First PCR

yang merupakan komposisi untuk satu buah bisa dilakukan pada satu mikrotube lebih dahulu

untuk memudahkannya pertama mencampurkan semua bahan dalam 1 tube maka terlebih

dahulu membuat kontrol negatif (kp/-) setelah itu mendistribusikan ke tube kontrol positif

(Kp/+) dan template DNA sesuai dengan perhitungan untuk 4 tempalte DNA :

First PCR : 7,5 x 6 = 45

IQ2000 : 0,5 x 6 = 3

48 : 6 = 8

Memberi kode/label pada mikrotube supaya tidak terjadi kesalahan dalam melakukan

amplifikasi. Memasukkan 45µL first PCR premix dan 3µL IQzyme2000 kedalam mikrotube

Kn menggunakan mikropipet.

Mendistribusi campuran reagen first PCR premix pada tube Kn ke tube Kp dan tube

uji/sampel dengan takaran 8µL untuk masing-masing mikrotube sehingga hasilnya merata

pada tiap mikrotube.

Setelah pendistribusian, tambahkan 2µL cairan khusus Kp pada tube Kp, 2 µL TE

buffer untuk mikrotube Kn, dan 2µL template DNA hasil ekstraksi untuk tiap-tiap tube yang

khusus sampel.

Vortex semua mikrotube dan spin down, setelah itu amplifikasi dengan memilih

WSSV1 pada thermal cycler menekan tobol start untuk memulai siklus dan tunggu sampai

semua siklusnya selesa (±45-50 menit).

Siklus First PCR :

940C 30 detik; 62

0C 30 detik; 72

0C 30 detik, diulang 5 siklus,

940C 15 detik; 62

0C 15 detik; 72

0C 20 detik, diulang 15 siklus,

720C 30 detik; 20

0C 30 detik; 4

0C , diakhir siklus

Menghitung komposisi Nested PCR dengan 4 template DNA ditambah dengan Kp

dan Kn :

Nested PCR premix =14µL x 6 = 84

IQzyme DNA plymerase=1µL x 6= 6

Total campuran reagen=90µL

Untuk membuat reagen sesuai 90 : 6 = 15, angka ini sesuai dengan komposisi Nested PCR

untuk satu tube.

Menambahkan nested PCR yang telah dibuat ke hasil amplifikasi tahap pertama yaitu

first PCR premix sebanyak 15µL secara merata. Vortex cepat dan spin down, setelah

melakukan amplifikasi kedua dengan memilih WSSV2 pada thermalcycler dan tekan tombol

start (±45-50 menit).

Amplifikasi untuk mendeteksi KHV ini dilakukan dengan metode OIE. Amplifikasi

metode ini berbeda dengan metode yang menggunakan kit IQ 2000 dimana dalam

ampilifikasi metode OIE ini tahap pemcampuran reagen hanya terjadi sekali atau bisa disebut

persiapan master mix dengan komposisi yang tentunya berbeda. Komposisi larutan untuk

master mix amplifikasi (OIE) KHV :

Green Master Mix : 12,5 µL

Primer Forward : 1 µL

Primer Reverse : 1 µL

Nuclease Free Water: 8,5 µL

Total campuran reagen adalah 23 µL

Perhitungan komposisi larutan untuk “8” contoh uji ditambah dengan kontrol positif

dan kontrol negatif telah dipaparkan sebelumnya pada hasil kegiatan

Green Master Mix : 12,5 µL x 10 = 125 µL

Primer Forward : 1 µL x 10 =10 µL

Primer Reverse : 1 µL x 10 = 10 µL

Nuclease Free Water: 8,5 µL x 10 = 85 µL

Total campuran reagen untuk 10 tube adalah 230 µL.

Perhitungan total campuran reagen ini di tentunya tidak akan cukup untuk mikrotube

ukuran 0,2mL maka itu dibuat dalam dua buah mikrotube dengan tiap-tiap reagen dibagi dua

sehingga cukup untuk dibagikan ke 10 buah tube yang masih kosong dengan pembagian

sebesar 23 µL untuk tiap-tiap tube sehingga 10 tube mendapat bagian yang rata. Hal ini untuk

memudahkan dalam proses pencampuran reagen dan menghemat alat yang digunakan seperti

tips. Untuk tube kontrol positif diberi 2 µL larutan kontrol positif dan kontol negatif diberi

NFW atau bisa juga TE buffer 2 µL, serta untuk tube contoh uji beri 2 µL template DNA

sesuai denga kode contoh ujinya sehingga larutan tiap-tiap tube rata jumlahnya yaitu 25 µL.

Setelah semua terdistribusikan lakukan vortex cepat dan spin down serta amplifikasi dengan

memilih untuk KHV pada thermal cycler. Amplifikasi berjalan ±90 menit.

Amplifikasi untuk mendeteksi TSV sama dengan amplifikasi KHV yaitu dengan

metode OIE yang membedakannya hanyalah pada percampuran reagennya. Campuran reagen

untuk proses amplifikasi TSV ini sebagai berikut :

Acces Quick :12,5µL

Primer 9992F :2,5µL

Primer 9195R :2,5µL

AMV :0,5µL

NFW :4,5µL

Dari campuran tersebut template RNA, kontrol positif, dan kontrol positif yang

diberikan 2,5µL untuk masing-masing mikrotube sesuai kodenya. Dengan akhirnya

amplifikasi dengan siklus sebagai berikut :

600C 30 menit; 94

0C 2 menit, diulang 1 siklus,

940C 45 detik; 60

0C 45 detik; diulang 40siklus,

600C 7 detik; 4

0C , diakhir siklus

Untuk Real time PCR komposisi reagen sebagai berikut :

Tagman Universal 12,5µL

Forward 1µL

Reverse 1µL

Probe 1µL

NFW 4,5µL

20µL

Contoh Uji 5µL

25µL

Dalam realtime PCR ini setelah melakukan percampuran reagen langsung

diketahuhasilnya tanpa melakukan elektroforesis hanya ikuti prosedur yang ada pada buku

panduan penggunaan Applied Biosystem.

Pada dasarnya reagen yang digunakan untuk amplifikasi ini sama saja fungsi yaitu

polimerisasi, yang intiya membuat replikasi DNA/RNA.

Hal yang penting atau bisa disebut komponen peting dalam amplifikasi adalah sebagai

berikut :

1. Template DNA/RNA

Fungsi DNA/RNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk

pembentukan molekul DNA/RNA baru yang sama. Templat DNA/RNA ini dapat berupa

DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat

tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.

Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan dengan menggunakan

metode lisis sel ataupun dengan cara melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid

dengan menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang digunakan di dalam

penyiapan DNA templat tergantung

dari tujuan eksperimen.

2. Primer

Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang digunakan. Di

dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan

diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang

diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan

urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju. Data urutan DNA

atau protein bisa didapatkan dari database GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan

protein yang dituju belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil

analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan

kekerabatan yang terdekat.

3. dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat),

dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin

trifosfat). Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan

dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari

primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat. Konsentrasi

optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.

4. Buffer PCR dan MgCl2

Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH tertentu. Oleh karena itu untuk

melakukan proses PCR diperlukan buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin

pH medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion tersebut berasal dari

berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas

DNA polimerase.

Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang

membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi

MgCl2 berpengaruh pada spesifisitas dan perolehan proses.

Umumnya buffer PCR sudah mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi

disarankan sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat dengan mudah

dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang diperlukan.

5. Enzim Polimerase DNA/ Taq polymerase

Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA.

Pada proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA

yang digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau hipertermofilik oleh

karena itu enzim ini bersifat termostabil sampai temperatur 95 oC. Aktivitas polimerase DNA

bergantung dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai contoh adalah

enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas

spesifik 10x lebih kuat dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polimerase (diisolasi dari

bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase DNA berkaitan erat dengan buffer

PCR yang dipakai.

Dari penjelasan tentang cara amplifikasi WSSV, TSV, daan KHV didapat bahwa

untuk melakukan amplifikasi harus melakukan perhitungan terlebih dahulu jika terdapat lebih

dari 1 contoh uji, hal ini untuk ekektifitas dan efiiensi waktu pengerjaannya. Jika dalam

pengerjaan campuran reagen lakukan dalam satu mikrotube yang mana telah dihitung

takarannya karena dalam deteksi virus harus dilakukan sejak awal dan alat yang tidak

terbuang sia-sia seperti mikrotips, jika tanpa perhitungan dan percaampuran awal di satu

mikrotube maka banyak mikrotips yang akan terbuang.

Amplifikasi ini sangat penting karena jika terjadi kesalahan pada hasil akhir

pembacaan elektroforesis didapatkan kejanggalan amplifikasi menjadi sorotan pertama

karena dalam amplifikasi tidak boleh terjadi kontaminan dan juga komposisi campuran

reagen haruslah benar. Pencampuran komposisi reagen ini dapat terjadi kesalahan disebabkan

oleh mikropipet, mikropipet banyak macamnya dan banyak pula perusahaan yang

membuatnya dimana mikropipet sering tertinggalnya sedikit cairan didalamnya karena

mikropipet dan mikrotips yang digunakan tidak dalam satu perusaahan. Hal seperti ini

disebut error pipeting, maka dari itu merek mikrotips dan mikropipet baiknya sama untuk

menghindari terjadinya error pipeting ini.

Dalam tahap amplifikasi pada thermal cycler yang prinsipnya siklus suhu dimana tiap

suhu yang diatur mempunyai tujuannya masing-masing. Thapan sikulus suhu sebagai berikut

:

1. Pre-Denaturasi : Tahap ini merupakan tahap untuk mempersiapkan proses berikutnya,

yaitu denaturasi (Pemanasan), Suhu yang digunakan 95°C. Hanya terdiri dari satu siklus

selama 5 menit.

2. Denaturasi : Tahap pemisahan antara untai satu dengan yang lain sehingga masing –

masing menjadi untai tunggal. Suhu yang dipakai 94°C. Proses yang tidak sempurna

dapat memutuskan rantai DNA. Jika terlalu lama dapat menghilangkan aktivitas enzim

polimerase.

3. Annealing : Tahap terpenting. Faktor yang mempengaruhi adalah suhu annealing dan

primer. Suhu rendah dapat mengakibatkan primer tidak dapat melekat pada untai DNA

dengan kurang sempurna. Suhu Tinggi dapat mengakibatkan salah sasaran, atau primer

melekat pada urutan basa yang salah. Suhu melting annealing primer optimum dapat

diukur dengan rumus Tm = 2 ( A+T ) + 4 ( G + C ). Setelah itu dari masing masing

dikurangi 5°C ( Suhu = Tm - 5°C ). Lalu hasil keduanya dihitung rata – ratanya.

4. Ekstention : Proses pemanjangan untai DNA yang telah melekat pada primer. Suhu

optimal yang dipakai 72°C, bertujuan untuk mengaktifkan Enzim Taq Polimerase. Enzim

Taq Polimerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus. Penggandaanya n2.

5. Post PCR : Tahap ini hanya tahap optimalisasi proses running. Suhu 72°C, 1 Siklus, 7

Menit.

6. Finalizing : Tahap penyelesaian. Suhu 4°C.

Elektroforesis merupakan proses terakhir dalam biologi molekuler dengan

menggunakan metode PCR. Elektroforesis ini sama saja proses yang dilakukannya baik dail

hasil amplifikasi IQ 2000 ataupun amplifikasi OIE.

Elektroforesis merupakan suatu metode yang digunakan untuk memisahkan molekul

DNA, RNA atau protein berdasarkan ukuran, muatan elektrik, dan sifat-saifat lainnya. Teknik

elektroforesis dilakukan dengan menarik suatu molekul untuk melewati massa gel yang

diberikan arus listrik kutub negatif menuju kutub positif sehingga DNA, RNA yang

mempunyai muatan negatif akan berpindah menuju kutub positif pada ujung akhir massa gel

dalam elektroforesis (Sambrook & Russel 2001 : 5.4). Kecepatan migrasi molekul DNA

ditentukan oleh besar fragmen DNA. Fragmen DNA berukuran kecil akan bermigrasi lebih

cepat diabndingkan dengan fragmen DNA berukuran besar. Fragmen DNA dalam gel dapat

divisualisasikan dengan pewarna pengikat DNA seperti ethidium bromida yang dapat

berpendar di bawah sinar ultraviolet (UV) (Weaver 2004:92). Teknik elektroforesis dialkuakn

karena telah banyak yang menggunakan untuk mendeteksi fragmen DNA hasil amplifikasi

dengan membandingkan pita DNA hasila alplifikasi dengan PITA DNA molecular weight

marker (penanda berat molekul DNA) (Sambrook & Russell 2001 :5.10)

Dalam elektroforesis ethidium bromida digunakan untuk campuran proses

penggambaran atau pewarnaan molekul asam nukleat atau lebih khususnya DNA dan RNA,

tetapi ethidium bromida ini tidak digunakan lagi karena sifat karsinogenik.

Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang

bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat

meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom

Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel

(Birren and Lai, 1993).

Dalam elektroforesis ini ethidium bromida tidak dipakai dan digantikan SYBR Green

dimana fungsinya sama dengan ethidium bromida tetapi lebih sensitif sehingga hasil yang

didapat maksimal diabnding menggunakan ethidium bromida.

Pengerjaan campuran dilakukan diatas parafilm ini bukan semata-semata tidak ada

tujuannya, tujuannya memudahkan melakukan homogenisasi sampel DNA/RNA dengan

loading dye dan SYBR green. Dalam membuat agar, agarose 1,5 % yang digunakan karena

memang 1,5% merupakan yang terbaik untuk pembuatan agar ini, stelah itu dipanaskan di

microwave sampai benar-benar larut. Sisir digunakan untuk membuat sumuran.

Agarose merupakan serbuk dari tanaman agar – agar, yang menghasilkan gel ketika

didinginkan. Buffer dibutuhkan untuk menjaga nilai pH pada angka yang konstan.

Lautan TAE buffer 1x yang digunakan untuk campuran agarose dan merendam

ketika dilakukan penyimpan campuran loading dye, SYBR Green, dan sampel DNA/RNA

memudahkan migrasi dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin,

2012). TAE buffer ini bisa dibilang sebagai penghantar arus listrik. Setelah gel mengeras, gel

dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer.

Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat

dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991).

Alasan kenapa loading dye/loading buffer digunakan untuk campuran dengan SYBR

Green dan sampel DNA/RNA karena ketika dalam perendaman dengan TAE buffer untuk

memasukkan campuran ke dalam sumur adalah loading dye ini lebih berat daripada TAE

buffer itu sendiri sehingga tenggelam atau bdapat disebut sebagai pemberat oleh karena itu

larutan yang dimasukkan ke dalam sumur/lubang tidak keluar dan tidak terjadi pencampuran

dengan larutan perendamnya, hal yang sangat penting untuk diketahui sehingga dapat

memperoleh hasil yang baik. SYBR-Green merupakan pewarna yang mengkelat dalam untai

ganda DNA. Bahan tersebut dapat digunakan untuk memvisualisasikan DNA, karena bahan

ini berpendar dibawah sinar UV namun tidak terlihat dalam cahaya biasa.

Dalam running harus sesuai dan tepat pengaturannya, dari yang biasanya dilakukan

dan dilihat dari hasil yang baik dalam mengatur running pada power suplai dengan kekuatan

listrik 80 volt, maksimal 200mA selama 50 menit. Semakin besar voltase kecepatan molekul

DNA semakin cepat.

UV transiluminator untuk visualisasi pewarnaan DNA didalam gel agarose ini

merupakan tahap dimana hasil dari elektroforesis dapat diketahui dan di dokumentasi dengan

UVIDOC serta software pendukung.

Gambar 1. Hasil Uji WSSV dengan Contoh Uji Frozen Shrimp

Hasil uji WSSV yang menggunkan marker 100 bp ini dikatakan negatif karena pada

angka 1 dan 2 yang merupakan contoh uji tidak menghasilkan pita DNA atau disebut band

yang menandakan WSSV. WSSV dikatakan positif apabila terbentuk band pada 296 bp

dan/atau 550 bp. Pada kolom kontrol positif terdapat band yang menyatakan bahwa band ini

merupakan band yang menjadi acuan untuk contoh uji dimana kontrol positif pada 296 bp.

Jika terdapat band selain 296 bp dan 550 bp berarti hasilnya tersebut negatif.

200 bp

100 bp

300 bp

Gambar 2. Hasil Uji TSV dengan Contoh Uji Artemia dan Red Cherry Shrimp

Hasil uji TSV yang menggunakan marker 100 bp dengan contoh uji artemia dan Red

Cheery Shrimp didapat hasil negatif karena A1, A2, A3, dan RCS tidak menghasilkan band

TSV samasekali. Hasil Uji TSV dikatakan positif apabila terbentuk band pada 231 bp Jika

terdapat band selain 231 bp.

Gambar 3. Hasil Uji KHV dengan Contoh Uji Fiksatif Insang

Hasil Uji KHV ini dinyatakan tidak baik karena munculya band pada kontrol negatif

yang seharusya tidak boleh ada samasekali. Band yang terdapat pada kontrol negatif ini

merupakan tanda bahwa telah terjadi kontaminasi dalam proses pengerjaan uji KHV ini. Uji

KHV dinyakatan positif apabila terdapat band apa 409 bp dan dikatakan negatif apabila tidak

mengahsilkan band atau pita DNA.

Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju

pergerakan dari molekul DNA, yaitu:

1. Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena

hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.

2. Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarose, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar

untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarose yang lebih tinggi memudahkan

pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarose yang lebih rendah memudahkan

pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.

3. Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak

dibandingkan dengan yang berbentuk bulat.

4. Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas

muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang

rendah.

5. Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul

DNA.

6. Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul

DNA.

7. Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga

mempercepat migrasi DNA

(Wolfe, 1993).

Elektroforesis ini ada 2 metode yaitu metode bebas dan horizontal tetapi kebanyakan

pada proses elektroforesis menggunakan metode horizontal karena memiliki kelebihan

dibanding metode bebas.

Kelebihan metode elektroforesis horizontal adalah mudahnya mengamati reaksi

kimia selama proses berlangsung, sampel atau contoh uji dapat ditangani dengan baik dan

cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam kantong plastik dan didinginkan setelah

percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih

lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain kelebihan, metode ini juga

memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran

sampel ke dalam sumuran/lubang gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey, 1984).

Elektroforesis gel ini mempunyai manfaat antara lain untuk mengetahui ukuran

fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda

ukuran, lalu dapat disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi

DNA. Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan, antara lain

membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan sekuens

berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab

kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau

jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme

atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di

tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan

atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik,

menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan

perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam

rekombinan plasmid DNA (Russell, 1994; Fairbanks and Andersen, 1999).

Namun disamping itu, elektroforesis gel juga memiliki kekurangan yaitu pada deteksi

atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini dirasakan kurang efisien karena

lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat diperiksa. Disamping itu,

kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk (ghost atau smeary

bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit diinterpretasikan (Tarigan,

2011).