tesis ii para optar el grado acadÉmico de

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

TESIS II

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Análisis computacional de metabolitos de Plantago major L. como futuros

candidatos a fármacos antiinflamatorios.

AUTORAS:

ARRIBASPLATA CHAMORRO, Erika Jakeline

JARA ROJAS, Luisa Marlyng

ASESOR:

Mg. VILLARREAL LA TORRE, Víctor Eduardo

TRUJILLO – PERÚ

2021

Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú.Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/

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DEDICATORIA

A Dios, por guiar nuestros pasos a lo largo de nuestra carrera, por estar con nosotras en todo

momento, por su amor infinito y motivarnos a ser mejores personas cada día.

A nuestros maestros, quienes con su dedicación y conocimientos impartidos fomentan el amor

por la carrera cada día en las aulas de nuestra querida facultad.

Las autoras



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A mis padres:

Por darme la vida y haberme inculcado

valores, gracias por apoyar siempre mis

sueños y estar conmigo en los momentos

más difíciles.

A mis hermanas:

Por preocuparse por mí y desearme

siempre lo mejor. Las adoro.

A mi abuela:

Por haberme tenido paciencia y haber

sido el mejor ejemplo de buena persona

en mi vida, gracias por el amor que me

diste. Eres mi ángel.

A mis amigos:

Por brindarme su apoyo y sus consejos,

gracias por alegrarse de mis logros y

enseñarme que la verdadera amistad si

existe.

Arribasplata Chamorro Erika Jakeline



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A Dios:

Por ser nuestro creador y fortaleza

cuando más lo necesitamos, por

darme paciencia y sabiduría

para concluir esta investigación.

A mis padres: Maria y Teofilo

Por apoyarme, por ser mi motivación,

quienes con su inmenso, amor y trabajo,

lograron hacerme una persona de bien.

Los Amo

A mi hermana: Katherine

Por apoyarme siempre en las buenas

y en las malas, y salir adelante ante

cualquier obstáculo, siempre motivándome

para culminar mis metas.

Jara Rojas Luisa Marlyng



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AGRADECIMIENTO

A nuestra querida Alma Mater por acogernos en sus instalaciones durante estos años y a

toda la plana docente de la Facultad de Farmacia y Bioquímica por guiarnos y proveernos

de conocimientos y actitudes necesarias para aportar a nuestra comunidad.

A nuestro estimado asesor Mg. Víctor Eduardo Villarreal La Torre, docente de la Facultad

de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, quien de forma muy

amable brindó su apoyo y tiempo durante todo el proceso del presente trabajo de

investigación. Muchas gracias, este trabajo no hubiera sido posible sin su gran apoyo.

Al Laboratorio de Investigación en Bioinformática (LIB) de la Facultad de Farmacia y

Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo por apoyar esta investigación.

Las autoras.



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PRESENTACIÓN

SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:

Dado el cumplimiento a lo establecido por el reglamento de Grados y Títulos de la Facultad

de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo; sometemos a vuestra

honorable consideración y elevado criterio el presente informe de tesis II, titulado:

“Análisis computacional de metabolitos de Plantago major L. como futuros

candidatos a fármacos antiinflamatorios”

De manera muy especial agradecemos la colaboración de los señores miembros del jurado.

Dejamos a vuestra consideración señores Miembros del Jurado, la respectiva calificación del

presente informe.

Trujillo, agosto del 2021

Erika Jakeline Arribasplata Chamorro Luisa Marlyng Jara Rojas



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JURADO DICTAMINADOR

Dr. Demetrio Rafael Jara Aguilar

PRESIDENTE

Mg. Víctor Eduardo Villarreal La Torre

ASESOR

Dr. Edmundo Arturo Venegas Casanova

MIEMBRO



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RESUMEN

El objetivo de la presente investigación científica fue identificar entre los metabolitos activos

con actividad antiinflamatoria reportados, presentes en las hojas de Plantago major L., el

mejor candidato a fármaco activo sobre ciclooxigenasa-2 (COX-2). Para ello se inició la

investigación con una búsqueda bibliográfica en diversos buscadores como: Google

Académico, PubMed y ScienceDirect, usando como palabras claves y conectores booleanos;

“Plantago major” AND “Antiinflamatory”. Producto de la búsqueda se identificaron 7

metabolitos a los que se les atribuía el efecto antiinflamatorio de Plantago major L. (llantén);

Aucubina, baicaleína, hispidulina, ácido oleanólico, ácido glicirrético, ácido ursólico y

sitosterol. Posteriormente usando el servidor I-Tasser se realizó la predicción tridimensional

de los targets seleccionados (ciclooxigenasa-2), cuyas secuencias fueron extraídas de la base

de datos NCBI. Se seleccionó la predicción tridimensional con el mejor C-Score. Toda

secuencia óptima fue corroborada con cristales previamente seleccionados de la base de datos

Protein Data Bank mediante el uso del programa Pymol 2.4. Por otro lado, las estructuras de

los ligandos fueron preparadas para el Docking Molecular mediante el uso del programa

Open Babel. Entonces teniendo la estructura del target y de los ligandos, se usó el programa

AutoDock Vina para realizar el Docking molecular. Los análisis se repitieron 50 veces para

obtener los valores más cercanos a la realidad. De este modo se pudo obtener la energía de

afinidad (EA) de las 7 moléculas y la del ácido mefenámico -6.9, que fue considerada como

molécula control, de las cuales solo 3 resultaron tener afinidad por dicho receptor: aucubina,

baicaleína e hispidulina, al presentar una EA de -5.8, -6.0 y -5.0 respectivamente. Los análisis

farmacodinámicos, farmacocinéticos y fisicoquímicos de las tres moléculas y del ácido

mefenámico se realizaron mediante los servidores SwissADME y pkCSM. Concluyendo que

al tener una menor cantidad de inhibiciones hacia CYP3A4, tener un tiempo de vida media

aparentemente aceptable, no tener toxicidad, tener un mayor porcentaje de absorción, tener

una energía de afinidad mucho más alta, una interacción hacia SER516, no tener violaciones

a la regla de Lipinski, un logP elevado o ligeramente lipófilo y por tener el menor valor de

accesibilidad sintética, baicaleína fue la mejor molécula elegida en esta investigación como

candidata a fármaco antiinflamatorio.

Palabras claves: Plantago major, antiinflamatorio, ciclooxigenasa-2, docking molecular



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ABSTRACT

The research aimed to identify among the active metabolites with reported anti-inflammatory

activity, present in the leaves of Plantago major L., the best candidate for active drug on

cyclooxygenase-2 (COX-2). For this, the investigation began with a bibliographic search in

some databases such as Academic Google, PubMed, and ScienceDirect, using Boolean

connectors and keywords such as "Plantago major" AND "Antiinflammatory". Seven

metabolites as a result of the search were identified to which the anti-inflammatory effect of

Plantago major L. (plantain) was attributed: Aucubin, baicalein, hispidulin, oleanolic acid,

glycyrrhetic acid, ursolic acid, and sitosterol. Subsequently, using the I-Tasser server, the

three-dimensional prediction of the selected targets (cyclooxygenase-2) was performed,

whose sequences were obtained from the NCBI database. The three-dimensional prediction

was selected with the most optimal C-Score. Every optimal sequence was corroborated with

crystals previously selected from the Protein Data Bank database by using the Pymol 2.4

program. On the other hand, the ligand structures were prepared for Molecular Docking by

using the Open Babel program. Then, having the structure of the target and the ligands, the

AutoDock Vina program was used to carry out molecular docking. The analyzes were

repeated 50 times to obtain the values closest to reality. In this way it was possible to obtain

the affinity energy (EA) of the 7 molecules and that of mefenamic acid -6.9, which was

considered as a control molecule, of which only 3 were found to have an affinity for said

receptor: aucubin, baicalein, and hispidulin presenting an EA of -5.8, -6.0 and -5.0

respectively. The pharmacodynamic, pharmacokinetic, and physicochemical analyzes of the

three molecules and mefenamic acid were performed using the SwissADME and pkCSM

servers. Concluding that by having a lower number of inhibitions towards CYP3A4, having

an apparently acceptable half-life, not having toxicity, having a higher absorption percentage,

having much higher affinity energy, an interaction towards SER516, not having violations to

the Lipinski rule, a high or slightly lipophilic logP and because it had the lowest synthetic

accessibility value, baicalein was the best molecule chosen in this research as a candidate for

an anti-inflammatory drug.

Keywords: Plantago major, anti-inflammatory, cyclooxygenase-2, molecular docking



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icaÍNDICE

DEDICATORIA

AGRADECIMIENTO

PRESENTACIÓN

JURADO DICTAMINADOR

I. INTRODUCCIÓN……………………………………...1

II. MATERIAL Y MÉTODO……………………………..6

III. RESULTADOS………………………………………....9

IV. DISCUSIÓN…………………………………………...13

V. CONCLUSIONES…………………………………….17

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………....18

VII. ANEXOS………………………………………………24



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I. INTRODUCCIÓN

El desarrollo de un nuevo medicamento es un proceso largo y costoso cuyo objeto es

demostrar en distintas fases; (descubrimiento de fármacos, ensayos preclínicos y ensayos

clínicos), si es que el nuevo fármaco reúne los requisitos de eficacia, seguridad y calidad

exigidos para su comercialización y administración al ser humano. Antes de que un candidato

a fármaco pueda probarse en seres humanos, su seguridad y eficacia deben explorarse en

estudios preclínicos. Estos estudios constituyen una etapa crucial en el desarrollo de nuevas

moléculas y terapias, y actualmente constituyen un “cuello” de botella en el desarrollo

farmacéutico, concretamente para el paso de moléculas a fase clínicas.1, 2

Los estudios preclínicos evalúan un gran rango de parámetros de la molécula, e incluyen

estabilidad, niveles plasmáticos, tisulares y propiedades farmacocinéticas. Básicamente

podemos clasificar los modelos experimentales en: experimentos in vivo, in vitro e in silico.

Se entiende por experimento in vivo aquel que se lleva a cabo con especies animales. Los

experimentos in vitro son realizados en dispositivos de laboratorio utilizando tejidos, células

o moléculas provenientes de las especies animales. Por último, los experimentos in silico son

simulaciones o reproducciones de experimentos in vivo o in vitro, que emplean modelos

matemáticos y softwares de simulación. La predicción in silico consiste en establecer,

mediante técnicas computacionales, la correlación de determinadas características biológicas

con la estructura de nuevas entidades químicas.3, 4, 5

El acoplamiento molecular (docking) es un método computacional que busca formas de

unión entre ligandos potenciales (un fármaco) y un blanco macromolecular (normalmente

células, proteínas o procesos químicos) cuya estructura es conocida experimentalmente.

Particularmente el acoplamiento molecular se aplica para encontrar la orientación y posición

de un ligando en el sitio activo de su blanco macromolecular, sin conocer el resultado final.



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Es decir, la conformación tridimensional de la unión ligando – receptor. El objetivo de esta

técnica consiste en encontrar la unión más probable entre el ligando y el receptor, es decir, la

que menos energía requiera (a menor energía, más fuerte la unión) así como el sitio idóneo

de unión molecular.6

La inflamación es la respuesta del sistema inmunológico del organismo a las agresiones

producidas por ingreso de organismos extraños, traumatismos, enfermedades agudas o

crónicas, etc. Existen dos grupos de medicamentos con propiedades antiinflamatorias, los

antiinflamatorios esteroideos y los antiinflamatorios no esteroideos. Los antiinflamatorios

esteroideos imitan el efecto de los corticoides naturales (hormonas producidas por la corteza

adrenal) o pueden ser semisintéticos de características estructurales y farmacológicas

similares a los primeros, aunque en general, son más potentes. Los antiinflamatorios no

esteroideos (AINEs), son un grupo químicamente heterogéneo de fármacos que además de

sus propiedades antiinflamatorias actúan en mayor o menor medida como analgésicos y

antipiréticos.7

Los AINEs actúan evitando la producción de prostaglandinas, que funcionan como

mediadores de la inflamación a nivel periférico y central. A través de la inhibición de la

enzima ciclooxigenasa (COX), afectando a la transformación del ácido araquidónico en

prostaglandinas, prostaciclina y tromboxano; se conocen tres isoformas de esta enzima.

COX-1, es una enzima constitutiva que se encuentra en la mayoría de los tejidos. Se encarga

de regular procesos como la protección gástrica, agregación plaquetaria, función renal y la

homeostasis vascular. Por lo tanto, su inhibición puede provocar efectos secundarios a estos

niveles. COX-2, esta enzima habitualmente no se detecta en los tejidos y aparece de forma

inducida en estados de inflamación. Su expresión se inhibe por todos los AINEs y también

por los corticoides. En estos casos, los llamados AINEs selectivos, al inhibir preferentemente



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la COX-2, consiguen una acción antiinflamatoria sin los efectos secundarios, especialmente

gástricos, al no inhibir la enzima COX-1. Por otro lado, la enzima COX-3, una isoforma de

la COX-1, al parecer juega un papel en el proceso antiinflamatorio y su inhibición explicaría

el alivio del dolor y la reducción de la fiebre.8, 9

La (COX-2, prostaglandina H sintasa-2, PGHS-2) y COX-1 tienen sitios activos similares,

cada uno de los cuales consta de un canal hidrofóbico largo y estrecho. Una única diferencia

de aminoácidos entre las dos enzimas es en la posición 523, COX-1 tiene una molécula de

isoleucina y COX-2 una valina. Esta diferencia resulta en un mayor acceso a la enzima COX-

2, que se cree que es el sitio de unión de muchas drogas selectivas. Sin embargo, las

principales diferencias entre COX-1 y COX-2 se localizan en los extremos amino y carboxilo

terminal, por lo cual los sitios de acetilación para la COX-1 es serina 529 y para COX-2 es

serina 516, ambos cercanos al extremo carboxilo terminal, son sitios altamente conservados,

por ello ambas enzimas son susceptibles a la inhibición mediante el uso de agentes

antinflamatorios no esteroideos (AINEs). Otro sitio activo clave de COX-2 y COX-1 es Arg-

120, que sirve como contraión para el grupo carboxilato de ácido araquidónico y AINEs. Las

enzimas COX catalizan la conversión de ácido araquidónico (AA) a prostaglandinas en un

proceso de dos pasos, primer paso, el hidrógeno se extrae del C13 de AA, y luego la

ciclooxigenasa añade dos moléculas de oxígeno, resultando en PGG2. En el segundo paso,

PGG2 se reduce a PGH2 por la actividad peroxidasa de las enzimas. La PGH2 sintetizada se

convierte rápidamente en prostaglandinas (PGD2, PGE2, PGF2R), prostaciclina (PGI2) o

tromboxano A2 (TxA2) por isomerasas específicas de tejido.10, 11

Los fenamatos son derivados del ácido antranílico sustituidos con un grupo arilo en el átomo

de nitrógeno; presentan un perfil farmacológico similar al de los salicilatos y se cree que

actúan, al igual que estos, por inhibición reversible de la ciclooxigenasa. En cuanto a las



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relaciones estructura-actividad (SAR), la introducción de sustituyentes sobre el anillo

aromático del ácido antranílico conduce a resultados negativos, mientras que la actividad

máxima se observa en derivados sustituidos en posición orto del otro grupo arilo como en el

ácido mefenámico o en el ácido meclofenámico. Además, la mayor parte de los AINEs son

carboxílicos, no obstante, los coxibs (celecoxib) contienen con frecuencia grupos

sulfonamida o sulfona; se cree que estos son determinantes de la selectividad de la molécula,

al impedir el acceso al canal hidrófobo en la COX-1. Por la similitud de la estructura se eligió

el ácido mefenámico como molécula patrón para comparación de los metabolitos presentes

en Plantago major L. El ácido mefenámico es un agente no esteroideo con demostrada

actividad antiinflamatoria, analgésica y antipirética. 12

El estudio titulado “Extracción de fluido supercrítico guiada por bioensayo de sustancias

inhibidoras de ciclooxigenasa-2 en Plantago major L.” se concluyó que variando las

condiciones de SFE (extracción de fluido supercrítico) fue posible obtener extractos

altamente enriquecidos con sustancias inhibidoras de la enzima COX-2.13

Plantago major L. se puede encontrar en regiones con climas templados y fríos, no

demasiado calurosos. Es una hierba perenne que desarrolla su ciclo de vida entre seis y siete

meses. Posee una altura entre los 15 cm a 30 cm; sin embargo, su longitud puede variar según

los distintos hábitats de crecimiento. Popularmente, es conocida como “llantén”. Por ser una

planta de fácil localización, no se cultiva, lo que hace que se considere como una maleza. Es

comercializada como planta medicinal tradicional, gracias a sus propiedades

antiinflamatorias, antibacterianas, astringentes y antihemorrágicas; también como

cicatrizante de heridas, tanto interna como externa. Las propiedades antiinflamatorias de las

hojas de plantago major L. se les atribuye a las moléculas como; baicaleína, hispidulina,

aucubina, ácido ursólico, ácido oleanólico, ácido glicirrético y sitosterol.14, 15



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Los componentes principales de la hoja del llantén son los iridoides heterosídicos, el

mayoritario es la aucubina (0,3-2,5%) que ha demostrado efecto antiinflamatorio, también

hay otras moléculas a las que se le atribuye esta actividad tal como; baicaleína, hispidulina

(ambas sustancias son flavonas). Mediante experimentos in vitro e in vivo se ha comprobado

que los componentes de las hojas de llantén tienen actividad antiinflamatoria. Diversos

extractos inhiben la producción de óxido nítrico en macrófagos y un extracto hidroalcohólico

inhibe la actividad de COX-2.16, 17, 18

Por lo expuesto en los párrafos anteriores se planteó el siguiente problema:

¿Cuál de los metabolitos activos con actividad antiinflamatoria reportada,

presentes en las hojas de Plantago major L. es el mejor candidato a fármaco

antiinflamatorio activo sobre COX-2?

Donde la Hipótesis es:

● Implícita

Se planteó los siguientes objetivos:

● General:

✓ Reconocer entre los metabolitos activos con actividad antiinflamatoria

reportada presentes en las hojas de Plantago major L., el mejor candidato a

fármaco activo sobre COX-2.

● Específicos:

✓ Determinar cuál de las moléculas tiene mayor unión al receptor COX-2.

✓ Determinar la unión al receptor COX-2 de las siete moléculas.

✓ Determinar cuál de las moléculas tiene mejor perfil cinético.

✓ Identificar cuál de las moléculas tiene una mayor accesibilidad sintética.



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II. MATERIAL Y MÉTODO

2.1. Material

2.1.1 Material de estudio

Servidores: I-Tasser, SwissADME, pkCSM.

Programas: Pymol, Open Babel, AutoDock Vina, Discovery Studio.

2.1.2 Método

• Búsqueda de Información

Se realizó una búsqueda de información de metabolitos activos con actividad

antiinflamatoria reportada en bases de datos:

Google Académico, PubMed y ScienceDirect

Se utilizó como palabras claves y conectores booleanos: “Plantago major”

AND “Antiinflamatory”19

• Análisis de Docking Molecular

El servidor I-Tasser fue utilizado para la predicción tridimensional de los

targets seleccionados, cuyas secuencias fueron extraídas de la base de datos

NCBI, se seleccionó la predicción tridimensional con el mejor C-Score. Toda

secuencia óptima fue corroborada con cristales previamente seleccionados de

la base de datos Protein Data Bank mediante el uso del programa Pymol 2.4.19

Las estructuras de los ligandos fueron preparadas para el Docking Molecular

mediante el uso del programa Open Babel.21, 22, 23

Teniendo la estructura del target y de los ligandos, se usó el programa

AutoDock Vina para realizar el Docking molecular. Los análisis se repitieron

50 veces para obtener los valores más cercanos a la realidad.



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• Análisis Cinético

El análisis fisicoquímico se realizó mediante el uso del servidor SwissADME

y el análisis cinético de las moléculas en estudio se realizó con el servidor

pkCSM.24, 25

Vida media: Es el tiempo para que la concentración del fármaco se reduzca a

la mitad (normalmente en horas). Los datos de Clearence y Vd obtenidos de

pkCSM se utilizaron en la siguiente fórmula para la obtención de la vida media

(horas).36

• Análisis de Data

✓ Análisis Farmacodinámico

Energía libre de Gibbs (ΔG°): sirve para determinar si una reacción

se puede dar de forma espontánea, sin necesitar de energía adicional.

Un valor negativo indicaría que la reacción es espontánea. Se obtuvo

mediante VINA.27

Constante de inhibición (Ki): concentración necesaria del metabolito

en el sitio activo para poder ejercer la inhibición del receptor.36

Ki = ΔG° = 2.303RT log (Ki) = # de Moles

Energía de enlace (LE): es la energía necesaria para romper un mol de

enlaces de una sustancia.28

LE = ΔG/n

donde “n” son los átomos no hidrógeno

Número de interacciones: son todas las fuerzas atractivas o repulsivas

entre moléculas y entre átomos no enlazados.29

𝑡1/2 =0.693 𝑥 𝑉𝑑

𝐶𝑙



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✓ Análisis Farmacocinético y Fisicoquímico

Regla de Lipinski (posibilidad de absorción): Esta regla predice que

si un compuesto viola 2 o más de los siguientes postulados, tendrá

problemas de absorción, los cuatro postulados de Lipinski son los

siguientes:30

1.- Peso Molecular menor de 500.

2.- Número de donadores de enlace (puente) de hidrógeno igual o

menos de 5 (suma de los grupos OH y NH en la molécula).

3.- Número de aceptores de enlace (puente) de hidrógeno igual o menor

a 10 (suma de O y N en la molécula).

4.- Log P calculado (C log P) menor a 5.

LogS: representa la solubilidad acuosa.31

LogP: representa la lipofilicidad, que suele expresarse como

coeficiente de partición.31

Accesibilidad sintética: facilidad para replicar la molécula en

laboratorio (1 - 10), de muy fácil a muy difícil respectivamente.32

ADME y toxicidad: etapas farmacocinéticas que atraviesan los

medicamentos en el organismo (absorción, distribución, metabolismo,

excreción y toxicidad).26

La data obtenida bajo diversos servidores fue analizada bajo el punto de vista

crítico haciendo uso de fundamentos base de la química medicinal,

comparando y analizando las probables dificultades de absorción, distribución,

metabolismo, excreción y toxicidad que poseen las estructuras, así como

posibles interacciones con el consumo de medicación adicional que pueda

consumir un potencial paciente.26, 32



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III. RESULTADOS

FIGURA N°1: Búsqueda de información de metabolitos activos con actividad

antiinflamatoria reportada en bases de datos

Google

Académico

(n=1580)

2718 artículos identificados en buscadores

12 artículos hacen mención de metabolitos activos, responsables de una

actividad antiinflamatoria de Plantago major L.

Se encontraron 7 moléculas a las que se les atribuye la actividad

antiinflamatoria de Plantago major L.: Aucubina, baicaleína, hispidulina,

ácido oleanólico, ácido glicirrético, ácido ursólico y sitosterol.

FIGURA N°2: Valores RMSD de la estructura del receptor COX-2 predicha con

el programa Pymol

ExecutiveRMS: 442 atoms rejected during cycle 1 (RMSD=1.57).





Executive: RMSD = 0.570 (5352 to 5352 atoms)



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TABLA N°1: Energía de afinidad y número de interacciones de los metabolitos activos de Plantago major L. sobre la enzima Ciclooxigenasa 2

(COX-2). Datos obtenidos mediante el servidor Pubchem y el programa Discovery studio

Metabolito Fórmula

Energía de

Afinidad

(ΔG)

Ki (M)LE

kcal/mol/átomos

Número de

Interacciones

Número de

Puentes de

hidrógeno

Aminoácidos

enlazantes con

Puentes de

hidrógeno

Aucubina C15H22O9 -5.8 5.56x10-05 -0.24 10 4ARG106, TYR341,

TYR371, MET508

Baicaleína C15H10O5 -6.0 3.97x10-05 -0.30 14 1 SER516

Hispidulina C16H12O6 -5.0 2.15x10-04 -0.23 19 1 SER516

Ácido mefenámico C15H15NO2 -6.9 8.68x10-06 -0.38 11 1 SER516

Donde:

Ki= Constante de inhibición

ΔG°= Energía libre de Gibbs

LE= Eficiencia del enlace



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TABLA N°2: Características químicas de los metabolitos activos de interés de Plantago major L. que presentan afinidad por la enzima

Ciclooxigenasa 2 (COX-2). Datos obtenidos mediante servidor SwissADME

Donde:

1 = Dato de solubilidad obtenido con algoritmo ESOL

MetabolitoLogP

(lipofilicidad)

LogS1

(solubilidad acuosa)LogS1 (Interpretación) Lipinski

Accesibilidad

sintética

Aucubina -1.89 0.18 Soluble Sí, 1 5.79

Baicaleína 2.24 -4.03 Moderadamente soluble Sí, 0 3.02

Hispidulina 2.12 -3.99 Soluble Sí, 0 3.12

Ácido mefenámico 3.30 -4.86 Moderadamente soluble Sí, 0 2.01



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TABLA N°3: Datos cinéticos de los metabolitos de interés de Plantago major L. Datos obtenidos mediante el servidor pkCSM

MetabolitoAbsorción

(%)P-gp

VDss

(Log

L/kg)

BBB

(LogBB)

CYP

1A2

CYP

2D6

CYP

2C9

CYP

2C19

CYP

3A4

Total Clearence

(log ml/min/kg)

T1/2

(hora)

Test de Ames

(Si/No)

Aucubina 35.949 S -0.333 -1.154 - - - - - 1.368 0.23 No

Baicaleína 94.268 S -0.004 -1.061 Inh - - - Inh 0.252 6.41 No

Hispidulina 84.654 S 0.37 -1.120 Inh - Inh Inh S 0.531 7.97 No

Ácido mefenámico 96.888 - -1.969 0.321 Inh - Inh - - 0.334 0.06 No

Donde:

S = Sustrato

Inh = Inhibidor



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IV. DISCUSIÓN

En el presente trabajo de investigación se buscó reconocer entre los metabolitos activos con

actividad antiinflamatoria reportada, presentes en las hojas de Plantago major L., el mejor

candidato a fármaco activo sobre COX-2 mediante un estudio computacional. Para ello se

inició la investigación con una revisión de información en buscadores como; Pubmed,

Google Académico y ScienceDirect; tal como se muestra en la Figura N°1. Donde se

obtuvieron 2718 artículos en total, de los cuales se seleccionaron 12 artículos que fueron

revisados en su totalidad, identificando 7 moléculas a las que se les atribuiría la actividad

antiinflamatoria de Plantago major L. Siendo estas; Aucubina, baicaleína, hispidulina, ácido

oleanólico, ácido glicirrético, ácido ursólico y sitosterol.14, 15, 16, 17

Posteriormente se procedió a realizar la predicción tridimensional del target seleccionado

(COX-2), usando el servidor I-Tasser y el programa pymol, tal como se muestra en la Figura

N°2 donde podemos observar un valor RMSD=0.570 obtenido al corroborar la estructura del

receptor Ciclooxigenasa- 2 (COX-2) en el programa pymol. El valor RMSD (desviación de

la media cuadrática) es la medida de la distancia promedio entre los átomos de las moléculas

superpuestas. Se espera que, al superponer estructuras de proteínas móviles, tengan mayores

diferencias en su RMSD ya que los distintos confórmeros depositados en el PDB dan

muestras de mayores diferencias entre ellas, tal como se observa en la Figura N°2 dónde el

valor obtenido fue superior a 0.5 concluyéndose así que la estructura del receptor estuvo bien

predicha y lista para realizar el docking molecular.33

En cuanto a los ligandos, usando el programa AutoDock Vina, se realizó el docking

estructural para conocer la energía de afinidad (EA) de los 7 metabolitos encontrados en

Plantago major L. Esta energía de afinidad se refiere a que la interacción entre ambas

moléculas (ligando y receptor COX-2) generaría que los átomos estructurales aceptaran



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electrones y se transformaran en iones negativos o aniones, con el consiguiente intercambio

de energía. Por ello se podría establecer la regla; a menor energía de afinidad, mayor

interacción entre los átomos de las moléculas. Además, se determinó la energía de afinidad

del ácido mefenámico, la cual se consideró como molécula control; siendo -6.9 y se usó este

resultado como base, tal y como se reporta en la Tabla N°1.34

De acuerdo con ello se encontró que las moléculas; ácido oleanólico, ácido glicirrético, ácido

ursólico y sitosterol tenían una energía de afinidad más positiva, lo cual nos demuestra la no

afinidad por el receptor COX-2. Más aun tomando en consideración la EA= -6.9 de nuestra

molécula control, el ácido mefenámico. El que estas moléculas no hayan presentado unión al

receptor COX-2 podría asociarse a que son moléculas estructuralmente parecidas al

colesterol que derivan del ciclopentano perhidrofenantreno y posiblemente sus propiedades

antiinflamatorias se deban a su interacción con otro tipo de receptor, tal como el de los

corticoides, cuyo receptor se encuentra a nivel nuclear.35

Por otro lado, se determinó que aucubina, baicaleína e hispidulina tenían una EA cercana a

la del ácido mefenámico; siendo la energía de afinidad de la baicaleína la más baja entre ellas

(-6.0), encontrando que la constante de inhibición (Ki) de esta estructura es de 3.97x10-05 M,

tal como se muestra en la Tabla N°1, lo cual es bastante bajo considerando que esta es la

concentración necesaria de esta molécula en el sitio activo para poder ejercer la inhibición

del receptor ciclooxigenasa 2. La estructura de baicaleína no tiene tantas interacciones, solo

14, tiene un puente de hidrógeno con la SER516 como se observa en la figura N°6 del Anexo

2. La interacción con la SER516 es muy importante porque la interacción con este

aminoácido es fundamental para la inhibición de todo el receptor COX-2 ya que los AINEs

como el ácido acetilsalicílico, acetila el residuo 516 constituido por una serina; esta isoforma

acetilada pasa a sintetizar 15(R)-HETE (15(R) hidroxieicosatetranoico), el cual, a su vez,

forma un potente agente antiinflamatorio derivado de la 5-LOX, la 15 epilipoxina A4.36, 37



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Además de ello en la Tabla N°2 se evidencia que las estructuras de baicaleína e hispidulina

tienen un logP de 2.24 y 2.12 respectivamente, lo cual indica una factibilidad para atravesar

membranas. Aucubina tiene un logP de -1.89 haciendo a esta estructura totalmente

hidrofílica, lo que a su vez dificultaría su ingreso a porciones mucho más profundas del

organismo; esto se puede comprobar al observar que aucubina infringe una de las 4 reglas de

Lipinski, la cual dice que la molécula no debe contener más de 5 grupos hidroxilos porque

esto dificulta su absorción, haciendo también que esta molécula tenga un logS positivo, lo

cual le permitiría aparentemente una fácil solubilidad acuosa, pero una mala absorción

gastrointestinal como se observa en la Tabla N°3, dónde baicaleína e hispidulina tienen una

muy buena absorción 94.268% y 84.654% respectivamente a diferencia de aucubina que

solamente tendría una absorción intestinal de 35.949%, pero para no descartar a aucubina,

por su fácil solubilidad, pero difícil absorción, se podría aprovechar sus propiedades

antiinflamatorias desarrollando una formulación que aumente su absorción.38

En la Tabla N°3 se evidencia que entre baicaleína e hispidulina; baicaleína tiene una menor

probabilidad de inhibir a citocromos metabolizantes lo cual le podría dar una menor

capacidad en comparación a hispidulina de generar interacciones con otras sustancias que se

estén consumiendo ya que baicaleína puede inhibir a 2 citocromos CYP1A2 y CYP3A4, en

cambio hispidulina es un probable inhibidor de CY1A2, CYP2C9 y CYP2C19 aparte de ser

sustrato de CYP3A4; si bien es cierto que esta última enzima es la metabolizante de la mayor

cantidad de sustancias, hispidulina inhibe una mayor cantidad de citocromos, lo que podría

generar mayores interacciones farmacológicas en comparación con baicaleína. También se

puede observar en la Tabla N° 3 que ambos metabolitos tienen un casi nulo traspase a barrera

hematoencefálica a diferencia de la molécula control; ácido mefenámico, la cual si atraviesa

barrera hematoencefálica. El no atravesarla es importante ya que evita efectos secundarios a

nivel de SNC algo que el ácido mefenámico si reporta dentro de las referencias tal como

mareo, dolor de cabeza y nerviosismo.39



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Por otro lado, el volumen de distribución de baicaleína e hispidulina es mucho más alto que

el de la molécula control y en cuanto al “total clearence”, baicaleína tiene el valor más bajo,

siendo 0.252 log (ml/min/kg) lo cual da un tiempo de vida media en horas bastante elevado

(6.41 horas) en comparación a ácido mefenámico (0.06 horas). El tiempo de vida media

obtenido con el servidor pkCSM para el ácido mefenámico es mucho más bajo en

comparación a lo reportado en las referencias; 2h, eso podría deberse a que la base de datos

utilizada para la generación del algoritmo de pkCSM no esté contemplando moléculas

similares a ácido mefenámico, esto generaría un sesgo en los datos de vida media obtenidos,

sin embargo, tienen un margen de error muy similar por ser datos obtenidos con el mismo

servidor. Para una mejor obtención de toda la data de vida media sería importante continuar

los estudios in vitro como in vivo.40

Además, ninguna de estas moléculas reporta una probable mutagenicidad o toxicidad de

acuerdo los resultados del algoritmo hacia el Test de Ames, el cual es una prueba in vitro que

permite evaluar el potencial efecto mutagénico de compuestos químicos o productos

biológicos como una medida indirecta del posible efecto carcinogénico sobre seres humanos.

De acuerdo a todo esto se puede mencionar que al tener una menor cantidad de inhibiciones

hacia citocromos, tener un tiempo de vida media aparentemente aceptable, no tener toxicidad

de acuerdo al Test de Ames, tener un mayor porcentaje de absorción, una energía de afinidad

mucho más alta, una interacción hacia SER516, no tener violaciones a la regla de Lipinski,

un logP bastante elevado o ligeramente lipófilo y por tener el menor valor de accesibilidad

sintética (la molécula menos complicada de sintetizar en laboratorio) baicaleína es la mejor

molécula extraída de Plantago major L., elegida en esta investigación como candidata a

fármaco antiinflamatorio.40, 41



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V. CONCLUSIONES

1. Se reconocieron los metabolitos activos con actividad antiinflamatoria reportada

presentes en las hojas de Plantago major L.: Aucubina, baicaleína, hispidulina, ácido

oleanólico, ácido glicirrético, ácido ursólico y sitosterol, siendo baicaleína el

metabolito mejor candidato a fármaco.

2. Se determinó la unión al receptor COX-2 de las 7 moléculas usando el programa

AutoDock Vina, siendo baicaleína la que tiene una menor energía de afinidad (EA:

-6.0), similar a la molécula control, ácido mefenámico (EA: -6.9).

3. Se determinó que el metabolito baicaleína, tiene un mejor perfil cinético y mayor

accesibilidad sintética, siendo elegido como candidato a fármaco antiinflamatorio.

VI. RECOMENDACIONES

Realizar ensayos in vitro e in vivo para corroboración de los datos obtenidos en este

estudio computacional.



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Pk-9nAL6l&sig=ACfU3U2LLw1nDC9PQ8BEcKAMD9FNMZnKEw&hl=es-

419&sa=X&ved=2ahUKEwjxsPGB1bjyAhX_TTABHW3_BPsQ6AF6BAghEAM#v=on

epage&q=accion%20del%20acido%20mefenamico%20sobre%20la%20serina%20516%

20de%20la%20cox2&f=false

38. Florin I. Búsqueda de moléculas con potencial farmacológico contra la enfermedad de

Alzheimer [Internet] 2017 [Consultado el 17 de agosto del 2021] Disponible en:

http://openaccess.uoc.edu/webapps/o2/bitstream/10609/64165/6/iiancuTFM0617memori

a.pdf

39. Ácido Mefenamico. Medline Plus. [Internet]2021[Consultado el 21 de agosto del 2021].

Disponible en: https://medlineplus.gov/spanish/druginfo/meds/a681028-es.html

40. Drugbank [Internet] [Consultado el 22 de agosto del 2021] Disponible en:

https://go.drugbank.com/drugs/DB00784

41. Farmacopea Argentina. Ensayo de salmonella/fracción microsomal (test de ames) para

detección de mutagenicidad. [Internet] [Consultado el 17 de agosto del 2021]; 7(6).

Disponible en:

http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/flip_pages/farmacopea_vol_iv/files/assets/basic-

html/toc.html



https://books.google.com.pe/books?id=BeQ6D40wTPQC&pg=PA514&lpg=PA514&dq=accion+del+acido+mefenamico+sobre+la+serina+516+de+la+cox2&source=bl&ots=LPk-9nAL6l&sig=ACfU3U2LLw1nDC9PQ8BEcKAMD9FNMZnKEw&hl=es-419&sa=X&ved=2ahUKEwjxsPGB1bjyAhX_TTABHW3_BPsQ6AF6BAghEAM#v=onepage&q=accion%20del%20acido%20mefenamico%20sobre%20la%20serina%20516%20de%20la%20cox2&f=false






http://openaccess.uoc.edu/webapps/o2/bitstream/10609/64165/6/iiancuTFM0617memoria.pdf

http://openaccess.uoc.edu/webapps/o2/bitstream/10609/64165/6/iiancuTFM0617memoria.pdf

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VIII. ANEXOS



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ANEXO N°1:

FIGURA N° 3: Secuencia aminoacídica de la enzima ciclooxigenasa 2 (COX-2)

Fuente: servidor NCBI

FIGURA N° 4: Molécula de COX-2 obtenida de Protein Data Bank (PDB) con

código 5IKR y emulada en I-Tasser

Fuente: programa Pymol



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ANEXO N°2:

- Imágenes de Docking molecular de metabolitos que presentaron interacción con

la ciclooxigenasa 2

FIGURA N° 5: Docking molecular de la aucubina y la COX-2 en formato 2D

Fuente: programa Discovery studio



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FIGURA N° 6: Docking molecular de la baicaleína y la COX-2 en formato 2D




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FIGURA N° 7: Docking molecular de la hispidulina y la COX-2 en formato 2D




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FIGURA N° 8: Docking molecular del ácido mefenámico y la COX-2 en formato 2D




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ΔG°x1000

1363.24242849 cal/mol= log Ki

10ΔG°x1000

1363.24242849 cal /mol = Ki

ANEXO N°3:

- Cálculos para completar la tabla N°2

1.- Energía de enlace (LE)

LE = ΔG/n

Donde “n” son todos los átomos presentes en la molécula diferentes del

hidrógeno.

2.- Constante de Inhibición (Ki)

Ki = ΔG° = 2.303RT log (Ki)

Donde “R” es la constante de los gases expresada en términos de energía (1.9853832

cal/K.mol) y “T” es la temperatura en Kelvin (25 °C =298.15 K)

Por lo tanto:

2.303RT = 1363.24242849 cal/mol

Entonces:

ΔG° = 1363.24242849cal

mollog Ki

# de Moles = Ki



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● 1 Este formato debe ser llenado, firmado, adjuntado al final del documento del PIC, del Informe de Tesis,

Trabajo de Investigación respectivamente.

Jr. Diego de Almagro #344 T. 051 - 044-2055B / Mesa de Partes: 044-209020 Email: [email protected]

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Anexo R.R. O 384-2018/UNT Pág. PAGE


UNTUNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

DECLARACIÓN JURADA

RECTORADO

Los AUTORES suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que

somos los responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del Proyecto de

Investigación Científica, así como, del Informe de la Investigación Científica realizado.

TITULO: Análisis computacional de metabolitos de Plantago major L. como futuros candidatos

a fármacos antiinflamatorios.

.

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA INFORME FINAL DE INVESTIGACION CIENTIFICA

Equipo Investigador Integrado por:

N°APELLIDOS Y

NOMBRESFACULTAD

DEP.

ACADÉMICO

CATEGORÍA

DOCENTE

ASESOR

CÓDIGO

Docente asesor

Número

Matrícula del

estudiante

Autor

Coautor

asesor

01 Arribasplata ChamorroErika Jakeline

Farmacia y

Bioquímica

Farmacología - 1031100113 Autora

02 Villarreal La Torre VíctorEduardo

Farmacia y

Bioquímica

Farmacología Contratado 6095 Asesor

Trujillo, …. de…………de………….

70498267 .

DNI

70323118 . .

DNI

…………………………………… ………………………………………

Firma

……………………………………

Firma (Estudiante)

……………………………………

Firma (Asesor)

PROY DE TRABAJO DE INVESTIGACION ( ) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN (PREGRADO) ( )

(PREGRADO)

PROYECTO DE TESIS PREGRADO ( ) TESIS PREGRADO (X)

PROYECTO DE TESIS MAESTRÍA ( ) TESIS MAESTRÍA ( )

PROYECTO DE TESIS DOCTORADO ( ) TESIS DOCTORADO ( )



Bibliot

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● 1 Este formato debe ser llenado, firmado, adjuntado al final del documento del PIC, del Informe de Tesis,

Trabajo de Investigación respectivamente.


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DECLARACIÓN JURADA

RECTORADO

Los AUTORES suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que

somos los responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del Proyecto de

Investigación Científica, así como, del Informe de la Investigación Científica realizado.

TITULO: Análisis computacional de metabolitos de Plantago major L. como futuros candidatos

a fármacos antiinflamatorios.

.

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Equipo Investigador Integrado por:

N°APELLIDOS Y

NOMBRESFACULTAD

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ACADÉMICO

CATEGORÍA

DOCENTE

ASESOR

CÓDIGO

Docente asesor

Número

Matrícula del

estudiante

Autor

Coautor

asesor

01 Jara Rojas Luisa Marlyng Farmacia y

Bioquímica

Farmacología - 1011100313 Autora

02 Villarreal La Torre VíctorEduardo

Farmacia y

Bioquímica

Farmacología Contratado 6095 Asesor

Trujillo, …. de…………de………….

74045791 .

DNI

70323118 . .

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(PREGRADO)

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PROYECTO DE TESIS MAESTRÍA ( ) TESIS MAESTRÍA ( )

PROYECTO DE TESIS DOCTORADO ( ) TESIS DOCTORADO ( )



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CARTA DE AUTORIZACIÓN DE PUBLICACIÓN DE TRABAJO DE

INVESTIGACIÓN EN REPOSITORIO DIGITAL RENATI-SUNEDU

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Los autores suscritos del INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA

Titulado: Análisis computacional de metabolitos de Plantago major L. como futuros candidatos a fármacos

antiinflamatorios

AUTORIZAMOS SU PUBLICACIÓN EN EL REPOSITORIO DIGITAL INSTITUCIONAL,REPOSITORIO RENATI-SUNEDU, ALICIA-CONCYTEC, CON EL SIGUIENTE TIPO DEACCESO:

A. Acceso Abierto: x

B. Acceso Restringido (datos del autor y resumen del trabajo)

C. No autorizo su Publicación

Si eligió la opción restringido o NO autoriza su publicación sírvase justificar……………

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ESTUDIANTES DE PREGRADO: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TESIS

ESTUDIANTES DE POSTGRADO: TESIS MAESTRÍA TESIS DOCTORADO

N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD

CONDICIÓN

(NOMBRADO,

CONTRATADO,

EMÉRITO,estudiante, OTROS)

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Docente asesor

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Autor

Coautor

asesor

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Farmacia y Bioquímica Farmacología 1031100113 Autora

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DOCENTES: INFORME DE INVESTIGACIÓN OTROS

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tesis ii para optar el grado acadÉmico de

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