teknik aseptis

7/17/2019 Teknik Aseptis

http://slidepdf.com/reader/full/teknik-aseptis-568e8c514046f 1/12

Pokok Bahasan IV : TEKNIK ASEPTIS

Pendahuluan

Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri,

jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Hambatan

utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi

yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama

kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme

menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera

mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur. Mikroorganisme ini

meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas

metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka

dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan

tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena

dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia

kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan

tsb.

Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur

jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi

kontaminasi adalah:

1. Sterilisasi ruang kerja

2. Sterilisasi medium dan alat-alat

3. Sterilisasi eksplan.

Tujuan Instruksional Khusus:

Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan

prinsip kerja aseptik yang meliputi: teknik Sterilisasi ruang kerja, medium, alat-

alat dan eksplan.



Subpokok Bahasan 1 : STERILISASI RUANG KERJA, MEDIUM, ALAT-ALAT

DAN EKSPLAN

Pendahuluan

Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur

Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi /

Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman

eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya

mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus

diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu

lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang

tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk

kedalam botol-botol yang berisi medium kultur. Serangga-serangga kecil ini

menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri

biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah

dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk.

Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan.

Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan

yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.

Materi Subpokok Bahasan 1

Sterilisasi ruang kerja

Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril,

ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi

dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan

lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya

ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan

harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya

bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena

dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada

satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari

jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat

menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30



menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup.

Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab.

masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik,kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat

alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain

Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).

a. Laminar air flow (laf).

Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk

menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis

haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang

sudah disaring (lihat gambar 1).

Gambar 4.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b)

blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.



Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high

efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 μm, spora-spora

jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluarsudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum

mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain

yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat

dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2. detail ruang kerja). Alat-alat dan

medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya,

untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap

dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum

bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan

kontaminan pada permukaan ruang kerja.

Gambar 4.2. Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur

dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh

menghalangi hembusan udara steril.



Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan

untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti

dengan lampu spiritus atau baktisinerator.

b. Steril box (entkas)

Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga

yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti

kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan

kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya

dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran

sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah

tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan

memudahkan untuk membersihkannya.

Gambar 4.3 Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca

Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan

melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam

entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan

porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi

satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat

didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot



permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan

kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga

dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harusditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata

dan kulit dari bahaya radiasi UV.

Sterilisasi media dan alat-alat

Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya

dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya

autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini

adalah pada temperatur 121°C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara

15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml

media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan

dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan

tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.

Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling

sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana

pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu

tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan

autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang

ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga

akan tercapai temperature 121°C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave

yang programmable). Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep

pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan

sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa

akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan

meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah

pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini

kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada

skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah

yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis

sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain.



Tabel 4. 1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media

Volume per wadah (ml) Waktu minimal sterilisasi pada 121°C

(menit)20 – 50

75

250 – 500

1.000

1.500

2.000

15

20

25

30

35

40

(Biondi dan Thorpe, 1978)

Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai

banyak kelemahan, antara lain:

1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa

2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan

terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun

didalam medium kultur

3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami

perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.

Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas

yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi

dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25°C). Dengan memakai

ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam

medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf)

ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa

macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus

dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter

holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari

filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 μm. Untuk larutan

termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi

dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam

jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu

dengan pompa vakum.



Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset

bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol

kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi,dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alat-

alat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan

aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol

kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau

bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol

kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika

disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan

didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol

kultur.

Sterilisasi eksplan

Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun

organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan

didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih

bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya

yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar,

penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip

yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik

antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama

meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan

meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler

(gambar 4. 4).



Gambar 4. 4. Tanam dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana

didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik.

Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam

keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali

menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri,

jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan

ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan. Kultur

jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak

dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat

dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya

kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam

didalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi

akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat



didalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi,

karena sterilisasi permukaan tidak akan efektip.

Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanyadapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical

meristem, embrio dsb sampai yang berukuran 1 cm atau lebih misalnya ruas

batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dsb. Bagian-bagian tanaman tersebut

seringkali masih tertutup oleh jaringan / sarung-sarung daun misalnya pada daun

tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah

bagian daun yang ada didalamnya masih suci hama. Eksplan yang berukuran

terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika

digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan

juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilemma ini

menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua

tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah

bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan keduanya adalah jasad hidup,

kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan.

Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah

calcium hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2),

alkohol dsb. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung

dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam

rumah kaca relatip lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada

umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur

sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan

pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi.

Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga

perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang

menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril,

seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah ( Triton-X , Tween 20

atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan.

Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril

pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.



Tabel 4. 2. Efektifitas beberapa bahan pensteril

Bahan pensteril Konsentrasi Lama

perendaman

Efektifitas

Cacium hypochlorite (9-10)% (5 - 30 ) menit Sangat bagus

Sodium hypoehlorite 2%(bayclin 20%) (5 - 30 ) menit Sangat bagus

Hydrogen peroxide (10-12)% (5 - 15 ) menit Bagus

Bromine water (H2O2) (1-2)% (2 - 10 ) menit Sangat bagus

Silver nitrate 1% (5 - 30 ) menit Bagus

Mercuric chloride (0,1 - 1)% (2 - 10 ) menit Memuaskan

Antibiotics (4 - 50) mg 1-1 (30 - 60) menit Cukup bagus

Bhojwani & Razdan, (1983)

Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent

dan dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30

menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka

terhadap bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya

kemudian dibawa kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk

sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril,

misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan

air steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan sublimate danpembilasan dengan air steril.

Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang

tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam

buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa

saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api

padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.



Latihan soal-soal

1. Jelaskan bagaimana prinsip kerja autoclave, apa kelemahan sterilisasi

medium dengan autoclave!2. Jelaskan apa bahayanya sinar UV yang digunakan untuk sterilisasi ruang

kerja!

3. Jelaskan bagaimana prinsip kerja Laminar Air Flow!

4. Jelaskan cara sterilisasi medium dalam jumlah banyak yang ditambahkan

asam-asam amino dan Gibberellin!

5. Jelaskan tahapan-tahapan yang harus dijalankan untuk sterilisasi eksplan

yang berasal dari lapangan!

Petunjuk jawaban latihan soal-soal

1. Ingat cara kerja autoclave dan akibat yang ditimbulkan oleh pemanasan

yang bertekanan terhadap komponen medium!

2. Ingat sifat-sifat sinar UV!

3. Ingat arti Laminar Air Flow!

4. Ingat cara sterilisasi medium!

5. Ingat cara sterilisasi eksplan secara bertingkat!

teknik aseptis

Documents