STUDI TERAPI EKSTRAK ETANOL AKAR SELEDRI (Apium graveolens) TERHADAP EKSPRESI TGF-

PROTEIN JEJUNUM PADA TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

HASIL INDUKSI INDOMETASIN

SKRIPSI

Oleh :

TYAS WAHYULI 105130107111001

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2017

ii

STUDI TERAPI EKSTRAK ETANOL AKAR SELEDRI (Apium

graveolens) TERHADAP EKSPRESI TGF- PROTEIN JEJUNUM PADA TIKUS (Rattus norvegicus)

MODEL INFLAMMATORY BOWEL DISEASE HASIL INDUKSI INDOMETASIN

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan

Oleh :

TYAS WAHYULI

105130107111001

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER HEWAN FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2017

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

STUDI TERAPI EKSTRAK ETANOL AKAR SELEDRI (Apium graveolens) TERHADAP EKSPRESI TGF-

PROTEIN JEJUNUM PADA TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

HASIL INDUKSI INDOMETASIN

Oleh : TYAS WAHYULI 105130107111001

Setelah dipertahankan di depan Majelis Penguji Pada tanggal 06 Juni 2017

dan dinyatakan memenuhi syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan

LEMBAR PERNYATAAN

Pembimbing II

drh. Dyah Ayu Oktavianie A. P. , M. Biotech NIP. 19841026 200812 2 004

Pembimbing I

NIP. 19600903 198802 2 001

Mengetahui

Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya

NIP. 19600903 198802 2 001

iv

LEMBAR PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama : TYAS WAHYULI NIM : 105130107111001 Program Studi : Pendidikan Dokter Hewan Penulis Skripsi berjudul :

STUDI TERAPI EKSTRAK ETANOL AKAR SELEDRI (Apium graveolens) TERHADAP EKSPRESI TGF-JEJUNUM PADA TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL INFLAMMATORY BOWEL DISEASE HASIL INDUKSI INDOMETASIN

Dengan ini menyatakan bahwa:

1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan tertulis di daftar pustaka dalam skripsi ini.

2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan, maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya terima.

Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang, 19 Mei 2017 Yang menyatakan, TYAS WAHYULI NIM. 105130107111001

v

STUDI TERAPI EKSTRAK ETANOL AKAR SELEDRI (Apium graveolens) TERHADAP EKSPRESI TGF-

PROTEIN JEJUNUM PADA TIKUS (Rattus norvegicus) MODEL INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

HASIL INDUKSI INDOMETASIN

ABSTRAK

Inflammatory bowel disease (IBD) merupakan suatu kondisi inflamasi pada saluran pencernaan. Indometasin yang termasuk dalam golongan obat NSAID menjadi salah satu penyebab munculnya penyakit IBD. Ekstrak etanol akar seledri mengandung flavonoid diosmin yang berpotensi sebagai alternatif terapi IBD. Penelitian ini bertujuan mengetahui kemampuan ekstrak etanol akar seledri dalam meningkatkan ekspresi TGF- dan mengamati perubahan profil protein pada jejunum tikus IBD hasil induksi indometasin. Penelitian ini menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar berumur 8-12 minggu, berat 150-200 gram. Induksi indometasin diberikan dengan dosis 15 mg/ kgBB. Terdapat 4 kelompok perlakuan, yaitu kelompok sehat, kelompok IBD, kelompok IBD dengan terapi ekstrak etanol akar seledri 100 mg/kgBB dan 300 mg/kgBB selama 14 hari. Variabel yang diamati adalah ekspresi TGF-jejunum dengan metode imunohistokimia yang dianalisis dengan ANOVA (Analysis of Variance) dan Uji BNJ (Beda Nyata Jujur). Profil pita protein diamati dengan metode SDS PAGE yang dianalisis secara semikuantitatif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi ekstrak etanol akar seledri pada terapi IBD secara signifikan (p<0,05) meningkatkan ekspresi TGF-adalah dosis terbaik berdasarkan adanya peningkatan ekspresi TGF-111% dan tidak tersintesisnya protein 26 kDa yang diduga merupakan CRP. Protein 26 kDa hanya tersintesis pada tikus IBD sedangkan pada tikus sehat dan tikus terapi tidak ditemukan. Kesimpulan dari penelitian ini terapi ekstrak etanol akar seledri dapat digunakan sebagai alternatif terapi IBD.

Kata kunci : Inflammatory bowel disease (IBD), Indometasin, Ekstrak etanol akar seledri, TGF-

vi

STUDY OF ETHANOL EXTRACT THERAPY OF CELERY ROOT (Apium graveolens) TOWARD TGF- EXPRESSION AND PROTEIN

PROFILES OF JEJUNUM ON INFLAMMATORY BOWEL DISEASE RATS (Rattus norvegicus) INDUCED

BY INDOMETHACINE

ABSTRACT Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory condition that occurs in the digestive tract. Indomethacin belonging to the class NSAIDs is one of the causes of IBD. The ethanol extract of celery root containing diosmin to potentially as an alternative therapy for IBD rats. The aim of this research was to determine the potency ethanol extract of cellery roots increasing TGF-expression and the differences of protein profiles in jejunum on IBD rats. This research used male rats (Rattus norvegicus) with range of age 8-12 weeks and weight average of 150-200 gram which divided into 4 groups: healthy group, IBD group, and two therapy group with dose of 100 mg/kgBW and 300 mg/kgBW for 14 days. The TGF- immunohistochemistry technique. Profile protein observed by SDS PAGE technique were analysed by semi quantitatively. The results showed that ethanol extract of celery root significantly (p <0.05) increase TGF- . The best dose therapy is dose of 300 mg/ kg BW that increase in TGF- 111% and not synthesized protein of 26 kDa as CRP. In conclusions, the ethanol extract of celery root have probably used for an alternative therapy to IBD rats. Key word : Inflammatory bowel disease, Indomethacine, ethanol extract of celery root, TGF- , profile protein.

vii

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah SWT, atas rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul Studi Terapi Ekstrak Etanol Akar Seledri (Apium graveolens) Terhadap Ekspresi TGF-Profil Protein Jejunum Pada Tikus (Rattus norvegicus) Model Inflammatory Bowel Disease Hasil Induksi Indometasin. Penelitian ini merupakan bagian dari payung penelitian . Tugas akhir ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan pada Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya.

Terwujudnya skripsi ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak yang telah

mendorong dan membimbing penulis, baik ide, tenaga, maupun pemikiran. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada :

1. dan Drh. Dyah Ayu Oktavianie

A.P.,M. Biotech selaku dosen pembimbing atas waktu, motivasi, bimbingan, arahan yang diberikan dalam penulisan tugas akhir.

2. Drh. Fajar Shodiq Permata, M. Biotech dan Drh. Wawid Purwatiningsih, M. Vet dan Drh. Yudit Oktanella M. Si selaku dosen penguji atas kritik, saran, tanggapan maupun masukan yang diberikan.

3. Prof DES selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan yang senantiasa dan tak kenal lelah memajukan FKH UB.

4. Emmy Juliningrum, SE, MM selaku Kasubag Akademik dan Kemahasiswaan atas semangat, kritik dan saran yang diberikan.

5. Drh. Dodik Prasetyo M. Vet selaku Dosen Pembimbing Akademik atas semangat, kritik dan saran yang diberikan.

6. Keluarga Penulis, Ayahanda Wahyudi Bahagia (alm), Ibunda Susmiati, Adek Herlambang Yahya dan Irfan Januar atas doa, kasih sayang, serta pengorbanan baik moril maupun materiil yamg telah diberikan.

7. Seluruh staf dan asisten Laboratorium Biokimia Fakultas MIPA dan Laboratorium Fisiologi Hewan Universitas Brawijaya Pak Harmaji, Mas Elhaq, Mbak Vivi, Mbak Nita, Mas Hilman.

8. Sahabat-sahabat FKH 2010 B Anindya, Rima, Anne, Bea, Tari, Devi Ika, Alm. Haryadi yang telah memberikan dukungan dan informasi yang sangat bermanfaat dalam penulisan dan pelaksanaan penelitian ini.

9. Rekan dan sahabat satu kelompok penelitian Ahmad Istighfar, Amanda Vicky, Annisa, Randi, Nur Maulida dan Teguh.

10. Teman-teman kos Nawangan Atika, Enggar, Ayu, Septi, Fika dan Citra yang telah memberikan semangat dalam penulisan laporan skripsi ini.

11. Semua pihak yang telah berjasa kepada penulis dalam menyelesaikan tugas akhir skripsi yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

viii

Atas bantuan, bimbingan, kritik dan saran yang diberikan penulis ucapkan beribu terima kasih. Semoga segala bantuan yang tak ternilai harganya ini menjadi amal ibadah di sisi Allah SWT. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat berharap kritik dan saran demi perbaikan selanjutnya. Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT membalas degala kebaikan yang telah diberikan kepada semua pihak dan semoga penulisan skripsi ini dapat bermanfaat serta menambah pengetahuan.

Malang, 27 April 2017

Penulis

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .........................................................................................i

LEMBAR PENGESAHAN ..............................................................................ii

LEMBAR PERNYATAAN ..............................................................................iii

ABSTRAK .........................................................................................................iv

ABSTRACT .......................................................................................................v

KATA PENGANTAR .......................................................................................vi

DAFTAR ISI ......................................................................................................ix

DAFTAR TABEL .............................................................................................xii

DAFTAR GAMBAR .........................................................................................xiii

DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................xiv

DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG ...........................................................xv

BAB 1. PENDAHULUAN ...............................................................................1

1.1 Latar Belakang .................................................................................1

1.2 Rumusan Masalah............................................................................6

1.3 Batasan Masalah ..............................................................................6

1.4 Tujuan Penelitian .............................................................................7

1.5 Manfaat Penelitian ...........................................................................8

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................9

2.1 Inflammatory Bowel Disease (IBD) ................................................9

2.2 Tikus Putih (Rattus norvegicus) .....................................................10

2.3 Transforming Growth Factor Beta (TGF- ) ..................................13

2.4 Tikus Model Inflammatory Bowel Disease.....................................14

2.5 Seledri (Apium graveolens) ............................................................16

2.6 Budidaya Seledri ............................................................................19

2.7 Pengaruh IBD terhadap Profil Protein ...........................................22

Halaman

x

BAB 3. KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS ......................................25

3.1 Kerangka Konseptual ......................................................................25

3.2 Hipotesis Penelitian .......................................................................27

BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN ..........................................................29

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian ..........................................................29

4.2 Materi Penelitian..............................................................................29

4.2.1 Alat Penelitian .......................................................................29

4.2.2 Bahan Penelitian ...................................................................29

4.3 Sampel Penelitian ............................................................................30

4.4 Rancangan Penelitian ......................................................................31

4.5 Variabel Penelitian .........................................................................32

4.6 Tahapan Penelitian ..........................................................................32

4.6.1 Persiapan Hewan Percobaan .................................................32

4.6.2 Persiapan Hewan Model IBD dengan Indometasin ..............33

4.6.3 Persiapan Ekstrak Etanol Akar Seledri .................................33

4.6.4 Euthanasia dan Pengambilan Organ Jejunum ......................35

4.6.5 Pembuatan Preparat Imunohistokimia ..................................35

4.6.6 Elektroforesis SDS-PAGE ....................................................36

4.6.6.1 Isolasi Protein ...........................................................36

4.6.6.2 Persiapan Gel ............................................................36

4.6.6.3 Injeksi Sampel dan Running.....................................37

4.6.6.4 Perlakuan Setelah Running ......................................37

4.6.6.5 Penentuan Berat Molekul .........................................38

4.6.6.6 Analisis Data ............................................................38

BAB 5. HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................39

5.1 Pengaruh Terapi Ekstrak Etanol Akar Seledri (Apium graveolens) Terhadap Ekspresi Transforming Growth Factor

xi

Beta (TGF- (Rattus norvegicus) Hasil Induksi Indometasin ...............................................................39

5.2 Pangaruh Terapi Ekstrak Etanol Akar Seledri (Apium graveolens)Terhadap Profil Protein Jejunum Tikus Putih (Rattus norvegicu) Hasil Induksi Indometasin ............................................45

BAB 6. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................54

6.1 Kesimpulan .....................................................................................54

6.2 Saran ..............................................................................................54

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................55

LAMPIRAN .......................................................................................................60

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Rancangan Kelompok Penelitian ................................................. 31 Tabel 5.1 Rata-rata Ekspresi TGF- jejunum Tikus perlakuan ..................... 41 Tabel 5.2 Perbedaan Berat Molekul (BM) Protein pada Jejunum ................ 46

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Tikus putih (Rattus norvegicus) ............................................... 11 Gambar 2.2 Saluran Pencernaan pada Tikus.................................................. 13 Gambar 2.3 Mekanisme kerusakan usus akibat penghambatan COX-1 ........ 15 Gambar 2.4 Tanaman Seledri .... 17 Gambar 5.1 Ekspresi TGF- 40 Gambar 5.2 Profil Pita Protein jejunum 45

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

1. Sertifikat Laik Etik ..........................................................................................60

2. Hasil Uji LCMS ..............................................................................................61

3. Determinasi Tanaman Seledri .........................................................................62

4. Skema Kerja Penelitian ...................................................................................63

5. Perhitungan Dosis, Sediaan dan Bahan Ekstrak ............................................64

6. Ekstraksi Akar Seledri Metode Maserasi ........................................................66

7. Diagram Kerja Penelitian ...............................................................................67

8. Metode Imunohistokimia ................................................................................70

9. Isolasi Protein ..................................................................................................71

10. Profil Protein dengan Teknik SDS-PAGE ...................................................76

11. Hasil Statistik Kadar TGF- ........................................................................78

12. Perhitungan Berat Molekul Hasil SDS-PAGE .............................................82

xv

DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG

Simbol/singkatan Keterangan

IBD Inflammatory Bowel Disease NSAID Non Steroidal Anti Inflammatory Disease ROS Reactive Oxygen Species MDA Malondialdehida HE Hematoxylin Eosin COX-1 Cyclooxygenase-1 COX-2 Cyclooxygenase-2 cm Centimeter mm Milimeter KU Kolitis ulseratif CD TNF- Tumor Necrosis Factor alpha TGF- Transforming Growth Factor beta INF- Interferon gamma IL-10 Interleukin-10 SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis

1

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Inflamasi merupakan respon protektif di dalam tubuh yang ditimbulkan oleh

cedera atau kerusakan jaringan, yang berfungsi menghancurkan, mengurangi, atau

mengurung (sekuestrasi) baik agen penyebab maupun jaringan yang mengalami

kerusakan (Dorland, 2002). Penyebab inflamasi antara lain mikroorganisme,

trauma mekanis, zat-zat kimia dan pengaruh fisika. Tujuan akhir dari respon

inflamasi adalah menarik protein plasma dan fagosit ke tempat yang mengalami

cedera atau terinvasi agar dapat mengisolasi, menghancurkan atau menginaktifkan

agen yang masuk, membersihkan debris dan mempersiapkan jaringan untuk

proses penyembuhan (Corwin, 2008).

Salah satu penyakit dengan gejala inflamasi adalah IBD (Inflammatory

Bowel Disease), merupakan salah satu penyakit pada intestinal dan dikenal

dengan sebutan radang usus. Berdasarkan subtipe klinisnya IBD dibedakan

menjadi dua yaitu penyakit Crohn (PC) dan kolitis ulserativa (KU). PC

merupakan inflamasi yang terjadi pada bagian lapisan dinding usus dan bagian

saluran pencernaan meliputi mulut, esophagus, perut dan usus halus, sedangkan

KU hanya sebatas pada usus besar, rektum dan peradangan terjadi pada lapisan

usus (Korpacka et al., 2009). Kedua penyakit PC dan KU lebih lanjut

menyebabkan terjadinya kanker usus (Roessner et al., 2008). Kasus IBD yang

terjadi pada sejumlah 546 ekor anjing sangat rentan di Queen Mother Animal

Hospital Inggris (Katharani et al., 2011).

2

IBD khususnya organ jejunum sering disebabkan oleh bakteri patogen dan

efek samping penggunaan obat-obatan khususnya golongan NSAIDs (Non

Steroidal Anti Inflammatory Drugs) seperti indometasin. Indometasin umumnya

digunakan untuk terapi inflamasi seperti pada penyakit artritis (Takeuchi et al.,

2003). Indometasin mempunyai fungsi menghambat enzim siklooksigenase 1

(COX-1) yang berperan dalam pembentukan prostaglandin pada saluran cerna.

Penurunan prostalglandin menyebabkan sekresi mukus berkurang sehingga terjadi

penurunan perlindungan terhadap mukosa barier usus, yang mengakibatkan

mudahnya invasi bakteri patogen (Kaseret et al., 2010).

Pada tikus pemberian secara oral indometasin dengan dosis 15 mg/ kg BB

dapat menginduksi ulserasi mukosa, perdarahan dan edema pada usus

et al., 2012). Mekanisme kerja dari indometasin secara tidak

langsung akan mengaktifkan makrofag yang berpartisipasi dalam respon imun

mukosa, yaitu terjadi pelepasan ROS (Reactive Oxygen Species) dan

memproduksi sitokin proinflamasi seperti TNF- -1, Interferon- -8

(Waetzig et al., 2002; Abraham, 2009). Produksi ROS yang meningkat

menyebabkan kerusakan jejunum yang ditunjukan dengan kerusakan vili dan

mukosa jejunum serta ditandai dengan adanya edema, infiltrasi sel-sel inflamasi

seperti neutrofil, basofil dan eosinofil, selain itu juga terjadi perubahan protein

organ jejunum karena terjadi proses inflamasi (Scarpignato, 2006; Handoko,

2015).

Pada penyakit IBD, Transforming Growth Factor beta (TGF-

peranan yang penting. TGF-

3

jenis sel kekebalan, termasuk sel B, sel T, sel dendritik dan makrofag untuk

meregulasi proliferasi, diferensiasi dan kematian dari beberapa jenis sel

(apoptosis). TGF-

-

dari pertumbuhan sel dan diferensiasi dengan pengaturan proinflamasi dan

antiinflamasi. Efek utama TGF- encegah proliferasi dan aktivasi

limfosit serta leukosit lain (Baratawidjaja dan Renggganis, 2010). Sinyal-sinyal

dari TGF-

inaktifasi jalur sinyal TGF- ngan

langsung dengan proses inflamasi pada penyakit IBD (Karsono, 2009).

Pengobatan yang dipakai dalam terapi IBD saat ini adalah pengguanaan

preparat kortikosteroid seperti, Prednisone dan Hidrocortisone, juga anti inflamasi

seperti, Sulfasalazin dan Mesalamin, namun penggunaan obat-obatan yang berasal

dari bahan kimia dapat menimbulkan efek samping yang memperparah kondisi

inflamasi, sehingga diperlukan treatment anti inflamasi dari bahan alam (Morrow

dan Robert, 2001). Beberapa penelitian telah banyak memanfaatkan tanaman

herbal seperti curcuma, Rosemary (Rosmarinus officinalis), rumput laut coklat

(Sarsassum duplicatum Bory), daun kedondong (Lannea coromandelica) dan

perasan buah labu siam (Sechium edule) yang mengandung antioksidan polifenol

seperti flavonoid (Rahmah, 2011). Pemanfaatan tanaman sebagai obat herbal

dapat dipakai sebagai alternatif dalam pengobatan yang dinilai lebih aman dari

segi toksisitas dan efek samping (Awang, 2009).

4

Pemanfaatan produk herbal saat ini banyak diteliti khasiatnya untuk

penyembuhan penyakit baik di hewan maupun di manusia. Produk herbal adalah

bahan yang berupa tumbuhan, bahan hewan dan bahan mineral, sediaan sarian

(galenik) atau campuran bahan-bahan tersebut (Dirjen POM, 1994). Produk herbal

dimanfaatkan sebagai obat karena adanya kandungan zat aktif di dalamnya, salah

satunya adalah flavonoid yang umumnya terdapat pada tumbuhan sebagai

glikosida. Senyawa flavonoid termasuk senyawa fenolik alam yang potensial

sebagai antioksidan (Widya, 2013).

Salah satu tumbuhan yang menarik untuk diteliti sebagai komponen aktif

antioksidan adalah seledri. Menurut Dalimartha (2000), berdasarkan hasil analisis

secara farmakologis ditemukan bahwa hampir semua bagian tumbuhan seledri

memiliki khasiat sebagai obat. Di Indonesia tanaman seledri (Apium graveolens

L.) sudah lama dikenal sebagai bahan obat tradisional yang dipercaya dapat

menurunkan tekanan darah. Penelitian tentang khasiat antihipertensi tanaman

seledri semakin berkembang dari herba kebagian tertentu tanaman ini seperti

batang dan daun, namun salah satu bagian tanaman yang berfungsi sebagai

penyokong berdirinya tanaman ini kerap dilupakan, sebelumnya akar seledri

hanya dijadikan limbah. Pada tahun 2010, menurut penelitian Siska menyatakan

bahwa akar seledri dapat dibuat menjadi ekstrak sehingga dapat dimanfaatkan

sebagai penurun kadar kolesterol total darah pada tikus putih jantan dengan dosis

16 mg/ 200 g BB. Penelitian lain meyatakan, secara in vivo formula terbaik dari

ekstrak akar seledri dengan dosis 100, 200 dan 400 mg/ kg BB yang diberikan

setiap hari selama satu minggu memberikan efek yang cukup bermakna terhadap

5

kadar asam urat dan mempunyai khasiat antiinflamasi secara signifikan pada

tikus. Formula ini mempunyai konsentrasi dibawah nilai LC 50, dan nilai LD50

yang diperoleh adalah lebih dari 15 g/ kg BB, sehingga formula tersebut tidak

toksik (Iswantini, 2004). Hasil penelitian tersebut memperkuat dugaan bahwa akar

seledri memiliki kandungan kimia yang berkhasiat sebagai obat (Sunaryo dkk,

2006).

Pada tanaman seledri bagian buah dan biji tanaman seledri sering dipakai

sebagai pereda kejang (antispasmodik), menurunkan kadar asam urat darah,

antirematik, peluruh kencing (diuretik), peluruh kentut (karminatif), penenang

(sedatif) dan antihipertensi. Sedangkan akar seledri berkhasiat memacu enzim

pencernaan dan juga bersifat diuretik. Peningkatan enzim pencernaan membantu

penyerapan zat di dalam intestinal sehingga akan menurunkaan tekanan osmotik

intraluminal dan diperkirakan dapat membantu mempercepat penyembuhan

gangguan saluran pencernaan seperti pada penyakit Inflammatory Bowel Disease

(IBD). Menurut Pramono (2004), akar seledri mengandung flavonoid kadar

flavonoid 0,91 + 0,10 % dari 200 mg serbuk akar seledri. Menurut Stankevicius et

al., (2010) akar seledri juga mengandung sejumlah senyawa asam phenolik yang

berfungsi sebagai antioksidan. Kandungan antioksidan di dalam seledri dapat

menstabilkan radikal bebas yang merupakan senyawa asing yang masuk ke dalam

tubuh dan merusak sistem imunitas tubuh. Antioksidan ini bekerja dengan cara

melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas dan menghambat

terjadinya proses oksidasi berkelanjutan di dalam tubuh.

6

Berdasarkan uraian di atas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek

ekstrak akar seledri (Apium graveolens L) dalam mengobati kondisi inflamasi

pada penyakit IBD pada tikus (Rattus norvegicus) pasca induksi indometasin

dengan cara mengamati ekspresi reseptor TGF- protein pada organ

jejunum.

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah yang akan dipecahkan dalam penelitian ini adalah

1) Apakah ada pengaruh terapi ekstrak akar seledri terhadap peningkatan

ekspresi Transforming Growth Factor (TGF-

pasca induksi indometasin?

2) Apakah ada pengaruh terapi ekstrak akar seledri terhadap perubahan

profil protein pada organ jejunum tikus pasca induksi indometasin

dibandingkan dengan jejunum tikus normal?

1.3 Batasan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan, maka penelitian ini

dibatasi pada :

1) Hewan coba yang digunakan yaitu tikus putih (Rattus norvegicus) usia

8 12 minggu dengan berat 150-200 gram, diperoleh dari Unit

Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta.

Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini telah mendapatkan

sertifikasi laik etik nomor 273-KEP-UB oleh Komisi Etik Penelitian

Universitas Brawijaya (KEP UB) (Lampiran 1).

7

2) Induksi IBD dilakukan dengan pemberian indometasin pada tikus

model IBD diberikan satu kali secara per oral (po) dengan dosis 15

mg/kgBB ( et al., 2012).

3) Bahan ekstrak etanol akar seledri yang digunakan adalah akar seledri

yang telah dikeringkan menjadi bentuk serbuk yang diperoleh dari

Balai Materia Medica Kota Batu, Jawa Timur (Lampiran 3) dan

dibuat dengan mengikuti tahapan pada metode maserasi (Lampiran

6).

4) Terapi ekstrak etanol akar seledri yang diberikan yaitu kelompok C

dengan dosis 100 mg/kgBB dan kelompok D dengan dosis 300

mg/kgBB selama 14 hari (Lampiran 5).

5) Variabel yang diamati pada penelitian ini adalah ekspresi TGF-

dengan teknik imunohistokimia dan profil protein organ jejunum

dengan metode SDS PAGE.

1.4 Tujuan Penelitian

1) Mengetahui pengaruh terapi ekstrak akar seledri terhadap ekspresi

Transforming Growth Factor (TGF-

induksi indometasin dibandingkan dengan jejunum tikus normal.

2) Mengetahui pengaruh terapi ekstrak akar seledri terhadap profil

protein pada organ jejunum tikus pasca induksi indometasin

dibandingkan dengan jejunum tikus normal.

8

1.5 Manfaat Penelitian

Melalui penelitian ini dapat dibuktikan kemampuan ekstrak akar seledri

dalam menekan inflamasi pada GIT sehingga nantinya dapat obat herbal alternatif

yang dapat menangani masalah saluran pencernaan pada manusia dan hewan

seperti anjing.

9

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Inflammatory Bowel Disease (IBD)

Inflammatory Bowel Disease (IBD) adalah suatu kondisi inflamasi kronis di

saluran pencernaan, termasuk lambung, usus halus (duodenum, jejunum, ileum)

dan usus besar (kolon). Gejala umum dari IBD adalah nyeri abdominal, demam,

diare disertai darah dan lendir serta penurunan berat badan (Neuman, 2011). Ada

dua macam penyakit IBD, yaitu Kolitis Ulserativa (radang pada usus besar) dan

Penyakit Crohn (radang pada usus halus) (Xavier and Podolsky, 2007).

Secara umum penyakit IBD disebabkan oleh banyak faktor seperti

kerentanan genetik, kegagalan regulasi sistem imun, lingkungan, xenobiotik, virus

dan adanya rangsangan dari flora normal pada saluran pencernaan (Basivirredy et

al., 2002). Kasus IBD pertama kali ditemukan pada abad ke-20. Tingkat kejadian

IBD mencapai 4-10 per 100.000 orang per tahun di wilayah Skandinavia,

Amerika Serikat dan Inggris (Neuman, 2011).

Penyebab IBD belum diketahui dengan jelas, diperkirakan bahwa

patomekanisme IBD secara umum, diawali oleh adanya infeksi seperti bakteri dan

virus pada individu rentan dan dipengaruhi oleh faktor genetis, defek imun dan

lingkungan sehingga terjadi proses inflamasi pada dinding usus (Kaser et al,

2010). Beberapa penelitian juga menunjukkan bahwa penyebab lain dari IBD

adalah pemakaian obat anti-inflamasi non steroid atau Nonsteroidal anti

inflammatory drugs (NSAIDs) yang dapat menghambat kerja enzim

siklooksigenase (COX) yang dihubungkan dengan patogenesis IBD (Dursun et al,

2009).

10

Dalam patogenesis IBD, tedapat dua mekanisme yang mungkin terjadi. Pada

patogenesis Penyakit Crohn (PC) yang difokuskan pada sel T helper 1 (Th1) yang

mengeluarkan sitokin seperti TNF- -

proses penyakit inflamasi. Sedangkan pada Kolitis Ulseratif (KU), yang berperan

adalah sel T helper 2 (Th2) yang akan mengeluarkan sitokin seperti IL-4, IL-13

dan TGF- 1 dan Th2 akan dilibatkan pada tiap fase,

kemungkinan terjadi bersamaan atau mungkin terpisah.

Respon imun dimulai ketika limfosit T sitotoksik (CD8+) atau sel helper T

CD4+ pada lumen usus mengenali antigen (Neuman, 2004). Pengaktifan sel T

helper akan menghasilkan sitokin. Sitokin ini akan berperan pada epitel usus

secara langsung akan mengaktifkan makrofag untuk melepaskan mediator

inflamasi dalam jumlah besar seperti Reactive Oxygen Spesies (ROS), Nitric

Oxide (NO) dan TNF alfa. (TNF- ), yang selanjutnya akan merekrut leukosit dan

menyebabkan inflamasi terus menerus, sehingga dapat merusak jaringan usus atau

nekrosis (Laroux et al., 2001).

2.2 Tikus Putih (Rattus norvegicus)

Hewan model yang dipakai adalah tikus putih dengan nama ilmiah Rattus

norvegicus merupakan spesies tikus yang paling sering digunakan sebagai hewan

model pada penelitian mengenai mamalia. Menurut Hendrich (2006), secara garis

besar fungsi dan bentuk organ serta proses biokimia dan biofisika antara tikus dan

manusia memeiliki banyak kesamaan sehingga hasil penelitiannya dapat

diaplikasikan pada manusia.

11

Ciri-ciri morfologi Rattus norvegicus adalah memiliki rambut tubuh

berwarna putih, mata merah, berat tubuh antara 150 600 gram dengan panjang

18 25 cm, hidung tumpul, telinga relatif kecil dan tidak lebih dari 20 23 mm

dan panjang ekor 205 mm seperti pada gambar (2.2) (Depkes, 2011). Tikus yang

digunakan sebagai hewan coba dalam penelitian memiliki klasifikasi sebagai

berikut (Armitage, 2004):

Kingdom : Animalia

Filum : Chordata

Sub filum : Vertebrata

Klass : Mammalia

Ordo : Rodentia

Sub Ordo : Sciurognathi

Familia : Muridae

Sub Familia : Murinae

Genus : Rattus

Spesies : Rattus norvegicus strain Wistar

Gambar 2.1 Rattus norvegicus (Estina, 2011)

Hewan coba merupakan hewan yang sengaja dipelihara sebagai hewan

model untuk mempelajari dan mengembangkan berbagai macam bidang ilmu

12

dalam skala penelitian atau pengamatan penelitian. Tikus putih (Rattus

norvegicus) umum digunakan sebagai hewan model IBD dikarenakan memiliki

saluran pencernaan yang sama dengan manusia yaitu bersifat monogastrik, kadar

asam amino dan sistem metabolismenya sehingga memudahkan dalam melakukan

penelitian (Miller et al., 2010).

Sebagai hewan laboratorium, ada beberapa keunggulan yang dimiliki yaitu

penanganan dan pemeliharaan yang mudah, kemampuan reproduksi yang tinggi,

masa kebuntingan singkat, sehat, bersih dan cocok untuk berbagai penelitan.

Rattus norvegicus merupakan hewan model yang paling sering digunakan dalam

penelitian yang berkaitan dengan pencernaan. Pemilihan hewan ini sebagai hewan

model didasari oleh beberapa pertimbangan yaitu tikus memiliki pola makan

omnivora seperti manusia (Malole et al., 1989), tikus memiliki saluran

pencernaan dengan tipe monogastrik seperti manusia (Hofstetter et al., 2005),

kebutuhan nutrisi tikus hampir menyerupai manusia (Wolfensohn et al., 1998),

dan struktur anatomi tikus yang tidak lazim dimana esofagus bermuara ke dalam

lambung membuat tikus tidak dapat muntah sehingga mempermudah proses

perlakuan pencekokan melalui sonde lambung (Hedrich, 2006). Saluran

pencernaan tikus dapat dilihat pada Gambar 2.2.

Jejunum merupakan bagian kedua dari usus halus dengan panjang 2/5 dari

panjang usus secara keseluruhan yaitu sekitar 2-3 meter dan berkelok-kelok,

terletak di sebelah kiri atas intestinum minor. Dengan perantaraan lipatan

peritoneum yang berbentuk kipas (mesentrium) memungkinkan keluar masuknya

arteri dan vena mesentrika superior, pembuluh limfe, dan saraf ke ruang antara

13

lapisan peritoneum. Penampang jejunum lebih lebar, mempunyai dinding yang

lebih tebal dan banyak mengandung pembuluh darah. Jejunum berfungsi sebagai

tempat pemecahan karbohidrat, protein serta vitamin-vitamin yang larut didalam

lemak (Jonqueira et al., 2005; Samuelson, 2007).. Gangguan fungsi jejunum dapat

menyebabkan produk nutrisi tidak termetabolis secara sempurna, sehingga

penyerapan nutrisi pada ileum tidak sempurna, hal tersebut menyebabkan tubuh

tidak menerima nutrisi secara cukup dan terjadi malnutrisi.

Gambar 2.2 Saluran pencernaan pada tikus (Hofstetter et al, 2005)

2.3 Transforming Growth Factor Beta (TGF-

2.2.1. Definisi dan Klasifikasi TGF-

Transforming growth factor beta (TGF- adalah protein yang disekresikan

oleh semua jenis sel imun, seperti sel B, sel T, sel dendritik dan makrofag untuk

meregulasi proliferasi, diferensiasi dan kematian ber

Fungsi TGF- ga berperan sebagai

anti proliferasi. Hal ini dapat dilihat saat TGF-

regulasi imunitas yang sering disebut juga dengan negative feedback regulator.

14

TGF- growth/ differentiation

factors (Grande,1997). Berdasarkan kesamaan struktur dan biologis, superfamili

TGF- Mullerian Inhibitory

Subtance (MIS), famili the inhibin/ activin, famili the Bone Morphogenic Protein

(BMP) dan famili TGF-

TGF-

usus halus dihasilkan oleh sel epitel, fibroblas dan sel T, yang mempunyai

berbagai fungsi primer dalam memodulasi respon imun. Transforming growth

factor beta (TGF- ses biologis

dasar seperti diferensiasi sel, proliferasi pertumbuhan sel, perkembangan,

perbaikan jaringan, aktivasi sistem kekebalan sel, fibrosis, angiogenesis dan

apoptosis. Selain itu TGF- kan sitokin yang berperan penting dalam

meregulasi salah satu fungsi utama faktor proteksi dan homeostasis usus. Dalam

proses ini, reaktivitas imun terhadap antigen yang masuk melalui mulut secara

selektif ditekan, terutama melalui efek TGF- dowstream (Claudio,

2001).

2.4 Tikus (Rattus norvegicus) Model Inflammatory Bowel Disease (IBD)

Salah satu penyebab inflamasi pada saluran pencernaan atau gastrointestinal

tract (GIT) adalah efek samping penggunaan obat golongan NSAID seperti

indometasin (Podolsky, 2002). Indometasin merupakan obat yang banyak

digunakan untuk pengobatan rheumatoid arthritis dan sangat efektif dalam

menekan kejadian inflamasi dengan menghambat produksi prostaglandin namun

15

efek samping penggunaan obat ini adalah mampu menyebabkan IBD (Kazuhide et

al., 2009).

Efek terhadap saluran pencernaan meliputi nyeri abdomen, diare dan

perdarahan saluran pencernaan. Nyeri kepala dialami oleh 20-25 % penderita dan

disertai dengan pusing, bingung dan depresi. Dosis indometasin yang normal

untuk pengobatan yaitu 2-4 kali 25 mg sehari. Untuk mengurangi gejala reumatik

dimalam hari diberikan indometasin dosis 50-100 mg sebelum tidur (Wilmana and

Gan S., 2007).

Gambar 2.3 Mekanisme kerusakan usus akibat penghambatan COX-1 oleh indometasin

(Takeuchi et al., 2003)

Pemberian indometasin terhadap terapi maupun hewan coba dapat

mengakibatkan terjadinya kerusakan usus yang ditunjukkan oleh Gambar 2.3.

Indometasin yang masuk ke dalam tubuh akan bekerja dengan cara menghalangi

aktivitas enzim COX-1 dan COX-2, sehingga terjadi penurunan kadar

protaglandin (PGE-2) yang merupakan faktor protektif usus berupa produksi

mukus terhambat dan peningkatan motilitas usus. Hal ini menyebabkan masuknya

bakteri ke dalam jaringan usus sehingga terjadi aktivitas makrofag, aktivasi

16

neutrofil, induksi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS), produksi Nitric Oxide

(NO·), pembentukan peroksidasi nitrit (RNS) dan pembentukan Reactive Oxygen

Spesies (ROS) yang selanjutnya terjadi kerusakan usus (Gommeaux et al., 2007).

Peningkatan produksi ROS yang berlebihan di dalam sel menyebabkan aktivasi

NF-kB dan fosforilasi inhibitor NF-kB (IkB) oleh sistem proteosome sehingga

terjadi degradasi. Karena tidak ada inhibitor bagi NF-kB, maka NF-kB akan

berpindah menuju nukleus dan mengekspresikan sitokin proinflamasi seperti

TNF- -

yang menyebabkan terjadi inflamasi akan menyebabkan penurunan jumlah sitokin

TGF- -

di dalam sel menyebabkan penurunan produksi imunoglobulin A pada permukaan

mukosa dan kelenjar sekretorik usus sehingga memudahkan invasi bakteri

patogen, toksin bakterial dan antigen asing ke dalam sel epitel usus sehingga

memperparah terjadinya proses inflamasi saluran cerna yang dapat dihubungkan

dengan kasus IBD (Burstein and Fearon, 2008).

2.5 Seledri (Apium graveolens)

Tanaman seledri merupakan tanaman yang tumbuh pada daerah dengan

ketinggian dua kaki. Daunnya majemuk (segmented) dengan tepi bergerigi, anak

daun melebar, pangkal berbentuk segitiga terbalik (pasak), hijau mengkilat,

memiliki batang agak keras dan bergalur, mempunyai biji yang berbau khas

dengan rasa agak pahit (Barnes, 2005). Bunga seledri berbentuk kecil dan

berwarna putih kekuningan yang nantinya berkembang menjadi buah dengan biji

yang halus serta mempunyai akar tebal, berumbi kecil. Seledri tumbuh subur pada

17

kondisi tanah yang lembab dengan sifat asam. Pascal menerapkan nama umum ke

beberapa seledri hijau. Di Eropa, seledri merupakan istilah yang sering digunakan

pada sayuran akar, Apium graveolens L. varitas Rapaceum (Marderosian, 2004).

Menurut Badan POM RI (2012), tanaman seledri mempunyai kandungan

kimia minyak atsiri, flavonoid, saponin, tanin 1%, sedanolida, asam sedanot,

manitol, kalsium, fosfor, besi, protein, glisidol, vitamin A, B1, B2, C dan K. Jenis-

jenis dari minyak atsiri yaitu limonen, p- -terpin - -pinen

-kariofilen. Macam-macam flavonoid dalam seledri, yaitu apiin, apigenin,

isokuersitrin. Kumarin, yaitu asparagin, bergapten, isopimpinelin, apiumetin,

santotoksin.

Gambar 2.4 Tanaman Seledri (Haryoto, 2009)

Menurut Marderosian (2004) klasifikasi tanaman seledri (Apium

graveolens) adalah sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Subkingdom : Tracheobionta

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Dicotyledonae

18

Bangsa : Apiales

Suku : Apiaceae

Genus : Apium

Spesies : Apium graveolens, Linn.

Menurut Pramono (2004) dikatakan bahwa terdapat kandungan flavonoid

dengan kadar sebanyak 0.91 + 0.10 % didalam 200 mg dari sediaan serbuk akar

seledri yang dibuat ekstrak. Menurut Stankevicius et al., (2010) akar seledri

(Apium graveolens ) mengandung flavonoid sebanyak <60 mg/100 g. Selain itu,

akar seledri (Apium graveolens ) juga mengandung sejumlah senyawa phenolik

seperti 9,3 mg/100g Chlorogenic acid; 25,1 mg/100g 4-hydroxy-3-

methoxycinnamic acid; 8,2 mg/100g quercetin -3- -D-glucoside; dan 25,1

mg/100g quercetin-3-rhamnoside. Flavonoid dan senyawa phenolik memiliki

potensi sebagai antiinflamasi. Untuk memanfaatkan tanaman sebagai obat herbal

dapat dilakukan salah satunya dengan cara membuat ekstrak dari bagian tanaman

yang digunakan (Pramono, 2004).

Menurut Skibola and Smith (2000), kandungan kimia golongan flavonoid

juga telah dibuktikan memiliki efek antiinflamasi misalnya apiin dan apigenin

yang terkandung di dalam seledri. Inflamasi merupakan respon protektif terhadap

kerusakan jaringan akibat berbagai rangsangan yang merugikan, baik rangsangan

989). Salah satu bagian tubuh yang sering

terjadi proses inflamasi adalah pada saluran cerna, hal ini bisa disebabkan karena

trauma fisik, bakteri patogen dan bahan kimia yang masuk dalam saluran

pencernaan. Inflamasi karena bahan kimia merupakan efek samping dari

19

penggunaan obat-obatan tertentu misalnya non steroid (NSAIDs) pada pengobatan

rheumatoid atritis atau gout (Park et all., 2011).

Di dalam flavonoid juga memiliki efek antioksidan yang dapat mendukukng

efek antiinflamasi seperti polifenol (Ishige et al., 2001). Mekanisme antioksidatif

flavonoid inilah dilaporkan melalui aktivitasnya sebagai penagkap radikal bebas

yang merupakan suatu senyawa asing yang masuk ke dalam tubuh, merusak

sistem imunitas dan penyebab inflamasi. Proses antioksidan menstabilkan radikal

bebas dengan melengkapi kekurangan elektron yang dimiliki radikal bebas, dan

menghambat terjadinya reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas (Selawa,

2013).

2.6 Budidaya Seledri

Seledri (Apium graveolens L.) adalah tanaman sayuran yang berasal dari

Mediterania sekitar Laut Tengah. Tanaman ini kemudian menyebar ke berbagai

wilayah, diantaranya di Dataran Cina, Asia Tengah, India, Mediterania, Etiopia,

Amerika Serikat, serta Meksiko Selatan dan tengah. Di Indonesia, seledri masih

belum menjadi komoditi utama para petani sehingga sulit untuk menentukan

sentra dan tanam, luas panen dan besarnya produksi nasional.

Untuk dapat tumbuh dengan baik, seledri harus ditanam di daerah subtropis

dengan ketinggian 1.000-1.200 m dpl, suhu udara 15o-24o C, kelembaban

berkisar antara 80-90%, Curah hujan berkisar antara 60-100 mm/bulan, dan lahan

harus mendapat penyinaran matahari yang cukup. Lahan yang ideal untuk

tanaman seledri adalah tanah yang gembur, subur, mengandung bahan organik,

serta tata udara dan air yang baik.

20

Tanah yang paling baik untuk budidaya seledri adalah tanah jenis Andosol,

karena mengandung unsur-unsur yang mendukung pertumbuhan tanaman seledri,

seperti: pH tanah antara 5,5-6,5, mengandung cukup natrium, boron, dan kalsium.

Karena jika kekurangan ketiga unsur tersebut, maka pertumbuhan tanaman seledri

akan kerdil, kuncup dan pucuk mengering, dan batang serta tangkai daun retak-

retak.

Menurut Susila (2006), budidaya tanaman seledri tidak terdapat persyaratan-

persyaratan khusus yang dibutuhkan oleh tanaman ini untuk dapat tumbuh dengan

baik. Namun, karena secara teknis budidaya seledri hampir mirip dengan tanaman

sayuran yang lain, maka juga tidak dapat dikatakan sulit. Berikut teknik dan cara

menanam seledri yang baik:

2.6.1. Pembibitan

Perkembangbiakan seledri dapat dilakukan secara generatif lewat bijinya

maupun vegetatif yakni dengan anakannya. Namun, memperbanyak seledri

dengan menggunakan biji lebih sering dilakukan untuk tujuan komersial. Biji

yang dijadikan benih berasal dari varietas unggul yang memiliki kemampuan atau

daya berkecambah >90%. Proses pembenihan diawali dengan merendam benih ke

dalam air hangat bersuhu 55-60°C selama 15 menit, selanjutnya disemai di

bedengan yang telah diolah dengan puput kandang yang berukuran lebar 100-120

cm, tinggi 30-40 cm dan panjang sesuai kondisi lahan. Bedengan dinaungi plastik

bening setinggi 120-150 cm di sisi timur dan 80-100 cm di sisi barat. Kemudian

bibit disemai diatas bedengan sedalam 0,5 cm dengan jarak antar alur 10-20 cm,

lalu ditutup dengan tanah tipis dan bedengan disiram sampai seluruh permukaanya

21

lembab. Selanjutnya benih yang sudah disemai dilakukan semprot pupuk pada

hari ke 15-25. Setelah benih berumur satu bulan atau lebih memiliki 3-4 helai

daun, bibit dipindahkan ke media tanam.

2.6.2. Pengolahan Media Tanam

Pengolahan media tanam dilakukan dengan mencangkul lahan sedalam 30-

40 cm, dibiarkan selama 15 hari. Tanah diolah dengan mencampur kapur kalsit

atau dolomite jika pH tanah kurang dari 6.5. Dosisnya sebanyak 1-2 ton kapur

untuk setiap hektar lahan, tergantung dari besarnya pH tanah serta kandungan

Alumunium di dalam tanah. Di atas tanah yang telah diolah tersebut kemudian

dibuat bedengan dengan lebar 80-100 cm, tinggi 30 cm, dan panjang sesuai

dengan kondisi lahan, sementara jarak antar bedengan antara 30-40 cm. Kemudian

dicampur pupuk kandang dengan tanah bedengan sebanyak 10-20 ton pupuk

kandang untuk setiap 1 hektar lahan, selanjutnya dibuat parit di antara bedengan

yang satu dengan yang lain.

2.6.3. Teknik Penanaman

Penanaman seledri dapat dilakukan dengan cara tumpangsari, namun untuk

tujuan komersil seledri ditanam sebagai tanaman tunggal atau monokultur dengan

cara menanam satu bibit seledri yang sudah siap pada setiap lubang pada media

tanam kemudian bedengan disiram dengan air bersih hingga lembab dan

permukaan bedengan ditutup dengan jerami padi kerinng setebal 3-5 cm.

2.6.4. Pemeliharaan Tanaman

Selama masa pemeliharaan, lakukan penyulaman saat tanaman berumur 7-

15 hari. Ganti bibit yang mati dan ganti dengan bibit tanaman yang baru. Untuk

22

penyiangan, dilakukan bersamaan dengan penggemburan dan pemupukan yakni

pada saat umur tanaman 2 dan 4 minggu. Agar unsur hara dalam lapisan tanah

senantiasa tercukupi. Selama proses pemeliharaan tanaman, pengairan atau

penyiraman dilakukan 1-2 kali sehari pada awal tanam. Selanjutnya pengairan

dikurangi menjadi 2-3 kali seminggu, tergantung dari kondisi cuaca. Tapi yang

pasti jangan sampai kondisi tanah kering, serta jangan sampai ada air yang

tergenang atau becek.

2.6.5. Panen dan Pasca Panen

Masa panen tanaman seledri terhitung cepat,yakni 1-3 bulan setelah

ditanam, tergantung dari jenis varietasnya. Untuk varietas Tall-Utah misalnya,

sudah dapat dipanen pada umur 3 minggu setelah tanam dan Kintsai pada umur

50. Tanaman seledri dapat dipanen ketika pertumbuhannya telah maksimal

dengan ditandai banyaknya daun, mencapai ketinggian tertentu. Cara

memanennya dilakukan dengan mencabut seluruh tanaman.

2.7 Pengaruh IBD terhadap Profil Protein

Elektroforesis adalah sebuah metode untuk separasi atau pemisahan sebuah

molekul besar (seperti protein, fragmen, DNA, RNA) dari campuran molekul

yang serupa. Elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau

molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah

medan listrik. Sebuah arus listrik dilewatkan melalui medium yang mengandung

sampel yang akan dipisahkan. Elektroforesis sering dipakai dalam penelitian

mengenai adanya protein yang terekspresi di dalam sel, jaringan tumbuhan, hewan

ataupun manusia baik keadaan normal maupun tidak normal (Yuwono, 2008).

23

Menurut Manatsathit et al. (2002), pada kasus terjadinya suatu penyakit

seperti IBD yang disebabkan oleh pemberian obat-obatan NSAIDs seperti

indometasin dengan dosis 15 gram/kg BB dapat menyebabkan kerusakan vili dan

mukosa di usus. Inflamasi dan eksudasi dapat terjadi akibat infeksi bakteri atau

bersifat non infeksi seperti (Lanas dan Scarpignato, 2006). Dalam sistem imunitas

mukosa usus pada kasus IBD juga diekspresikan beberapa protein-protein yang

berperan dalam membantu penghambatan NF-

transkripsi yang mengatur ekspresi sel-sel sitokin proinflamatori seperti TNF-

sehingga menginisiasi terjadinya inflamasi usus. Protein tersebut akan berbeda

ketika dalam kondisi normal yang kemudian diperlukan analisa protein (Petrof et

al., 2004).

Tujuan analisa protein dengan metode elektroforesis yaitu untuk

memisahkan protein berdasarkan berat molekul dengan menggunakan matriks

penyangga akrilamid. Selain itu, dengan elektroforesis akan diketahui jenis

protein dalam bahan atau sampel yang akan dianalisis. Elektroforesis dalam skala

besar memungkinkan digunakan sebagi metode pemisahan untuk menentukan

komponen dari protein (Wibowo, 2010)

Salah satu metode elektroforesis adalah SDS-PAGE (sodium deodecyl

sulphate poly-acrilamid gel), yaitu metode yang umumnya digunakan untuk

analisa campuran protein secara kualitatif. SDS merupakan detergen anionik,

yang apabila dilarutkan molekulnya memiliki muatan negatif dalam pH yang luas.

Fungsi utama SDS pada metode SDS-PAGE yaitu memberikan muatan negatif

pada protein yang akan dianalisis, selain itu SDS dapat mendenaturasi protein,

24

mempermudah menyamakan kondisi dan menyederhanakan protein (bentuk,

ukuran dan muatan). Muatan negatif SDS akan menghancurkan sebagian struktur

kompleks protein dan secara kuat tertarik ke arah anoda bila ditempatkan pada

suatu medan listrik (Anam, 2009). Fungsi akrilamid pada metode SDS-PAGE

yaitu untuk mencegah difusi akibat timbulnya pana pada arus listrik. Selain itu gel

akrilamid sering dimanfaatkan untuk memisahkan molekul protein yang kecil.

Konsentrasi akrilamid total dalam gel dapat mempengaruhi migrasi protein. Pada

proses pembuatan gel, akrilamid akan berpolimerisasi secara spontan bila tidak

ada oksigen (Prihanto, 2011).

25

BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konseptual

Keterangan : : pengaruh induksi indometasin : pengaruh terapi ekstrak akar seledri : parameter yang diamati : induksi indometasin : pemberian terapi

: menghambat karena ekstrak akar seledri

Tikus (Rattus norvegicus)

Produksi ROS

Aktivasi NF-kB dan Fosforilasi inhibitor NF-kB

Ekspresi sitokin pro-inflamasi (TNF )

Perubahan Profil Protein

Kerusakan jaringan jejunum

Ekstrak akar seledri (bioaktif Diosmin)

Indometasin

Inflamasi

26

Jejunum yang terpapar indometasin dalam sekali induksi dengan dosis

15mg/ kgBB pada tikus Rattus norvegicus yang diinduksi secara oral dapat

menyebabkan inflamasi. Indometasin merupakan NSAID yang mengakibatkan

produksi ROS yang berlebih dalam sel. Oksigen reaktif yang terlepas

menyebabkan ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan endogen

sehingga menimbulkan stres oksidatif. Produksi ROS yang berlebihan dalam sel

menyebabkan aktivasi NF-kB dan fosforilasi inhibitor NF-kB. Kemudian NF-kB

berpindah menuju nukleus dan mengekspresikan sitokin pro-inflamasi seperti

TNF-

TNF- dapat mengaktifkan limfosit T. Limfosit T dibagi

menjadi Th1 dan Th2. Pada IBD, terjadi peningkatan aktivasi Th1 dan penurunan

Th2. Sel Th1 akan memproduksi sitokin-sitokin proinflamasi seperti TNF- -1,

IL-12, IFN- eningkatkan respon inflamasi. Th2 mensekresikan

sitokin antiinflamasi yaitu TGF- -sel imun

mencakup deaktivasi dalam produksi makrofag serta menghambat proliferasi Th1.

Sehingga secara tidak langsung peningkatan TNF- juga berhubungan dengan

adanya penurunan sitokin regulator seperti TGF- yang mengkontrol jumlah

TNF- .

Pada saluran cerna seperti pada jejunum, TGF- berperan dalam akumulasi

matriks ekstraseluler, proliferasi dan migrasi fibroblas pada usus, sehingga apabila

ekspresi sitokin ini turun akan terjadi inflamasi dan meningkatkan aktivasi

neutrofil, penurunan proteksi usus serta pelepasan enzim protease yang

menyebabkan kerusakan jaringan jejunum. Adanya proses inflamasi ini juga

27

menyebabkan terjadinya kerusakan jaringan dan juga terjadi perubahan pada

profil protein pada organ jejunum dengan tersintesisnya protein marker penanda

inflamasi.

Ekstrak akar seledri memiliki potensi digunakan sebagai terapi IBD karena

mengandung flavonoid yang merupakan senyawa antioksidan berperan dalam

menurunkan stres oksidatif. Penurunan stres oksidatif menyebabkan ROS ikut

menurun yang mengakibatkan NF-kB dan fosforilasi inhibitor NF-kB (IkB)

mengalami deaktivasi, sehingga terjadi penurunan ekspresi sitokin TNF-

akan diimbangi dengan peningkatan serta kestabilan TGF- aktor

keseimbangan toleransi mukosa, peningkatan perbaikan dan intregritas jaringan

jejunum. Adanya peningkatan sitokin antiinflamasi TGF- akan menghambat

regulasi sitokin-sitokin pro-inflamasi seperti TNF- -

aktivitas neutrofil sehingga kerusakan jaringan dapat dihambat. Selain itu, TGF-

yang meningkat memicu integrin dalam mengontrol reaksi perbaikan jaringan

melalui produksi kolagen, matriks ekstraseluler dan fibroblas sehingga

mengurangi inflamasi pada organ jejunum.

3.2 Hipotesa Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang ada, maka hipotesis yang dapat

diajukan adalah

1. Ada peningkatan produksi sitokin antiinflamasi TGF-

tikus (Rattus norvegicus) model IBD hasil induksi indometasin pasca

pemberian terapi ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens).

28

2. Ada perubahan profil protein antara jejunum tikus (Rattus norvegicus)

model IBD hasil induksi indometasin dan pasca pemberian terapi

ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens).

29

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2013 sampai Juni 2015 di

Laboratorium Biokimia Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam Universitas Brawijaya, Malang.

4.2 Materi Penelitian

4.2.1 Alat Penelitian

Alat yang dipakai dalam penelitian ini yaitu bak pemeliharaan hewan coba,

tempat pakan dan minum hewan coba, seperangkat alat bedah (gunting tajam tumpul,

gunting tajam tajam, scalpel dan pinset), papan bedah, cawan petri, beaker glass, tabung

reaksi, labu takar (10 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL), pipet tetes, mikro pipet (200 µL

dan 1000 µL), pH meter digital, stirrer, microtube, spuit, aluminium foil, sentrifugasi,

plastik organ, mortar, freezer -20oC, kulkas, waterbath, Spektofotometri Uv-Vis,

mikroskop cahaya, blue tip, yellow tip, spuit, autoclave, sarung tangan, vortex, pisau

dan timbangan digital.

4.2.2 Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang dipakai dalam penelitian ini antara lain ekstrak etanol akar

seledri yang dibagi menjadi dua sediaan yaitu sediaan dengan konsentrasi 1000 mg/100

mL dan 3000 mg/100 mL, tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar berumur 8-12

minggu, indometasin dengan dosis 15 mg/ kg BB tikus, minyak jagung, air, aquades,

30

larutan PBS-Azida, larutan PFA 4%, larutan NaCl fisiologis 0,9%, KCl, Formaldehyde,

HCl 1 N, parafin, xylol, Na2HPO4, Tris-HCl, etanol, PBS-Tween, PSMF, Lower Gel

Buffer (GLB), T-Acryl, gliserol, SDS, Ammonium Persulphate (APS), TEMED, Upper

Gel Buffer (UGB), marker pasir kuarsa dan alkohol.

4.3 Sampel Penelitian

Sampel penelitian yang digunakan adalah hewan coba berupa tikus (Rattus

norvegicus) jantan strain Wistar berumur 8-12 minggu dengan berat badan tikus antara

150-200 gram (Kusriningrum, 2008). Hewan coba diaklimatisasi selama tujuh hari

untuk menyesuaikan dengan kondisi di laboratorium. Estimasi besar sampel dihitung

berdasarkan rumus:

t (n-1)

4 (n-1)

4n 4

4n

n

n

n

Berdasarkan perhitungan di atas, maka diperoleh 4 perlakuan kelompok dengan 5 kali

ulangan dalam setiap kelompok. Total tikus yang dibutuhkan adalah 20 ekor.

Keterangan:

t = jumlah kelompok perlakuan

n = jumlah ulangan yang diperlukan

31

4.4 Rancangan Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak Lengkap

(RAL). Hewan coba dibagi menjadi empat kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol

negatif, kelompok kontrol positif, kelompok yang diinduksi indometasin dan diberi

terapi ekstrak etanol akar seledri dengan dosis 100 mg/ kg BB, kelompok yang

diinduksi indometasin dan diberi terapi ekstrak etanol akar seledri dengan dosis 300 mg/

kg BB. Kelompok kontrol negatif merupakan tikus tanpa perlakuan, sedangkan kontrol

positif merupakan tikus yang telah dipapar indometasin. Masing masing kelompok

perlakuan terdiri dari lima ekor tikus sebagai ulangan. Rancangan kelompok penelitian

ditunjukkan pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1. Rancangan kelompok penelitian

Kelompok Perlakuan Keterangan

Kontrol negatif (A)

Tikus dibiarkan hidup normal dengan pakan standar dan air minum ad libitum selama 23 hari. Pada hari ke 23 dilakukan pembedahan.

Kontrol positif (B)

Kontrol positif diinduksi dengan indometasin 15mg/kg BB pada hari ke 8 dan dilakukan pembedahan 24 jam setelah induksi indometasin.

IBD terapi 100 mg/ kg BB (C)

Pada hari ke 8 tikus diinduksi indometasin 15mg/kg BB. Selanjutnya pada hari ke 9 diberi terapi ekstrak etanol akar seledri dosis 100 mg/ kg BB sebanyak 2 mL/tikus selama 14 hari kedepan. Pada hari ke 23 dilakukan pembedahan.

32

4.5 Variabel Penelitian

Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah:

Variabel bebas : Pemberian Indometasin dan terapi ekstrak etanol akar

seledri ( Apium graveolens).

Variabel tergantung : Profil protein jejunum jejunum.

Variabel kendali : Tikus putih (Rattus norvegicus) strain wistar jantan, umur

8-12 minggu, berat badan 150-200 gram, kandang berukuran 17,5

x 23,75 x 17,5 cm, pakan pellet dan diberi air ad libitum.

4.6 Tahapan Penelitian

4.6.1 Persiapan Hewan Coba

Tikus dibagi dalam 4 kelompok perlakuan (Tabel 4.1) dan setiap kelompok

perlakuan di isi 5 tikus sesuai ulangan. Sebelum mendapat perlakuan, tikus

diaklimatisasi di kandang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm selama 7 hari agar tikus

beradaptasi dengan lingkungan (AOAC, 2005). Tikus diberi minum ad libitum dan

pakan yang sama selama proses perlakuan.

IBD terapi 300 mg/ kg BB (D)

Pada hari ke 8 tikus diinduksi indometasin 15mg/kg BB. Selanjutnya pada hari ke 9 diberi terapi ekstrak etanol akar seledri dosis 300 mg/ kgBB sebanyak 2 mL/tikus selama 14 hari kedepan. Pada hari ke 23 dilakukan pembedahan.

33

4.6.2 Persiapan Hewan Model IBD dengan Indometasin

Pemberian indometasin menggunakan metode sonde oral. Dosis indometasin yang

digunakan adalah 15 mg/kg BB tikus. Indometasin dilarutkan dalam minyak jagung

steril dengan perbandungan 45 mg indometasin dilarutkan dalam 4 mL minyak jagung.

Berat rata-rata tikus yang digunakan ±150 gram dan terdapat 15 ekor yang akan

diinduksi indometasin. Jadi indometasin yang diperlukan untuk setiap tikus dengan

berat badan 150 gram adalah

Kebutuhan indometasin = 150 gram / 1000 gram X 15 mg = 2,25 mg / tikus

Jadi yang diperlukan untuk pemberian indometasin pada 15 ekor tikus adalah 15

x 2,25 = 33,75 mg

Pengenceran dengan minyak jagung (dalam 45 mg diencerkan ke dalam 4 mL

minyak jagung) (Bures et al, 2011)

33,75 mg x 4 mL = 3 mL

45 mg

Untuk larutan indometasin yang diperlukan sebayak 33,75 mg indometasin yang

diencerkan ke dalam minyak jagung 3 mL untuk 15 ekor tikus dan induksi indometasin

per tikus sebanyak 2,25 mg / 45 mg x 4 mL = 0,2 mL/tikus.

4.6.3 Persiapan Ekstrak Etanol Akar seledri

Ekstrak etanol akar seledri dibuat dengan mengikuti tahapan pada metode

maserasi. Gel akar seledri hasil ekstraksi yang dibutuhkan dalam pembuatan stok

sediaan ekstrak etanol akar seledri adalah 8 g yang diperoleh dari proses ekstraksi

metode maserasi (Lampiran 6).

34

Bahan sejumlah 100 g serbuk akar seledri diekstraksi dan dibuat menjadi sediaan

dengan dosis 100 mg/ kg BB yang diberikan sebagai terapi untuk kelompok IBD C dan

dosis 300 mg/ kg BB yang diberikan sebagai terapi untuk kelompok IBD D (Lampiran

5). Terapi dilakukan satu kali sehari dengan pemberian sebesar 2 mL/ ekor selama 14

hari. Pemberian dilakukan secara sonde oral dengan spuit 10 mL.

4.6.4 Euthanasia dan Pengambilan Organ Jejunum

Pengambilan organ jejunum dilakukan dengan melakukan pembedahan tikus

terlebih dahulu. Sebelum dibedah tikus dilakukan euthanasia dengan cara dislokasi

leher, kemudian diletakkan pada papan bedah dan diposisikan secara terlentang

(dorsoventral). Alat bedah yang digunakan antara lain, yaitu scalpel, pinset dan gunting

serta dibutuhkan juga cawan petri. Setelah hewan dibedah dilakukan pengambilan organ

jejunum dengan cara diisolasi dan dipotong dari organ usus halus yang lain. Organ

jejunum diletakkan pada cawan petri sebagai tempat pencucian organ dengan larutan

NaCl Fisiologis 0,9%, kemudian organ jejunum dipotong menjadi dua bagian yang

masing-masing dimasukkan dalam larutan Phospate Buffer Saline-azida (PBS-azida)

pH 7,4 dan larutan paraformaldehid 4% (PFA).

4.6.5 Pembuatan Preparat Imunohistokimia Jejunum dan pengamatan

ekspresi TGF-

Organ difiksasi dengan cara jejunum dibilas dengan NaCL-fisiologis 0,9% dingin,

kemudian organ dibagi dan dimasukkan dalam larutan paraformaldehid 4% (PFA),

kemudian didehidrasi menggunakan alkohol bertingkat dari konsentrasi 70% selama 24

jam, etanol 80% selama 2 jam, etanol 90%, 95% dan etanol absolut selama 20 menit.

35

Kemudian organ dijernihkan dengan cara menerndam jaringan dalam larutan xylol I

selama 20 menit dan xylol II selama 30 menit. Proses selanjutnya adalah infiltrasi dan

embending jaringan dengan parafin cair pada inkubator suhu 58-60°C. Trimming

jaringan dengan cara meletakkan cetakan dalam mikrotom dan jaringan dipotong

dengan ketebalan 5µm. Sediaan jaringan dalam blok parafin kemudian disimpan dalam

inkubator 38-40°C selama 24 jam dan dilakukan pembuatan preparat imunohistokimia

(Muntiha, 2001)

Preparat organ jejunum yang telah jadi dilakukan deparafinasi dengan cara

direndam dalam larutan xylol 1, xylol 2, alkohol bertingkat (96%, 90%, 80%, 70%) dan

aquades masing-masing sebanyak satu kali lima menit. Kemudian preparat dicuci

dengan PBS pH 7,4 selama tiga kali lima menit dan selanjutnya diteteskan 3% hydrogen

peroksida (dalam dionize) selama 20 menit. Setelah itu preparat ddicuci dengan PBS 7,4

sebanyak tiga kali dan masing-masing selama lima menit. Preparat selanjutnya ditetesi

BSA (Bovin Serum Albumin) 1% dalam PBS selama 30 menit, lalu dicuci kemudian

preparat ditetesi dengan antibodi primer yakni Rat Anti TGF- dengan perbandingan (1

: 100), dibiarkan semalam dengan suhu 40°C (diencerkan dalam 1% BSA dalam PBS).

Preparat kemudian dicuci lalu ditetesi dengan antibodi sekunder Rabbit Anti Rat IgG

Biotin Labeled (2497,5 ; 2,5) yang didiamkan selama satu jam dalam suhu ruang.

Setelah itu preparat dicuci lalu ditetesi dengan SA-HRP (Strepta avidin-Horseradish

Peroxidase) selama 30-60 menit dalam suhu ruang selanjutnya dicuci kembali. Setelah

dicuci preparat diteteskan chromogen DAB (3,3-Diaminobenzidine tetrahydrochloride)

dibiarkan selama 10-20 menit dalam suhu ruang, lalu preparat dicuci kembali dan

36

ditetesi counter stam (Hematoxylen-Eosin) dan ditunggu 5 menit dalam suhu ruang.

selanjutnya dilakukan mounting dengan entellan dan hasilnya diamati dengan

mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Diagram alir metode imunohistokimia

dapat dilihat pada lampiran 8 (Dewi, 2011).

4.6.6 Elektroforesis SDS-PAGE

4.6.6.1 Isolasi Protein

Isolasi protein dimulai dengan menimbang organ jejunum sebanyak 0,5 gram,

ditambah sedikit pasir kuarsa dan digerus dengan mortar dingin yang diletakkan diatas

balok es. Setelah itu homogenat ditambah dengan larutan PBS-Tween : PSMF (9:1)

sebanyak 1 mL dan dipindahkan ke dalam tabung ependorf steril lalu disonifikasi

selama 10 menit dengan sonikator lalu disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan

6000 rpm. Selanjutnya supernatan diambil dan ditambahkan etanol absolut dingin

dengan perbandingan 1:1 dan disimpan dalam freezer selama semalam. Kemudian

dilakukan sentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu supernatan

dibuang dan dikering anginkan sampai bau etanol hilang. Kemudian endapan

ditambahkan dengan larutan Tris-HCl pH 6,8.

4.6.6.2 Persiapan Gel

Pada persiapan gel, yang dilakukan pertama adalah membuat plat gel dengan

merangkai dua plat kaca dengan jarak antar plate kurang lebih 1 mm. Gel dibuat dua

lapis yaitu sel sebagai tempat sampel (stacking gel) dan gel sebagai media untuk

pemisah protein (separating gel). Bahan-bahan untuk separating gel yaitu lower gel

buffer (LGB), T-Acryl, aquades, ammonium persulphate (APS), dan TEMED yang

37

dilarutkan menjadi satu dalam aquades steril. Kemudian larutan tersebut dituangkan ke

dalam plate tempat lapisan gel menggunakan mikropipet dan dibiarkan selama 15 menit

hingga terbentuk gel. Selanjutnya stacking gel dituangkan diatas separating gel yang

telah memadat sambil dipasang sisir hingga terbentuk gel beserta sumurannya.Untuk

pembuatan stacking gel dibuat dengan komposisi upper buffer (UGB), T-Acryl, APS,

TEMED dan dilarutkan menjadi satu dalam aquades steril. Setelah menjadi gel, sisir

diangkat dengan hati-hati dan plate dipasang pada alat elektroforesis dan dituangkan

larutan running buffer pada bejana alat elektroforesis.

4.6.6.3 Injeksi Sampel dan Running

Ekstrak kasar hasil isolasi dari jejunum diambil sebanyak 150 µl, ditambahkan

150 µl Reducing Sampel Buffer (RSB) dan dipanaskan pada penangas air dengan

temperatur 100°C selama 5 menit. Setelah dingin sampel dimasukkan dalam sumuran

gel dengan masing-masing sumuran sebanyak 30 µl dan pada salah satu sumuran gel

diisi dengan protein standar marker. Selanjutnya, anoda pada alat elektroforesis

dihubungkan pada reservoir bawah dan katoda dihubungkan pada reservoir atas, lalu

power supply dinyalakan dengan arus listrik konstan volt 200 volt selama 45 menit. Alat

elektroforesis dihentikan apabila warna penanda biru berada kurang lenih 0,5 cm dari

batas bawah plat gel. Kemudian gel diambil dari alat elektroforesis.

4.6.6.4 Perlakuan Setelah Running

Pewarnaan dilakukan dengan merendam gel dalam larutan staining selama 30-60

menit menggunakan shaker. Setelah gel terwarnai, larutan staining diganti dengan

38

larutan destaining untuk dapat membedakan pita protein yang terwarnai dengan gel

tanpa pita protein menggunakan shaker sampai gel menjadi jernih.

4.6.6.5 Penentuan Berat Molekul

Pita protein yang telah terbentuk pada gel hasil elektroforesis diukur berat

molekulnya dengan cara membandingkan dengan marker. Penentuan berat molekul

dilakuukan dengan menghitung nilai Rf (Retardation factor) dari masing-masing pita

dengan rumus:

Rf = jarak pergerakan protein dari tempat awal (cm)

jarak pergerakan warna dari tempat awal (cm)

kemudian dibuat kurva standar dengan harga Rf sebagai sumbu X dan harga

logaritma berat molekul sebagai sumbu Y, lalu diplotkan mobilitas dan berat molekul

dari protein yang dicari sehingga diketahui berat molekulnya.

4.6.6.6 Analisa Data

Data diperoleh dengan melihat dan menganalisa profil protein secara

semikuantitatif pada organ jejunum dengan metode SDS-PAGE, sedangkan analisa data

rata-rata presentase area ekspresi TGF- ukan secara kuantitatif statistik dengan

metode one-way ANOVA, kemudian dilakukan uji lanjutan BNJ (Beda Nyata Jujur)

dengan (taraf kepercayaan 95%).

39

BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1 Pengaruh Terapi Ekstrak Etanol Akar Seledri (Apium graveolens) Terhadap Ekspresi Transforming Growth Factor Beta (TGF- pada Jejunum Tikus Putih (Rattus norvegicus) Hasil Induksi Indometasin

Penyakit IBD atau secara medis disebut Inflammatory Bowel Disease adalah

penyakit dengan gejala peradangan pada saluran cerna. Parameter yang dapat

digunakan untuk mengetahui adanya reaksi inflamasi dengan cara pengamatan

ekspresi Transforming Growth Factor Beta (TGF- pada jejunum tikus dengan

metode imunohistokimia pada empat kelompok perlakuan yakni, kelompok

kontrol, kelompok IBD, kelompok terapi ekstrak etanol akar seledri dosis 100

mg/kg BB dan kelompok terapi ekstrak etanol akar seledri dosis 300 mg/kg BB

(Gambar 5.1).

Pada metode imunohistokimia ekspresi TGF-

berwarna kecoklatan pada preparat jejunum, karena adanya ikatan antara antigen

TGF- -

ini menggunakan dua jenis antibodi yaitu antibodi primer yakni Rat Anti TGF-

yang berikatan dengan antigen pada jaringan dan antibodi sekunder Rabbit Anti

Rat IgG Biotin Labeled. Pemberian antibodi sekunder diikuti dengan penambahan

SAHRP dan subtratnya berupa DAB yang merupakan substrat dari peroksidase

yang dapat menghasilkan warna kecoklatan, sehingga akan terbentuk warna yang

lebih jelas pada jaringan tersebut (Elias et al., 1989).

40

Gambar 5.1 Ekspesi TGF- tikus (Rattus norvegicus) Inflammatory

Bowel Disease (IBD) hasil induksi indometasin (Perbesaran 400x) (Pewarnaan IHK)

Keterangan : A = Jejunum tikus kontrol; B = Jejunum Tikus Model IBD diinduksi

indometasin; C = Jejunum tikus yang diiduksi indometasin dan diberi terapi ekstrak etanol akar seledri 100 mg/ kg BB; D = Jejunum tikus yang diinduksi indometasin dan diberi terapi ekstrak etanol akar seledri 300 mg/ kg BB. Tanda ) menunjukkan ekspresi TGF-

Hasil rata-rata ekspresi TGF-

dari 5 bidang pandang perbesaran 400x dengan menggunakan program

ImmunoRatio. Hasil yang diperoleh kemudian dikonversikan ke dalam presentase

dengan cara rata-rata perlakuan (B, C, D) dikurangi dengan rata-rata kontrol (A)

dibagi dengan rata-rata kontrol kemudian dikalikan dengan 100% pada Tabel 5.1.

Data yang diperoleh kemudian dilakukan perhitungan statistik menggunakan one

A B

C D

41

way dengan hasil uji

statistika (Calnek, 1997).

Tabel 5.1 Rata-rata Ekspresi TGF- perlakuan

Kelompok Rata-rata Ekspresi TGF- Ekspresi TGF- (%)

Penurunan Peningkatan

Sehat 25,06 ± 1.49 d - -

Induksi Indometasin

9,46 ± 1,11 a 62,25 -

Terapi 100 mg/kgBB

15,52 ± 0,89 b - 64,05

Terapi 300 mg/kgBB

19,69 ± 1,86 c - 111

Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan adanya perbedaan yang nyata (p<0,05). Persentase peningkatan terhadap kontrol negatif. Persentase penurunan terhadap kontrol positif.

Hasil Uji stastika (one way ANOVA) menggunakan software SPSS

Statistics 17.0 for windows nilai p-value (p<0,05) sebesar 0,000 menunjukkan

adanya perbedaan yang nyata antara ekspresi TGF- Rattus

norvegicus) yang diinduksi indometasin dengan ekspresi TGF-

kontrol, tikus (Rattus norvegicus) yang diberi terapi ekstrak etanol akar seledri

100 mg/ kg BB dan tikus (Rattus norvegicus) yang diberi ekstrak etanol akar

seledri 300 mg/ kg BB (Lampiran 11). Pada uji lanjutan BNJ (Lampiran 11)

menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antara kelompok perlakuan kontrol

yang memiliki notasi d dengan kelompok tikus induksi indometasin yang

memiliki notasi a. Kelompok terapi ekstrak etanol akar seledri 100 mg/ kg BB dan

kelompok terapi ekstrak etanol akar seledri 300 mg/ kg BB mampu meningkatkan

42

ekspresi TGF- b pada terapi 100 mg/

kg BB dan notasi c pada terapi 300 mg/ kg BB.

Perbedaan hasil perlakuan menunjukkan adanya pengaruh pemberian

indometasin terhadap penurunan ekspresi TGF- model IBD dan

peningkatan ekspresi TGF- etanol akar seledri.

Pada kelompok kontrol negatif ditunjukkan melalui Tabel 5.1 dengan nilai rata-

rata ekspresi TGF- tinggi sebesar 25,06 ± 1,49 dengan gambaran

imunohistokimia jejunum tikus (Rattus norvegicus) yang ditunjukkan dengan

warna kecoklatan pada seluruh pengamatan jaringan atau sel di jejunum yaitu

lamina propia dan sel epitel. Hal ini menunjukkan bahwa TGF-

tubuh walaupun kondisi tubuh sehat atau normal dengan kadar yang relatif stabil.

Sitokin TGF-

proinflamasi maupun antiinflamasi, yang berfungsi sebagai sitokin pengatur

homeostasis pada tubuh (Linda, 2010).

Ekspresi TGF- (Tabel 5.1) yaitu yang

diinduksi indometasin mengalami penurunan secara signifikan (p<0,05) terhadap

kelompok negatif yaitu sebanyak 62,25%. Penurunan ekspresi TGF-

karena adanya induksi indometasin, yakni golongan obat NSAID yang respon

kerjanya adalah mengakibatkan produksi ROS yang berlebihan dalam sel. ROS

merupakan radikal bebas yang dihasilkan endogen dan eksogen. Secara

intraseluler ini, terbentuk karena oksigen reaktif yang terbentuk menyebabkan

ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan endogen sehingga

menimbulkan stres oksidatif yang memicu aktivasi NF-kB dan fosforilasi

43

inhibitor NF-kB, kemudian NF-kB berpindah menuju nukleus dan

mengekspresikan TNF- sebagai sitokin proinflamatori, yang akan menyebabkan

timbulkan inflamasi. Produksi TNF- dapat mengaktifkan

limfosit T.

Limfosit T dibagi menjadi Th1 dan Th2. Pada IBD, terjadi peningkatan

aktivasi Th1 dan penurunan Th2. Sel Th1 akan memproduksi sitokin-sitokin

proinflamasi seperti TNF- -1, IL-12, IFN-

respon inflamasi. Th2 mensekresikan sitokin antiinflamasi yaitu TGF-

memiliki efek supresi sel-sel imun mencakup deaktivasi dalam produksi makrofag

serta menghambat proliferasi Th1. Sehingga secara tidak langsung peningkatan

TNF- urunan sitokin regulator seperti

TGF- -

jejunum, TGF- lam, menjaga toleransi usus, mempertahankan dan

memperbaiki jaringan yang rusak dengan cara akumulasi matriks ekstraseluler,

proliferasi dan migrasi fibroblas pada usus, sehingga apabila ekspresi sitokin ini

turun dan terjadi inflamasi akan meningkatkan aktivasi neutrofil serta pelepasan

enzim protease yang menyebabkan kerusakan jaringan jejunum.Tingginya

produksi sitokin proinflamasi, akan menurunkan sitokin regulator seperti TGF- ,

sehingga diperlukan zat seperti bioaktif flavonoid untuk membantu peningkatan

TGF- -

tinggi. Kelompok tikus terapi ekstrak etanol akar seledri pada tikus IBD dengan

dosis 100 mg/ kg BB dapat meningkatkan ekspresi TGF- 64,05% (Tabel

5.1). Begitu juga dengan perlakuan kelompok tikus yang keempat diberikan terapi

44

ekstrak etanol akar seledri dengan dosis 300 mg/ kgBB mengalami peningkatan

ekspresi TGF- 111% (Tabel 5.1). Data ini menjelaskan bahwa ekstrak

etanol akar seledri yang menjadi bioaktif diosmin dengan menurunkan reaksi

inflamasi pada kasus IBD melalui pengamatan ekspresi TGF-

Kandungan diosmin dari ekstrak etanol akar seledri yang merupakan salah

satu dari antioksidan golongan flavonoid yang berfungsi sebagai antioksiidan

yang menghambat efek toksis dari radikal bebas seperti ROS. Flavonoid akan

mendonorkan ion hidrogen sehinggan ion-ion yang mengalami radikal bebas

membentukan ikatan dengan ion hidrogen dan berubah menjadi lebih stabil.

Keadaan ion yang stabil menyebabkan penurunan stres oksidatif. Radikal bebas

yang sudah stabil juga dapat menekan pembentukan NF-kB, Penurunan stres

oksidatif menyebabkan ROS ikut menurun yang mengakibatkan NF-kB dan

fosforilasi inhibitor NF-kB (IkB) mengalami deaktivasi, sehingga terjadi

penurunan ekspresi sitokin TNF-

kestabilan TGF-

perbaikan dan intregritas jaringan jejunum. Adanya peningkatan sitokin

antiinflamasi TGF- -sitokin pro-inflamasi

seperti TNF- -

jaringan dapat dihambat. Selain itu, TGF-

dalam mengontrol reaksi perbaikan jaringan melalui produksi kolagen, matriks

ekstraseluler dan fibroblas sehingga mengurangi inflamasi pada organ jejunum.

(Chattopadhyay et al., 2006). Berdasarkan hasil analisis statistika diketahui terapi

ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens) yang terbaik dalam meningkatkan

45

ekspresi TGF-

dosis 300 mg/kgBB.

5.2 Pangaruh Terapi Ekstrak Etanol Akar Seledri (Apium graveolens) Terhadap Profil Protein Jejunum Tikus Putih (Rattus norvegicu) Hasil Induksi Indometasin

Profil pita protein yang diperoleh dari hasil elektroforesis SDS-PAGE

antara tikus kontrol negatif, tikus hasil induksi indometasin dosis 15 mg/kg BB,

tikus terapi ekstrak etanol akar seledri dosis 100 mg/ kg BB dan tikus terapi

ekstrak akar seledri dosis 300 mg/ kg BB, menunjukkan adanya perbedaan pita

protein yang tersintesis (Gambar 5.2).

Gambar 5.2 Profil pita protein jejunum tikus putih (Rattus norvegicus) dengan teknik SDS-PAGE.

Profil pita protein pada jejunum dengan berat molekul dari Gambar 5.2

ditunjukkan pada Tabel 5.2.

167 kDa

120 kDa

64 kDa 54 kDa

26 kDa

14 kDa

11 kDa

Keterangan: M = Marker Protein K (-) = Sehat K (+) = Hasil induksi indometasin T1 = Terapi ekstrak akar seledri 100 mg/ kg BB T2 = Terapi ekstrak akar seledri 300 mg/kg BB = Menunjukkan profil protein yang tersintesis berbeda pada perlakuan

46

Tabel 5.2. Perbedaan Berat Molekul (BM) Protein pada Jejunum

Kelompok

Berat Molekul (BM) Protein (kDa)

167 120 64 54 26 14 11

Sehat -

Induksi indometasin

- - -

Terapi 100 mg/ kg BB

- -

Terapi 300 mg/ kg BB

-

Hasil analisis penelitian profil protein jejunum tikus IBD dengan metode

SDS PAGE (Tabel 5.2) (Lampiran 12) menunjukkan sintesis protein yang

terekspresi pada kelompok tikus sehat dengan berat molekul 167 kDa, 120 kDa,

64 kDa, 54 kDa, 14 kDa dan 11 kDa . Kelompok tikus induksi indometasin

muncul profil protein dengan berat molekul 64 kDa, 26 kDa, 14 kDa dan 11 kDa,

yang mana ada beberapa protein yang tidak terkspresi seperti pada kelompok tikus

sehat serta ada satu protein yang tersintesis hanya pada tikus induksi indometasin

yaitu dengan berat molekul 26 kDa. Pada kelompok tikus terapi 100mg/ kgBB

terekspresi kembali protein dengan berat molekul 167 kDa, 64 kDa, 54 kDa, 14

kDa dan 11 kDa, sedangkan pada kelompok tikus terapi 300 mg/ kg BB protein

yang dengan berat molekul 167 kDa, 120 kDa, 64 kDa, 54 kDa, 14 kDa dan 11

kDa. Ekspresi protein ini terekspresi sama pada kelompok tikus sehat.

Data dari hasil penelitian tikus IBD yaitu pada Gambar 5.2 dan Tabel 5.2

menunjukkan tidak terjadi sintesis protein dengan berat molekul 167 kDa, 120

kDa dan 54 kDa. Namun ada sintesis protein dengan berat molekul 26 kDa yang

tidak ditemukan pada kelompok kontrol dan kelompok terapi. Protein dengan

47

berat molekul 26 kDa ini hanya nampak tersintesis pada kelompok kontrol positif

yang dilakukan induksi indometasin 15 mg/ kg BB.

Menurut pendapat Silalahi (2013) protein dengan berat molekul 26 kDa

diduga merupakan C-Reactive Protein (CRP). C-Reactive Protein (CRP) adalah

anggota dari golongan protein pentraxin, karena memiliki komposisi pentamer

cyclic yang identik dengan sub unit glikosilasi dan merupakan suatu protein

pengikat kalsium dengan sifat pertahanan imunologis. Molekul CRP terdiri dari 5-

6 subunit polipeptida non glikosilat yang identik, terdiri dari 206 residu asam

amino dan berikatan satu sama lain secara non kovalen, selain itu CRP juga

merupakan marker inflamasi yang diproduksi dan dilepas oleh hepar dibawah

rangsangan sitokin-sitokin seperti Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 1 (IL-1) dan

(TNF- yang ditujukan pada organ-organ yang

mengalami inflamasi seperti pada kasus ini adalah organ jejunum. Konsentrasi

CRP dalam keadaan normal adalah 0,0008-0,004 g/L atau 0,08-4 mg/dL

sedangkan dalam keadaan peradangan akut, konsentrasinya kira-kira 0,4 g/L atau

40 mg/dL, CRP beredar dalam darah selama 6-10 jam setelah proses inflamasi

akut serta destruksi jaringan, kadarnya akan naik dalam 48-72 jam. Kadar CRP

akan menurun tajam bila proses peradangan atau kerusakan jaringan mereda

dalam waktu sekitar 24-48 jam telah mencapai nilai normal kembali (Susanto dan

Adam, 2009).

CRP merupakan salah satu dari beberapa protein yang sering disebut

sebagai protein fase akut dan digunakan untuk memantau perubahan-perubahan

dalam fase inflamasi akut yang dihubungkan dengan banyak penyakit infeksi.

48

(Nakou et al., 2010). Induksi indometasin dosis 15 mg/kg BB menunjukkan

tersitesisnya protein dengan berat molekul 26 kDa yang merupakan C-Reactive

Protein (CRP) dimana protein ini merupakan marker penanda adanya inflamasi.

Munculnya protein ini disebabkan karena Indometasin terbukti meningkatkan

produksi Reactive Oxygen Species (ROS) yaitu radikal hidroksil

peroksida (H2O2) dan radikal nitrit oksida . ada proses oksidasi metabolit

indometasin dari DMBI (desmetildeskoro-benzoil-indometasin) menjadi

imunokuinon dan imunokuinon ini merupakan metabolit yang cukup reaktif.

imunokuinon ini nantinya akan berpengaruh terhadap aktivasi dari neutrofil yang

merupakan merupakan salah satu responden pertama sel-sel inflamasi untuk

bermigrasi ke jaringan yang mengalami peradangan dengan cara penghancuran

mikroorganisme hingga dapat merusak sel maupun jaringan (Basivirreddy et al.,

2002).

Pada tikus kontrol poritif (IBD) hasil induksi indometasin, profil protein

dengan berat molekul 167 kDa tidak tersintesis, diduga protein tersebut

merupakan 2-makrogloulin yang merupakan protein plasma terbesar di dalam

tubuh dan diproduksi oleh darah. Protein 2-makroglobulin bertindak sebagai

antiprotease dan mampu melumpuhkan berbagai macam proteinase, selain itu juga

dapat bertindak sebagai protein pembawa karena mampu mengikat berbagai faktor

pertumbuhan dan sitokin, antara lain platelet, TGF, insulin dan IL- Protein 2-

makroglobulin tidak tersintesis pada tikus kontrol positif karena adanya

peningkatan aktivitas protease yang mengindikasikan bahwa telah terjadi

inflamasi. Hal ini sesuai hasil penelitian (2012) bahwa induksi

49

indometasin dengan dosis 15 mg/ kg BB dapat menyebabkan IBD pada jejunum.

Peningkatan aktivitas enzim protease ini dapat memecah dan merusak protein

tersebut.

Pada tikus kontrol positif dengan induksi indometasin yang diharapkan

mampu membentuk gejala IBD, pita protein dengan berat molekul 120 kDa tidak

tersintesis, diduga protein tersebut merupakan enzim -galaktosidase yang mampu

menghidrolisis gugus -D-galaktosil terminal dari polimer -D-galaktosida

(Jacobson et al., 1994). Pada tikus sehat secara normal enzim -galaktosidase

berfungsi dalam pencernaan karbohidrat yang terdapat di mukosa usus halus

termasuk jejunum (Campbell et al., 2000), sedangkan pada tikus kontrol positif

tidak dtemukan karena terjadi kerusakan mukosa jejunum akibat gangguan

gastrointestinal oleh indometasin, sehingga konsentrasi -galaktosidae pada brush

border mukosa jejunum berkurang dan aktivitas enzim tersebut menjadi terganggu

(Sinuhaji, 2006). Pada kasus IBD terjadi gangguan gastrointestinal karena adanya

stres oksidatif yang salah satunya adalah penggunaan obat NSAID seperti

indometasin sehingga menyebabkan inflamasi dan aktivitas enzim protease

meningkat, sehingga mampu merusak kerja jejunum yang mengakibatkan

kerusakan enzim-enzim pencernaan. Sedangkan protein dengan berat molekul 54

kDa yang diduga merupakan enzim dehidrogenase, merupakan kompleks enzim

pertama yang sering disebut sebagai kompleks 1, pada bagian mitokondria disebut

rantai transport elektron. Enzim dehidrogenase bertindak memisahkan dan

menambahkan elektron atau hidrogen dari substrat, enzim ini juga tidak

50

ditemukan pada kontrol positif karena peningkatan aktifitas enzim protease yang

dapat memecah dan merusak protein tersebut (Naiola dan Widhyastuti, 2002).

Pemberian terapi ekstrak akar seledri dengan dosis 100 mg/ kg BB dan

300 mg/ kg BB pada masing-masing kelompok perlakuan menunjukkan tidak

tersintesisnya protein dengan berat molekul 26 kDa, yang merupakan C-Reactive

Protein (CRP), tidak munculnya protein marker penanda inflamasi ini disebabkan

karena kandungan dari ekstrak akar seledri berupa diosmin yang merupakan salah

satu golongan dari flavonoid yang merupakan antioksidan, yakni senyawa yang

mampu menghambat reaksi oksidasi atau zat yang mampu menetralkan radikal

bebas (Widjaya, 2003). Diosmin ini bertindak sebagai antioksidan karena mampu

mengurangi kerusakan akibat radikal bebas sampai 90% (Gadow et al., 2000).

Antioksidan dibagi menjadi dua kelompok yaitu antioksidan non enzimatik yang

didapat dari luar tubuh seperti flavonoid dan antioksidan enzimatik yang didapat

dalam tubuh. Produksi ROS dalam tubuh yang normal dapat di seimbangkan oleh

enzim Superoksida Dismutase (SOD) (Droge, 2002).

Pita protein dengan berat molekul 64 kDa merupakan protease yang

ditemukan pada semua kelompok perlakuan. Penelitian Sidney and Lester (1972)

menjelaskan bahwa enzim protease memiliki berat molekul 18-90 kDa. Pada

keadaan sehat, enzim protease berfungsi mengkatalisasi pemecahan ikatan peptida

dalam peptida, polipeptida dan protein menjadi molekul-molekul seperti rantai

pendek dan asam amino (Naiola dan Widhyastuti, 2002). Protein dengan berat

molekul 14 kDa diduga merupakan enzim lipase, protein ini terdapat di semua

perlakuan. Menurut Gong et enzim lipase dengat berat molekul 14 kDa

51

merupakan FABP (fatty acid binding protein) yang secara normal berfungsi

mengkatalisasi pemecahan lemak menjadi asam lemak dan gliserol. FABP

menghasilkan protein yang berfungsi untuk mengikat, transportasi dan pengaturan

deposit asam lemak.

Protein dengan berat molekul 11 kDa muncul di semua perlakuan, protein

dengan berat molekul antara 11-48 kDa termasuk small heat shock protein

(SHSP), protein ini memiliki fungsi utama molekul pendamping yang mencegah

aggregasi dan kesalahan pelipatan protein target, dan menjaga protein dalam

komponen lipatan yang benar, serta proteksi jaringan terhadap beberapa jenis stres

(Borges, 2005). Dalam keadaan sehat SHSP berfungsi sebagai molekul

pendamping, menjaga protein dan menfasilitasi transport protein. Dalam kondisi

stres SHSP menjaga agregasi protein, melipat kembali protein yang rusak dan

mendegradasikan protein yang sudah tidak bisa diperbaiki. Selain itu HSPS

bertindak sebagai molekul pro dan antiinflamasi. Sebagai anti inflamasi SHSP

memodulasi sinyal transduksi sitokin dan ekspresi gen melalui penghambatan

terhadap nuclear factor-kappa B (NF-kB) sehingga mencegah pelepasan mediator

inflamasi. Sebagai mediator pro inflamasi SHSP dapat melepaskan zat nekrotik

dan non nekrotik ke dalam lingkungan ekstraselluler yang akan memproduksi

berbagai respon immune dan inflamasi termasuk mengaktivasi beberapa efektor

sistim imun dan pelepasan sitokin.

Protein 2-makroglobulin dan dehidrogenase ditemukan kembali

tersintesis pada kelompok tikus terapi 100 mg/ kg BB dan 300 mg/ kg BB karena

kembali ke fungsi protein 2-makroglobulin adalah sebagai antiprotease, salah

52

satunya juga dengan mengikat faktor-faktor pertumbuhan, sedangkan dengan

pemberian ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens) mengandung

antioksidan dan antiinflamasi yang mampu menekan radikal bebas akibat dari

indometasin, sehingga perbaikan jaringan mulai terjadi sehinggan protein 2-

makroglobulin kembali bekerja normal, sementara untuk enzim dehidrogenase

pemberian terapi ekstrak etanol akar seledri dapat terekspresi kembali karena

mekanisme kerja dari flavonoid (Fl-OH) sebagai antioksidan yaitu dengan cara

mendonasikan atom hidrogen (H) dari gugus hidroksil (OH) kepada radikal bebas

(R ) yang mana mekanisme ini diperlukan enzim dehidrogenase sebagai rantai

transpor elektron, sehingga flavonoid berubah menjadi radikal fenoksis flavonoid

(FIO ) yakni (FI-OH+R

mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi maka dapat menyeimbangkan dengan

cara delokalisasi elektron sehinggan menjadi senyawa kuinon yang stabil.

Enzim -galaktosidase ditemukan kembali pada kelompok terapi ekstrak

akar seledri dengan dosis 300 mg/ kg BB dikarenakan adanya kandungan diosmin

dalam ekstrak yang berfungsi sebagai antioksidan mampu menangkal ROS yang

disebabkan oleh induksi indometasin dan memperbaiki permeabilitas membran

sel-sel intestinal untuk menyeimbangkan produksi sitokin proinflamatori dan

memperbaiki aktivitas kelenjar usus sehingga aktivitas enzim -galaktosidase

menjadi normal kembali.

53

Berdasarkan ekspresi TGF-

hasil induksi indometasin yang diterapi ekstrak etanol akar seledri dengan

kandungan antioksidan flavonoid diosmin menunjukkan pemberian terapi

menyebabkan protein marker inflamasi seperti CRP tidak tersintesis kembali,

sementara protein-protein yang tersintesis pada kelompok sehat (kontrol)

semuanya terekspresi kembali dan berpengaruh terhadap perbaikan jaringan

seperti kondisi normal dan dikuatkan dengan hasil pengamatan imunohistokimia

menyatakan hasil data ekspresi sitokin TGF-

terapi ekstrak etanol akar seledri sehingga apabila sitokin regulator ini meningkat

dapat membantu dalam proteksi usus dan bekerja menurunkan aktivitas sitokin

proinflamasi seperti TNF-

54

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN

6.1 Kesimpulan

1. Terapi ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens) meningkatkan

ekspresi sitokin TGF- tikus (Rattus norvegicus) model

IBD hasil induksi indometasin dengan dosis efektif 300 mg/ kg BB

dengan peningkatan ekspresi TGF- sebesar 111 %.

2. Terapi ekstrak etanol akar seledri (Apium graveolens) menunjukkan

adanya perubahan ekspresi profil pita protein dengan berat molekul

167 kDa, 120 kDa dan 54 kDa hanya tersintesis pada tikus sehat dan

terapi. Sintesis protein dengan berat molekul 26 kDa yang hanya

ditemukan pada kelompok tikus model IBD, serta ditemukan juga

sintesis protein dengan berat molekul 64 kDa, 14 kDa dan 11 kDa

pada seluruh perlakuan.

6.2 Saran

1. Diperlukan uji lanjutan secara kuantitatif dan kualitatif untuk

menentukan kadar dosis ekstrak akar seledri (Apium graveolens) yang

terbaik dan efektif untuk terapi penyakit Inflammatory Bowel Disease

(IBD).

2. Diperlukan uji lanjutan berupa uji western blot untuk mengkonfirmasi

protein dengan berat molekul 26 kDa sebagai C-Reactive Protein

(CRP).

3. Diperlukan identifikasi profil flora normal pasca terapi seledri.

55

DAFTAR PUSTAKA

Allen R. G. and M. Tressini, 2000. Oxidative Stress and Gene Regulation, Free Radical Biol Med., 28: 463-99.

Pengaruh Paparan

Lipopolisakarida pada Rongga Mulut dan Assisted Drainage Therapy (Adt) terhadap Kadar S-Ige dan Profil Radikal Bebas Pada Tikus Asma. Seminar Nasional Biologi XX dan Kongres PBI XIV UIN Maliki Malang 24-25 Juli 2009.

AOAC, International. 2005. Officials Methods of Analysis of AOAC International.

2 Vols. 16 edition, Arlington VA. USA. Association of Analytical Community.

and NL. Rahmah. 2012. The Potency of Sargassum

duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6 : 144-154. https://www.davidpublishing.org/journal. Diakses 04 Desember 2014.

Basivireddy, J., M. Jacob, R. Prabhu, A.B. Pulimood and K.A. Balasubramanian.

2002. Indometachin-induced Free Radical- Mediated Changes in The Intestinal Brush Border Membranes. Biochem. Pharmacol. 65: 683-695.

Besselsen, DG. 2004. Biology of laboratory rodent.http://www.ahsc.arizona.edu/ Bures, J., J. Pejchal, J. Kvetina, A. Tichy, S. Rejchrt, M. Kunes and M. Kopacova.

2011. Morphometric Analysis of The Porcine Gastrointestinal Tract in a 10-Day High-dose Indometachin Administration with or Without Probiotic Bacteria Eschericia coli Nissle 1917. J.Human and Experimental Toxicology 30(12): 1955-1962.

Campbell, K.J. and N.D. Perkins. 2000. Regulation of NF-kappaB Function. Biochem Soc Symp. 73:165-180.

Dalimartha, S. 2000. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Bogor : Trobus Agriwidya. Deltabase. 2006. Digestive system. Deltagen Inc. http://www.deltagen.com. [29

Mei 2014]. Djojoniningrat, D. 2006. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Jakarta: EGC. p. 384-

388. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2011. Pedoman Pengendalian Tikus.

http://www.depkes.go.id/Pengendalian%20tikus.pdf. Diakses 04 Desember 2014.

56

Droge, W., 2002. Free Radicals in the Physiological Control of Cell Function.

Physiol Rev 82:47-95. Dursun, H., F. Albayrak, M. Bilici, F. Koc, H. Hakan, T. Candar and O. Kukula.

2009. Gastroprotective and Antioxidant Effect of Opipramol on Indometachin-induced Ulcer Rats. Yakugaku Zasshi 129 (7) : 861-869.

Efendi, Z. 2003. Peranan Leukosit Sebagai Anti Inflamasi Alergik Dalam Tubuh.

Bagian Histologi. Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera Utara. Elahi, M., Q. Inayat, F. Wazir and Z. Huma. 2009. Adaptation of Rat Gastric

Mucosa Exposed to Indomethacin: a Histological Study. Gomal Journal of Medical Sciences. 7(2): 340-346

European Comission, Directorate-General Health & Consumer Protection.

. Report of the scientific Committee Health and Animal Welfare, 2000 April.

Fiocchi, C. 2001. TGF-

mechanisms and Possible Novel Therapies For Chronic Inflammation. Division of Gastroenterology, University Hospitals of Cleveland, and Case Western Reserve University. USA.

Friedman S, and RS Blumberg. Inflammatory Bowel Disease - Dalam, Longo DL,

Fauci AS, penyunting. th

edition. United States : The Mc Graw Hill companies ; 2010 ; 16 : 174-95.

Gadow, A., E. Joubert and CF. Hansmann. 2000. Comparison of the antioxidant

activity of aspalathin with that of other plant phenols of Rooibos Tea (Aspalathus linearis) -tocopherol, BHT and BHA. J. Agric.Food Chem., 45, 632-638.

Geboes, K. 2003. . J

Clin Pathol (18): 255-276 Halliwell, B and J.M.C., Gutteridge, 2000. Free Radical in Biology and Medicine.

Oxford University Press. New York. Hasanah, H. 2008. Pengaruh lama fermentasi terhadap kadar alkohol tape ketan

hitam (Oryza sativa L. var. formaglutinosa) dan tape singkong (Manihot utilissima Pohl). Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri, Malang.

57

Hedrich, HJ. 2006. Taxonomy stock and strains. J The laboratory Rat 71(92). Hofstetter, C. P., Holmstrom, N. A., and Lilja, J. A. 2005. Allodynia limits the

useful-ness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat. Nerosci. 8:346-353.

Inamoto T, M Namba, WM Qi, K Yamamoto, Y Yokoo, H Miyata, J Kawano, T

Yokoyama, N Hoshi, and H Kitagawa. 2008. An immunohistochemical detection of actin and myosin in the indigenous bacteria-adhering sites of micvilli in the rat jejunoileum. J Vet Med Sci 70(11):1153-1158.

Junqueira LC, and J Carneiro. 2005. Basic Histology: Text and Atlas. Ed.11.

Poule; McGraw-Hill Medical. Junqueira, LC. and J Carneiro. 2007. Basic Histology. The McGraw-Hill

Companies. Kathrani A., D. Werling, K. Allenspach. 2011. Canine breeds at high risk of

developing inflammatory bowel disease in the south-eastern UK. Veterinary Record. 169:635.

Kaser, A., S. Zeissig and R.S. Blumberg. 2010. Inflammatory Bowel Disease. Annu Rev Immunol. 28:573-621.

Kazuhide H, E. Umegaki, T. Watanabe, Y. Yoda, E. Morita, M. Murano, S.

Tokioka and T. Arakawa. 2009. Present status and strategy of NSAIDs-induced small bowel injury. J Gastroenterol 44:879 888.

Kumar, V., A.K Abbas., and N. Fausto, 2005. Tissue Renewal and Repair:

Regeneration, Healing, and Fibrosis In: Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease 7th eds. Philadelphia: Elsevier Saunders. p. 111-4.

Kusriningrum, 2008. Dasar Perancangan Percobaan dan Rancangan Acak

Lengkap. Fakultas Kedokteran Hewan. Universitas Airlangga. Surabaya. Lanas A, and C. Scarpignato. 2006. Microbial Flora in NSAID-Induced Intestinal

Damage: A Role for Antibiotics? Digestion;73(Suppl.1):136-150. Linda,A., and MD Feagins. 2010. Role of Transforming Growth Factor-

Inflammatory Bowel Disease and Colitis-associated Colon Cancer. Inflamm Bowel Dis 2010:16:1963-1968.

58

Martins, N.B. and MA Peppercorn. 2004. Inflammatory bowel disease. Am J Manag Care 2004, 10:544-552.

McCance, K.L., and S.E. Huether, 2006. Innate Immunity: Inflammation In: PATHOPHYSIOLOGY: The Biologic Basis for Disease in Adults and Children 5th eds. Philadelphia: Elsevier Saunders. p. 201-4.

McGavin MD and JF Zachary. 2007. Pathologic Basis of Veterinary Disease. Edisi ke-4. USA: Mosby Elsevier.

Middleton EJ, C Kandaswami, and TC.Theoharides. 2000. The effects on mammalian cells: implication for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev, 52(4):673-51Hofstetter et al. 2005.

Mitchell, R.N. and Cotran, R.S. 2003. Acute and chronic inflammation. Dalam S.

L. Robbins & V. Kumar, Robbins Basic Pathology (7th ed.)(pp33-59). Philadelphia: Elsevier Saunders.

Neuman, M.G. and R.M Nanau. 2011. Inflammatory bowel disease: role of diet,

microbiota, lifestyle. Translational Research. 160(1):29-44. Niedernhofer, Laura J., J. Daniels., Scott., C, A. Rouzer., Greene, F., Rachel., and

L. J. Marnett, 2003. Malondialdehyde, a Product of Lipid Peroxidation, Is Mutagenic in Human Cells. Journal of Biological and Chemistry Vol. 278, No. 33, pp. 31426-31433.

Podolsky, DK. 2002. Inflammatory Bowel Disease. N. Engl. J. Med. 347 (6): 417-

429. Pramono, S. 2005. Efek Antiinflamasi Beberapa Tumbuhan Umbelliferae.

Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Sekip Utara, Yogyakarta 55281.

Prihanto, A.A. 2011. Teknik Molekuler: Elektroforesis.

http://asep.lecture.ub.ac.id. Diakses tanggal 03 Desember 2014. Qi WM, K Yamamoto, Y Yokoo, H Miyata, T Inamoto, KGS Udayanga, J

Kawano, T Yokoyama, N Hoshi, and H Kitagawa. 2008. Histoplanimetrical study on the relationship between the cell kinetics of villous columnar epithelial cells and the proliferation of indigenous bacteria in rat small intestine. J Vet Med Sci 71(4):463-470.

Rush, J.W.E., S.G Denniss and D.A Graham. 2005. Vascular Nitric Oxide and

Oxidative Stress: Determinants of Endothelial Adaptations to Cardiovascular Disease and to Physical Activity. Can J Appl Physiol 30(4): 442-474.

59

Samuelson, DA. 2007. Textbook of Veterynary Histology. China: Saunder

Elsevier. Selawa, Widya,Max Revolta John Runtuwene, Gayatri Citraningtyas. 2013.

Kandungan Flavonoid dan Kapasitas Antioksidan Total Ekstrak Etanol Daun Binahong Anredera cordifolia (Ten) Steenis. Program Studi Farmasi FMIPA UNSRAT. Manado.

Skibola CF and MT Smith. 2000. Potential health impacts of excessive flavonoid

intake. Free Rad Biol Med 29:375-383

Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activities of spice plants extracts. Journal. Vytautas Magnus University, Faculty of Natural Sciences, Department of Biochemistry and Biotechnologies, Vileikos 8, Kaunas, LT-44404, Lithuania.

Susanto, H.K. and J.M.F. Adam. 2009. Plasminogen Activator Inhibitor-1 and

High Sensitivity C-Reactive Protein in Obesity. The Indonesian Journal of Medical Science, 2 (1): 23-31.

Takeuchi, K.; A. Tanaka; R. Ohno and A. Yokota. 2003. Role of COX Inhibition

in Pathogenesis of NSAID-Induced Small Intestinal Damage, Kyoto Pharmaceutical University, Kyoto.

Tamtomo, DG. 2008. Gambaran Histopatologi Kulit pada Pengobatan

Tradisional Kerokan. cdk 160/35 (1). UPT Materia Medica, 2014. Determinasi Tanaman Seledri. Dinas Kesehatan

Propinsi Jawa timur. Kota Batu. Wibowo, M. S. 2010. Elektroforesis. Sekolah Farmasi Institut Teknologi

Bandung. Widjaya, C. H. 2003. Peran antioksidan Terhadap Kesehatan Tubuh. Healthy

Choice. Edisi IV Yamada T. 2005. Inflammatory Bowel Disease. Handbook of Gastroenterology.

2nd ed. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins.p. 357-73. Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta: Penerbit Erlangga.