ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STAPHYLOCOCCUS SP

I. PENDAHULUAN

Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapt di alam

dan menumbuhkannya dalam suatu media buatan. Proses pemisahan

atau pemurnian dari mikroorgnanisme lain perlu dilakukan karena

semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi

mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari

satu jenis mikroorganisme saja.

Proses isolasi dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada

media padat, selanjutnya sel – sel microorganism akan membentuk

suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.

Staphylococcus sp merupakan gram positif berbentuk bulat,

biasanya bergerombol seperti buah anggur. Saat ini terdapt kurang

lebih 32 spesies Staphylococcus sp namun yang penting secara klinik

bagi manusia yaitu Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis,

dan Staphylococcus saprophyticus.

II. PRINSIP

Prinsip Isolasi : memisahkan satu jenis mikroorganisme dengan

mikroorganisme lainnya yang berasal dari

campuran bermacam – macam mikroorgnanisme

tersebut

Prinsip Kerja : pemeriksaan dilakukan dengan melakukan

identifikasi berdasarkan pada pemeriksaan

mikroskopik dengan pewarnaan gram,

pembiakan (morfologi dan sifat koloni), uji

katalase dan uji biokimia, uji plasma koagulase

dan DNase, dan uji resistensi terhadap antibotik

novobiosin.

III. TUJUAN

Untuk mengisolasi Staphylococcus sp sehingga dapat

mengidentifikasi jenis spesies dari Staphylococcus sp

( mengidentifikasi Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis,

Staphylococcus saprophyticus ).

IV. TINJAUAN PUSTAKA

Staphylococcus berasal dari kata staphylos berarti kelompok

buah anggur dan coccus berarti bulat. Kuman ini sering ditemukan

sebagai flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia.Pada tahun

1880 Pasteur mengenal mengisolir micrococcu yang membentuk

kelompok. Pada tahun 1881 Oyston berhasil mengisolir micrococci

dari abces. Pada tahun 1884 Rosenbach untuk pertama kalinya

mempelajari Staphylococcus secara mendalam sehingga berhasil

mengenal varietas aureus, albus dari micrococcus pyogenes.

A. Kalasifikasi Staphylococcus

Genus Staphylococcus mencakup 32 spesies. Kebanyakan tidak

berbahaya dan tinggal di atas kulit dan selaput lendir manusia dan

organisme lainnya. Mereka juga menjadi mikroba tanah. Genus ini

dapat ditemui di seluruh dunia.

Kingdom         :  monerA

Divisio             :  Firmicutes

Class                :  Bacilli

Order               :  Bacillales

Family             :  Sthapylococcacae

Genus              :  Staphyloccocus

Spesies            : Staphylococcus aureus

Staphylococcus citerus

Staphylococcus albus

  Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus saprophyticus (Cahtim dkk, 1993)

B. Morfologi dan Fisiologi

Morfologi

Bentuk : bulat, ukuran 1 mikron. Tidak membentuk spora.

Tidak mempunyai flagela. Letak sel satu sama lain yang

karakteristik bergerombol seperti buah anggur. Sifat karakteristik

ini dipakai sebagai pemberian nama Staphylococcus. Tetapi

kadang-kadang ada yang letaknya tersebar atau terpencar.

Pengelompokan ini akan terlihat baik pada pengamatan penanaman

dalam media padat. Pasangan atau rantai pendek lebih sering

terlihat dalam smear nanah dan kultur dalam kaldu. Sifat

pewarnaan : pada kultur muda bersifat Gram (+), sedang pada

kultur tua bersifat Gram (-).

Koloni micrococci tumbuh cepat pada media agar pada suhu

normal (370), dan biasanya bergaris tengah 1-2 mm setelah

inkubasi 24 jam. Koloni tadi halus, basah, menonjol dengan tepi

bulat dan berwarna, yaitu pada varietas albus berwarna putih,

varietas citreus berwarna kuning jernih dan varietas aureus

berwarna kuning emas. (Jawtez, 1996)

Fisiologi

Micrococci tumbuh paling baik pada suhu 220 – 370. Umumnya

dapat tumbuh dalam lingkungan aerob maupun anaerob. Produksi

warna terlihat baik pada situasi aerob dan  terlihat paling baik pada

kultur yang tumbuh pada suhu rendah.

Produksi toksin pada semua strain terlihat pada penanaman

dalam media sederhana yang berisi asam-asam amino, garam

glukosa dan faktor pertumbuhan yaitu thiamin dan asam nicotinat.

Dalam garis besarnya strain aureus lebih aktif metabolismenya dari

pada strain albus. Dalam media kaldu yang berisi dekstrosa,

sukrosa, maltosa, dan manitol akan terjadi pemecahan karbohidrat

menjadi asam tanpa gas. (Jawetz, 1996)

C. Patogenitas

Staphylococcus merupakan penyebab terjadinya infeksi yang

bersifat poogenik. Untuk pembuatan kultur dapat diambil bahan

dari pernanahan kecil, bisul kecil, bisul besar, dan abces diberbagai

bagian tubuh. Bakteri ini dapat masuk ke dalam kulit melalui

folikel-folikel rambut, muara kelenjar keringat dan luka-luka kecil.

Kemampuan yang menyebabkan penyakit dari staphylococcus

adalah gabungan dari efek yang ditimbulkan oleh produk-produk

ekstraseluler, daya infasi kuman dan kemampuan untuk

berkembang biak.

Staphylococcus patogen mempunyai sifat sebagai berikut:

Dapat menghemolisa eritrosit

Menghasilkan koagulasi’dapat membentuk pigmen (kuning

keemasan)

Dapat memecah manitol menjadi asam

Diantara staphylococcus yang mempunyai kemampuan besar

untuk menimbulkan penyakit ialah Staphylococcus aureus.

Staphylococcus nonpatogen bersifat:

Non hemolitik

Tidak menghasilkan koagulasi

Koloni berwarna putih

Tidak memecah manitol

Infeksi yang ditimbulkan oleh Staphylococcus dapat meluas ke

jaringan sekitarnya, perluasannya dapat melalui darah atau limfe,

sehingga pernanahan disitu bersifat menahun, misalnya sampai

pada sumsum sehingga terjadi radang sumsum tulang

(osteomyelitis). Perluasan ini dapat sampai ke paru-paru, selaput

otak dan sebagainya.

D. Toksin dan Enzim

Staphylococcus dapat menyebabkan penyakit karena

kemampuannya berkembang biak dan menyebarluas dalam

jaringan tubuh serta adanya beberapa zat yang dapat diproduksi

olehnya, zat tersebut ialah:

1) Eksotoksin

Bahan ini dapat diketemukan di dalam filtrat hasil

pemisahan dari kuman dengan jalan menyaring kultur. Bahan

ini bersifat tidak tahan pemanasan dan bila disuntikkan kepada

hewan percobaan dapat menimbulkan kematian dan nekrose

kulit. Eksotoksin ini mengandung hemolisin, yang dikenal

dalam beberapa jenis:

a) Alfa hemolisin       : ialah putih telur yang dapat

menghancurkan eritrosit kelinci dan dapat mempengaruhi

otot polos pembuluh darah.

b) Beta hemolisin      : ialah suatu putih telur yang dapat

menghancurkan eritrosit kambing (tetapi tidak pada eritrosit

kelinci) dalam 1 jam pada suhu 37o

c) Gama hemolisin    : bersifat antigen.

Eksotoksin ini bila ditambah formalin akan kehilangan sifat

toksinnya dan terbentuk toksoid yang dapat digunakan untuk

imunisasi, walaupun akhirnya tidak dipakai karena nilai

imunitasnya tidak ternilai. (Lowy, F. 2003)

2) Leukosidin

Yaitu suatu suspensi yang dihasilkan oleh

Staphylococcus yang bersifat membinasakan atau mematikan

leukosit dari berbagai macam spesies binatang. Leukosidin juga

suatu antigen tetapi lebih termolabil daripada eksotoksin.

(Lowy, F. 2003)

3) Enterotoksin

Yaitu suatu suspensi yang dihasilkan oleh jenis

Staphylococcus tertentu, terutama bila ditanam pada media

setengah padat dengan konsentrasi CO2 yang tinggi (30 %).

Sifat-sifat enterotoksin: bersifat antigen Termostabil, tidak

mengalami perubahan pada perebusan selama 30 menit.

Merupakan salah satu penyebab gejala keracunan

makanan dengan gejala berupa: lesu, kejang perut, berak-berak

(diare), muntah-muntah, yang terjadi 1-6 jam setelah makan

makanan yang mengandung enterotoksin. (Lowy, F. 2003)

4) Koagulase

Yaitu suspensi seperti enzim yang terdiri atas putih telur

yang dapat mengendapkan plasma sitrat atau plasma oksalat.

Staphylococcus patogen kebanyakan menghasilkan bahan ini.

(Lowy, F. 2003)

5) Lain-lain produk ekstra seluler dari Staphylococcus :

a) Stafilokinase yang dapat dengan lambat melarutkan fibrin

seperti streptokinase.

b) Penisilinase, yang dapat merusak penisilin G.

c) Hialuronidase

d) Proteinase

e) Lipase (Lowy, F. 2003)

E. Pemeriksaan Laboratorium

Untuk pemeriksaan staphylococcus secara laboratorium dapat

dilakukan dengan bermacam-macam cara.

Bahan pemeriksaannya dapat berupa:

Nanah

Darah

Cairan otak

Usapan luka

Pengambilan sampel untuk pemeriksaan mikrobiologi berneda

dengan pemeriksaan laboratorium lainya. Pengambilan sampel

untuk mikrobiologi harus dilakukan secar aseftik unuk mengindari

adanya kuman bakteri lain yang tumbuh pada saat pembiakan pada

media.

Pengambilan sampel darah untuk mikrobiologi harus dilakukan

dengan cara :

1. Tindakan asepsis kulit secara melingkar dengan iodophor dan

alkohol 70%

2. Darah diambil dengan spuit secara steril

3. Tanpa antikoagulan atau dengan sodium polyanetholsulfonate

(SPS) (Yellow-capped tube) dan pindahkan darah ke botol

media kultur

Pengambila sampel dari luka atau usapan luka :

Cara : biopsi(jar. Luka diambil sedikit) (terbaik),

aspirasi(disedot)(ex, bisul yg tertutup), dan swab

Anaerob : biopsi dan aspirasi

Aspirasi untuk :

Abses tertutup

Luka bergaung dengan cairan di dalamnya yang tertutup

debris superfisial

Swab :

Pus diluar dibersihkan terlebih dahulu dengan swab

yang telah dicelupkan dengan NaCl steril dengan swab

baru buat usapan dari dasar ulkus

Tidak dianjurkan untuk mengambil pus yang berasal dari drain

(Wahid, M. H. 2007)

V. CARA KERJA

Identifikasi dilakukan berdasarkan pada :

1. Pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan gram

Alat dan bahan :

Alat :

- Kaca obejek

- ose

- Lampu spirtus

- Mikroskop

Bahan :

suspensi bakteri Staphylococcus

sp

Cara kerja :

1) Buat apusan kering dari suspense bakteri yang tealh disediakan

2) Sedian yang telah difiksasi di bubuhi Kristal violet (1 menit)

3) Cuci dengan air mengalir, tetesi lugol (1 menit)

4) Cuci dengan air mengalir, tetesi alkolhol 96 % (20 – 30 detik)

5) Cuci dengan air mengalir, tetesi safranin (30 detik)

6) Cuci dengan iar mengalir, keringkan

7) Amati dengan mikroskop perbesaran 100X

2. Pembiakan (morfologi dan sifat koloni)

Bahan pemeriksaan ditanam pada perbenihan media agar darah dan

MSA (manitol salt agar), inkubasi pada suhu 37℃ selama 18 – 24 jam.

Kemudian hari berikutnya lakukan pengamatan koloni pada media

tersebut. Kemudian dilakukan kembali pewarnaan gram dari koloni

yang tumbuh untuk di identifikasi jenis spesies Staphylococcus nya.

3. Uji katalase dan uji biokimia

Uji katale untuk membedakan Staphylococcus dengan Streptococcus.

Alat dan bahan :

Alat :

- Objek glass

- Ose

- Lampu spirtus

Bahan :

- Koloni bakteri tersangka

- Larutan 2H2O

Cara kerja :

1) Siapkan objek galss, ambil 1 ose koloni bakteri

2) Tetesi dengan 2H2O aduk dengan ose

3) Amati terbentuknya gelembung gas

Uji bikomia dengan manitol untuk membedakan spesies dari bakteri

Staphylocccus sp.

Alat dan bahan :

Alat :

- Ose

- Lampu spirtus

Bahan :

- Koloni bakteri tersangka

- Media manitol

Cara kerja :

1) 1 ose koloni ditanam pada media manitol

2) Inkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam

3) Amati perubahan waran pada media

4. Uji plasma koagulase

Uji plasma koagulase digunakan untuk mengetahui bakteri

Staphylococcus yang pathogen.

Alat dan bahan :

Alat :

- Ose

- Lampu spirtus

- Objek glass

Bahan :

- Plasma

- Koloni bakteri

Cara kerja :

1) 1 ose koloni bakteri di tempatkan pada objek glass

2) Tambahkan 1 tetes plasma sitrat manusia

3) Campur dan baca hasilnya, hasil positif akan di tandai dengan

gumpalan putih.

5. Uji resistensi terhadap novobiosin

Cara kerja :

1) Sediakan lempeng agar Mueller hinton, buat suspense kuman pada

NaCl fisiologis sampai didapat kekeruhan 1 Mc farland

2) Tanam suspense kuman pada agar

3) Letakkan cakram antibiotic novobiosin

4) Inkubasi pada suhu 37 ℃ selama 24 jam.

VI. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil pengamatan

Hari I :

1. Hasil direct preparat dengan pewarnaan Gram

Sampel : se Bentuk : coccus

Susunan : bergerombol,

satu kokus, diplokokus

Sifat : Gram positif

Tersangka :Staphylococcus

sp

Sampel : sa Bentuk : coccus

Susunan : bergerombol

Sifat : gram positif

Tersangka : Staphylococcus sp

Hari II :

1. Morfologi koloni

Cirri-ciri koloni

Media

Agar Darah MSA

Koloni : se Koloni : sa Koloni : se

Bentuk koloni Bulat Bulat Bulat

Diameter(mm) 3 mm 3 mm 0.1 mm

Warna Putih Putih Putih

Elevasi Convex /

cembung

Convex /

cembung

Convex /

cembung

Permukaan Molst /

basah

Molst /

basah

Molst / basah

Pinggiran Rata Rata Rata

Sifat hemolisis* - hemolisis -

Mempermentas

i manitol

- - Tidak

memfermentasi

manitol

2. Hasil pewarnaan Gram dari koloni tersangka media AD

Sampel : se Bentuk : coccus

Susunan : bergerombol,

satu kokus, diplokokus

Sifat : Gram positif

Tersangka :Staphylococcus

sp

Sampel : sa Bentuk : coccus

Susunan : bergerombol,

satu kokus, diplokokus

Sifat : Gram positif

Tersangka :Staphylococcus

sp

3. Hasil uji katalase : koloni + H2O2 → bergelembung,

katalase positif (+)

Hari III :

No. Parameter pemeriksaan Hasil

1. Plasma koagulase Negatif (-)

2. Gula manitol Negatif (-)

3. Gula glukosa Positif (+)

4. Resistensi terhadap novobiosin Sensitif (diameter 20 mm)

B. Pembahsan

Cara pemeriksaan bakteri tersangka dapat dilakukan dengan car :

1. Pemeriksaan langsung

Dari bahan dibuat sediaan/preparat, kemudian diadakan

pewarnaan. Dapat dipakai zat warna sederhana, tetapi lebih baik

dengan zat warna Gram. Umumnya bersifat gram positif. Secara

mikroskopis tidak dapat dibedakan antara staphylococcus patogen

dan yang non patogen.

2. Penanaman

Kalau ditanam pada media agar darah selama 18 jam suhu

37O C akan tumbuh koloni. Untuk melihat ada tidaknya hemolisin,

atau terbentuknya pigmen. Pengeraman harus lebih lama lagi. Pada

infeksi campuran penanaman pada media ditambah 75 % NaCl

agar flora lain sukar tumbuh.

3. Tes Koagulase

Plasma sitrat yang telah diencerkan 1:5 dicampur dengan

pertumbuhan Staphylococcus dalam media cair dalam jumlah yang

sama. Kemudian ditunggu selama 3 jam, apabila terjadi

perjendelan berarti bahwa Staphylococcus tersebut menghasilkan

koagulase. Semua staphylococcus aureus yang tes koagulase positif

adalah bersifat patogen terhadap manusia, kecuali staphylococcus

albus yang dapat menyebabkan endocarditis (radang selaput dalam

jantung).

4. Tes Manitol

Staphylococcus ditanam pada media cair (air pepton) + 5 %

manitol + phenol merah (sebagai indikator). Setelah dieramkan 18-

24 jam akan terjadi perubahan warna menjadi kuning; karena

terbentuk asam.( Juuti, K. 2004)

Sama halnya dengan pemeriksaan bakteri tersangka pada

praktikum kali ini yaitu dengan cara :1. Pemeriksaan mikroskopik

Dari kedua sampel didapat :

Bentuk koloni : coccus

Susunan : bergerombol diplokokus, satu kokus

Sifat : gram positef

Tersangka : Staphylococcus sp

2. Isolasi

Sampel bahan pemeriksaan diisolasi dalam media dan

diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37o C selama 24 jam.

a. Biakan pada Agar Darah (BAP= Blood Agar Plate)

Media BAP untuk membedakan bakteri yang

menghemolisa darah dan non hemolisa.

Pengamatan koloni pada media:

Media Agar Darah : Koloni berwarna putih, halus, 

dan basah. Pada sampel sa di sekitar koloni menjadi jernih

atau transparan pada terjadi hemolisis. Kemudian Yang

tumbuh pada media BAP dengan koloni hemolisa positif

kemudian dilakukan pembuatan preparat dan pewarnaan

metode Gram ( karena Streptococcus juga hemolisa

positif ).

Hasil Pemeriksaan : Bentuknya Coccus/bulat, ungu

gram positif. Susunannya bergerombol seperti buah anggur.

b. Biakan pada MSA (Manitol Salt Agar).

Media MSA : Koloni berwarna merah berarti tidak

memecah manitol.

c. Koloni pada subkultur dilakukan uji katalase dan parameter

pemriksaan yang lain.

Uji Katalase : 1 ose koloni + 1 ose H2O2 3%.  Hasil

positif dengan indikasi dengan terbentuknya gelembung. 

Tes katalase menentukan apakah organisme menghasilkan 

enzim katalase yang menguraikan hidrogen peroksida

menjadi 

air dan oksigen. 

Parameter pemriksaan lain :

No

.Parameter pemeriksaan hasil

1. Plasma koagulase Negatif (-)

2. Gula manitol Negatif (-)

3. Gula glukosa Positif (+)

4.Resistensi terhadap

novobiosin

Sensitif (diameter 20

mm)

VII. KESIMPULAN

Diagnostik bakteriologik :

Dari bahan pemeriksaan dengan sampel se didapatkan bakteri

Staphylococcus epedermidis sedangkan dari sampel sa didapatkan bakteri

Staphylococcus aureus.

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Cahtim, A., dan Suharto. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta:

Bina Aksara Rupa. hal.39-52.

Jawetz, E., J. L. Melnick, E. A. Adelberg, G. F. Brooks, J. S. Butel and L. N.

Orston. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. Diterjemahkan

oleh E. Nugroho & R.F. Maulany. Jakarta: Buku Kedokteran

EGC. hal. 211-215.

Juuti, K. 2004. Surface protein Pls of methicillin-resistant Staphylococcus aureus role in adhesion, invasion and pathogenesis, and evolutionary aspects. [Disertation]. Helinski: Department of Biological and Environmental Sciences Faculty of Biosciences. p. 61-63.

Lowy, F. 2003. Gram positive : the example of Staphylococcus aureus. J Clinic Invest. 111(9): 1265-1273.

Wahid, M. H. 2007. Pengambilan specimen mikrobiologi . Dalam: Andra.

Jakarta, 29 Juni-1 Juli. Jakarta: Farmacia.