standar analisis semen who 2010

Alur Pemeriksaan Analisis Semen

[email protected]

Makroskopis

Kelayakan spesimen

Persiapan pasien

Pengumpulan spesimen

Mikroskopis

Format pelaporan hasil

Menilai:1. Likuifaksi (umumnya terjadi dalam

15–30 menit setelah diejakulasikan)2. Viskositas3. Warna4. Bau5. Volume6. pH (diperiksa dalam waktu 30–60

menit setelah diejakulasikan)

Diperiksa setelah likuifaksi sempurna (dalam 30–60 menit setelah semen die-jakulasikan), menilai:1. Agregasi. Jika agregasi banyak dite-

mukan, evaluasi apakah likuifaksi su-dah lengkap dan homogenisasi di-lakukan dengan baik.

2. Aglutinasi3. Motilitas4. Vitalitas. Harus dilakukan jika sperma-

tozoa immotile (IM) > 50%. Penting di-lakukan terutama jika spermatozoa pro-gresif (PR) < 40%.

5. Konsentrasi6. Morfologi7. Sel nonsperma

[email protected]

MAKROSKOPIS Likuifaksi15–30 menit pertama setelah diejakulasikanPemeriksaan selan-jutnya ditunda dan di tunggu dalam 30 menit berikutnya

Viskositas

Lengkap dalam 30 menit pertama

Tidak Lengkap dalam 30 menit pertama

Tidak lengkap dalam 60 menit

Lengkap dalam 60 menit

Tindakan/penambahan: Pipetasi Dulbecco’s PBS Bromelain

Warna & Bau

Viskositas < 2 cm Viskositas tinggi

Volume

pHDalam 30–60 menit setelah diejakulasikan

MIKROSKOPIS Agregasi & Aglutinasi

Evaluasi likuifaksi dan homogenisasi

Motilitas

Konsentrasi

Morfologi

Vitalitas

Sel nonsperma(sel bulat)

Leukosit peroksidase

Preparat basah perbesaran 100–400×

Spermatozoa <4/400×)

Konsentrasi spermatozoa

Spermatozoa >4/400×

Harus dilakukan jika IM > 50%Penting dilakukan jika PR < 40%

Sel bulat >106/ml

Setelah likuifaksi sempurna (30–60 menit setelah diejakulasikan)

Jika agregasi banyak

Aglutinasi positif

Pemeriksaan antibodi antisperma

Perhitungan tidak akurat: Konsentrasi dilaporkan sebagai

<2 × 106/ml dengan ditemukan atau tidak spermatozoa motil, atau

Memeriksa semen yang telah dis-entrifus untuk menemukan sper-matozoa, atau

Memeriksa sampel yang tidak disentrifugasi untuk mencari spermatozoa motil

Perhitungan akurat: Memeriksa semua grid (9

grid) improved Neubauer, atau

Menggunakan bilik hitung volume besar secara fluoresensi

Alur Pemeriksaan Analisis SemenAlat dan Bahan Analisis Semen Dasar secara Umum1. Sarung tangan2. Masker3. Jas lab4. Sepatu lab5. Kursi dengan meja yang tidak menyerap air6. Mikroskop dgn perbesaran 100x, 400x, 1000x7. Stage micrometer (optional)8. Minyak imersi 9. Tip kuning dan biru10.Tisu halus, lint-free11.Cairan pembersih lensa12.Tabung reaksi kaca steril ukuran 12x75mm + rak tabung13.Rak pewarnaan14.Mikropipet 5µl, 10µ, 100µl, 500µl, dan 1000µl15.Tip pipet kuning dan biru16.Tempat tip pipet17.Kontainer/tempat tip kotor18.Label19.Slide kaca dan slide pengapus20.Slide kaca dengan grid (optional)21.Pensil HB22.Counter hemocytometer23.Kertas dan alat tulis24.Kalkulator25.Refrigerator 2–8 °C26.Termometer ruangan27.Kertas saring (saringan 0,45 mikron)28.Improved Neubauer29.Coverslip* 22×22 mm, ketipisan no 4 (0,44 mm)30.Cawan petri + tutup31.Timer32.Counter33.Kalkulator34.Alat tulis

35.Penggaris, cm36.Tabel/grafik perbedaan perhitungan konsentrasi yg dpt diterima37.Tabel perkiraan kesalahan pemeriksaan (sampling error)38.Desinfektan/sodium hipklorit, 0,1% (v/v) dan 1% (v/v) dalam akuades39.Sabun desinfektan/antiseptik pembersih kulit40.Eye-wash solution/eye-rinse41.First-aid kit42.Blanko formulir hasil pemeriksaan semen43.Sample mixers:

Shaker dua dimensi atau rotator(optional) Vortex untuk mencampur semen yg telah diencerkan

40 Wadah semen41 Reagen pengencer40 Reagen pewarnaan41 Reagen peroksidase42 Kriteria spermatozoa normal dan abnormal43 Alat bantu gambar (vitalitas, peroksidase positif, ketentuan spermatozoa

yg dihitung, grid bilik hitung improved neubauer, morfologi, atlas spermatozoa (plate 1–14 WHO 2010))

44 Tabel-tabel/grafik untuk menentukan perhitungan yang dapat diterima

[email protected]

Pemeriksaan analisis semen dasarSpesimen : SemenWadah : Wadah khusus semen/wadah dari gelas bersih yang sudah diketahui beratnya atau wadah dari gelas ukur berskala (ketepatan 0,1 ml) yang

dimodifikasi bermulut lebar

Semua alat/bahan habis pakai sebaiknya steril

MakroskopisNo Parameter Alat Bahan Cara pemeriksaan1 Likuifaksi 1. Timer

2. Termometer ruangan3. Batang pengaduk*Optional : 1. Inkubator2. Shaker dua dimensi3. Spuit + jarum* no 18 (Ø

internal 0,84 mm) atau 19 G (Ø internal 0,69

1. Semen dalam wadah

Optional:1. Dulbecco’s

phosphate-buffered saline

2. Bromelain (enzim

‒ Diamati sejak 15 setelah semen diejakulasikan‒ Semen diletakkan pada suhu kamar (20–24°C) atau pada inkubator (37°C)‒ Sambil menunggu, sampel dengan perlahan di homogenkan menggunakan

batang pengaduk/memutar/menggoyang wadah semen atau menggunakan shaker dua dimensi pada suhu kamar (20–24°C) atau dalam inkubator 37°C.

‒ Dilakukan pencatatan waktu antara pengeluaran semen (sesuai keterangan pasien menggunakan jam yg sama) sampai waktu semen mengalami likuifaksi lengkap

‒ Tampilan likuifaksi lengkap berupa semen yang homogen, hanya tersisa

[email protected]

mm) proteolitik) dalam Dulbecco’s phosphate-buffered saline

sedikit daerah yang menggumpal, kadang mengandung butiran jeli/benang mukus ‒ Pelaporan likuifaksi dilakukan dalam satuan menit‒ Bila pada 30 menit belum terjadi likuifaksi lengkap, maka pemeriksaan selan-

jutnya ditunda dan di tunggu dalam 30 menit berikutnya‒ Bila dalam 60 menit belum juga terjadi likuifaksi lengkap maka dilakukan

pipetasi perlahan (6–10 kali) menggunakan syringe dengan ukuran jarum 18G atau 19G

Atau dengan penambahan: Medium fisiologis:Dulbecco’s phosphate-buffered saline dengan volume yang sama

dengan volume semen diikuti dengan pipetting Bromelain 10 IU/ml dalam Dulbecco’s phosphate-buffered salineCatatan: Penambahan dengan medium fisiologis atau Bromelin harus diperhitungkan ketika melakukan perhitungan konsentrasi sperma. Perlakuan-perlakuan untuk men-dapatkan likuifaksi (mengurangi viskositas) semen di atas dapat berpengaruh pada biokimia plasma seminal, motilitas dan morfologi sperma sehingga penggunaannya harus dilaporkan.

2 Viskositas 1. Batang gelas*atau

2. Pipet plastik* berlubang besar (Ø ± 1,5 mm), sebaiknya steril

3. Penggaris 10 cmOptional:1. Spuit + jarum* no 18 atau

19 G

1. Semen

Optional:1. Dulbecco’s

PBS2. Bromelain

dalam Dulbecco’s PBS

‒ Dinilai setelah likuifaksi lengkap‒ Melakukan aspirasi perlahan menggunakan pipet plastik berlubang lebar (Ø ±

1,5 mm), kemudian membiarkan semen menetes akibat gaya gravitasi‒ Mengukur panjangnya benang tetesanAtau dengan cara:‒ Membiarkan semen menetes melalui batang gelas‒ Panjang benang tetesan semen dinilai/dilaporkan dalam cm‒ Panjang normal: < 2 cm‒ Metode untuk mengurangi viskositas yang abnormal dapat dilakukan dengan

cara yang sama seperti yang dilakukan pada likuifaksi abnormal.3 Warna 1. Cahaya terang

2. Papan putih1. Semen Semen dilihat dengan latar belakang putih di tempat terang

Pelaporan: putih abu-abu/putih seperti kanji, putih kekuningan, kuning, kemerahan, atau kecoklatan.

4 Bau 1. Indra penciuman yg baik 1. Semen ‒ Dilakukan penilaian bau semen yang tercium saat pemeriksaan‒ Bau semen dilaporkan sebagai bau khas (bunga akasia), busuk, atau amis

5 Volume 1. Timbangan digital2. Gelas ukur* dgn skala


Mengumpulkan semen menggunakan wadah yang sudah ditimbang/diketahui berat-nya

[email protected]

ukur 0,1mlatau

3. Pipet volume* dgn skala ukur 0,1 ml + bola pipet

Menimbang wadah yang sudah berisi semen Mengurangi berat semen dengan berat wadah Menghitung volume semen dari berat semen dengan menganggap densitas semen

sebesar 1 g/ml (densitas semen bervariasi antara 1,043–1,102 g/ml)Atau dengan cara: Mengumpulkan semen secara langsung ke dalam gelas ukur yang dimodifikasi den-

gan mulut lebar Membaca volume semen secara langsung dalam gelas ukur (akurasi 0,1 ml).Catatan: Mengukur volume dengan cara aspirasi semen dari wadah semen ke dalam pipet atau syringe, atau menuang ke dalam gelas ukur tidak direkomendasikan, karena tidak semua sampel akan terukur sehingga volume yang terukur akan lebih rendah (volume yang hilang antara 0,3–0,9 ml).

6 pH 1. Kertas pH, skala ukur 6,0–10,0,jika ada dengan ketepatan 0,1


‒Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak ± 10 kali menggu-nakan pipet berlubang lebar (Ø ± 1.5 mm) secara perlahan

‒Meratakan 1 tetes semen pada kertas pH.‒Ditunggu sampai perubahan warna yang terjadi menjadi seragam (<30 detik).‒Dilakukan penilaian perubahan warna yang terjadi dengan cara mencocokkan den-

gan pH standar.*Sebaiknya steril

MikroskopisNo Parameter/

PersiapanAlat Bahan Cara pemeriksaan:

1. Pembuatan preparat basah

1. Pipet plastik* berlubang besar (Ø ± 1,5 mm)

2. Mikropipet 10 µl + tip kuning*

3. Gelas objek*4. Coverslip* 22×22 mm,

ketipisan no 4 (0,44 mm)Optional : 1. Sentrifus

1. Semen ‒Pemeriksaan dilakukan pada suhu kamar (20–24°C)‒Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak ± 10 kali menggu-

nakan pipet berlubang lebar (diameter ± 1.5 mm) secara perlahan (hindari terben-tuknya gelembung udara)

‒Sebanyak 10µl semen diletakkan di atas gelas objek‒Gelas objek ditutup dengan coverslip 22×22 mm (hindari terbentuknya gelembung

udara)‒Membuat replikat preparat basah dengan cara yang sama.‒Dilakukan pemeriksaan dengan segera preparat basah yang sudah jadi setelah semen

tidak lagi mengalir (± 1 menit). Catatan: Homogenisasi tidak boleh menggunakan vortex (merusak spermatozoa).

2. Pemeriksaan awal

1. Mikroskop dengan perbesaran 100–400 ×

1. Preparat basah

‒ Preparat basah diperiksa dengan perbesaran 100× sebagai scanning awal untuk melihat formasi benang mukus, agregasi, aglutinasi, sel non sperma. Perbesaran

[email protected]

(skrining) 200–400× digunakan untuk memperjelas temuan skrining awal, menilai motilitas sperma dan untuk menentukan besar pengenceran

‒ Pemeriksaan dimulai dengan perkiraan jumlah sperma/lapang pandang besar (LPB), agregasi, aglutinasi dan motilitas

‒ Jika jumlah spermatozoa pada pemeriksaan mikroskopis awal rendah (<4/LPB (400×)= ± 1×106/ml) maka perhitungan konsentrasi sperma yang akurat mungkin tidak diperlukan. Untuk penilaian konsentrasi sperma rendah (<2/LPB(×400)= <±0,5×106/ml) yang akurat, direkomendasikan untuk menggunakan semua grid (sembilan grid) pada bilik hitung improved Neubauer atau bilik hitung bervol-ume besar dengan menggunakan pemeriksaan fluoresensi.

3. Pembuatan preparat basah dengan sentrifugasi




ketipisan no 4 (0,44 mm)

1. Semen ‒Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak ± 10 kali menggu-nakan pipet berlubang lebar (diameter ± 1.5 mm) secara perlahan (hindari terben-tuknya gelembung udara). Jika semen viskous, maka dilakukan perlakuan untuk mengurangi viskositas seperti perlakuan pada likuifaksi semen yang abnormal.

‒Sebanyak 1 ml semen diletakkan dalam tabung reaksi steril‒Dilakukan sentrifugasi pada 3000g selama 15 menit‒Membuang supernatan dengan menyisakan ± 50µl‒Melakukan resuspensi sedimen, kemudian sedimen dihomogenkan‒10µl sedimen diteteskan pada gelas objek dan tutup dengan coverslip‒Membuat replikat preparat dengan cara yang sama‒Dilakukan pemeriksaan preparat dengan perbesaran 100–250× (WHO 2010 men-

yarankan perbesaran 200–250×)‒Memeriksa seluruh lapang pandang coverslip secara sistematis (zig-zag). Dimulai

dari satu sudut dan bergerak sepanjang sumbu x sampai ke sudut seberang; kemu-dian berpindah satu lapang pandang sepanjang sumbu y dan kembali memeriksa sepanjang sumbu x sampai seluruh lapang coverslip diperiksa

‒Ditemukan spermatozoa pada salah satu replikat menunjukkan cryptozoospermia. Tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat menunjukkan dugaan azoosper-mia.

4. Agregasi & Aglutinasi

1. Mikroskop2. Contoh gambar agregasi3. Contoh gambar aglutinasi

1. Preparat basah semen

‒Preparat basah diperiksa dengan perbesaran 100–400×‒Perbesaran 100× digunakan untuk skrining awal‒Perbesaran 200–400× digunakan untuk memperjelas temuan awal‒Memeriksa ada tidaknya agregasi atau aglutinasi‒ Jika agregasi banyak ditemukan, maka dilakukan evaluasi apakah likuifaksi sudah

lengkap dan apakah homogenisasi sudah dilakukan dengan baik‒Hasil pemeriksaan agregasi dilaporkan sebagai positif atau negatif‒Agregasi sperma yang positif dilaporkan sebagai agregasi sedikit atau banyak (ratu-

[email protected]

san spermatozoa yang beragregasi) ‒Aglutinasi dilaporkan sebagai positif atau negatif‒Bila aglutinasi positif maka ditentukan bentuk dan derajat aglutinasi.‒ Jika aglutinasi positif disarankan untuk pemeriksaan antibodi antisperma.

5. Motilitas 1. Mikroskop2. Coverslip* 22 x 223. Spidol permanen (0,05

mm) untuk membuat garis 5 mm pada pinggir coverslip) Atau

4. Eyepiece reticle5. Gambar area baca

coverslip dan alur baca6. Counter (hemocytometer)7. Kriteria motilitas

progresif, nonprogresif dan imotil

8. Tabel/grafik untuk menentukan perbedaan perhitungan yang dapat diterima

1. Preparat basah semen

‒ Pemeriksaan motilitas dilakukan dalam 30 menit–1 jam sesudah ejakulasi‒ Menggunakan preparat basah segar‒ Pemeriksaan motilitas dilakukan setelah ± 1 menit dilakukan inkubasi preparat

basah (semen tidak ada lagi yang mengalir)‒ Menggunakan perbesaran 200× atau 400× ‒ Dilakukan pada suhu kamar (20–24°C) atau pada suhu 37°C sesuai standarisasi tiap

laboratorium‒ Area baca untuk menilai motilitas sperma adalah pada > 5 mm dari pinggir cover-

slip (pada bidang tengah coverslip)‒ Penilaian motilitas sperma pada preparat basah mengikuti alur yang sistematis dan

acak ‒ Jika menggunakan eyepiece reticle, maka area penilaian hanya dipilih baris bagian

atas jika spermatozoa banyak (konsentrasi tinggi) atau seluruh baris jika spermato-zoa sedikit (konsentrasi rendah)

‒ Menilai dan menghitung dengan cepat, tidak menunggu spermatozoa berenang pada area baca. Menghitung salah satu saja, spermatozoa yang berenang keluar area baca atau yang masuk ke dalam area baca

‒ Hanya sperma utuh (mempunyai kepala dan ekor) yang dinilai, spermatozoa motil kepala jarum (pinhead) tidak dinilai

‒ Penilaian dimulai dengan bertahap; menghitung spermatozoa yang progresif (PR) terlebih dahulu dalam 1 LP, kemudian dilanjutkan dengan menghitung spermatozoa yang non progresif (NP) dalam LP yang sama, dan selanjutnya spermatozoa yang imotil (IM) dalam LP yang sama

‒ Untuk mencegah bias pada penilaian motilitas, tahapan penilaian dapat dibalik den-gan menilai IM terlebih dahulu, kemudian NP dan terakhir PR

‒ Perhitungan jumlah tiap kategori motilitas spermatozoa dibantu dengan counter (hemocytometer)

‒ Penilaian motilitas spermatozoa dilakukan pada minimal 200 spermatozoa dalam to-tal minimal 5 lapang pandang tiap replikat

‒ Jika perhitungan sedang pada tahap pertama atau kedua (contoh, pertama menilai PR, kedua menilai NP dan ketiga menilai IM dalam area yang sama) dan perhitun-gan mencapai 200 spermatozoa sebelum semua tingkat motilitas dinilai, maka perhi-

[email protected]

tungan harus dilanjutkan melebihi 200 spermatozoa sampai semua tingkat motilitas telah dinilai

‒ Selanjutnya dilakukan penilaian motilitas sperma pada preparat replikat dari sampel yang sama dengan cara yang sama

‒ Menghitung rerata dan perbedaan persentase sperma hidup dari 2 preparat dengan melihat tabel perbedaan yang dapat diterima dari hasil perhitungan rerata pada 2 preparat basah (melihat tabel/grafik)

‒ Menentukan penerimaan perbedaan dari rerata persentase perhitungan antara 2 preparat basah dilakukan dengan cara menghitung rerata persentase sperma PR, NP atau IM. Kriteria yang sering digunakan adalah rerata IM, dengan rumus:

Rerata imotil= Jumlah % total sperma imotil dari 2 preparat basah 2

‒Hasil yang didapat merupakan % rerata‒Menghitung selisih jumlah persentase antara 2 preparat basah. Hasil yang didapat

merupakan batas atas perbedaan yang dapat diterima (melihat tabel/grafik)‒Bila perbedaan antara 2 preparat basah dapat diterima (sesuai dengan tabel 2.1),

maka dilanjutkan dengan perhitungan hasil. Bila tidak, maka dilakukan pembuatan 2 preparat basah baru dan dilakukan penilaian ulang

‒Melaporkan hasil rerata persentase tiap tingkatan motilitas sperma‒Pembulatan ke nilai terdekat. Ketentuan pembulatan nilai 0,5 untuk puluhan di-

lakukan pembulatan ke bawah, untuk satuan dilakukan pembulatan ke atas (contoh, 32,5% dibulatkan ke bawah menjadi 32%; tapi 3,5% dibulatkan ke atas menjadi 4%).

‒Hasil dilaporkan dalam persentase ketiga tingkatan motilitas sperma.

6. Vitalitas a. Eosin: 1. Pipet plastik* berlubang

besar (Ø ± 1,5 mm) untuk homogenisasi


3. Coverslip ukuran 22mm x 22mm

4. Minyak imersi

1. Eosin Y (colour index 45380)

2. NaCl 0,9% Cara pembuatan: Melarutkan 0,5 g eosin Y dalam 100 ml NaCl 0,9%

Pembuatan preparat:‒Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak ± 10 kali menggu-

nakan pipet berlubang lebar (diameter ± 1.5 mm) secara perlahan (hindari terben-tuknya gelembung udara)

‒Meneteskan 5 μl semen dan 5 μl larutan eosin 0,5% pada objek gelas‒Mencampur 5 μl semen dan larutan eosin 0,5% menggunakan tip pipet dengan ger-

akan melingkar‒Menutup campuran dengan coverslip ukuran 22mm × 22mm

[email protected]

‒Sediaan diinkubasi selama 30 detik‒Membuat preparat replikat/duplikat dengan cara yang samaAtau dengan cara:‒Setelah dilakukan homogenisasi, selanjutnya dilakukan pencampuran 5 μl semen

dan 5 μl larutan eosin 0,5% pada objek gelas‒Melakukan inkubasi selama 1 menit‒Membuat apusan seperti membuat apus darah tepi‒Membiarkan preparat kering di udara‒Membuat replikat preparat‒Preparat dapat diperiksa menggunakan minyak imersi, perbesaran 1000×.Cara pemeriksaan vitalitas:‒Dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa yang terwarnai (mati) dan tidak terwar-

nai (hidup) menggunakan counter. Menghitung 200 spermatozoa tiap preparat. Spermatozoa mati akan berwarna pink tua/merah, spermatozoa hidup berwarna putih

‒Membaca masing-masing preparat, sebaiknya menggunakan optik fase kontras negatif (fase kontras positif membuat warna merah muda sulit dilihat) pada perbe-saran 200× atau 400×

‒Menghitung rerata dan perbedaan persentase sperma hidup dari 2 preparat‒Menentukan apakah perbedaan dapat diterima; Jika perbedaan dapat diterima, maka

dilaporkan persentase sperma hidup; Jika perbedaan tidak dapat diterima maka di-lakukan pembuatan 2 preparat baru dan melakukan pemeriksaan ulang

‒Persentase sperma mati tidak boleh melebihi persentase sperma imotil, jika keadaan ini terjadi maka dilakukan pemeriksaan ulang, bila perlu dengan menggunakan 2 preparat baru; Persentase sperma hidup umumnya lebih banyak dibandingkan den-gan sperma motil. Hasil pemeriksaan dilaporkan dalam persentase rerata sperma hidup yang digenapkan ke angka terdekat.

b. Eosin–nigrosin: 1. Pipet plastik* berlubang

besar (Ø ± 1,5 mm) untuk homogenisasi


1. Eosin Y (colour index 45380)

3. NaCl 0,9% 2. Nigrosin

(colour index

Cara pembuatan eosin-nigrosin: ‒ Melarutkan 0,67 g eosin Y dalam 100 ml NaCl 0,9%‒ Menambahkan 10 g nigrosin dalam 100 ml larutan eosin Y‒ Mendidihkan suspensi campuran, kemudian membiarkan dingin dalam temperatur

kamar

[email protected]

3. Minyak imersi4. Porcelain spot plate well

atau test-tube

50420) ‒ Menyaring menggunakan kertas saring ( 90 g/m2)‒ Menyimpan pada botol gelas hitam tertutup rapat.

c. Hypotonic swelling : 1. Freezer –20 °C2. Tabung mikrosentrifus3. Inkubator

1. Swelling solu-tion;

2. Akuades

Cara pembuatan Swelling solution : ‒ 0.735 g sodium citrate dihydrate + 1.351 g of D-fructose dalam 100 ml akuades,

kemudian bekukan 1 ml larutan pada –20 °C‒ Untuk penggunaan: solusi 1 ml dicairkan pada inkubator suhu 37°C selama 5–30

menit, kemudian diencerkan dengan akuades 1 + 1 (1:2).7. Konsentrasi 1. Refrigerator 2–8 °C

2. Termometer ruangan3. Kertas saring (saringan

0,45 mikron)4. Gambar ketentuan

spermatozoa yg dihitung5. Improved Neubauer6. Mikropipet 10µl7. Coverslip* 22×22 mm,

ketipisan no 4 (0,44 mm)8. Tip kuning9. Tabung reaksi10. Cawan petri + tutup11. Timer12. Counter13. Kalkulator14. Alat tulis15. Tabel/grafik perbedaan

perhitungan konsentrasi yg dpt diterima

16. Tabel perkiraan kesalahan pemeriksaan (sampling error)

Optional:1. Coverslip ukuran 24

mm × 50 mm2. Mikropipet 40µl atau

20µl

1. Semen2. Reagen

sebagai larutan pengencer

Tahapan pemeriksaan konsentrasi sperma: Menentukan besarnya pengenceran menggunakan preparat basah yang digunakan

pada pemeriksaan motilitas Mencampur semen dengan larutan pengencer Mengisi bilik hitung dan membiarkan spermatozoa mengendap pada suasana lem-

bab Menilai sampel dalam 10–15 menit (mencegah pengaruh penguapan pada posisi

spermatozoa dalam bilik hitung) Menghitung minimal 200 spermatozoa per replikat (total 400) dengan memper-

hatikan ketentuan spermatozoa yg dihitung pada bilik hitung Membandingkan perhitungan replikat untuk menentukan apakah perhitungan da-

pat diterima atau tidak. Jika perhitungan dapat diterima maka dilanjutkan dengan perhitungan konsentrasi spermatozoa per mililiter; jika tidak maka dilakukan pem-buatan preparat baru.

Perhitungan konsentrasi spermatozoa per mililiter. Perhitungan jumlah total spermatozoa per ejakulasi.

a. Persiapan reagen sebagai larutan pengencer‒Melarutkan 50 g sodium bikarbonat (NaHCO3) dan 10 ml formalin 35% (v/v) dalam

1000 ml akuades‒Bila perlu dapat ditambahkan 5 ml gentian violet jenuh (>4mg/ml) untuk memperje-

las kepala spermatozoa‒Menyimpan reagen pada suhu 4°C. Bila terbentuk kristal pada larutan, maka di-

lakukan penyaringan reagen dengan kertas saring (saringan 0,45 mikron) sebelum digunakan.

b. Melakukan pengenceran menggunakan larutan pengencer sesuai ketentuan pada tabel.

Jika ditemukan terlalu sedikit spermatozoa per lapang pada pengenceran yang direkomendasikan, maka dilakukan pembuatan preparat baru dengan pengenceran yang lebih rendah

[email protected]

Jika ditemukan terlalu banyak spermatozoa yang tumpang tindih per lapang pandang pada pengenceran yang direkomendasikan, maka dilakukan pembuatan preparat baru dengan pengenceran yang lebih tingg

Jika pengenceran 1 + 19 (1:20) tidak memadai (banyak ditemukan spermatozoa yang tumpang tindih), maka digunakan pengenceran 1 + 49 (1:50).

c. Cara melakukan pengenceran Mempersiapkan 2 tabung reaksi berisi larutan pengencer (sesuai pengenceran yang

digunakan) Semen dihomogenkan dengan baik menggunakan cara seperti yang telah dijelaskan

sebelumnya Segera melakukan aspirasi sejumlah volume semen (sesuai pengenceran) Menyeka bagian luar tip pipet semen (tidak mengenai lubang pipet) Memasukkan semen ke dalam tabung berisi larutan pengencer dan melakukan aspi-

rasi laruran pengencer untuk membilas tip pipet Melakukan tindakan yang sama untuk membuat replikat pengenceran

d. Cara mengisi bilik hitung improved Neubauer Menggunakan bilik hitung yang bersih dan bebas sisa sampel dari penggunaan se-

belumnya Mengaduk campuran semen dengan pengencer yang sudah dibuat menggunakan

vortex selama 10 detik pada kecepatan maksimal, kemudian segera mengaspirasi ± 10µl campuran

Menyentuhkan ujung tip pipet dengan hati-hati pada tepi bawah lekukan berbentuk huruf V pada salah satu sisi bilik hitung

Menekan mikropipet dengan perlahan, untuk membiarkan bilik hitung terisi oleh gaya kapiler. Coverslip tidak boleh bergerak saat mengisi semen, dan bilik hitung tidak boleh diisi berlebihan (dapat ditandai dengan coverslip yang bergerak) atau kurang (ditandai dengan udara yang menempati beberapa daerah bilik hitung).

Melakukan cara yang sama pada replikat pengenceran kedua (mengisi sisi seberang bilik hitung)

Melakukan inkubasi preparat minimal 4 menit pada suhu kamar dalam suasana lembab (contohnya diletakkan di atas kertas saring yang basah dalam cawan petri tertutup). Pemeriksaan dilakukan dalam 5–10 menit.

e. Cara mengisi bilik hitung improved Neubauer Menggunakan bilik hitung yang bersih dan bebas sisa sampel dari penggunaan se-

belumnya Menyiapkan bilik hitung dengan coverslip. Cara mempersiapkan bilik hitung den-

[email protected]

gan coverslip; membuat permukaan bilik hitung sedikit lembab dengan menghem-buskan nafas pada bilik hitung, kemudian mengunci/menempatkan coverslip pada ruang penghitungan dengan menekan kuat kedua bagian pilar (pinggir) ruang penghitungan). Terbentuknya warna seperti pelangi (iridescence atau beberapa cincin Newton) antara dua permukaan kaca menunjukkan posisi yang benar dari coverslip. Semakin banyak baris seperti pelangi terbentuk, menunjukkan posisi coverslip semakin baik; jika hanya satu atau dua baris mungkin menun-jukkan masalah pada variasi kedalaman ruang.

Mengaduk campuran semen dengan pengencer yang sudah dibuat menggunakan vortex selama 10 detik pada kecepatan maksimal, kemudian segera mengaspirasi ± 10µl campuran

Menyentuhkan ujung tip pipet dengan hati-hati pada tepi bawah lekukan berbentuk huruf V pada salah satu sisi bilik hitung

Menekan mikropipet dengan perlahan, untuk membiarkan bilik hitung terisi oleh gaya kapiler. Coverslip tidak boleh bergerak saat mengisi semen, dan bilik hitung tidak boleh diisi berlebihan (dapat ditandai dengan coverslip yang bergerak) atau kurang (ditandai dengan udara yang menempati beberapa daerah bilik hitung)

Melakukan cara yang sama pada replikat pengenceran kedua (mengisi sisi seberang bilik hitung)

Melakukan inkubasi preparat selama 10–15 menit pada suhu kamar dalam suasana lembab (contohnya diletakkan di atas kertas saring yang basah dalam cawan petri tertutup).

f. Cara Pemeriksaan‒Menggunakan bilik hitung dengan mikroskop perbesaran 200× atau 400×‒Memeriksa minimal 200 spermatozoa per preparat jika dapat, dengan menyesuaikan

area pemu sisi eriksaan yang digunakan.‒Pertama: Memeriksa bagian sentral grid (nomor 5) pada satu sisi bilik hitung, baris

demi baris‒Melanjutkan perhitungan sampai minimal 200 spermatozoa telah diperiksa. Perhi-

tungan harus dilakukan pada baris secara sempurna, tidak boleh berhenti pada pertengahan baris. Jika spermatozoa tidak ditemukan pada 5 baris dalam grid sen-tral, maka perhitungan dilanjutkan pada baris (terdiri dari 4 kotak besar) dalam 2 grid tambahan yaitu grid 4 dan 6.

‒Mencatat jumlah baris yang digunakan pada perhitungan minimal 200 spermatozoa, jumlah baris yang sama akan digunakan untuk menilai spermatozoa pada replikat (sisi seberang bilik hitung).

‒Perhitungan dilakukan menggunakan alat bantu hitung‒Hanya sperma utuh (dengan kepala dan ekor) yang dihitung, sperma kepala jarum

[email protected]

(pinhead/free tail) tidak dihitung.‒ Jika banyak ditemukan spermatozoa dengan bentuk pinheads atau free tail hasil di-

laporkan sebagai catatan tambahan. Perhitungan dapat menggunakan preparat yang digunakan pada pemeriksaan morfologi sebagai persentase relatif terhadap sperma-tozoa normal.

‒Beralih ke ruang perhitungan sisi kedua/seberang bilik hitung untuk melakukan perhitungan replikasi dengan menggunakan jumlah baris yang sama (volume yang sama) seperti pada preparat pertama, walaupun pada per-hitungan kedua ini menghasilkan kurang dari 200 spermatozoa.

‒Menghitung jumlah total spermatozoa dari kedua preparat.‒Menghitung selisih/perbedaan dari 2 perhitungan kedua preparat.‒Menilai apakah perhitungan dapat diterima atau tidak dengan ketentuan seperti ter-

cantum dalam tabel.

‒ Jika perbedaan dapat diterima, selanjut dilakukan perhitungan konsentrasi spermato-zoa/ml dengan menggunakan rumus kalkulasi.

g. Rumus kalkulasi konsentrasi sperma/ml:C = (N/n) × (1/20) × faktor pengenceran × 106/ml semenKeterangan:C= konsentrasi spermaN= Jumlah spermatozoan = jumlah baris

Pelaporan dilakukan dalam satuan per ml (106/ml) atau per nl.h. Kalkulasi konsentrasi sperma/ejakulat. Setelah konsentrasi spermatozoa/

ml didapat, selanjutnya dilakukan perhitungan jumlah spermatozoa/ejakulat dengan mengalikan nilai konsentrasi spermatozoa dengan volume ejakulat. Pelaporan di-lakukan sebagai jumlah spermatozoa ×106/ejakulat

i. Perkiraan kesalahan pemeriksaan (sampling error). Presisi dari perkiraan jumlah sperma tergantung pada jumlah spermatozoa yang terhitung. Menurut dis-tribusi Poisson, standard error (SE) dari perhitungan (N) adalah akar kuadrat N (√N) dan confidence interval (CI) untuk jumlah spermatozoa dalam volume semen adalah sekitar N ± 1.96 × √N (atau N ± sekitar 2 ×√N). Perkiraan kesalahan pe-meriksaan dapat diekspresikan dalam persentase kesalahan perhitungan (100×(√N/N), dapat dilihat pada tabel perkiraan kesalahan pemeriksaan dengan membulatkan jumlah total spermatozoa yang terhitung dari kedua preparat ke nilai terdekat.

[email protected]

8. Pada keadaan konsentrasi rendah atau tidak ditemukan spermatozoa

Jika perkiraan jumlah sperma rendah/LPB1. Jika perhitungan yang akurat tidak diperlukan Jika jumlah spermatozoa per LPB pada pemeriksaan awal preparat basah rendah

(0–4/LP 400× atau 0–16/200×), dapat dilakukan beberapa pilihan tindakan:a. Tidak mengambil tindakan lebih lanjutJika jumlah spermatozoa/LP 400× < 4 (yaitu< ±1×106/ml), maka cukup untuk sebagian besar tujuan klinis untuk melaporkan konsentrasi sperma sebagai <2 × 106/ml (dengan memperhitungkan kesalahan perhitungan yang tinggi berhubungan dengan jumlah sperma yang rendah), dengan catatan, apakah ditemukan atau tidak spermatozoa yang motil.

9. Pembuatan preparat basah dengan sentrifugasi




ketipisan no 4 (0,44 mm)

2. Semen b. Memeriksa semen yang telah disentrifus untuk menemukan spermatozoa‒ Jika tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat basah maka dilakukan:‒Semen dihomogenkan dengan cara aspirasi berulang sebanyak ± 10 kali menggu-

nakan pipet berlubang lebar (diameter ± 1.5 mm) secara perlahan (hindari terben-tuknya gelembung udara). Jika semen viskous, maka dilakukan perlakuan untuk mengurangi viskositas seperti perlakuan pada likuifaksi semen yang abnormal.

‒Sebanyak 1 ml semen diletakkan dalam tabung reaksi steril‒Dilakukan sentrifugasi pada 3000g selama 15 menit‒Membuang supernatan dengan menyisakan ± 50µl‒Melakukan resuspensi sedimen, kemudian sedimen dihomogenkan‒10µl sedimen diteteskan pada gelas objek dan tutup dengan coverslip‒Membuat replikat preparat dengan cara yang sama‒Dilakukan pemeriksaan preparat dengan perbesaran 100–250× (WHO 2010 men-

yarankan perbesaran 200–250×)‒Memeriksa seluruh lapang pandang coverslip secara sistematis (zig-zag). Dimulai

dari satu sudut dan bergerak sepanjang sumbu x sampai ke sudut seberang; kemu-dian berpindah satu lapang pandang sepanjang sumbu y dan kembali memeriksa sepanjang sumbu x sampai seluruh lapang coverslip diperiksa

‒Ditemukan spermatozoa pada salah satu replikat menunjukkan cryptozoospermia. Tidak ditemukan spermatozoa pada kedua preparat menunjukkan dugaan azoosper-mia.

Catatan: Jika sentrifugasi sampel untuk tujuan teknologi bantuan reproduksi, maka seluruh sampel semen dalam sedimen (misalnya empat 10µL aliquot sedi-men) dapat dianalisis untuk menemukan spermatozoa hidup. Tidak ditemukan spermatozoa motil dari aliquot yang diperiksa tidak berarti bahwa tidak dite-mukan spermatozoa motil pada sisa sampel. Karena sentrifugasi tidak membuat semua spermatozoa membentuk sedimen, maka metode ini tidak dapat digunakan untuk menentukan jumlah total spermatozoa.

[email protected]

c. Memeriksa sampel yg tidak disentrifugasi untuk mencari spermatozoa motilJika spermatozoa motil sangat dicari (seperti pada sampel semen pascavasektomi), Mengencerkan spesimen pada larutan pengencer atau sentrifugasi kecepatan tinggi pada spermatozoa harus dihindari. Pada kasus ini dilakukan pemeriksaan menggunakan satu aliquot sampel yang tidak diencerkan, dengan cara:‒Menghomogenkan semen dengan baik‒Mengambil 40 µl aliquot semen dan menempatkan di bawah coverslip ukuran 24

mm × 50 mm‒Memeriksa slide dengan perbesaran 200× atau 250×‒Memeriksa seluruh lapang coverslip secara sistematis,lapang demi lapang. Mulai

dari satu ujung dan bergerak sepanjang sumbu x ujung seberang, kemudian berpin-dah satu lapang pandang searah sumbu y dan memeriksa kembali sepanjang sumbu x. Pemeriksaan menggunakan cara zig-zag ini dilakukan pada seluruh lapang slide.

2. Jika perhitungan yang akurat diperlukanDigunakan untuk menentukan konsentrasi spermatozoa yang rendah tanpa sentrifugasi dengan menggunakan pengenceran yang rendah dan memeriksa volume yang lebih banyak. Pilihan yang dapat digunakan:a. Menggunakan bilik hitung improved NeubauerUntuk mengurangi kesalahan pemeriksaan (sampling errors), sebaiknya menghitung minimal total 400 spermatozoa dari 2 replikat (200/replikat). Cara pemeriksaan:‒Menghomogenkan semen dengan baik Mengambil satu aliquot semen dan mengencerkan 1 + 1 (1:2) dengan pengencer Memeriksa semua grid (9 grid) improved Neubauer Selanjutnya pemeriksaan dilakukan dengan cara yang sama seperti pada perhitungan

konsentrasi spermatozoa secara umumCatatan: Tidak ditemukan spermatozoa dari aliquot yang diperiksa tidak menunjukkan bahwa tidak ditemukan spermatozoa pada sisa sampel.b. Menggunakan bilik hitung volume besar secara fluoresensi. Membutuhkan

mikroskop fluoresensi dan pewarna Hoechst 33342 bisbenzimide fluorochrome.10. Morfologi 1. Objek glass

2. Mikropipet 10µl, 200 µl, 500 µl + tip

3. Pipet plastik* berlubang besar (Ø ± 1,5 mm), sebaiknya steril

4. Termometer ruangan5. Gelas ukur skala 0,1

1. Methanol 95%2. NaCl

fisiologis3. Reagen Diff-

Quik4. Reagen Shorr5. Reagen

Papanicolaou

a. Membuat preparat apus sperma‒Membersihkan objek gelas dengan methanol 95%‒Meneteskan ± 10µl semen pada objek gelas‒Cara membuat apusan dapat menggunakan metode seperti membuat preparat apus

darah tepi untuk semen yang tidak diencerkan atau dengan menggunakan metode pipet untuk preparat yang diencerkan/dicuci

‒Membiarkan kering pada suhu kamar (20–24°C)

[email protected]

6. Sentrifus 800g7. Timer8. Tabung reaksi dengan

batas 20–40µl9. Pipet Pasteur10.Gambar pembuatan

preparat apus semen yg tidak dicuci dan yg dicuci

‒Membuat replikat preparat dengan cara yang sama

b. Pencucian semen‒Mengencerkan 0,2–0,5 ml tergantung dari konsentrasi semen dengan 10 ml NaCl

fisiologis pada suhu kamar‒Melakukan sentrifugasi pada 800g selama 10 menit‒Membuang sebagian supernatan dengan menyisakan sekitar 20–40µl‒Melakukan resuspensi sedimen dengan supernatan dengan pipetting perlahan‒Meletakkan 5–10 µl suspensi sperma pada slide‒Membuat apusan dengan menggunakan pipet Pasteur seperti terlihat pada gambar

11. Pewarnaan cepatDiff-Quik

Kit pewarna Diff-Quik:1. 1,8

triarylmethan2. Metanol 95%3. Larutan

pewarna 1 (eosinophilic xanthene)

4. Larutan pewarna 2 (basophilic thiazine)

c. Pewarnaan Pembuatan reagen Diff-Quik:

1. Pembuatan reagen fiksatif (1,8 triarylmethan dilarutkan dalam 1000 ml metanol 95% (v/v)) atau hanya metanol 95 % (v/v) saja

2. Larutan pewarna 1 (eosinophilic xanthene)3. Larutan pewarna 2 (basophilic thiazine)

Cara pewarnaan:‒Melakukan fiksasi preparat dengan merendam ke dalam larutan fiksatif triaryl-

methane selama 15 detik atau selama 1 jam dalam metanol 95%)‒Membuang kelebihan larutan fiksatif dengan menempatkan preparat ver-

tikal di atas kertas saring‒Melakukan pewarnaan dengan merendam preparat untuk kedua kalinya dalam:

Larutan pewarna 1 selama 10 detik Selanjutnya dalam larutan pewarna 2 selama 5 detik

‒Membilas preparat dengan air bersih 15 kali untuk membuang kelebihan zat warna

‒Mengeringkan kelebihan larutan pada tiap langkah di atas dengan men-empatkan preparat secara vertikal pada kertas saring.

Jika latar belakang kotor, maka diperlukan pencucian sebagian semen dan dibuat preparat baru dengan cara pewarnaan yang sama.

12. Pewarnaan Shorr

1. Harris haema-toxylin: Papanico-laou No12. Shorr solution 3. Asam etanol4. Ammoniacal ethanol

Cara pembuatan reagen:1. Shorr solution:

Melarutkan 4 gr serbuk Shorr dalam 220 ml etanol panas 50% (v/v). Biarkan din-gin, kemudian tambahkan 2.0 ml asam asetat glasial (dilakukan dalam lemari asam) kemudian disaring

2. Asam etanol:Menambahkan 25 ml asam asetat glasial ke dalam 75 ml etanol 95% (v/v)

[email protected]

3. Ammoniacal ethanol:Menambahkan 5ml amonium hidroksida 25%(v/v) ke dalam 95ml etanol 75%(v/v)

Tahapan pewarnaan:a. Fiksasi preparat apus semen kering

Merendam preparat apus dalam asam etanol atau etanol 75% (v/v) selama 1 jamb. Pewarnaan

Merendam secara bertahap preparat apus dalam1. Air kran bersih 12–15 celupan*2. Haematoxylin 1–2 menit3. Air kran bersih 12–15 celupan*4. Ammoniacal ethanol 10 celupan*5. Air kran bersih 12–15 celupan*6. Etanol 50% (v/v) 5 menit7. Shorr stain 3–5 menit8. Etanol 50% (v/v) 5 menit9. Etanol 75% (v/v) 5 menit10. Etanol 95% (v/v) 5 menit

*Satu celupan= merendam ± 1 detikProsedur pewarnaan membutuhkan waktu sekitar 1,5 jam

13. Pewarnaan Papanicolaou

1. Komponen-komponen pe-warnaan Papan-icolaou

2.Asam etanol3.Xylene:etanol,

1+1 (1:2)

Tahapan pewarnaan:a. Fiksasi preparat apus semen kering

Merendam preparat apus dalam asam etanol 95% (v/v) selama 15 menitb. Pewarnaan

Merendam secara bertahap preparat apus dalam1. Etanol 80% (v/v) 30 detik2. Etanol 50% (v/v) 30 detik3. Akuades 30 detik4. Harris’s haematoxylin 4 menit5. Akuades 30 detik6. Asam etanol 4–8 celupan*7. Air kran dingin 5 menit8. Etanol 50% (v/v) 30 detik9. Etanol 80% (v/v) 30 detik10. Etanol 95% (v/v) minimal 15 menit11. G-6 orange stain 1 menit12. Etanol 95% (v/v) 30 detik

[email protected]

13. Etanol 95% (v/v) 30 detik14. Etanol 95% (v/v) 30 detik15. EA-50 green stain 1 menit16. Etanol 95% (v/v) 30 detik17. Etanol 95% (v/v) 30 detik18. Etanol 100% 15 detik19. Etanol 100% 15 detik

*Satu celupan= merendam ± 1 detikProsedur pewarnaan membutuhkan waktu sekitar 1 jam

Catatan: Metode pewarnaan cepat dengan cara meneteskan semen pada slide yang sudah ditambahkan larutan fiksatif dan pewarna yang tersedia secara komersial tidak direkomendasikan oleh panduan WHO 2010. Hal ini disebabkan karena tidak dilakukan penyebaran spermatozoa seperti yang dilakukan pada teknik apus, sehingga tidak dapat mengamati rincian yang diperlukan untuk mengklasifikasikan morfologi seperti yang dijelaskan oleh panduan WHO tahun 2010.14. Sel

nonsperma(sel bulat)

1. Termometer ruangan2. Gambar hasil

pemeriksaan sel bulat3. Improved Neubauer*4. Mikropipet berbagai

ukuran5. Tip* kuning dan biru6. Timer7. Timbangan digital5. Pipet plastik* berlubang

besar (Ø ± 1,5 mm)6. Gelas objek*8. Coverslip*9. Counter10. Kalkulator & alat tulis

Preparat basah, preparat vitalitas, preparat morfologi, atau preparat peroksidase

Sel bulat (sel-sel germinal dan leukosit) dapat diperkirakan dengan pemeriksaan menggunakan preparat yang digunakan dalam pemeriksaan konsentrasi sperma (preparat basah), vitalitas, morfologi, atau menggunakan preparat yang digu-nakan dalam pemeriksaan sel positif peroksidase. Cara perhitungan sel bulat:‒ Memeriksa preparat dengan menggunakan mikroskop perbesaran 400×‒ Menghitung jumlah sel bulat yang terdiri dari leukosit dan germ sel per 200 sperma‒ Melakukan perhitungan dengan menggunakan rumus:

C = N×S/200 Keterangan:C = Jumlah atau konsentasi sel bulat dalam 106/ml.N = Jumlah sel bulat (leukosit dan/atau sel germinal).S = Jumlah sperma atau konsentrasi sperma dalam 106/ml.

‒ Jika tidak ditemukan sel bulat dalam keseluruhan preparat maka dilaporkan sebagai sel bulat <3700 sel/ml

‒ Jika konsentrasi sel bulat >106/ml, maka diperlukan pemeriksaan peroksidase seba-gai konfirmasi terdapatnya sel leukosit

15. Peroksidase leukosit

Seperti pada perhitungan sel bulat dengan tambahan:1. Gambar hasil

pemeriksaan peroksidase2. Tabel/grafik perbedaan

perhitungan sel peroksidase yg dpt diterima

1.Ortho-toluidine (karsinogenik)

2.Saline 0,9%3.Phosphate

buffer4.Sodium

hydrogen phosphate (Na2HPO4)

Cara pembuatan reagen:1. Phosphate buffer, 67 mmol/l, pH 6.0: Melarutkan 9.47 g sodium hydrogen phos-

phate (Na2HPO4) dalam 1000 ml akuades dan 9.08 g potassium dihydrogen phos-phate (KH2PO4) dalam 1000 ml akuades. Menambahkan ±12 ml larutan Na2HPO4 ke dalam ± 88 ml larutan KH2PO4 sampai pH mencapai 6,0.

2. Larutan amonium klorid (NH4Cl) jenuh: Menambahkan 250 g NH4Cl ke dalam 1000 ml akuades.

3. Disodium ethylenediamine tetra-acetic acid (Na2EDTA) 148 mmol/l: Melarutkan 50 g/l Na2EDTA dalam phosphate buffer (pH 6.0).

[email protected]

5.Akuades6.Potassium

dihydrogen phosphate (KH2PO4)

7.Amonium klorid (NH4Cl)

8.Disodium ethylenediamine tetra-acetic acid (Na2EDTA)

9.Hidrogen peroksida (H2O2) 30%

4. Substrat: Melarutkan 2,5 mg o-toluidine dalam 10 ml saline 0,9% (9 g/l).5. Hidrogen peroksida (H2O2 ) 30% (v/v).6. Working solution: Menambahkan 1 ml larutan NH4Cl jenuh, 1 ml Na2EDTA 148

mmol/l, dan 10µl H2O2 30% (v/v) ke dalam 9 ml substrat o-toluidine kemudian campur dengan baik.

Larutan ini dapat digunakan sampai 24 jam setelah pembuatan.

Cara pemeriksaan peroksidase:‒Menghomogenkan semen dengan baik‒Mencampur 0,1 ml semen dengan 0,9 ml ortho-toluidine (pengenceran 1:10)‒Menghomogenkan suspensi semen selama 10 detik‒Menginkubasi suspensi semen dalam suhu kamar selama 20–30 menit‒Menghomogenkan kembali suspensi semen kemudian mengisi kedua sisi bilik hi-

tung dengan suspensi semen‒Menempatkan bilik hitung pada posisi horizontal selama paling sedikit 4 menit

dalam suhu kamar dalam ruangan lembab (contoh, di atas kertas saring yang dibasahi dengan air dalam cawan petri)

‒Memeriksa preparat dengan perbesaran 200× atau 400×‒Menghitung paling sedikit 200 sel positif peroksidase pada tiap sisi bilik hitung/

replikat. Sel peroksidase positif berwarna coklat, sedangkan sel peroksidase negatif tidak berwarna (gambar 2.14). Memeriksa satu sisi bilik hitung dilakukan pada mas-ing-masing grid satu demi satu sampai didapatkan paling sedikit 200 sel positif per-oksidase dan grid diperiksa dengan sempurna (tidak berhenti pada sebagian grid).

‒Mencatat jumlah grid yang diperiksa ketika perhitungan mencapai 200 sel peroksi-dase positif

‒ Jumlah grid yang sama digunakan untuk menghitung sel peroksidase positif pada bi-lik hitung sisi lain/replikat

‒Menghitung bilik hitung replikat dengan menggunakan jumlah grid yang sama yang digunakan pada pemeriksaan pertama, meskipun didapatkan perhitungan sel per-oksidase positif kurang dari 200

‒Menghitung jumlah total sel peroksidase positif dan menghitung perbedaan antara dua perhitungan

‒Menentukan perbedaan dapat diterima atau tidak‒ Jika perbedaan dapat diterima, maka dilanjutkan dengan menghitung konsentrasi sel

peroksidase positif

[email protected]

‒ Jika perbedaan tidak dapat diterima maka dilakukan pembuatan dua preparat baru dan perhitungan ulang secara replikat

‒Melaporkan rerata konsentrasi sel peroksidase positif‒Menghitung jumlah total sel peroksidase positif per ejakulat

16. Sel nonsperma lain.

Eritrosit, epitel saluran genitourinarius, bakteri dan jamur dapat diperiksa menggu-nakan perbesaran 400× pada preparat basah atau preparat apus dan dilaporkan tersendiri.

*Sebaiknya steril

[email protected]

standar analisis semen who 2010

Documents