3.1.4.5. Alternatif Agregasi Kovalen

Meskipun bentuk paling umum dari agregasi kovalen karena pembentukan ikatan disulfida, agregasi juga dapat terjadi melalui amino bebas, karbonil, karboksil, atau kelompok fungsional hidroksil dengan ester atau amida hubungan, misalnya. agregat tersebut telah didokumentasikan untuk insulin dan juga ditemukan selama analisis relaxin.

3.1.5. Deglikosilasi dan Desialilasi

Ada sejumlah protein terapeutik glikosilasi yang memiliki molekul asam gula dan sialic kovalen melekat pada tulang punggung peptida. Runkel et al. melaporkan bahwa IFN- beta diproduksi dalam kultur sel mamalia sebagai protein glikosilasi, identik dengan molekul manusia, memiliki stabilitas yang lebih besar untuk agregasi dari protein yang sesuai yang dihasilkan oleh fermentasi bakteri dalam bentuk nonglikosilasi.

Umumnya, obligasi melampirkan gula dengan protein yang stabil, dan modifikasi dalam struktur karbohidrat karena proses perubahan selama pembuatan produk. Namun Desialylation dapat terjadi pada pH asam di penyimpanan. Modifikasi struktur karbohidrat, atau perubahan dalam glikosilasi protein terapeutik, dapat mengakibatkan perubahan signifikan dalam farmakokinetik molekul. Berbeda kandungan asam sialat telah terbukti bertanggung jawab untuk variabilitas dalam bioaktivitas sangat murni hipofisis manusia isoform hormon luteinizing.

Perubahan glikosilasi dapat dideteksi dengan berbagai metode gel termasuk fluorophore dibantu karbohidrat elektroforesis dan MS. Perubahan kandungan asam sialat dapat dideteksi dengan pengukuran asam sialic gratis. metode baru untuk quantitate oligosakarida sedang dikembangkan. Misalnya, resolusi tinggi dari fase normal kromatografi-pH tinggi pertukaran anion dan fase normal metode HPLC dikombinasikan dengan MS dapat menyediakan teknologi yang efektif untuk menganalisis repertoar macam struktur oligosakarida.

3.1.6. Photodegradasi Protein

Kedua pengion dan non ion radiasi dapat menyebabkan inaktivasi protein. Tirosin, triptofan, dan sistein sangat rentan terhadap radiasi non ion, seperti ultraviolet (UV) cahaya. Penyerapan foton mengarah ke photoionization dan pembentukan produk fotodegradasi baik melalui interaksi langsung dengan asam amino atau tidak langsung melalui berbagai agen kepekaan, seperti oksigen. Umumnya diamati produk fotodegradasi dalam soda, netral-pH, larutan protein berair termasuk SS obligasi fisi, konversi tirosin untuk DOPA, 3- (4 hidroksifenil) asam laktat, dan dityrosine, serta fragmentasi oleh-produk dan konversi triptofan residu untuk kynurenine dan N-formil-kynurenine. Posisi residu sensitif dalam struktur tiga dimensi protein yang juga mempengaruhi reaktivitas menuju fotolisis. Hal ini juga penting untuk memperhitungkan potensi kerusakan protein selama analisis menggunakan dichroism melingkar (CD), UV, atau neon pengukuran di mana radiasi insiden sedang digunakan.

3.2. Ketidakstabilan Fisik

Ketidakstabilan fisik, untuk tujuan ini, telah dikategorikan sebagai reaksi-reaksi yang tidak melibatkan pembentukan atau perusakan ikatan kovalen. Agregasi protein, dibahas terutama sebagai ketidakstabilan fisik, juga dapat terjadi sebagai hasil dari pembentukan ikatan disulfida antarmolekul atau transamidation seperti yang dibahas sebelumnya.Perubahan konformasi (yaitu, perubahan struktur sekunder dan tersier) dalam protein dapat terjadi sebagai akibat dari paparan perturbants struktural atau stres lingkungan. Seringkali, studi stabilitas protein melibatkan perubahan suhu dan pH, yang keduanya dapat menyebabkan modifikasi struktural yang dapat dideteksi oleh teknik spektroskopi standar seperti CD, fluoresensi dan inframerah (IR) spektroskopi.

3.2.1. Agregasi dan Pengendapan

Agregasi jangka protein mencakup jangkauan yang sangat luas dari reaksi dan hasil, beberapa di antaranya telah dipelajari secara ekstensif untuk protein tertentu sedangkan yang lain tetap menantang untuk belajar dan menentukan. Bentuk monomer protein umumnya diinginkan spesies aktif secara fisiologis (dengan pengecualian dari spesies multimeric), tetapi ada beberapa protein yang tidak rentan terhadap beberapa bentuk baik agregasi larut atau tidak larut, reversibel atau ireversibel.

Mekanisme yang paling umum dari agregasi protein diyakini melibatkan denaturasi protein dan asosiasi nonkovalen melalui antarmuka hidrofobik. Denaturasi biasanya diinduksi pada gas-cair, cair-cair (seperti selama proses mikroenkapsulasi) atau antarmuka kontainer-cair, meskipun panas, variasi pH, pelarut, garam, dan eksipien dapat juga berkontribusi.

Studi stres termal sering digunakan untuk mengevaluasi kemampuan pangkat formulasi untuk menstabilkan protein. Chan et al. menunjukkan, melalui diferensial scanning kalorimetri (DSC), bahwa kalsium klorida dan gula stabil deoksiribonuklease manusia rekombinan (rh DNAse) terhadap denaturasi termal sementara kation divalen, urea, dan guanidin hidroklorida mengguncang protein. Sebuah studi baru pada ligan agregasi Flt3 manusia rekombinan memaparkan pentingnya reversibilitas termal karena berkaitan dengan minimalisasi agregasi ligan dan peran potensial untuk menentukan kondisi solusi yang dapat mencapai stabilitas jangka panjang terbesar. Bukti bahwa unfolding didahului pembentukan agregatdisediakan oleh CD jauh-UV.

Mekanisme nonkovalen lain dari agregasi termasuk kompleksasi ionik, penggaraman, biaya netralisasi dekat dengan pH isoelektrik, dan membatasi kelarutan molekul. jenis agregat, seperti agregat hydrobic, harus reversibel, misalnya dengan pengenceran.

Seiring dengan studi dipercepat, sejumlah kegiatan pembangunan terkait farmasi lainnya telah ditemukan untuk menginduksi denaturasi. Studi pada stres spray drying dan pengabutan pada protein telah diterbitkan, dan investigasi ke dalam efek beku-mencair bersepeda juga

didokumentasikan. Perumusan dan mengisi kegiatan bersama dengan pengiriman formulasi cair sering mengakibatkan eksposur yang signifikan dari protein untuk interface gas-cair.

Surfaktan seperti Tween 80, Pluronic F-68, dan Brij 35 telah terbukti menstabilkan agregasi antarmuka-diinduksi hormon pertumbuhan manusia (hGH).tapi tidak stabil hGH terhadap stres termal dalam studi DSC. Bahkan, konsentrasi yang lebih tinggi dari surfaktan ditemukan untuk mengacaukan molekul. Formulasi dengan gula juga dikenal untuk menstabilkan sejumlah protein terhadap agregasi.

agregat larut tetap dalam larutan sering multimers berat molekul dimer atau rendah. Secara umum, jenis agregat dapat dideteksi dengan kinerja tinggi eksklusi ukuran kromatografi (HP-SEC) dan telah ditemukan dengan metode ini dalam banyak protein termasuk hGH, insulin, interleukin-2 (IL-2), antitrypsin - α1, IFN -y, faktor pertumbuhan fibroblast dasar, dan IFN-β. metode HP-SEC konvensional juga dapat dimodifikasi untuk memberikan pemisahan yang lebih akurat. Misalnya, guanidin hidroklorida sering ditambahkan ke fase gerak untuk membedakan protein asli dan terdenaturasi. Secara umum, rendahnya tingkat agregat larut dalam produk farmasi dapat ditoleransi asalkan produk tetap stabil dan larutagregat tidak berkembang menjadi bentuk larut. Ada kekhawatiran bahwa peningkatan tingkat agregat larut mungkin bertanggung jawab untuk perubahan imunogenisitas protein terapeutik.

agregat larut biasanya bermanifestasi sebagai partikulat terlihat, meskipun pada kesempatan tingkat dan ukuran partikel sangat kecil sehingga identifikasi visual bisa sulit. agregat larut telah didokumentasikan untuk insulin dan IL-1β. agregat larut dapat dievaluasi oleh sejumlah teknik solid-state seperti Fourier transform infrared (FTIR) dan Raman dan spin elektron spektroskopi resonansi. teknik hamburan cahaya seperti penyerapan UV sederhana pada 320 dan 360 nm dapat berguna untuk evaluasi perbandingan sederhana. Protein konsentrasi tekad menggunakan absorbansi UV sering digunakan dengan latar belakang pengurangan untuk memperhitungkan tingkat rendah bahan tidak larut.

3.2.2. Adsorpsi

Adsorpsi ke berbagai permukaan telah dieksploitasi untuk keuntungan dalam banyak disiplin ilmu seperti teknologi analitis dan pemisahan. Ada banyak penelitian-penelitian adsorpsi dalam literatur analitis dan biomaterial. Kecenderungan untuk protein untuk menyerap umumnya merupakan masalah yang harus diatasi dalam perumusan dan kontainer pilihan penutupan produk farmasi. Perawatan juga harus diambil untuk mengevaluasi administrasi set parenteral untuk kompatibilitas untuk memastikan bahwa dosis yang ditargetkan disampaikan. Umumnya, adsorpsi lebih merupakan masalah bagi terapi dosis rendah di mana bagian signifikan dari dosis bisa hilang untuk wadah / penutupan atau administrasi set permukaan.

Secara umum, penambahan molekul surfaktan untuk formulasi yang dikenal untuk mengurangi kerugian adsorpsi. Kalsitonin telah terbukti menyerap ke kaca dengan isoterm adsorpsi Langmuir dan Freundlich jenis, tergantung pada pH. Penambahan surfaktan nonionik, seperti Pluronic F68 dan Tween 80, untuk kalsitonin solusi menunjukkan

penghambatan adsorpsi dan pengurangan laju adsorpsi.

Adsorpsi protein untuk antarmuka cair-gas, serta antarmuka padat-cair, baru-baru ini menjadi area yang menarik menggunakan teknik baru seperti x-ray atau refleksi neutron. Studi telah menyertakan evaluasi dari jumlah terserap, ketebalan total lapisan teradsorpsi, dan pengaruh pH dan eksipien pada parameter ini. Mikroskop kekuatan atom dalam mode kekuatan-spektroskopi telah digunakan untuk menyelidiki kinetika proses adsorpsi fibrinogen mol.

Metode yang berguna untuk Mendeteksi Protein Degradasi / Inaktivasi

4. Metode AnalyticalMeskipun metode analisis digunakan untuk mendeteksi dan menjelaskan mekanisme degradasi polipeptida telah disinggung di bagian yang relevan dari bab ini, Tabel 4 memberikan daftar yang cukup komprehensif metode ini. Biasanya, evaluasi stabilitas polipeptida akan memerlukan penggunaan beberapa metode (misalnya, salah satu metode sensitif terhadap perubahan kimia dan satu metode sensitif terhadap modifikasi konformasi).

5. KesimpulanKesimpulannya, polipeptida dan protein yang unik dalam tingkat yang lebih tinggi dari struktur menunjukkan. Hilangnya struktur tingkat yang lebih tinggi biasanya menghasilkan aktivitas biologis dengan atau tanpa kehilangan komposisi kimia molekul.

1. Tuliskan agregasi kovalen dapat terjadi dimana saja Jawab:Paling umum dari agregasi kovalen terjadi pada pembentukan ikatan disulfida, namun agregasi juga dapat terjadi melalui amino bebas, karbonil, karboksil, atau kelompok fungsional hidroksil dengan ester atau amida hubungan, misalnya. Agregat tersebut telah didokumentasikan untuk insulin dan juga ditemukan selama analisis relaxin.

2. Jelaskan mengenai photodegradasi proteinJawab:Kedua pengion dan non ion radiasi dapat menyebabkan inaktivasi protein. Tirosin, triptofan, dan sistein sangat rentan terhadap radiasi non ion, seperti ultraviolet (UV) cahaya. Penyerapan foton mengarah ke photoionization dan pembentukan produk fotodegradasi baik melalui interaksi langsung dengan asam amino atau tidak langsung melalui berbagai agen kepekaan, seperti oksigen. Umumnya diamati produk fotodegradasi dalam soda, netral-pH, larutan protein berair termasuk SS obligasi fisi, konversi tirosin untuk DOPA, 3- (4 hidroksifenil) asam laktat, dan dityrosine, serta fragmentasi oleh-produk dan konversi triptofan residu untuk kynurenine dan N-formil-kynurenine. Posisi residu sensitif dalam struktur tiga dimensi protein yang juga mempengaruhi reaktivitas menuju fotolisis. Hal ini juga penting untuk memperhitungkan potensi kerusakan protein selama analisis menggunakan dichroism melingkar (CD), UV, atau neon pengukuran di mana radiasi insiden sedang digunakan.

3. Jelaskan mekanisme umum dari agregasi proteinJawab:Mekanisme yang paling umum dari agregasi protein diyakini melibatkan denaturasi protein dan asosiasi nonkovalen melalui antarmuka hidrofobik. Denaturasi biasanya diinduksi pada gas-cair, cair-cair (seperti selama proses mikroenkapsulasi) atau antarmuka kontainer-cair, meskipun panas, variasi pH, pelarut, garam, dan eksipien dapat juga berkontribusi.

4. Sebutkan minimal 3 surfaktan yang dapat menstabilkan induksi antarmukaJawab:Tween 80, Pluronic F-68, dan Brij 35

5. Jelaskan mengenai deglikosilasi dan desialilasiJawab:Ada sejumlah protein terapeutik glikosilasi yang memiliki molekul asam gula dan sialic kovalen melekat pada tulang punggung peptida. Runkel et al. melaporkan bahwa IFN- beta diproduksi dalam kultur sel mamalia sebagai protein glikosilasi, identik dengan molekul manusia, memiliki stabilitas yang lebih besar untuk agregasi dari protein yang sesuai yang dihasilkan oleh fermentasi bakteri dalam bentuk nonglikosilasi. Umumnya, obligasi melampirkan gula dengan protein yang stabil, dan modifikasi dalam struktur karbohidrat karena proses perubahan selama pembuatan produk. Namun Desialylation dapat terjadi pada penyimpanan di pH asam.