PENENTUAN KUALITAS DAN KUANTITAS ASAM NUKLEAT MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER

Oleh :

Nama : Putri Etty FerayantiNIM : B1J011060Kelompok : 2Rombongan : IIAsisten : Arthika Lovia Sari

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGIPURWOKERTO

2013

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas

ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf 2001). Plasmid biasanya digunakan dalam

teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang

sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk

membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Plasmid

dapat dijadikan sebagai vektor disebabkan dapat melakukan replikasi, terletak

ekstrakromosom, ditransfer secara stabil, berukuran kecil, susunan DNA sudah

dketahui, harus mempunyai jumlah salinan yang banyak di dalam sel inang,

memiliki titik Ori, memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna

untuk tanda bila plamid disisipkan gen asing, dan memiliki situs restriksi yang

unik sebagai tanda untuk menyisipkan gen asing (Brolle, 1997).

Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid,

elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultra violet (UV). Elektroforesis

DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran

(berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan dalam

proses elektroforesis adalah agarosa. Elektroforesis biasanya digunakan untuk

analisa ukuran dan konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan

ektraksi DNA. Proses kuantifikasi DNA dan analisa kualitas merupakan

serangkaian proses yang berperan untuk mengetahui konsentrasi dan menganalisa

kualitas dari DNA tersebut. Kualitas DNA sangat erat kaitannya dengan

kemurnian DNA terhadap berbagai kontaminan seperti kontaminan protein.

Kemurnian DNA dapat diukur melalui rasio antara absorpsi suspensi DNA pada

panjang gelombang 256 nm terhadap panjang gelombang 280 (Jusuf, 2001).

Diawali dengan isolasi DNA. Hal ini bertujuan untuk mengeluarkan DNA

yang berada dalam inti sel dari organisme. Kemudian dilakukan dengan uji

kualitatif DNA dengan metode Elektroforesis gel agarosa yang bertujuan untuk

mengetahui keberadaan DNA dalam larutan contoh dan metode spekrofotometri

dimana pengukuran jumlah DNA dengan spektrofotometer didasarkan pada

prinsip iradiasi sinar ultraviolet yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam

larutan. Analisis asam nukleat umumnya dilakukan untuk penentuan konsentrasi

rata-rata dan kemurnian DNA yang terdapat dalam sampel. Jumlah dan kemurnian

tertentu diperlukan untuk kinerja optimal sampel DNA yang digunakan. Asam

nukleat menyerap sinar ultraviolet dengan pola tertentu. Sampel ditembus sinar

ultraviolet dan fotodetektor cahaya pada 260 nm, semakin besar cahaya yang

diserap sampel, maka semakin tinggi konsentrasi asam nukleat dalam sampel

(Sambrook dan Russel 2001).

B. Tujuan

Tujuan dari acara praktikum kali ini adalah untuk melakukan pengukuran

kualitas dan kuantitas DNA hasil isolasi.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi

Bahan yang digunakan pada praktikum adalah akuades steril dan DNA

hasil isolasi dari buah (buah strawberry (Fragaria X ananassa), buah naga

(Hylocereus undatus), buah alpukat (Persea americana), buah mangga

(Mangifera indica) dan buah papaya (Carica papaya)) dan bakteri Escherichia

coli.

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalahSpektrofotometer UV

(dalam praktikum ini digunakan UV-VIS Spectrophotometer Shimadzu model UV

Mini 1240), tabung reaksi, tisu, kuvet dan mikropipet beserta tipnya.

B. Metode

1. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi 3 µl DNA + akuades steril hingga

volume 3000 µl.

2. Disiapkan spektrofotometer, larutkan blankonya dan dibandingkan tingkat

kemurnian dan konsentrasi DNA buah (buah strawberry (Fragaria X

ananassa), buah naga (Hylocereus undatus), buah alpukat (Persea

americana), buah mangga (Mangifera indica) dan buah papaya (Carica

papaya)) dan bakteri Escherichia coli dengan nilai absorbansi λ 230, λ 260, λ

280 dan λ 320.

3. Dihitung konsentrasi DNA.

DNA : λ 260 nm

Protein : λ 260/ λ 280 nm

Karbohidrat dan kemikalia : λ 260/ λ 230 nm

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Tabel 1. Perhitungan Konsentrasi DNA

No. Sampel

Absorbansi

λ 230

A[S] – A[B]

λ 260

A[S] – A[B]

λ 280

A[S] – A[B]

λ 320

A[S] – A[B]

1

Strawberry

(Fragaria X

ananassa)

0.019 0.026 0.016 0.011

2Pepaya (Carica

papaya)0.162 0.063 0.045 0.046

3Alpukat (Persea

americana)0.069 0.025 0.012 0.011

4Mangga (Mangifera

indica)0.037 0.023 0.015 0.012

5

Buah Naga

(Hylocereus

undatus)

0.023 0.026 0.015 0.012

6 Escherichia coli -0.026 -0.013 -0.015 0.009

Keterangan :

A[S] : Absorbansi sampel

A[B] : Absorbansi blanko

Tabel 2. Perhitungan Konsentrasi DNA terhadap Kontaminasi

Konsentrasi

No.λ 260 λ 280 λ 230

1 1300 ng/µL 1.625 ng/µL 0.160 ng/µL

2 3150 ng/µL 1.4 ng/µL 0.389 ng/µL

3 1250 ng/µL 2.08 ng/µL 0.3 ng/µL

4 1150 ng/µL 1.533 ng/µL 0.622 ng/µL

5 1300 ng/µL 1.733 ng/µL 0.130 ng/µL

6 - 650 ng/µL 0.867 ng/µL 0.5 ng/µL

Interpretasi :

λ 230 = 2-2,2 : DNA murni

< 2 : kemikalia/karbohidrat

>2,2 : blanko tidak sesuai

λ 280 = 1,8 : DNA murni

< 1,8 : protein

> 1,8 : RNA

Perhitungan :

DNA Buah

1. Konsentrasi DNA (λ 260) = λ 260 x 50 x faktor pengenceran

= λ 260 x 50 x 1000

= 0,025 x 50 x 1000

= 1250 ng/µL2. Protein (λ 280) = λ 260

λ 280

= 0,0250,012

= 2.08 ng/µL

3. Kemikalia (λ 230) = λ 260λ 230

= 0,0250,011

= 0.3 ng/µL

DNA Bakteri

1. Konsentrasi DNA (λ 260) = λ 260 x 50 x faktor pengenceran

= λ 260 x 50 x 1000

= - 0,013 x 50 x 1000

= - 650 ng/µL

2. Protein (λ 280) = λ 260λ 280

= - 0,013- 0,015

= 0.867 ng/µL

3. Kemikalia (λ 230) = λ 260λ 230

= - 0,013 0,009

= 0.5 ng/µL

B. Pembahasan

Berdasarkan praktikum didapatkan hasil absorbansi perhitungan

konsentrasi DNA buah alpukat panjang gelombang 230, 260, 280 dan 320 nm

adalah 0.069, 0.025, 0.012 dan 0.011ng/µL, sedangkan perhitungan panjang DNA

buah alpukat terhadap kontaminasi panjang gelombang 260, 280 dan 230 nm

adalah 1250, 2.08 dan 0.3ng/µL. Hasil absorbansi perhitungan konsentrasi DNA

bakteri E.coli panjang gelombang 230, 260, 280 dan 320 nm adalah -0.026, -

0.013, -0.015 dan 0.009ng/µL, sedangkan perhitungan panjang DNA bakteri

E.coli terhadap kontaminasi panjang gelombang 260, 280 dan 230 nm adalah –

650, 0.867 dan 0.5ng/µL. Jumlah DNA dicerminkan berat molekul bukan oleh

volume Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan

protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang

gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara 1,8-2,0

mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari kontaminan protein.

Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi

konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA utas ganda tiap ml.

Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat ataupun materi organic lain

dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi pada panjang

gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang gelombang 230 nm. Bila

perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2 hingga 2,2 dikatakan bahwa

sampel asam nukleat yang diukur murni. Namun, bila nilai tersebut lebih rendah

dari 2 dikatakan bahwa asam nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat, materi

organic lain ataupun kemikalia. Sebaliknya, jika perbandingan nilai absorbansi

tersebut lebih tinggi dari 2,2 hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak

sesuai dengan pelarut DNA yang digunakan (Suharsono dan Widyastuti, 2006).

DNA murni dapat diperiksa pada panjang gelombang 260 dan 280 nm (Khadye

dan Abhijit, 2012).

Spektrofotometri adalah metode untuk mengukur konsentrasi senyawa

berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi cahaya. Menurut

Underwood (2001), spektofotometri merupakan suatu metoda analisa yang

didasarkan pada pengukuran serapan  sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan

berwarna pada panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator

prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat

untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang

gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda

yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri (Basset, 1994).

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan

visual dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi

oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh

suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen

yang berbeda (Khopkar, 2003). Spektrometri molekular (baik kualitatif dan

kuantitatif) bisa dilaksanakan di daerah sinar tampak, sama halnya seperti di

daerah yang sinar ultraviolet dan daerah sinar inframerah. Spektrofotometri dapat

dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih

mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada

berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan

spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda ( Mathias, 2005 ).

Kelebihan analisis kualitatif dan kuantitatif DNA dengan menggunakan

metode spektrofotometri yakni prosesnya cepat atau sederhana dan dapat

menganalisa dari konsentrasi yang sangat kecil. Sedangkan kekurangannya yakni

absorbansi sendiri dipengaruhi oleh pH, suhu, dan adanya zat pengganggu

sehingga kebersihan kuvet harus terjaga agar nilai absorbansi tidak terganggu

kemudian pemakainannya hanya dapat dipakai pada UV daerah yang panjang

gelnya paling tinggi 185 nm. Menurut pustaka Sastrohamidjojo (1992),

Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri ini adalah metode ini

memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang

sangat kecil. Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan

energi cahaya oleh suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang

gelombang radiasi, demikian pula pengukuran penyerapan yang menyendiri pada

suatu panjang gelombang tertentu. Analisis spektrofotometri digunakan suatu

sumber radiasi yang menjorok ke dalam daerah ultraviolet spektrum itu. Dari

spektrum ini, dipilih panjang-panjang gelombang tertentu dengan lebar pita

kurang dari 1 nm.

Spektrofotometri analisis sampel DNA terutama dilakukan untuk

memeriksa kualitas dan kuantitas sampel DNA terisolasi. Kuantifikasi sampel

DNA terisolasi ditentukan oleh mengambil absorbansi di 260 nm (1 OD = 50 g

mL.1 double terdampar DNA). Juga A260 280, A260/230 dan A260 270 bertekad

untuk mengidentifikasi kotoran dari protein, polisakarida dan polyphnolics

masing-masing. DNA murni, rasio A260 280 harus 1.8, A260/230 harus lebih

besar dari 1,8 dan A260 270 harus antara 1.2 untuk 1,3. Untuk agarose

Elektroforesis, 0,8% agarose gel disiapkan dan ditempatkan ke dalam sebuah unit

electrophoretic yang mengandung 1 X TAE buffer. Sampel DNA murni (2 L)

dicampur dengan bromophenol biru yang dimuat ke dalam sumur dan 150

tegangan V diterapkan untuk 20-45 menit. Band utuh DNA genom diamati di gel

dengan pewarnaan dengan ethidium bromida. Tes kualitatif untuk memeriksa

apakah DNA terpencil adalah PCR amplifiable, dilakukan untuk menguji jika ada

mencemari bahan yang bisa menghambat reaksi PCR. Saham DNA genom

diencerkan sampai kadar akhir 50.1 dan acak primers urutan: 5-GTGATCGCAG-

3 (Eurofins Genomics, Bangalore) digunakan dalam campuran reaksi PCR (Teare,

2011).

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum dan pembahasan dapat diambil kesimpulan

bahwa :

1. Spektrofotometri adalah metode untuk mengukur konsentrasi senyawa

berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi cahaya.

Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban

suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.

2. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan

protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada

panjang gelombang 260 nm terhadap 280 nm. Rasio OD260/OD280 antara

1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari

kontaminan protein.

3. Kemurnian asam nukleat dari pengotor karbohidrat ataupun materi organic

lain dan kemikalia ditentukan berdasarkan perbandingan nilai absorbansi

pada panjang gelombang 260 nm terhadap absorbansi pada panjang

gelombang 230 nm. Bila perbandingan absorbansi tersebut berkisar dari 2

hingga 2,2 dikatakan bahwa sampel asam nukleat yang diukur murni.

Namun, bila nilai tersebut lebih rendah dari 2 dikatakan bahwa asam

nukleat terkontaminasi oleh karbohidrat, materi organic lain ataupun

kemikalia. Sebaliknya, jika perbandingan nilai absorbansi tersebut lebih

tinggi dari 2,2 hal ini menandakan penggunaan blanko yang tidak sesuai

dengan pelarut DNA yang digunakan.

4. Hasil absorbansi perhitungan konsentrasi DNA buah alpukat panjang

gelombang 230, 260, 280 dan 320 nm adalah 0.069, 0.025, 0.012 dan

0.011ng/µL, sedangkan perhitungan panjang DNA buah alpukat terhadap

kontaminasi panjang gelombang 260, 280 dan 230 nm adalah 1250, 2.08

dan 0.3ng/µL. Hasil absorbansi perhitungan konsentrasi DNA bakteri

E.coli panjang gelombang 230, 260, 280 dan 320 nm adalah -0.026, -

0.013, -0.015 dan 0.009ng/µL, sedangkan perhitungan panjang DNA

bakteri E.coli terhadap kontaminasi panjang gelombang 260, 280 dan 230

nm adalah – 650, 0.867 dan 0.5ng/µL.

B. Saran

Acara praktikum sudah berjalan dengan baik, namun harus lebih teliti dan

hati-hati. Sebaiknya sebelum melakukan praktikum, praktikan harus mengetahui

dan memahami dengan baik prosedur kerja terlebih dahulu agar tidak terjadi

kesalahan saat melakukan praktikum.

DAFTAR REFERENSI

Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. EGC. Jakarta.

Brolle. 1997. Microbiology Biotechnology. University of Tubingen, Germany.

Jusuf M. 2001. Genetika 1 Struktur dan ekspresi Gen. Sagung Seto, Bogor.

Khadye, Vishwanath S. dan Abhijit V Sahasrabudhe. 2012. Rapid Detection Of Genetically Modified Organisms In Cotton Seeds By Real Time PCR. Int. J. LifeSc. Bt & Pharm. Res. 1(4): 99-105.

Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta .

Mathias, Ahmad. 2005. Spektrofotometri. Exacta: Solo.

Sambrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning: A laboratory manual. Ed ke-3. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sastrohamidjojo, Hardjono. 1992. Spektroskopi Inframerah. Yogyakarta : Liberty Yogyakarta

Teare, J.M. 2011. Measurement of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa Quant and the Genequant. BioTechniques. 22(6):1170-1171.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Underwood,A.L dan R.A day, J.R. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga. Jakarta.