No. Dokumen : 011/VI/096

Revisi : 00

Terbitan : 23 April 2015

Berlaku : 8 Agustus 2015

PROSEDUR PEMELIHARAAN KOLOM HPLCHalaman : 1 dari 9

Disetujui oleh : Risa, S.Farm, Apt.

A. TUJUAN

Untuk mendapatkan manfaat sepenuhnya dari kolom HPLC yang terpelihara dengan baik.B. RUANG LINGKUP

Prosedur ini menjelaskan tentang tatacara memelihara kolom HPLC dengan baik dan benar.

C. ACUAN

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Departemen Farmasi FMIPA Universitas Indonesia : 2006.

Fortis Technologies. HPLC Column Care.

D. TEORI

Kolom berfungsi untuk memisahkan masing-masing komponen. Untuk menahan tekanan tinggi, kolom dibuat dari bahan yang kokoh seperti stainless steel atau canpuran logam dengan gelas. Kolom standar mempunyai diameter dalam antara 4-5 mm. Diameter partikel berkisar antara 4-7 m. Panjang kolom standar berkisar antara 10-30 cm. Kolom dengan diameter dalam yang kecil (2 mm) dibandingkan dengan kolom standar pada kondisi isokratik akan menghasilkan waktu analisis yang sama.Kolom merupakan bagian penting dalam HPLC, karena ikut menentukan keberhasilan analisis. Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam memilih kolom adalah panjang kolom, diameter kolom, pengisi kolom, fase gerak, dan tekanan kolom. Oleh karena perannya yang sangat penting dalam keberhasilan analisis, menjaga kolom agar tetap dalam kondisi baik harus dilakukan.E. PROSEDUR

1. Instalasi Kolom

1.Bilas kolom KCKT dengan fase gerak yang sesuai. Pastikan tidak ada udara yang terperangkap dalam sistem.2. Hubungkan kolom ke injektor sesuai dengan arah aliran (terletak pada kolom).3. Atur kecepatan aliran pada 0,1 mL/menit (atau pengaturan terendah) dan tingkatkan menjadi laju aliran normal setelah 5 menit.4. Hentikan aliran ketika fase gerak sudah dapat terbaca oleh detektor.5. Seimbangkan kolom dengan melewatkan fase gerak sekitar 10-30 dari volume kolom dengan kecepatan normal.

6.Bagi kolom yang dapat digunakan pada kondisi fase terbalik atau fase normal (yaitu, -CN atau -NH2), bilas dengan IPA atau THF 20-30 volume kolom sebagai pelarut intermediate ketika berpindah dari fase terbalik ke fase normal, atau sebaliknya. Hubungkan kolom ke injektor.2. Equilibration1.Pelarut yang digunakan untuk kolom KCKT harus memenuhi standar mutu KCKT.

2. Saring dan bebaskan fase gerak dari gas sebelum digunakan.

3. Alirkan pelarut yang akan digunakan melalui sistem sebelum melakukan intalasi kolom.

4. Hubungkan kolom untuk menyesuaikan arah aliran.

5. Sesuaikan secara perlahan laju alir yang diinginkan, pastikan tidak terjadi lonjakan tekanan. Kolom analitik harus dijaga di bawah 400 bar.

6. Bilas kolom dengan fase gerak dengan volume kolom 20 30. Untuk menghitung volume kolom gunakan perhitungan:

Vm 0,5 Ldc2 Di mana:

Vm : Volume kolom

L : Panjang kolom (cm)

dc : Diameter dalam kolom (cm)

7. Jaga temperature kolom < 60C untuk menjaga kualitas kolom yang baik. Kolom yang digunakan melebihi temperature tersebut akan mempengaruhi kualitas kolom.

8.Jaga pH fase gerak antara 2 8 untuk mengoptimalkan kerja fase gerak. Kolom C18 akan beroperasi pada pH 1 11.

9. Gunakan buffer organik seperti asam format, ammonium asetat untuk menjaga umur penggunaan kolom dibandingkan buffer anorganik seperti fosfat.

3. Menguji Kolom

1.Lakukan pengetesan kolom dibawah kondisi yang optimum

Kolom

: Fortis C18 100x4,6 mm 5

p/n

: F18-050505

Fase gerak

: 60:40 ACN:H2O

Laju alir

: 1.0 ml/menit

Suhu

: 25 C

Panjang gelombang : 254 nm

1. Urasil

2. Fenol

3. 4-Etilanilin

4. N,N-Dimetilanilin

5. Naphtalen2.Hitung efisiensi kolom dengan menggunakan rumus

3.Hitung bentuk peak yang dihasilkan kolom dengan menggunakan rumus

4. Pemilihan Fase Gerak1.Kolom berbasis silika cocok dengan semua pelarut organik.

2.Pelarut harus berkualitas tinggi (HPLC grade).

3.Saring dapar yang digunakan dengan filter berukuran 0,5 m sebelum digunakan.

4.Gunakan pelarut yang sudah murni.

5. Pemilihan Buffer1.Kolom berbasis silika stabil pada rentang pH 2 sampai 8.

2.Kolom berbasis silika gel murni bisa digunakan pada rentang pH lebih tinggi, hingga pH 11.

3.Analisis senyawa polimer harus menggunakan kolom dengan pH tinggi.

Larutan buffer yang bisa digunakan :

6. Penyimpanan Kolom1.Simpan kolom dalam sedikitnya 40% pelarut organik tanpa adanya buffer.

2.Sesuaikan Endfitting untuk memastikan tidak ada penguapan pelarut dan tidak terjadi dry out.

3.Simpan kolom dalam temperature ruangan dan harus bebas dari getaran.

4.Jika kolom harus disimpan dalam periode waktu tertentu, idealnya lakukan pembersihan kolom sesuai cara kerja.

5.Simpan kolom dengan pelarut organik 60: 40 = ACN: air.

7. Pencucian Kolom1.Sebelum pencucian, bilas kolom dengan air agar bebas dari buffer.

2.Bilas secara bolak-balik untuk memastikan tidak ada penyumbatan pada frits.

Pencucian Kolom Fase Terbalik (Reversed Phase)

Sebanyak 20 x Vm (Volume Kolom) digunakan untuk setiap tahap pencucian.

Tahap pencucian :

1. Air-ACN = 95:5 (menghilangkan buffer)

2. 100% ACN

3. Air-ACN = 50:50

Jika senyawa atau matriks yang tertahan pada kolom cukup banyak maka dapat diberikan tahap pencucian tambahan dengan menginjeksikan DMSO atau THF. Tahap pencucian:

1. Air-ACN 95:5 (menghilangkan buffer)

2. 100% ACN

3. Injek DMSO atau THF 4 x 20l

4. Air-ACN 50:50Pencucian Kolom Fase Normal (Normal Phase)

Sebanyak 20 x Vm (Volume kolom) digunakan untuk setiap tahap pencucian :

1. THF

2. Kloroform

3. Metilen Klorida

4. Heksan

Pencucian Kolom dengan HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)Sebanyak 20 x Vm (Volume kolom) digunakan untuk setiap tahap pencucian :

1. ACN-air 95:5 (menghilangkan buffer)

2. ACN-air 50:50

3. Metanol-air 50:50

4. ACN-air 95:5

Untuk menghitung volume kolom (perkiraan kasar) :

Dimana :

Vm = Volume kolom

L = panjang kolom (cm)

dc = diameter dalam dari kolom (cm)

8. Penyelesaian MasalahBeberapa hal yang mempengaruhi kolom dan stabilitas kolom:

1. Sebagian filter mengalami penyumbatan

2. Terserapnya kotoran dari sampel

3. Faktor mekanik atau panas yang menyebabkan kerusakan

4. Zat kimia yang dapat mempengaruhi faseRetensi dan resolusi

Penyebab:Solusi:

Hilangnya fase diamGanti kolom

Adanya kontaminasiCuci kolom sesuai pedoman

Keterlambatan mencapai keseimbanganSeimbangkan atau jenuhkan fase gerak lebih lama

Fase normal adanya kelembapan dalam fase gerakPastikan pelarut kering, atau gunakan 2% air dalam fase gerak

Tekanan balik berubah/meningkat

Penyebab:Solusi:

Penyaring terblokir atau tersumbatBalik kolom dan bersihkan sesuai dengan pedoman

Ganti penyaring atau ganti penjaga kolom

Fase terkontaminasiBalik kolom dan bersihkan sesuai dengan pedoman

Presipitasi penyangga karena tingginya konsentrasi dari pengubah organikSiram kolom dengan air dengan konsentrasi tinggi (>90%)

Tailing atau perpecahan puncak

Penyebab:Solusi:

Rusaknya kolomGanti kolom atau penjaga kolom

Penyaring terblokir atau tersumbatBalik kolom dan siram kolom

Sampel yang berlebihanEncerkan sampel

Adanya kontaminasiCuci kolom sesuai pedoman

Perluasan kolomPeriksa semua sambungan pipa dan periksa jika terjadi kebocoran

Sampel memiliki kelarutan yang rendahModifikasi sampel atau modifikasi komponen fase gerak

9. Pelindung dan PenyaringPelindung berbagai jenis fase diam dalam format yang sesuai kolom analitis:

Alternatif lain kolom penjaga adalah sistem penyaringan. Penyaring yang tersedia untuk sistem LC 400bar atau sistem UHPLC 1000bar. Frit (ring) analitis berukuran pori 2um; untuk UHPLC 0.5um (seluruhnya terbuat dari stainless steel).

Vm QUOTE 0,5 Ldc2