USULAN PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA

JUDUL PROGRAM

BIDANG KEGIATAN:

PKM PENELITIAN

Diusulkan oleh:

Yoana Puspita Sari G84110066 2011

Lu’lu’ Atul Fitriyah G84110033 2011

Judulnya itu Pengaruh aktivitas ekstrak sirih merah terhadap peningkatan eritrosit

dan kadar hemoglobin pada tikus putih Sprague dawley anemia

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

PENGESAHAN USULAN PKM-PENELITIAN

1. Judul Kegiatan :2. Bidang Kegiatan :3. Ketua Pelaksana Kegiatan

a. Nama Lengkap :b. NIM :c. Jurusan :d. Universitas/Institut :e. Alamat Rumah dan No Telp/HP :f. Alamat email :

4. Anggota Pelaksana Kegiatan/Penulis :5. Dosen Pendamping

a. Nama Lengkap dan Gelar :b. NIDN :c. Alamat Rumah dan No. Telp :

6. Biaya Kegiatan Totala. Dikti :b. Sumber lain :

7. Jangka Waktu Pelaksanaan : bulan

Bogor,

MenyetujuiWakil/Pembantu Dekan atau Ketua Ketua Pelaksana KegiatanJurusan/Departemen/Program Studi/Pembimbing Unit Kegiatan Mahasiswa

(____________________________) (__________________________)NIP/NIK. NIM

Wakil Rektor Bidang Kemahasiswaan/ Dosen PendampingDirektur Politeknik/Ketua Sekolah Tinggi,

(____________________________) (__________________________)

NIP/NIK. NIP/NIK.

DAFTAR ISI

RINGKASAN

Tujuan, target penelitian, metode yang dipakai, rencana kegiatan

BAB 1. PENDAHULUAN

Latar belakang

Penyakit kekurangan gizi, misalnya anemia masih banyak diderita oleh

sebagian masyarakat Indonesia. Di Indonesia anemia mencapai 38-71,5 % yang

umumnya diderita oleh para wanita, ibu hamil dan buruh yang berpenghasilan

rendah. Penyakit ini menjadi penyebab kematian di negara berkembang,

menggantikan kematian akibat infeksi (Djohan, 2004). Penyakit anemia bisa

disebabkan karena penurunan kadar eritrosit atau berkurangnya kadar hemoglobin

dalam tubuh. Faktor penyebab lainnya adalah kekurangan zat gizi, asam folat, zat

besi dan vitamin. Anemia ditandai dengan gejala cepat lelah, kurang bergairah,

tidak mampu berkonsentrasi, kurang selera makan, pusing, sesak napas dan lain

sebagainya. Mutasi pada gen protein hemoglobin mengakibatkan suatu penyakit

menurun yang disebut hemoglobinopati, diantaranya anemia sel sabit dan

talasemia (Guyton dan Hall, 2006).

Radikal bebas yang mengancam kesehatan manusia berkontribusi terhadap

berbagai penyakit kronis dan penyakit degeneratif seperti serangan jantung,

alzheimer, stroke, dan kanker (Judarwanto, 2013). Radikal bebas berupa molekul

dengan elektron tidak berpasangan dan bersifat reaktif yang dapat menyebabkan

kerusakan pada molekul sekitarnya. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh

(endogen) maupun luar tubuh (eksogen). Radikal bebas endogen berupa

autooksidasi, oksidasi enzimatis, dan respiratory burst. Radikal bebas eksogen

dapat berasal dari polusi udara, sinar –X, radiasi UV, pestisida, dan asap rokok.

Saat tubuh mengalami infeksi, radikal diperlukan untuk membunuh

mikroorganisme penyebab infeksi, namun paparan radikal bebas berlebihan dapat

menyebabkan kerusakan sel, sehingga mengurangi kemampuan sel untuk

beradaptasi dengan lingkungannya yang menyebabkan kematian sel.

Molekul radikal bebas sering menangkap elektron dari molekul makro

pembentuk sel seperti lipid, protein, polisakarida, dan DNA yang membentuk

radikal bebas baru dan seterusnya hingga jumlah radikal bebas semakin banyak.

Radikal bebas terhadap sel kulit dapat merusak lipid pada membran sel yang

memicu keriput dan mempercepat penuaan. Radikal bebas dapat meningkatkan

kadar LDL dalam darah yang menyebabkan penimbunan kolesterol di dinding

pembuluh darah yang memicu timbulnya penyakit kronis seperti stroke dan

serangan jantung.

Tubuh pada kondisi yang normal akan membentuk antioksidan untuk

melawan radikal bebas sampai terjadi keseimbangan antara radikal bebas dan

antioksidan. Antioksidan merupakan senyawa yang menghambat interaksi antara

radikal bebas dengan target molekulnya. Antioksidan berasal dari dua sumber

yaitu dari dalam tubuh (endogen) dan dari luar tubuh (eksogen). Antioksidan

endogen berupa enzim yang terdiri atas superoksida dismutase, glutation

peroksidase, dan katalase. Antioksidan eksogen berupa vitamin E, vitamin C,

betakaroten, dan senyawa flavonoid.

Sirih merah merupakan tanaman asli Indonesia yang tumbuh merambat.

Ciri khas tanaman tropis ini adalah berbatang bulat hijau keunguan dan tidak

memiliki bunga. Daun sirih merah memiliki permukaan yang mengkilap dan tidak

merata. Tanaman sirih merah ini secara empiris telah terbukti menyembuhkan

berbagai macam penyakit. Selain diabetes melitus, penyakit yang dapat

disembuhkan dengan sirih merah antara lain hipertensi, leukemia, dan kanker

payudara (Duryatmo 2005). Hasil penelitian oleh Hermiati et al. (2013) diketahui

bahwa sirih merah mengandung flavonoid, polevenolad, tanin, dan minyak atsiri.

Kandungan flavonoid dalam sirih merah dapat berfungsi sebagai antioksidan

alami sebagai pengganti asupan vitamin C. Senyawa flavonoid inilah diduga dapat

meningkatkan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin dalam darah tikus putih

Sprague dawley.

Dari permasalahan di atas, penulis tertarik melakukan penelitian untuk

menguji fitokimia daun sirih merah (Piper crocatum) serta uji antioksidannya

untuk pemanfaatan dalam peningkatan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin.

Hasil penelitian ini diharapkan, ekstrak sirih merah dengan dosis yang berbeda,

memberikan pengaruh terhadap peningkatan jumlah eritrosit dan kadar

hemoglobin. Berdasarkan penelitian ini, dapat dijadikan bahan rujukan dalam

mengobati penyakit anemia.

Permasalahan yang diteliti

Penelitian terhadap tanaman sirih merah dinilai masih kurang, terutama

dalam pengembangan sebagai bahan baku untuk biofarmaka. Penelitian ini

bertujuan menentukan konsentrasi flavonoid total yang berperan sebagai

antioksidan yang diekstraksi oleh air dan metanol 30%. Hipotesis penelitian ini

adalah sirih merah (Piper crocatum) memiliki senyawa flavonoid yang berfungsi

sebagai antioksidan untuk menurunkan aktivitas radikal bebas. Selain itu, dapat

mengetahui adanya pengaruh pemberian ekstrak sirih merah (Piper crocatum)

terhadap peningkatan jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin (Hb) dalam darah

tikus putih Sprague dawley.

Tujuan khusus

Adapun tujuan dilakukannya penelitian ini adalah:

a. Mengetahui pengaruh sirih merah terhadap penurunan kadar radikal bebas

dalam tubuh

b. Menambah pengetahuan dalam bidang kesehatan, yaitu

dapat memberikan informasi bahwa sirih merah (Piper

crocatum) merupakan obat tradisional yang dapat digunakan

untuk mengobati penyakit anemia.

Urgensi penelitian

Kendala yang dihadapi masyarakat Indonesia saat ini adalah meningkatnya

resiko penyakit kronis terkait radikal bebas. Antioksidan berperan penting dalam

mengikat senyawa radikal bebas. Tubuh manusia dapat menghasilkan senyawa

antioksidan, namun jumlahnya sering tidak cukup untuk menetralkan radikal

bebas yang masuk ke dalam tubuh sehingga dapat mengurangi terjadinya penyakit

anemia.

Kontribusi terhadap ilmu pengetahuan

Luaran yang diharapkan

Penelitian mengenai pengaruh sirih merah terhadap penurunan kadar

radikal bebas dalam tubuh diharapkan dapat membantu mengurangi penyakit yang

timbul karena hadirnya radikal bebas berlebih dalam tubuh seperti kanker,

penyakit jantung, tumor, anemia, dan penyakit degeneratif lainnya.

Manfaat kegiatan

Program penelitian ini memiliki beberapa manfaat antara lain:

a. Pembudidayaan sirih merah sebagai bahan obat-obatan dan biofarmaka

mengingat kandungan zat aktif di dalam sirih merah cukup tinggi

b. Menurunkan risiko dan angka kematian dini akibat penyakit mematikan

karena timbulnya radikal bebas yang berlebihan di dalam tubuh

c. Menurunkan terjadinya penyakit anemia akibat kekurangan eritrosit dan

kadar hemoglobin yang diakibatkan karena banyaknya radikal bebas

dalam tubuh

d. Menggalakkan pemanfaatan penggunaan tanaman tradisional oleh

masyarakat sebagai upaya untuk melestarikan alam atau back to nature

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

Hasil penelitian up to date dan relevan, ada jurnal ilmiah

Teori, temuan,

Darah

Darah merupakan bagian penting sistem transport yang terdiri atas dua

bagian yaitu plasma darah (bagian cair dalam tubuh) dan sel-sel darah yaitu

bagian padat dalam darah (sel darah merah, sel darah putih, dan sel pembekuan

darah). Plasma darah mengandung 90% air dan 10% nya adalah protein-protein

darah (albumin, globulin, dan fibrinogen). Darah merupakan suatu cairan yang

berada di dalam tubuh yang berfungsi mengalirkan oksigen ke seluruh jaringan

tubuh, mengirimkan nutrisi yang dibutuhkan sel-sel, mengatur keseimbangan

asam basa cairan tubuh, dan menjadi sistem pertahanan tubuh terhadap virus dan

infeksi. Volume darah manusia sekitar 7-10 % dari berat badan normal dengan

jumlah 5 L. Keadaan jumlah darah setiap orang berbeda-beda bergantung pada

usia, pekerjaan, dan keadaan jantung dan pembuluh darah (Jhonson 2003).

Gambar 1 Bentuk komponen dalam darah (Shier et al., 2004)

Eritrosit

Eritrosit atau sel darah merah adalah sel yang terbanyak dalam darah

perifer. Jumlah eritrosit pada pria dewasa normal berkisar 5.4 juta sel/µL dan pada

wanita dewasa sekitar 4.8 juta sel/µL. Pematangan eritrosit dalam sumsum tulang

berlangsung selama 7 hari, sedangkan masa hidup eritrosit setelah pelepasan dari

sumsum tulang sekitar 120 hari (Guyton dan Hall, 2006). Fungsi utama eritrosit

adalah transport gas yang mengangkut oksigen dari paru-paru ke jaringan tubuh

dan mengangkut karbondioksida dari jaringan ke paru-paru. Eritrosit tidak

memiliki mitokondria, memiliki organel sehingga eritrosit tidak memerluka

oksigen untuk dikonsumsi. Jumlah eritrosit setiap individu berbeda-beda karena

salah satunya disebabkan perbedan kadar hemoglobin darah. Rata-rata jumlah

eritrosit wanita normal adalah 4.3-5.2 juta per mm3, sedangkan pada pria dewasa

yaitu 5.1-5.8 mm3 (Marieb 2004).

Gambar 2 Bentuk sel darah merah (Shier et al., 2004)

Bentuk khas sel darah merah ikut berperan terhadap

efisiensi eritrosit dalam pengangkutan O2 dalam darah melalui

dua cara, yaitu: pertama, bentuk bikonkaf mampu membuat

permukaan sel darah merah menjadi lebih luas sehingga difusi O2

lebih lancar untuk menembus membran daripada yang dihasilkan

oleh sel bulat dengan volume yang sama. Kedua, selnya tipis dan

membrannya lentur (flexibilitas) sehingga memungkinkan O2

berdifusi secara lebih cepat antara bagian paling dalam sel

dengan eksteriornya (Sherwood, 2001).

Hemoglobin

Hemoglobin (Hb) adalah metaloprotein (protein yang mengandung zat

besi) di dalam darah yang berfungsi sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke

seluruh tubuh dan membawa karbondioksida kembali menuju paru-paru untuk

dihembuskan keluar tubuh (Evelyn, 2009). Molekul hemoglobin terdiri atas

globin, apoprotein, dan empat gugus heme (molekul organik dengan satu atom

besi). Jumlah hemoglobin dalam darah normal adalah sekitar 15 g/100 mL darah

(Evelyn, 2009). Kadar hemoglobin pria dewasa sekitar 13,0 g/dL dan pada wanita

dewasa sekitar 12,0 g/dL. Kadar hemoglobin setiap orang berbeda-beda karena

perbedaan umur, jenis kelamin, kecukupan zat besi, dan metabolisme zat besi di

dalam tubuh (Arisman, 2002).

Gambar 3 Struktur molekul hemoglobin (Marieb dan Hoehn, 2007)

Hemoglobin mengandung empat rantai polipeptida dan empat gugus

prostetik heme, yang mempunyai atom besi dalam bentuk ferro (Fe 3+). Bagian

protein yang disebut globulin terdiri dari dua rantai α (masing-masing 141 residu

asam amino) dan dua rantai β (masing-masing 141 residu asam amino) (Marieb,

2005).

Anemia

Anemia merupakan kondisi kekurangan jumlah sel darah merah (eritrosit)

dalam darah. Anemia terjadi karena minimnya kadar hemoglobin yang

mengakibatkan pengangkutan oksigen ke seluruh tubuh juga berkurang yang

penyebab utamanya kekurangan zat gizi, khususnya zat besi untuk pembentukan

Hb tersebut (Budiyanto, 2002).

Natrium Nitrit (NaNO2)

Nitrat dan nitrit adalah komponen yang mengandung nitrogen yang

berikatan dengan atom oksigen. Nitrit mengikat dua atom oksigen, sedangkan

nitrat mengikat tiga atom oksigen sehingga nitrat lebih kaya oksigen daripada

nitrit. Natrium nitrit merupakan obat yang paling sering digunakan untuk

keracunan sianida. Dosis awal standart adalah 3% larutan natrium nitrit 10 ml,

memerlukan waktu kira-kira 12 menit untuk membentuk kira-kira 40%

methemoglobin (Tintus, 2008).

Dalam tubuh, hemoglobin hanya akan mengikat Fe dalam bentuk Fe 2+

(Ferro). Ion nitrit yang terbentuk ini diabsorpsi ke dalam darah dan masuk ke

dalam eritrosit, lalu akan mengoksidasi ion Fe2+ (ferro) dalam hemoglobin (Hb)

dan mengubahnya menjadi ion Fe3+ (ferri) sehingga terjadi pembentukan

methemoglobin, bukan hemoglobin. Methemoglobin ini tidak bisa membawa

oksigen ke jaringan tubuh sehingga menyebabkan kekosongan oksigen dalam

darah (hipoksia). Keadaan hipoksia menyebabkan sel-sel akan mati karena

kekurangan oksigen (Yuningsih, 2000). Natrium nitrit memiliki LD50 untuk oral

rat atau pemberian pada tikus, secara oral sebesar 250 mg/kg (Muchtadi, 1989).

Tikus Putih Sprague dawley

Tikus merupakan hewan laboratorium yang banyak digunakan dalam

penrcobaan untuk mempelajari pengaruh obat-obatan, toksisitas, metabolisme,

embriologi maupun dalam mempelajari tingkah laku. Salah satu alasannya adalah

mudah dipelihara dan bisa beradaptasi baik pada lingkungan yang baru. Hewan ini

berkembang biak dengan cepat, berumur pendek (2-3 tahun), relatif murah, dan

dapat dibeli dalam jumlah besar sehingga dapat diamati dalam waktu yang

singkat. Alasan lain penggunaan tikus sebagai model uji medis adalah genetika,

karakteristik biologi, dan perilakunya sangat mirip dengan manusia. Jenis tikus

yang paling banyak digunakan untuk percobaan adalah tikus putih (Rattus

novergicus), mencit (Mus musculus), tikus hitam (Rattus rattus), Wistar, dan

Sprague dawley ditandai dengan warna albino putih, berkepala kecil, dan ekornya

lebih panjang dari badannya (Rahayu 2007).

Sirih Merah

Sirih merah termasuk tanaman yang berasal dari famili peperaceae dan

nama latin dari sirih merah adalah Piper crocatum (Sulihandari 2013). Klasifikasi

lengkap sirih merah menurut Duryatmo (2005) yaitu:

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Monochlamydeae

Bangsa : Piperales

Suku : Piperaceae

Genus : Piper

Jenis : Piper crocatum

Sirih mengandung senyawa antiseptik berupa kavibetol dan kavikol yang lima kali

lebih efektif dibandingkan fenol biasa. Beberapa penyakit yang dapat disembukan

dengan sirih merah yaitu hipertensi, leukimia, diabetes melitus, asam urat, dan

hepatitis (Mursito 2002).

Sirih merah memiliki daun bertangkai membentuk jantung meruncing

pada ujungnya, bertepi rata, dan tidak berbulu. Daun ini memiliki rasa yang pahit,

berlendir, dan memiliki bau khas seperti sirih hijau (Sudewo 2005). Sirih merah

dapat tumbuh dengan baik di tempat teduh, sehingga warna daunnya tidak pudar.

Sudewo (2005) berpendapat bahwa sirih merah tumbuh baik jika mendapat

cahaya matahari kisaran 60-75% dan lingkungan berhawa dingin.

Sudewo (2005) berpendapat bahwa tanaman sirih merah dapat mengobati

hipertensi, diabetes melitus, leukimia, TBC, maag, asam urat, dan batu ginjal.

Secara empiris, air rebusan daun sirih merah berkhasiat sebagai antihiperglikemia

dengan dosis 20 g/kg BB dapat menurunkan glukosa darah sampai 40% selama 13

hari masa pencekokan pada tikus Sprague dawley yang diabetes (Safithri dan

Fahma 2005).

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Safithri dan Fahma (2005), air

rebusan sirih merah mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan tanin.

Flavonoid merupakan sumber antioksidan bagi tubuh. Flavonoid merupakan

senyawa metabolit sekunder yang memproduksi pigmen warna kuning dan merah

untuk menarik hewan polinator.

Gambar 4 Tanaman sirih merah

Alkaloid

Alkaloid merupakan senyawa yang mengandung atom nitrogen, karbon,

hidrogen, dan oksigen. Alkaloid banyak ditemukan pada tanaman Angiospermae

dan jarang ditemukan pada Gymnospermae. Pelarut alkaloid yang biaasa

digunakan adalah pereaksi Meyer berupa merkuri potasium iodida, pereaksi

Wagner berupa larutan I2 dalam larutan kalium iodida, dan pereaksi Dragendorf

berupa bismut potasium iodida. Pada temperatur kamar,alkaloid berupa padatan.

Alkaloid padat sukar larut dalam air, tapi larut dalam pelarut organik umum

seperti kloroform, alkohol, benzen, dan eter (Sumardjo 2008). Untuk

mendapatkan senyawa alkaloid, dibutuhkan beberapa pelarut. Kloroform

berfungsi untuk melarutkan ikatan glikosida yang terputus akibat penambahan

ammonia. Prinsip yang mendasari adalah “like dissolve like”. Karena sifat

kloroform yang semipolar, selain bisa melarutkan senyawa polar kloroform juga

bisa melarutkan senyawa non polar seperti glikosida. Filtrat yang mengandung

alkaloid kemudian ditambah dengan HCl yang bertujuan unttuk membentuk

garam ammonium R3NH+Cl-.

Reaksi yang terjadi :

R3N + HCl R3NH+Cl-

Alkaloid garam ammonia (Fessenden, 1999)

Filtrat pertama ditambahkan pereaksi Dragendroff yang mengandung ion Bi3+ dan

HI, dimana uji positif jika terbentuk endapan merah bata.

Reaksinya :

R3N + Bi3+ + H+ + 4I- R3N.HBiI4

Alkaloid endapan merah bata (Harbone, 1977)

Filtrat kedua ditambahkan dengan pereaksi mayer yang mengandung Hg2+ dan KI.

Uji positif jika terbentuk putih.

Reaksinya :

R3N + Hg2+ + 2K+ + 4I- R3N.K2H3I4

Alkaloid endapan putih (Harbone, 1977)

Tanin

Tanin banyak dimanfaatkan sebagai bahan pewrna, perekat, dan

penyamakkan kulit hewan karena sifatnya yang dapat mengikat protein, alkaloid,

dan gelatin. Tanin juga berfungsi sebagai antioksidan biologis (Hagerman 2002).

Tanin dapat diklasifikasikan yaitu tanin terhidrolisis dan tanin terkondensasi.

Tanin terhidrolisis berikatan dengan karbohidrat membentuk jembatan oksigen

dan dihidrolisis menggunakan asam sulfat atau asam klorida. Tanin terkondensasi

kebanyakan terdiri dari polimer flavonoid yang terkondensasi menghasilkan asam

klorida. Menurut Najebb (2009), sifat fisika dari tanin adalah tidak dapat

mengkristal, jika dicampur dengan alkaloid dan gelatin akan mengendap, rasa

asam jika dilarutkan dengan air. Sifat kimia tanin adalah dapat diidentifikasi

dengan kromatografi, memiliki aksi adstrigensia, antiseptik, dan pemberi warna.

Prinsip uji tanin adalah adanya ikatan hidrogen antara gugus hidroksil akan larut

dalam air sesuai prinsip “like dissolves like. Kelarutan tanin yang tinggi terjadi

dalam keadaan panas karena alasan inilah maka dilakukan proses pendidihan agar

tanin yang terlarut semakin banyak. Selain itu proses pendidihan juga berfungsi

untuk memecah ikatan-ikatan pada tanin sehingga dihasilkan bentuk monomer-

monomer tanin bebas. Kemudian dilakukan pendinginan untuk mengendapkan

senyawa-senyawa pengotor yang tidak larut pada suhu rendah, misalnya saponin.

Selanjutnya adalah penyaringan yang bertujuan untuk memisahkan tanin dari

simplisia dan senyawa lain yang terkandung didalamnya seperti alkaloid, steroid,

flavonoid. Penambahan FeCl3 berfungsi sebagai sumber atom pusat, dimana tanin

merupakan ligan yang membutuhkan atom pusat untuk membentuk kompleks

yang stabil, sehingga terbentuklah kompleks antara atom pusat Fe3+ dengan ligan

tanin. Uji positif yaitu terbentuk larutan berwarna cokelat kehitaman.

Reaksi yang terjadi :

Kompleks warna (cokelat kehitaman) (Markham, 1988)

Flavonoid

Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam

tanaman hijau, kecuali alga. Flavonoid adalah pigmen tumbuhan yang paling

penting untuk warna bunga yang memproduksi pigmen warna kuning, merah, atau

biru di kelopak untuk menarik hewan polinator. Flavonoid dikenal dengan

aktivitasnya sebagai antioksidan in vitro. Prinsip uji flavonid adalah melarutkan

flavon sehingga flavonoid dapat dipisahkan dari golongan lain. Penambahan

etanol berfungsi untuk melarutkan flavonoid. Hal ini disebabkan flavonoid

merupakan senyawa polar sehingga etanol yang juga bersifat polar mampu

memisahkan flavonoid dari senyawa-senyawa yang bersifat non polar, misalnya

kuinon.

Steroid

Steroid mengandung inti siklopentana perhidrofenatren dari tiga cincin

sikloheksana dan sebuah cincin siklopentana (Lenni 2006). Triterpenoid adalah

senyawa dengan kerangka karbon berasal dari enam satuan isoprena dan

diturunkan dari hidrokarbon C30 secara asiklik. Triterpenoid bersifat tidak

berwarna, berbentuk kristal, berititk leleh tinggi, dan bersifat optis aktif. Prinsip

uji ini adalah penggunaan Pelarut eter yang bersifat nonpolar karena steroid

merupakan senyawa organik yang memiliki sifat nonpolar sehingga steroid dapat

larut dalam pelarut nonpolar seperti eter. Pelarut asam asetat anhidrat dimana

asam asetat anhidrat akan bereaksi dengan steroid melalui reaksi asetilasi

menghasilkan kompleks asetil steroid.

Reaksi yang terjadi :

(Fessenden, 1999)

Penambahan H2SO4 pekat bertujuan untuk mendekstruksi kompleks asetil steroid.

H2SO4 pekat lebih bersifat reaktif jika bereaksi dengan steroid dibandingkan

dengan asam asetat anhidrat. Hal ini dikarenakan kemampuan H2SO4 yang lebih

mudah masuk mengatasi efek sterik yang besar dari molekul steroid sehingga

senyawa kompleks yang dihasilkan lebih stabil dari kompleks asetil steroid.

Saponin

Saponin merupakan golongan senyawa glikosida dengan struktur steroid

membentuk rumus C32H18O7 dan bersifat khas dengan membentuk larutan koloid

dalam air dan berbuih bila dikocok. Saponin yang terhidrolisis terdiri atas glikon

yang membentuk gula seperti glukosa, arabinosa, xilosa, dan asam glukoronat,

serta terdiri atas aglikon yang membentuk sapogenin. Sapogenin dapat

membentuk saponin netral berupa steroid dan saponin asam berbentuk

triterpenoid. Prinsip dari uji saponin adalah mendidihkan ekstrak salam koja yang

sudah diencerkan untuk memperbesar kelarutan saponin dalam air.

BAB 3. METODE PENELITIAN

Tahapan penelitian, luaran, indikator capaian terukur tiap tahapan, teknik

pengumpulan data, analisis data, cara penafsiran, penyimpulan hasil penelitian

Rancangan Penelitian

Penelitian ini berupa penelitian eksperimental secara in vitro yang

bertujuan menguji aktivitas antiradikal bebas DPPH sebagai kapasitas antioksidan

ekstrak air dan ekstrak metanol daun sirih merah. Variabel terikat adalah

peredaman radikal bebas DPPH dan variabel bebas berupa ekstrak air dan ekstrak

metanol dalam berbagai konsentrasi. Pada uji in vivo menggunakan variabel

bebasnya berupa pemberian ekstrak sirih merah dengan dosis yang berbeda,

sedangkan variabel terikatnya adalah jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin (Hb)

dalam darah tikus putih Sprague dawley jenis kelamin jantan umur 5 bulan,

dengan berat badan rata-rata sekitar 250 g.

Bahan Penelitian

Bahan utama yang digunakan adalah 5 kg daun sirih merah, metanol, eter,

aqua destilata, kloroform, larutan amonia, reagen Dragendorf, reagen Meyer,

reagen Walkner, larutan etanol 30%, larutan asam glasial, larutan asam sulfat

pekat, DPPH, tikus putih Sprague dawley 18 ekor jenis kelamin jantan umur 5

bulan, dengan berat badan rata-rata sekitar 250 g, bahan makanan tikus berupa

pellet, reagen Hemolysin (terbuat dari larutan Kalium ferrocyanida [K3Fe(CN)]

0,6% mmol/l dan larutan Cyanida (KCN) 1,0 mmol/l) (Supariasa, 2002), ekstrak

sirih merah dengan dosis 0.25 g/ekor/hari, 0,50 g/ekor/hari dan 0,75 g/ekor/hari,

betadin, natrium nitrit (NANO2), alkohol 70%, dan aquades.

Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini, antara lain pisau stainless

steel, oven, blender, wadah plastik, kantong plastik, nampan pengering,

mikroskop, cawan petri steril, eksikator, neraca analitik, labu bersumbat, labu

takar, labu Erlenmeyer 500 mL, shaker orbital, evaporator dan asesorisnya,

aluminium foil, plastik perekat, kertas saring, lemari es, wadah penumbuh larva

udang, lampu, vial pengujian, tabung reaksi, pipet Mohr, pipet tetes, pipet mikro,

autoklaf, laminar air flow, penggaris, pipet hemoglobin,

spektrophotometer, kuvet, gunting, sangkup rangkap, eppendorf

untuk menampung darah, Haemositometer, Mikropipet ukuran

20-1000 μl, kapas, spidol marker merah, hitam dan biru.

.

Prosedur Percobaan

Pembuatan Simplisia Tanaman Obat. Daun sirih merah dipreparasi

melalui beberapa tahap, yaitu pencucian dan penyortiran basah. Sirih merah dicuci

dengan air bersih, lalu ditiriskan dalam wadah berlubang-lubang agar air cucian

yang tertinggal dapat dipisahkan, kemudian ditempatkan ke dalam wadah yang

bersih dan kering. Sirih merah sebanyak 1 kg kemudian dirajang melintang

dengan ketebalan 5 mm menggunakan pisau stainless steel. Hasil rajangan ini

ditempatkan dalam nampan tahan panas, dikeringkan dalam oven pada suhu 50

selama 2-3 hari. Simplisia ditimbang beratnya dan diambil gambarnya. Simplisia

kering ini dihaluskan menggunakan alat penggiling (blender) berukuran 100

mesh, dikemas dalam plastik, dan disimpan dalam suhu ruang untuk pengujian

selanjutnya.

Analisis Mutu Simplisia Tanaman Obat. Simplisia sirih merah akan

diuji secara organoleptik. Uji ini dilakukan dengan mengamati sampel sebelum

dan sesudah menjadi simplisia yang sudah dalam bentuk mesh untuk ditentukan

bau, rasa, dan bentuk permukaannya. Uji makroskopik dilakukan dengan

mengamati bentuk dan warna dari simplisia. Uji mikroskopik dilakukan dengan

menggunakan mikroskop yang derajat pembesarannya disesuaikan dengan

keperluan. Serbuk simplisia diletakkan di bawah mikroskop untuk diamati

anatomi dari jaringan yang khas.

Penentuan Kadar Air Simplisia. Sebanyak 2 gram simplisia ditimbang

pada sebuah cawan porselen yang telah diketahui bobotnya. Simplisia di dalam

cawan tersebut kemudian dioven pada suhu 1050C selama 3 jam. Cawan tersebut

didinginkan terlebih dahulu di dalam eksikator setelah diangkat dari oven. Bobot

cawan dan simplisia tersebut ditimbang kembali dan dihitung kadar airnya.

Kadar air=

Penentuan kadar sari larut etanol. Serbuk simplisia ditimbang 5 g

dengan labu bersumbat. Maserasi dengan 100 mL etanol 95%, sambil dikocok

selama 3 jam pertama, kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi disaring

dengan cepat untuk menghindari penguapan etanol. Hasil penyaringan ditera ke

dalam labu takar 100 mL dan dikocok. Sebanyak 20 mL diambil tepat dan

dikeringkan pada oven suhu 105 di cawan dangkal yang telah diketahui bobotnya.

Larutan simplisia didinginkan dalam eksikator. Pekerjaan ini dilakukan

penimbangan berulang-ulang hingga diperoleh bobot tetap.

Ekstraksi Tanaman Obat. Sebanyak tiga labu Erlenmeyer 500 mL

disiapkan dengan menambahkan 10 g simplisia sirih merah pada masing-masing

Erlenmeyer tersebut. Labu Erlenmeyer 1-3 ditambahkan pelarut akuades untuk

Erlenmeyer-1, pelarut etanol untuk Erlenmeyer-2, dan pelarut kloroform untuk

Erlenmeyer-3, masing-masing sebanyak 100 mL. Erlenmeyer ditutup dengan

aluminium foil, lalu digoyang dengan kecepatan 250 rpm selama 3 jam,

selanjutnya disimpan selama 24 jam di tempat gelap pada suhu ruang. Ekstrak

disaring menggunakan kertas saring. Filtrat ditempatkan pada labu evaporator

yang telah diketahui bobotnya. Pelarut/ filtrat diuapkan dengan menggunakan

vakum evaporator pada suhu pemanasan tidak lebih dari 50. Ekstrak-ekstrak

tersebut dapat disimpan dalam lemari es suhu 4 untuk digunakan dalam pengujian

selanjutnya. Pelarut-pelarut yang digunakan, ditentukan rendemennya, dengan

rumus:

Rendemen =

Pengujian Screening Fitokimia dan Potensi Farmakologi Ekstrak

Tanaman Obat. Uji Alkaloid. Sebanyak 0.3 ml ekstrak ditambahkan 1.5 ml

kloroform dan 3 tetes amonia, kemudian fraksi kloroform diasamkan dengan 2

tetes asam sulfat. Bagian asamnya diambil dan ditambahkan pereaksi Dragendorf,

Meyer, dan Wagner. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah

pada penambahan pereaksi Dragendorf, endapan putih pada Meyer, dan endapan

putih pada Wagner. Uji Tanin. Sampel ekstrak diencerkan dengan akuades 1:10,

lalu dididihkan selama 5 menit. Lalu 3 tetes sampel tersebut dipindahkan ke plat

tetes dan ditambahkan 3 tetes FeCl3 1%. Terbentuknya warna biru tua atau hijau

kehitaman menunjukkan positif tanin. Uji Flavonoid. Sampel esktrak diencerkan

dengan 5 ml akuades, lalu sebanyak 0.3 ml dicampurkan dengan 1.5 ml etanol dan

dipanaskan pada suhu 500C selama 5 menit. Kemudian 5 tetes larutan tersebut

dipindahkan ke plat tetes dan ditambahkan 5 tetes asam sulfat pekat. Warna merah

yang terbentuk menunjukkan adanya flavonoid. Uji Saponin. Sampel ekstrak

diencerkan dengan 10 ml akuades, lalu dikocok kuat selama 10 menit. Lalu

didiamkan selama 15 menit dan dilihat tinggi buih yang terbentuk. Keberadaan

saponin ditunjukkan dengan adanya buih yang stabil dengan tinggi lebih dari 1

cm. Uji Steroid dan Triterpenoid. Sampel ekstrak dilarutkan dengan 2 ml etanol

30% dan dipanaskan. Filtratnya diuapkan dan ditambahkan 1 ml eter. Fraksi eter

sebanyak 5 tetes dipindahkan ke plat tetes dan ditambahkan 3 tetes asetat

anhidrida dan 1 tetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah atau ungu

menunjukkan adanya senyawa triterpenoid, dan warna hijau menunjukkan adanya

senyawa steroid.

Pengukuran absorbansi peredaman radikal bebas DPPH. Larutan uji

dengan berbagai konsentrasi (10 ppm, 20 ppm, 40 ppm, 80 ppm, 160 ppm)

sebanyak 4 ml ditambahkan 1 ml larutan pereaksi DPPH dimasukkan dalam vial

dikocok, kemudian didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian

dibaca serapan aktivitasnya pada panjang gelombang maksimum. Blanko yang

digunakan berupa metanol.

Pengujian Antiradikal Bebas DPPH

Contoh cara kerja pengujian antiradikal bebas DPPH (Santosa et al., 1998;

Dyatmiko dan Santosa, 1998) sebagai berikut.

1. Larutan DPPH 0,004 % disiapkan. Sebanyak 600 μl etil asetat dipipet ke dalam

kuvet, larutan DPPH ditambahkan 3 ml, aduk rata dengan pipet dan segera

dibuat spektra sinar tampak (360-720 nm). Absorban dicatat pada 497-517-537

nm.

2. Pengukuran antiradikal bebas untuk bahan uji adalah sebanyak 600 μl larutan

uji dipipet ke dalam kuvet, kemudian ditambahkan larutan DPPH 3 ml, diaduk

rata dengan pipet, segera dibuat spektra sinar tampak (360-720 nm) di kertas

yang sama untuk dianalisis jika masih ada jelas kurva puncak normal (sigmoid)

antara 497-537 nm. Pada menit ke-5 setelah pereaksian dibaca absorban pada

497-517-537 nm dan sekali lagi pada menit ke-60.

3. Perhitungan kapasitas antiradikal bebas DPPH diukur dari peredaman warna

ungu merah DPPH, yaitu puncak 517 nm dengan perhitungan seperti

persamaan 1. sedangkan kapasitas antiradikal bebas sebagai prosen peredaman

absorban pada puncak 517 nm menggunakan perhitungan:

Persiapan Hewan Coba. Sebelum penelitian dimulai, hewan uji

diadaptasikan selama satu minggu dalam kandang pada suhu kamar (20-250C)

(Santoso, 2006). Setiap hewan coba dikelompokkan menjadi 3 ekor untuk setiap

perlakuan kontrol positif, kontrol negatif, dan normal, sedangkan untuk perlakuan

ekstrak digunakan 3 ekor tikus untuk setiap masing-masing dosis 0.25 g/hari, 0.50

g/hari, dan 0.75 g/hari. Lalu, disiapkan reagen hemolysin untuk menganalisis

kadar hemoglobin, dan disiapkan juga ekstrak sirih merah.

Perlakuan pada hewan coba. Hewan coba dibagi menjadi empat

kelompok perlakuan yakni kelompok normal, kontrol positif, kontrol negatif, dan

ekstrak sirih merah. Setiap kelompok perlakuan diberi pakan sebesar 10 g/hari.

Apabila pakan habis maka ditambah 2.5 g/hari. Perlakuan kontrol positif dengan

pemberian parasetamol yang dapat menurunkan antioksidan dalam tubuh, kontrol

negatif dengan pemberian larutan natrium nitrit, dan perlakuan normal dengan

tanpa ekstrak sirih merah. Perlakuan pada kelompok perlakuan ekstrak diinjeksi

dengan ekstrak sirih merah sebesar 0.25 g/hari, 0.50 g.hari, dan 0.75 g/hari. Pakan

diganti setiap hari selama satu bulan dan kandang dibersihkan. Minggu ke-0 dan

ke-2 darah diambil dari vena ekor.

Pengambilan darah. Tikus yang akan diambil darahnya dipuasakan sedikitnya

12 jam sebelum waktu pengambilan darah. Gunting disterilkan dengan alkohol

70%. Bagian ekor tikus yang akan diambil darahnya dibersihkan juga dengan

alkohol 70%. Ujung ekor kemudian dipotong maksimal 5 mm hingga berdarah.

Ujung ekor tersebut kemudian diurut hingga mencapai volume maksimal 2 ml per

ekor tikus. Apabila darah sulit keluar, dapat dilumuri dengan minyak kelapa.

Setelah selesai bagian ekor ditetesi dengan betadine.

Penentuan Dosis Natrium Nitrit. Menurut Muchtadi (1989), LD50 rata-

rata dari natrium nitrit secara oral pada tikus adalah 250 mg/kg berat badan. Pada

penelitian ini, berat badan tikus 250 g, sehinga LD50 untuk setiap ekor adalah:

LD50 = x

= x 250

= 62.5 mg/ekorLD50 efektif untuk membuat anemia pada tikus sebanyak:

x LD50

= x 62.5 mg/ekor

= 31.25 mg/ekor

Jadi, dosis yang digunakan pada setiap ekor yaitu 31.25 mg yang dilarutkan dalam

1 ml aquades.

Penghitungan Jumlah Eritrosit. Darah dari ekor tikus dikeluarkan

dengan menekan pangkal ekor, kemudian diurut sampai ke ujung ekor, lalu darah

dihisap dengan pipet eritrosit hingga tanda 0.5. Darah yang tersisa di ujung pipet

dibersihkan dan pipet dimasukkan ke dalam larutan natrium sitrat 2.5% dan

dipipet hingga tanda 101. Pipet ditutup dengan jari lalu dikocok selama 15-30

detik. Cairan ditiup ke dalam hemasitometer yang telah dibersihkan lalu ditutup

dengan kaca penutup. Hemasitometer diamati dibawah mikroskop dengan

perbesaran 40X. Jumlah eritrosit yang terlihat lalu dihitung. Contoh jumlah

perhitungan eritrosit sebagai berikut:

Panjang sisi 1 bilik R = 0,2mm

Dalamnya bilik hitung = 0,1mm

Pengenceran darah (p) = 100 atau 200

Jumlah eritrosit dari 5 bilik hitung = N

Volume dari 5 bilik hitung = Vmm3

Jumlah eritrosit per mm3 = N p/V (S) (Gandasoebrata, 2007).

Penentuan Kadar Hemoglobin. Darah diambil sebanyak 20 μl dengan

menggunakan mikropipet, kemudian dimasukkan dalam tabung reaksi yang telah

berisi 5ml larutan Drabkin. Lalu, sampel yang ada pada tabung reaksi dipindahkan

pada kuvet. arutan standar (Drabkin) dimasukkan pada spektrofotometer sebagai

blanko, kemudian skala diatur hingga penuh (full scale) pada panjang gelombang

540 nm. Sampel dimasukkan, dilihat absorbansinya, kemudian dimasukkan dalam

rumus berikut ini:

Kadar Hb = Absorbansi x 36,8 g/dL (Gandasoebrata, 2007).

Analisis Data

Kurva antara konsentrasi larutan uji dengan % peredaman DPPH dan

ditentukan harga EC50, yaitu konsentrasi larutan uji yang memberikan peredaman

DPPH sebesar 50%. Harga EC50 umum digunakan untuk menyatakan aktivitas

antioksidan suatu bahan uji dengan metode peredaman radikal bebas DPPH

(Molyneux 2004). Data dalam penelitian invivo ini berupa jumlah eritrosit dan

kadar Hemoglobin dalam darah tikus putih (Sprague dawley). Data diperoleh

dengan cara menghitung jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin tikus putih

sebelum dan sesudah perlakuan, kemudian data yang diperoleh dimasukkan dalam

tabel berikut: Data dalam penelitian ini berupa jumlah eritrosit dan

kadar Hemoglobin dalam darah tikus putih (Sprague dawley).

Data diperoleh dengan cara menghitung jumlah eritrosit dan

kadar hemoglobin tikus putih sebelum dan sesudah perlakuan,

kemudian data yang diperoleh dimasukkan dalam tabel berikut:

Tabel 1 Kadar hemoglobinSampel Aterukur (A) A terkoreksi (A) Kadar Hbnya

(g/dL)X1 Y1 X1 Y1

NormalKontrol positif

Kontrol negatif

Ekstrak dosis 0.25 mg/hariEkstrak dosis 0.50 mg/hariEkstrak dosis 0.75 mg/hari

Keterangan: X= sebelum perlakuan

Y= setelah perlakuan

Tabel 2 Penentuan jumlah eritrosit dalam darah tikus putih Sprague dawley sebelum dan setelah perlakuan

Sampel ∑ eritrosit Jumlah/mm3

X1 Y1 X1 Y1Normal

Kontrol positifKontrol negatif Ekstrak dengan

dosis 0.25 mg/hari

Ekstrak dengan dosis 0.50 mg/hari

Ekstrak dengan dosis 0.75 mg/hari

Keterangan: X= sebelum perlakuanY= setelah perlakuan

Untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak sirih

merah terhadap jumlah eritrosit dan kadar hemoglobin tikus

putih Sprague dawley dianalisis dengan kovarian ANNOVA 1

faktor. Apabila dengan analisis kovarian menunjukkan hasil yang

berbeda nyata atau sangat nyata, maka dilanjutkan dengan uji

Beda Nyata (BNT) taraf signifikansi 5%.

BAB 4. BIAYA DAN JADWAL KEGIATAN

4.1 Anggaran Biaya

No. Jenis Pengeluaran Biaya (Rp)1 Peralatan penunjang (ditulis sesuai kebutuhan)2 Bahan habis pakai, ditulis kebutuhan3 Perjalanan (kemana, tujuan apa)4 Lain2: administrasi, publikasi, seminar, laporan

Jumlah

4.2 Jadwal Kegiatan (3-5 bln)

DAFTAR PUSTAKA

Arisman. 2002. Gizi dalam Daur Kehidupan Buku Ajar Ilmu Gizi. Jakarta: UGC.

Boston New York: Pearson Benjamin Cummings.

Budiyanto, Agus Krisno. 2002. Gizi dan Kesehatan. Malang: UM PRESS.

Duryatmo S. 2005. Wajah Ganda Sirih Merah. Trubus 434: 92-93.

Dyatmiko W, Santosa MH. 1998. Aktivitas Antiradikal Bebas Difenilpikrilhidrazil (DPPH) Sari Air Curcuma aeruginosa Roxb. Seminar Nasional Tumbuhan Obat XIV. Bogor.

Evelyn C. 2009. Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.

Fessenden. 1999. Kimia Organik. Jakarta: Erlangga.

Guyton AC dan Hall JE. 2005. Buku Teks Fisiologi Kedokteran Edisi ke-10. Adji Dharma et al, penerjemah. Jakrta: Kedokteran EGC. Terjemahan dari: Texbook of Medical Physiology, 10th Ed.

Hermiati, Rusli, Naomi YM, Mersi SS. 2013. Ekstrak daun sirih hijau dan merah sebagai antioksidan pada minyak kelapa. Jurnal Teknik Kimia USU. Vol 2: 37-43.

Jhonson GB. 2003. The Living Words 3rd Ed. Saintv Louis: The Mc Grow-Hill, Inc.

Judarwanto W. 2013. 10 Jenis Radikal Bebas Ancam Manusia. Kompas. http://health.kompas.com/read/2013/08/05/1340331/10.Jenis.Radikal.Bebas.Ancam.Manusia

Lenni S. 2006. Senyawa Terpenoid dan Steroid. Medan: FMIPA Universitas Sumatera Utara.

Marieb EN. 2004. Essentials of Human Anatomy and Physiology 2th Ed. California: Cummings Publishing Company.

Marieb, Elaine N dan Katja Hoehn. 2007. Human Anatomy And Phisyology seventh edition. San Fransisco, New York: Pearson Benjamin Cummings.

Marieb, Elaine N. 2005. Anatomy And Physiology Second Edition. San Fransisco

Markham. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung: ITB Press.

Molyneux P. 2004. The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity. J.Sci.Technology 26(2): 211-219.

Muchtadi, Deddy. 1989. Aspek Biokimia. Bogor: Institut Tehnologi Bandung (ITB).

Mursito B. 2002. Ramuan Tradisional untuk Penyakit Malaria. Jakarta: Penebar Swadaya.

Rahayu YS. 2007. Khasiat ekstrak ramuan daun jati belanda terhadap konsentrasi kolesterol hati tikus yang hiperlipidemia. [Skripsi]. Bogor: FMIPA IPB.

Safithri M, Fahma F. 2007. Potency of Piper crocatum Decoction as anantihiperglycemia in rat strain Sprague dawley. Hayati Journal of Biosciences Vol 15: 45-48.

Salim A. 2006. Potensi rebusan daun sirih merah (Piper crocatum) sebagai senyawa antihiperglikemia pada tikus galur sprague-dawley. [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Shier, David. 2004. Human Anatomy Physiology Tenth Edition. WI New York, San Fransisco St. Louis: Mc Graw Hill.

Sudewo B. 2005. Basmi Penyakit dengan Sirih Merah. Jakarta: PT Agromedia Pustaka.

Sulaksono, M Edhie. 2002. Penentuan Nilai Rujukan Parameter Faal Hewan Percobaan Sebagai Model Penyakit Manusia Dan Hewan. Jurnal Penelitian. Jakarta: Litbang Kesehatan. Diakses Tanggal 6 Mei 2009.

Sulihandari H. 2013. Herbal Sayur dan Buah Ajaib. Yogyakarta: Trans Idea Publishing.

Tintus, Libertus. 2008. Dosis Efektif Kombinasi Natrium Tiosulfat Dan Natrium Nitrit Sebagai Antidot Keracunan Sianida Akut Pada Mencit Jantan Galur Swiss. Skripsi. Yogyakarta: Universitas Sanatha Dharma. Diakses Tanggal 4 April 2009.

Yuningsih. 2008. Keracunan Nitrat-Nitrit Pada Hewan Serta Kejadiannya Di Indonesia. Jurnal Penelitian. Bogor: Balai Penelitian Veteriner. Diakses Tanggal 25 April 2009.

LAMPIRAN-LAMPIRAN

Lampiran 1. Biodata Ketua dan Anggota

Lampiran 2. Justifikasi Anggaran Kegiatan

Lampiran 3. Susunan Organisasi Tim Peneliti dan Pembagian Tugas

Lampiran 4. Surat Pernyataan Ketua Peneliti

Lampiran 5. Nota Kesepahaman MOU atau pernyataan kesediaan dari mitra (bila ada)