SERODIAGNOSIS ANTRAKS KUTANEUS MANUSIA DI INDIAMENGGUNAKAN FAKTOR ANTI-LETHAL INDIRECT IgG ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY

AbstrakAntraks, disebabkan oleh Bacillus anthracis merupakan penyakit zoonosis utama. Diagnosis dini antraks pada manusia sangat penting karena merupakan masalah kesehatan masyarakat di beberapa negara berkembang. Pada penelitian ini, peneliti menjelaskan kegunaan indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi anti-lethal factor (anti-LF) IgG pada sampel serum manusia. Panel 203 sampel serum manusia terdiri atas 50 sampel pasien dengan antraks kutaneus, 93 sampel kontrol sehat dari daerah India yang tidak endemik antraks, 44 sampel kontrol dari daerah yang endemik antraks, dan 16 pasien dengan penyakit bukan antraks dievaluasi dengan anti-LF ELISA. Rerata kombinasi titer anti-LF pada tiga kelompok kontrol adalah 0,136 ELISA unit (EU), dengan 95% interval kepercayaan (IK) 0,120 sampai 0,151 EU. Sensitivitas dan spesifisitas ELISA adalah 100% (IK 95%, 92,89-100%) dan 97,39% (IK 95%, 93,44-99,28%), dengan nilai cutoff 0,375 EU, berdasarkan analisis kurva receiver operating characteristic (ROC). Likelihood ratio 49,98. Nilai prediksi positif (NPP), nilai prediksi negatif (NPN), efisiensi, dan indeks Youden (J) untuk keakuratan pemeriksaan adalah 92,5%, 100%, 98,02%, dan 0,97 secara berturut-turut. Angka false-positive predictive (nilai prediksi positif palsu) dan false-negative predictive (nilai prediksi negatif palsu) pemeriksaan adalah 2,61% dan 0%. Pemeriksaan sangat berguna untuk diagnosis dini kasus antraks kutaneus, antibodi terhadap LF jauh lebih cepat muncul dibandingkan dengan antibodi terhadap toksin antraks pada serum sampel manusia.

Antraks merupakan penyakit yang berpotensi menyebabkan kematian, disebabkan oleh bakteri Gram positif, Bacillus anthracis yang membentuk spora, telah diketahui sejak lama. Herbivora termasuk ternak sapi, lembu, kambing, kuda, dan biri-biri sering terinfeksi kuman spora B. anthracis. Manusia terinfeksi antraks melalui kontak langsung dengan daging, rambut, kulit, dan wool yang terkontaminasi dengan spora B. anthracis dari binatang yang terinfeksi antraks. Infeksi antraks pada manusia muncul dengan tiga cara umum, dari kulit, traktus respiratorius atau gastrointestinal, menyebabkan tiga bentuk gejala utama yang berbeda di kulit, saluran pernafasan, dan gastrointestinal. Case-fatality rates dari antraks kutaneus, gastrointestinal, dan inhalasi yang tidak diobati bervariasi dari 1%-20%, 25%-60%, dan 86%-89%. Laporan kasus antraks terbanyak adalah kutaneus (95%), inhalasi 5%, sedangkan gastrointestinal antraks jarang dilaporkan. Antraks diketahui dapat muncul secara global, namun kebanyakan kasus tidak dilaporkan.Faktor virulensi utama B. anthracis ada dua yaitu toksin tripartite dan kapsul asam poly--D-glutamic, dibawa oleh dua plasmid berbeda yaitu pX01 dan pXO2. Kapsul terlibat pada proses fagositosis organisme. Eksotoksin antraks dibentuk dari kombinasi LF dan/atau edema factor (EF) dengan protective antigen (PA) untuk membentuk lethal toxin (LTx) atau edema toxin (ETx). Antigen protektif berikatan dengan reseptor sel dan memediasi masuknya LF dan zink metaloprotease kedalam sitosol yang memecah mitogen-activated protein kinase kinases (MAPKK), dan EF (merupakan adenylate cyclase yang mengubah ATP menjadi cyclic AMP (cAMP) dan meningkatkan kematian jaringan yang edema). Gabungan aktivitas toksin ini menghambat respons imun alamiah dan didapat, agar bakteri dapat bereplikasi dan tidak terdeteksi oleh pejamu.Perlindungan terhadap antraks diperantarai oleh respons antibodi antitoksin baik yang diinduksi secara aktif ataupun pasif. Penelitian pada hewan coba membuktikan bahwa respons imun terhadap PA adalah proteksi sentral terhadap infeksi B. anthracis. Anti-PA IgG yang ditemukan dalam serum manusia merupakan target indikator utama antraks, khususnya pada bentuk kutaneus. Penelitian vaksin binatang telah menunjukkan bahwa titer antibodi IgG LF lebih tinggi dari PA. Perjalanan penyakit antraks kutaneus, secara umum respons toksin antibodi spesifik langsung terhadap LF, dengan terdeteksinya IgG paling cepat empat hari setelah gejala muncul, berlawanan dengan respons EF-dan PA IgG spesifik yang lambat dan rendah. Oleh karena itu perkembangan anti-LF ELISA dapat menjadi diagnostik retrospektif yang baik atau sarana epidemiologi untuk investigasi kasus antraks kutaneus. Lebih lanjut, anti-LF ELISA harus dibedakan antara seseorang yang divaksin dengan yang secara alami terinfeksi antraks sama seperti PA yang merupakan komponen utama dari vaksin antraks.Kejadian antraks alami di negara industri rendah dan tidak menjadi masalah kesehatan utama bagi masyarakat umum di daerah berkembang. Antraks kutaneus menjadi masalah kesehatan umum di beberapa negara berkembang, dengan sumber utamanya adalah peternakan atau masyarakatnya hidup dekat hutan. India dengan populasi terbesar di dunia, memiliki beberapa daerah yang endemik antraks kutaneus. India masih kekurangan uji diagnostik spesifik untuk antraks kutaneus. Pemeriksaan diagnostik antraks kutaneus yang akurat sangat penting untuk waktu pengobatan yang tepat dan perkembangan strategi pencegahan penyebaran penyakit lebih lanjut.Pada penelitian ini, peneliti melaporkan perkembangan dan evaluasi ELISA tidak langsung untuk mendeteksi faktor anti-lethal (anti-LF) IgG pada sampel serum dari beberapa populasi di India.

MATERIAL DAN METODEPersiapan AntigenRekombinan lethal factor (rLF) B. anthracis diperoleh dari Alpha Diagnostic International Company, San Antonion, TX. Lethal factor dilarutkan dalam ultrapure water, dan 50-l alikuot disimpan pada suhu -80oC.

Sampel SerumTotal 203 sampel serum dikumpulkan dari kelompok populasi berbeda, menentukan latar belakang tingkat reaktivitas anti-LF ELISA pada populasi India. Sebanyak 93 sampel (kelompok I) dikumpulkan dari donor darah sehat dari bagian utara dan tengah India, mewakili daerah kota yang tidak endemikantraks. Serum lain sebanyak 44 sampel (kelompok II) terdiri dari donor darah sehat bagian India selatan yang merupakan daerah endemik antraks. Pemilihan pasien berdasarkan tidak adanya paparan dengan antraks atau berhubungan dengan infeksi atau vaksin. Donor termasuk sukarelawan dari kelompok berbagai umur. Sebanyak 16 serum (kelompok III) dikumpulkan dari pasien tanpa klinis terinfeksi antraks dari daerah endemis antraks. Pemilihan pasien pada kelompok ini berdasarkan penyakit selain antraks. Kelompok IV terdiri dari total 50 serum sampel pasien dengan diagnosis klinis antraks dari daerah endemis antraks. Kasus antraks kutaneus dikonfirmasi dengan gejala klinis, riwayat penyakit atau PCR swab lesi kutaneus pasien.

Prosedur ELISAPlat mikrotiter Maxisorp flat-bottom 96-well dilapisi dengan 100 l suspensi 2 g/ml rLF per well in coating buffer (0,06 M Na2CO3 dan 0,14 M NaHCO3 [pH 9,5] dan diinkubasi semalaman pada suhu 4oC. Plat yang dilapisi antigen dicuci tiga kali dengan wash buffer (phosphate-buffered saline [PBS] terdiri dari 0,1% Tween 20) menggunakan the ELx50 microplate washer. Well diblok dengan 300 l blocking buffer (3% susu skim dalam PBS [pH 7,4] ) selama 1 jam pada suhu 37oC. Blocking buffer dituangkan dan plat dikeringkan dengan kertas isap tanpa dicuci. Pemeriksaan positif dan negatif serum diencerkan 1:200 dalam PBS terdiri dari susu skim (pH 7,4). Seratus mikroliter serum yang telah diencerkan dimasukkan kedalam well, dan plat diinkubasi pada 37oC selama 45 menit. Kemudian plat dicuci tiga kali dengan wash buffer dan dikeringkan dengan kertas isap. Setiap plat well, ditambahkan 100 l horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-human IgG yang diencerkan 1:25.000 dalam PBS berisi 1% susu skim, untuk mendeteksi ikatan anti-LF-IgG. Plat diinkubasi kembali pada suhu 37OC selama 60 menit. Kemudian plat dicuci 3 kali dengan wash buffer, dan setiap well ditambahkan 100 l 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) dalam sodium asetat/bufer sitrat (pH 6,0) berisi hidrogen peroksida sebagai substrat untuk menghasilkan perubahan warna. Plat dibaca pada gelombang 630 nm menggunakan ELx808 microplate reader dengan Gen5 data analysis software setelah inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan. Semua serum diuji 2 kali tanpa inaktivasi pemanasan. Nilai rata-rata absorbansi (densitas optik pada 630 nm [OD630]) diterapkan pada ELISA units (EU).

Seleksi Nilai CutoffNilai EU (OD630) dari kelompok populasi berbeda diplot menggunakan computer graphics software untuk menentukan tingkat latar belakang dari kelompok serum kontrol yang berbeda, begitu juga dengan distribusi anti-LF EU. Nilai cutoff ELISA dihitung sebagai serum rerata OD630 dari kelompok berbeda, + 3 standar deviasi (SD). Tingkat keakuratan nilai cutoff 95% ditentukan menggunakan kurva receiver operating characteristic (ROC), dan hasil pemeriksaan dievaluasi berdasarkan area under the ROC curve (AUC).

Tabel 1 Perbandingan titer anti-LF IgG pada serum menggunakan unit ELISA dari kelompok berbeda Titer anti-LF IgG (EU) untuk

Parameter Kelompok I Kelompok II Kelompok III Populasi kontrol Kelompok IV Komulatif (n=153)

Minimum 0,012 0,022 0,082 0,012 0,400Nilai tengah 0,097 0,158 0,181 0,113 0,878Maksimum 0,35 0,683 0,257 0,683 1,746Rerata 0,107 0,184 0,169 0,136 0,938SD 0,067 0,130 0,055 0,096 0, 365SE 0,007 0,0197 0,014 0,008 0,05295% CI Rendah 0,093 0,145 0,140 0,120 0,834 Tinggi 0,121 0,121 0,198 0,151 1,041Cutoff (rerata + 3SD) 0,307 0,574 0,171 0,422

Kelompok I, kontrol sehat; kelompok II, kontrol dari daerah endemis; kelompok III, infeksi bukan antraks; kelompok IV, infeksi antraks secara klinis. Ketelitian Diagnostik ELISAVariabel pengukuran untuk penghitungan indeks pelaksanaan dari pemeriksaan adalah jumlah true positives (TP), true negatives (TN), false positives (FP), dan false negative (FN). Sensitivitas dan spesifisitas dihitung dengan [TP/(TP + FN)] X 100 dan [TN/(TN + FP)] X 100. Penghitungan PPV dan NPV dengan cara TP/(TP + FP) dan TN/(FN + TN). Sensitivitas dan spesifisitas digunakan untuk menghitung false-positive rate (FPR) sebagai 1-spesifisitas dan false-negative rate (FNR) sebagai 1-sensitivitas. Ketelitian atau efisiensi pemeriksaan dihitung dengan (TP + TN)/TP + TN + FP + FN. Reliabilitas menggunakan indeks Youden (J) dan dihitung dengan [sensitivitas + (spesifisitas-1)]. Kehadiran anti-LF IgG dalam serum FP dikonfirmasi lebih lanjut dengan Western blotting.

Analisis StatistikA one-way analysis of variance (ANOVA) dilakukan untuk menguji signifikansi perbedaan rerata titer anti-LF IgG pada kelompok berbeda. Uji Tukeys multiple comparisons dilakukan untuk menganalisis pairwise comparisons antara kelompok berbeda dengan menggunakan windows GraphPad versi 6.00, GraphPad Software, La Jollla, CA.

HASILReaktivitas Serum Manusia dari Kelompok Populasi yang Berbeda dengan B.anthracis LF. Nilai rerata EU anti-LF IgG pada kelompok populasi berbeda dapat dilihat pada tabel 1. Nilai rerata EU (secara keseluruhan interval kepercayaan (IK) 95%) pada kelompok serum I, II, III, dan IV adalah 0,107 (0,093-0,121 EU), 0,184 (0,145-0,224), 0,169 (0,140-0,198), dan 0,938 (0,834-1,041). Secara keseluruhan nilai rerata EU (dengan IK 95%) dari semua kelompok serum kontrol (n=153) adalah 0,136 (0,120-0,151). Cutoff EU diukur dalam kelompok populasi kontrol berbeda dengan rerata +3SD. Penghitungan nilai cutoff adalah 0,307 EU pada kelompok kontrol sehat (kelompok I), 0,574 EU pada populasi kontrol dari daerah endemis (kelompok II), dan 0,171 EU pada kelompok infeksi bukan antraks (kelompok III). Nilai cutoff untuk semua populasi kontrol 0,422 EU (rerata +3SD) dan 0,375 (dengan ROC). Scatter plot data EU dasar dari kelompok tersebut dijelaskan pada Gambar 1. Pemeriksaan Sensitivitas dan SpesifisitasSensitivitas dan spesifisitas pemeriksaan untuk menentukan berbagai nilai cutoff under the ROC curve. Gabungan terbaik dari sensitivitas dan spesifisitas diobservasi pada nilai cutoff 0,375 EU (dihitung dari komulatif populasi kontrol [n=153]. Pada cutoff ini, sensitifitas dan spesifisitas ELISA 100% (IK 95%, 92,89-100%) dan 97,39% (IK 95%, 93,44-99,28%). Indeks AUC pemeriksaan IgG dengan nilai cutoff 0,375 EU dengan analisis kurva ROC 0,996 (IK 95% 0,992-1,000; P 0,05) antara rerata nilai EU dari kelompok kontrol berbeda. Perbedaan signifikan (P < 0,0001, uji Tukeys) ditemukan antara rerata nilai EU dari kelompok populasi kontrol berbeda dan serum infeksi antraks (kelompok IV). Nilai cutoff EU ditetapkan dari area under the ROC curve (Tabel 2).

Tabel 2 Perbandingan Sensitivitas dan Spesifisitas dengan 95% CIs pada Beberapa Cutoff untuk Anti-LF ELISAa. % sensitivitas % spesifisitas Likelihood Cutoff (EU) (IK 95%) (IK 95%) ratio

>0,240 100 (92,89-100,0) 92,16 (86,70-95,88) 15,3>0,243 100 (92,89-100,0) 92,81 (87,50-96,36) 17>0,251 100 (92,89-100,0) 93,46 (88,31-96,82) 19,13>0,263 100 (92,89-100,0) 94,12 (89,13-97,28) 21,86>0,281 100 (92,89-100,0) 94,77 (89,96-97,72) 25,5>0,303 100 (92,89-100,0) 95,42 (90,80-98,14) 30,6>0,322 100 (92,89-100,0) 96,08 (91,66-98,55) 38,25 >0.341 100 (92,89-100,0) 96,73 (92,54-98,93) 37,49>0,375 100 (92,89-100,0) 97,39 (93,44-99,28) 49,98>0,421 98 (89,35-99,95) 97,39 (93,44-99,28) 48,96 >0,444 98 (89,35-99,95) 98,04 (94,38-99,59) 73,44>0,457 96 (86,29-99,51) 98,04 (94,38-99,59) 71,91

aCatat bahwa Kombinasi Terbaik dari Sensitivitas, Spesifisitas, dan Rasio Likelihood Terletak pada Cutoff 0,375 EU.

Kombinasi terbaik dari sensitivitas dan spesifisitas sebaik rasio likelihood didapat pada Cutoff 0,375 EU. Sensitivitas dan spesifisitas ELISA adalah 100% dan 97,39%, dengan 95% IKs untuk kedua sensitivitas dan spesifisitas dan rasio likelihood 49,98. Hanya empat sampel serum positif palsu dari daerah endemis. Nilai NPP, NPN, efisiensi, dan J indeks dari pemeriksaan adalah 92,5%, 100%, 98,02%, dan 0,97. Angka FPP dan FNP dari pemeriksaan adalah 2,61% dan 0%. Oleh karena itu adanya anti-LF ELISA dapat membantu sebagai pemeriksaan serologi terbaik untuk diagnosis infeksi antraks pada sampel serum manusia. Penelitian ini menghadirkan pemeriksaan optimum pertama dari India yang dapat mendeteksi antibodi anti-LF antraks kutaneus. Pemeriksaan ini dapat menjadi sangat berguna alat deteksi cepat.

Gambar 2 Distribusi Frekuensi Titer Anti-LF IgG ELISA (EU) Serum dari Kelompok Populasi Berbeda Diencerkan 1:200. (A) Serum Kontrol Sehat (Kelompok I); (B) Serum Kontrol Pasien dari Daerah Endemis (Kelompok II); (C) Serum Pasien Bukan Antraks (Kelompok III); (D) Serum Pasien Terinfeksi Antraks (Kelompok IV). Garis Putus-putus Vertikal Melambangkan Nilai Cutoff 0,375 untuk Anti-LF ELISA. 8