seleksi dan karakterisasi enzim protease …digilib.unila.ac.id/27882/3/skripsi tanpa bab...
TRANSCRIPT
ii
SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAMLAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.)
(Skripsi)
Oleh
Hafiz Auzar
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2017
iii
ABSTRAK
SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAMLAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.)
Oleh
Hafiz Auzar
Bekasam merupakan produk fermentasi dengan bahan dasar berupa ikan.Pembuatan bekasam umumnya masih memanfaatkan fermentasi spontan tanpaadanya penambahan starter bakteri. Proses fermentasi bekasam dilakukan olehbakteri asam laktat (BAL) dengan lama fermentasi selama 3-7 hari. Selama prosesfermentasi bekasam, BAL menghasilkan berbagai jenis enzim untukmendegradasi substratnya, salah satunya enzim protease. Penelitian ini bertujuanuntuk mendapatkan isolat BAL dari bekasam ikan patin yang memilikikemampuan proteolitik dan mengetahui kemampuan proteolitik BAL berdasarkanaktivitas protease secara kualitatif dan kuantitatif serta karakterisirik enzim yangdihasilkan. Data dianalisis secara deskriptif dengan menampilkan data dalambentuk tabel dan gambar. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukan 8 isolatBAL proteolitik dari bekasam ikan patin, yaitu BP1, BP2, BP3. BP4, BP5, BP6,BP7 dan BP8. Keenam isolat, yaitu BP2, BP4, BP5, BP6, BP7 dan BP8dilakukan uji indeks proteolitik. Hasil uji menunjukkan bahwa isolat BP7memiliki nilai IP tertinggi sebesar 4,80. Hasil uji kualitiatif menunjukkan bahwaenzim protease dari isolat BP2 memiliki pH optimum 8 dan suhu optimum 40 oCsebesar 0,57 U/ml. Aktivitas enzim protease meningkat dengan penambahanlogam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (5 mM), sedangkan penambahan logam Fe3+, Mg2+
dan Mn2+ (1 mM), Ca2+, Cu2+ dan EDTA ( 1 mM dan 5 mM) menurunkanaktivitas enzim protese.
Kata kunci : Bekasam, BAL, Proteolitik, Uji Kualitatif, Uji Kuantitatif
iv
SELEKSI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAMLAKTAT (BAL) DARI BEKASAM IKAN PATIN (Pangasius sp.)
Oleh
Hafiz Auzar
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai GelarSARJANA SAINS
Pada
Jurusan BiologiFakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG2017
vii
RIWAYAT HIDUP
Penulis lahir pada tanggal 8 Oktober 1994 di sebuah desa kecil yang bernama
sungai batang, tepatnya disekitaran danau Maninjau. Penulis merupakan anak
keenam dari enam bersaudara oleh pasangan Bapak Auzar dan Ibu Iryana.
Penulis mengawali pendidikan di Taman Kanak-kanak (TK) Tunas Harapan,
Maninjau. Penulis melanjutkan pendidikan Sekolah Dasar di SDN 11 Duo Sidang
pada tahun 2000, Sekolah Menengah Pertama di SMPN 15 Padang pada tahun
2006, dan Sekolah Menengah Atas di SMAN 8 Padang pada tahun 2009. Pada
tahun 2013 penulis terdaftar sebagai mahasiswa di Program Studi Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung melalui
Seleksi Bersama Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SBMPTN).
Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten dosen dalam
Praktikum Mikrobiologi Umum dan Mikrobiologi Lingkungan. Selain itu penulis
juga aktif dalam organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMBIO) sebagai
anggota Bidang SAINTEK.
Penulis Melaksanakan Kuliah Kerja Nyata (KKN) di Desa Bujung Buring,
Kecamatan Tanjung Raya, Kabupaten Mesuji pada bulan Januari-Maret 2016 dan
melaksanakan Kerja Praktik di Balai Uji Standar Karantina Ikan Pengendalian
viii
Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Jakarta Timur pada bulan Juli-
Agustus 2016 dengan judul “Identifikasi Bakteri Hama Penyakit Ikan (HPI)
Pada Ikan Lele Dumbo (Clarias gariepinus) di Balai Uji Standar Karantina
Ikan, Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM)
Jakarta Timur”
ix
PERSEMBAHAN
Dengan mengucapkan rasa syukur kepada Allah SWTyang telah memberikan rahmat dan nikmat ksehatan,
kekuatan dan kesempatan dalam penyelesaian penulisanskripsi ini.
Kupersembahkan karya sederhana ini untuk :
Ayah dan ibu yang senantiasa menjagaku melaui setiapdoa disujudnya, menjadi penyemangat dan alasan
terbesar kesuksesan hidupku serta sumber dari segalakasih sayang.
Kakak, ni Rini, Nina, Abang dan Uda serta seluruhkeluargaku tersayang yang senantiasa mendukung dan
memberikan semangat.
Bapak dan ibu dosen utamanya pembimbingku yang takpernah lelah dan selalu sabar dalam membimbing dan
memberikan ilmu.
Teman-temankuAtas pengalaman, dukungan, dan bantuannya selama
masa studi
Serta Almamaterku tercintaUniversitas Lampung
x
Motto
Merantaulah...
Orang berilmu dan beradab tidak diam beristirahat di kampung halaman.Tinggalkan negerimu dan hidup asing di negeri orang. Kau akan dapatkanpengganti dari orang-orang yang engkau tinggalkan (kerabat dan kawan).
Berlelah-lelahlah, manisnya hidup terasa setelah lelah berjuang.
Aku melihat air menjadi rusak karena diam tertahan.Jika mengalir menjadi jernih, jika tidak, akan keruh menggenang. Singa jika
tak tinggalkan sarang, tak akan dapat mangsa.Anak panah jika tak tinggalkan busur, tak akan kena sasaran.
Jika matahari di orbitnya tak bergerak dan terus berdiam,tentu manusia bosan padanya dan enggan memandang. Biji emas tak ada
bedanya dengan tanah biasa di tempatnya (sebelum ditambang).Kayu gaharu tak ubahnya seperti kayu biasa jika di dalam hutan.
Jika gaharu itu keluar dari hutan, ia menjadi parfum yang tinggi nilainya.Jika biji memisahkan diri dari tanah, barulah ia dihargai sebagai emas
murni.
Merantaulah…
Orang berilmu dan beradab tidak diam beristirahat di kampung halaman.Tinggalkan negerimu dan hidup asing di negeri orang (Al-Imam Asy-
Syafi’i).
xi
SANWACANA
Dengan mengucap Alhamdulillah, puji syukur penulis ucapakan kepada Allah
SWT yang telah memberikan rahmat dan nikmatNya sehingga penulis dapat
menyelesaikan skripsi yang berjudul “SELEKSI DAN KARAKTERISASI
ENZIM PROTEASE BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) DARI BEKASAM
IKAN PATIN (Pangasius sp.)”. Penelitian ini merupakan bagian dari proyek
penelitian mandiri bapak Dr. Sumardi, M.Si. Dalam menyelesaikan skripsi ini,
penulis menyadari bahwa banyak sekali bantuan yang penulis dapatkan dari
berbagai pihak. Dengan terselesaikannya skripsi ini, penulis ingin menyampaikan
rasa terimakasih kepada :
1. Ibu dan Ayah tercinta yang telah menjaga, mendidik, menyayangi,
menasehati serta senantiasa mendoakan penulis.
2. Kakak, Ni Rini, Nina, Abang dan Uda yang selalu memberikan dukungan dan
semangat dalam perkuliahan.
3. Bapak Dr. Sumardi, M.Si., selaku pembimbing I yang telah memberikan
bimbingan dan arahan dalam melakukan penelitian hingga menyelasaikan
skripsi ini.
4. Ibu Dra. C.N. Ekowati, M.Si selaku pembimbing II yang telah memberi
nasehat, saran, dan bimbingan selama penyelesaian skripsi ini.
xii
5. Bapak Ir. Salman Farisi, M.Si.,selaku pembahas yang telah banyak
memberikan kritik dan koreksi pada penulis skripsi ini.
6. Bapak Drs. Hendri Busman, M.Biomed selaku pembimbing akademik yang
telah memberikan arahan dalam perkuliahan
7. Ibu Dra. Nuning Nurcahyani, M.Sc., selaku Ketua Jurusan Biologi FMIPA
Universitas Lampung.
8. Bapak Prof. Warsito, S.Si., D.E.A., Ph.D sekalu Dekan FMIPA Universitas
Lampung.
9. Bapak ibu Dosen jurusan Biologi FMIPA Universitas Lampung, karyawan
dan staff serta laboran di Jurusan Biologi.
10. Teman-teman terdekatku selama perkuliahan Purwo Kuncoro, Nur Rohman,
Muhammad Pazry, Rio Riski Ananda, , Hendra Verry Setiawan, Rizani
Oktanisyah P, Nadia Eka Yulian, Nuraeni Prija Agustin, Iffa Affiqa dan
Silvia Andriani.
11. Teman terbaikku Artika Bunga Maharani, terima kasih.
12. Teman-teman seperjuangan Biologi angkatan 2013 dan Microholic ’13 atas
kebersamaanya selama di lab Mikrobiologi
13. Almamater tercinta Universitas Lampung.
Bandar Lampung, 8 Agustus 2017
Penulis
Hafiz Auzar
xiii
DAFTAR ISI
Halaman
ABSTRAK .................................................................................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... v
RIWAYAT HIDUP ..................................................................................... vi
SANWACANA ............................................................................................ xi
DAFTAR ISI .............................................................................................. xiii
DAFTAR TABEL ..................................................................................... xvi
DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xvii
I. PENDAHULUAN ............................................................................... 1
A. Latar Belakang ............................................................................... 1
B. Tujuan Penelitian ........................................................................... 3
C. Manfaat Penelitian ......................................................................... 4
D. Kerangka Pikir ............................................................................... 4
E. Hipotesis ........................................................................................ 6
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Deskripsi Ikan Patin (Pangasius sp.) ............................................. 7
1. Habitat Ikan Patin ..................................................................... 7
2. Morfologi Ikan Patin ................................................................. 7
3. Klasifikasi Ikan Patin ................................................................ 8
4. Kandungan Gizi Ikan Patin ....................................................... 9
B. Bekasam ........................................................................................ 9
1. Pengertian Bekasam .................................................................. 9
2. Pembuatan Bekasam .............................................................. 10
3. Kandungan Bekasam .............................................................. 11
4. Bahan Pembuatan Bekasam .................................................... 11
xiv
C. Bakteri Asam Laktat (BAL) ........................................................ 12
1. Karakteristik BAL ................................................................... 12
2. Jenis BAL ............................................................................... 13
3. Peranan BAL ........................................................................... 13
4. Hasil Fermentasi BAL ............................................................ 14
D. Enzim Protease ............................................................................ 14
1. Pengertian Enzim Protease ..................................................... 14
2. Pemanfaatan Enzim Protease .................................................. 15
3. Jenis Enzim Protease .............................................................. 16
E. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim .................. 17
1. Suhu ........................................................................................ 17
2. pH ............................................................................................ 18
3. Aktivator dan Inhibitor ........................................................... 19
III. METODE KERJA
A. Waktu dan Tempat .................................................................... 20
B. Alat dan Bahan .......................................................................... 20
C. Metode Penelitian ...................................................................... 21
D. Analisis Data ............................................................................. 21
E. Cara Kerja ................................................................................. 22
1. Pembuatan Bekasam .......................................................... 22
2. Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik ................................... 22
3. Pemurnian Isolat BAL Proteolitik ...................................... 23
4. Karakteristik BAL Proteolitik ............................................ 23
5. Peremajaan Isolat BAl Proteolitik ...................................... 23
6. Penentuan Indeks Proteolitik.............................................. 24
7. Karakterisasi Terbatas Aktivitas Enzim Protease .............. 25
7.1 Pembuatan Starter Isolat BAL .................................... 25
7.2 Produksi Enzim Protease ............................................ 25
7.3 Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim Protease .... 26
7.4 Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease . 27
7.5 Penentuan Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas
Enzim Protease ............................................................ 27
F. Diagram Alir ............................................................................. 29
xv
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Penelitian ........................................................................ 30
1. Isolat BAL Proteolitik dari Bekasam Ikan Patin ................ 30
2. Daya Hidup dan Indeks Proteolitik BAL ........................... 32
3. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Protease ............. 33
4. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Protease .......... 34
5. Pengaruh Ion-ion Logam.................................................... 35
B. Pembahasan ............................................................................... 36
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan.................................................................................... 47
B. Saran .......................................................................................... 47
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 48
LAMPIRAN ................................................................................................ 54
A. Isolasi dan Karakterisasi BAL Proteolitik Bekasam Ikan Patin 55
B. Hasil Uji Aktivitas Enzim protease Secara Kualitatif ............... 58
C. Karakterisasi Enzim Protease (pH, suhu dan ion-ion logam) ... 58
D. Pembuatan Pereaksi Enzim Protease......................................... 60
E. Pembuatan Inhibitor EDTA dan Ion-ion Logam....................... 61
F. Bekasam Ikan Patin, Isolasi dan Karakterisasi BAL................. 62
G. Uji Kuantitatif Aktivitas Enzim Protease .................................. 66
xvi
DAFTAR TABEL
HalamanTabel 1. Golongan Enzim Protease ............................................................. 16
Tabel 2. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease................................ 28
Tabel 3. Hasil Karakterisasi BAL Proteolitik ............................................. 31
Tabel 4. Daya Hidup dan Indeks Proteolitik BAL ...................................... 32
Tabel 5. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 Fermentasi .................... 55
Tabel 6. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi .................... 55
Tabel 7. Hasil Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi .................... 55
Tabel 8. Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 fermentasi .................... 56
Tabel 9. Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi ................... 56
Tabel 10.Karakterisasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi ................... 56
Tabel 11.BAL Proteolitik Bekasam Ikan Patin............................................ 57
Tabel 12.Hasil Uji Indeks Proteolitik........................................................... 58
Tabel 13. Hasil Uji Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Protease......... 58
Tabel 14. Hasil Uji Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Protease ..... 58
Tabel 15. Hasil Uji Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas Enzim
Protease (1 mM) .......................................................................... 59
Tabel 16. Hasil Uji Pengaruh Ion-ion Logam terhadap Aktivitas Enzim
Protease (5 mM) .......................................................................... 59
xvii
DAFTAR GAMBAR
HalamanGambar 1. Morfologi Ikan Patin .................................................................... 8
Gambar 2. Hubungan Aktivitas Enzim dengan Suhu .................................. 17
Gambar 3. Hubungan Kecepatan Reaksi dengan pH ................................... 18
Gambar 4. Penentuan Indeks Proteolitik BAL............................................. 24
Gambar 5. Diagram Alir Penelitian ............................................................. 29
Gambar 6. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Protease .................... 33
Gambar 7. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas Enzim Protease.................. 34
Gambar 8. Pengaruh Ion-ion Logam Terhadap Aktivitas Enzim Protease . 35
Gambar 9. Bekasam Ikan Patin Hari Ke 3, 5 dan 7 Fermentasi................... 62
Gambar 10. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 3 Fermentasi ........................ 62
Gambar 11. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 5 Fermentasi ......................... 63
Gambar 12. Isolasi BAL Proteolitik Hari Ke 7 Fermentasi ......................... 63
Gambar 13. Pewarnaan Gram Isolat BP2 ................................................... 64
Gambar 14. Pewarnaan Spora Isolat BP2 ................................................... 64
Gambar 15. Uji Katalase Isolat BP2 ............................................................ 65
Gambar 16. Uji Motilitas Isolat BP2 .......................................................... .65
Gambar 17. Uji Indeks Proteolitik Isolat BP2 ............................................ 66
Gambar 18. Uji Aktivitas Enzim Protease Isolat BP2 ................................ 66
1
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Fermentasi merupakan salah satu cara untuk mengawetkan makanan.
Makanan yang difermentasi memiliki banyak kelebihan, yaitu lebih tahan
lama, mudah untuk dicerna, mengandung mikronutrisi seperti vitamin dan
kofaktor, menghasilkan probiotik dan prebiotik (Tanasupawat dan
Visessanguan, 2008). Salah satu contoh makanan fermentasi adalah
bekasam. Menurut Desniar (2012), bekasam merupakan produk fermentasi
dengan bahan dasar berupa ikan.
Pembuatan bekasam umumnya masih memanfaatkan fermentasi spontan
tanpa adanya penambahan starter bakteri. Ikan yang digunakan untuk
membuat bekasam umumnya adalah ikan air tawar dengan penambahan
garam dan nasi. Garam berfungsi untuk menghambat pertumbuhan bakteri
yang intoleran garam sedangkan nasi sebagai sumber karbohidrat. Proses
fermentasi pada bekasam dilakukan oleh bakteri asam laktat (BAL)
dengan lama fermentasi selama 3-7 hari. Beberapa penelitian yang telah
dilakukan menunjukkan BAL dari bekasam merupakan bakteri yang
memiliki bentuk batang atau bulat, tidak menghasilkan spora, bersifat
Gram positif, tidak motil dan katalase negatif (Desniar, 2012).
2
Selama proses fermentasi bekasam, BAL menghasilkan berbagai jenis
enzim untuk mendegradasi substratnya, salah satunya enzim protease.
Keberadan enzim selama proses fermentasi bekasam akan mengubah rasa,
tekstur, aroma dan akan meningkatkan nilai gizi (Suri, 2013). Menurut
Kwok dan De Vos (1994), beberapa strain BAL mempunyai kemampuan
proteolitik sehingga memungkinkan bakteri ini tumbuh pada substrat yang
kaya protein. Kemampuan proteolitik BAL diperoleh karena bakteri ini
dapat menghasilkan enzim protease. Protease merupakan enzim yang
berperan untuk menghirolisis ikatan peptida pada protein sehingga
dihasilkan senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti paptida kecil
dan asam amino.
Hasil isolasi yang dilakukan oleh Vichaslip (2008) dari makanan
fermentasi sejenis bekasam yang berasal dari Thailand, yaitu pla-ra
ditemukan beberapa jenis BAL yang memliliki aktivitas proteolitik, yaitu
Pediococcus, Lactobacillus spp., L. plantarum dan L. brevis. Kemampuan
proteolitik BAL berbeda-beda tergantung dari level genus dan strain pada
spesies yang sama. Pada bekasam ikan bandeng ditemukan BAL yang
memiliki kemampuan proteolitik sebesar 62,26 % (33 dari 53 isolat BAL),
ikan tuna 43,63 % (24 dar 55 isolat BAL) dan pada bekasam ikan nila
ditemukan BAL dengan kemampuan proteolitik sebesar 64,2% (27 dari 42
isolat BAL) (Wikandari et.al, 2012).
3
Perbedaan jenis ikan dalam pembuatan bekasam dapat menyebabkan
perbedaan jenis BAL yang berperan dalam fermentasi bekasam sehingga
kemampuan proteolitiknya juga berbeda. Hal ini disebabkan kandungan
protein pada setiap jenis ikan berbeda. Penelitian yang dilakuakan
Widowati et.al (2011) pada fermentasi bekasam ikan patin menganalisis
kadar air, pH, total asam, total bakteri dan total bakteri penghasil asam.
Sejauh ini informasi tentang BAL yang memiliki kemampuan proteolitik
dalam fermentasi bekasam ikan patin belum jelas. Oleh karena itu, perlu
dilakukan penelitian ini untuk mendapatkan BAL dari bekasam ikan patin
yang memiliki kemampuan proteolitik berdasarkan nilai indeks proteolitik
dan aktivitas enzim protease yang meliputi pengaruh pH, suhu dan ion-ion
logam.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan isolat BAL dari bekasam ikan Patin yang memiliki
kemampuan proteolitik.
2. Mengetahui kemampuan proteolitik BAL berdasarkan nilai indeks
proteolitik.
3. Mengetahui karakter aktivitas enzim protease BAL dari bekasam ikan
patin yang meliputi pH optimum, suhu optimum dan pengaruh ion-ion
logam.
4
C. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah
mengenai isolat BAL dari bekasam ikan Patin yang memiliki kemapuan
proteolitik sehingga dapat digunakan sebagai bahan kajian untuk
memproduksi enzim protease.
D. Kerangka Pikir
Bekasam merupakan makanan fermentasi dengan bahan dasar berupa ikan.
Umumnya pembuatan bekasam berlangsung secara spontan tanpa adanya
penambahan starter bakteri. Munculnya BAL pada bekasam disebabkan
adanya proses penggaraman. Garam memiliki tekanan osmotik yang tinggi
sehingga dapat menghambat pertumbuhan bakteri yang intoleran garam.
Bakteri yang toleran garam akan tumbuh dan menghasilkan asam selama
proses fermentasi. Bakteri yang toleran pada garam diantaranya adalah
BAL. Bakteri ini juga tahan terhadap lingkungan asam.
BAL mampu menghasilkan berbgai jenis enzim salah satunya adalah
enzim protease. Menurut Elfahri (2012), aktivitas tertinggi enzim protease
BAL adalah pada jam ke 12 pada suhu 37 oC. Penelitian yang dilakukan
oleh Putranto (2006) salah satu jenis BAL, yaitu Lactobacillus plantarum
memiliki aktivitas enzim protease tertinggi pada jam ke-18 sebesar 0,752
U/ml.
5
Hasil penelitian Desniar (2012), menunjukkan bahwa aktivitas protease
tertinggi L. palntarum terjadi pada jam ke-16. Perbedaan lamanya waktu
aktivitas enzim protease diduga karena adanya perbedaan perlakuan saat
inkubasi.
Jenis ikan yang digunakan dalam fermetasi bekasam menyebabkan BAL
yang dihasilkan memiliki kemampuan proteolitik yang berbeda. Hal ini
disebabkan perbedaan kandungan protein pada setiap jenis ikan. Selain itu
jenis BAL juga menentukan kemapuan proteolitiknya. Menurut
Saravanakumar (2010), aktivitas enzim protease dipengaruhi beberapa
parameter, yaitu sumber karbon, sumber nitrogen, pH, suhu, konsentrasi
substrat dan waktu inkubasi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh
Kurniati (2015), menunjukkan bahwa aktivitas proteolitik tertinggi BAL
dari jenis L. plantarum terjadi pada konsentrasi glukosa 6%, pepton 6%,
pH 6 dan pada jam ke- 12 inkubasi.
Menurut penelitian Vishalsip (2008), pada makanan fermentasi sejenis
bekasam, yaitu plara dengan bahan dasar ikan kembung ditemukan BAL
dari genus Lactobacillus yang memiliki nilai indeks proteolitik sebesar
2.71 sedangkan Pediococcus memiliki indeks proteolitik sebesar 1.66.
6
Pada bekasam ikan bandeng ditemukan 33 isolat BAL proteolitik
sedangkan pada bekasam ikan nila ditemukan 27 isolat BAL proteolitik.
Hal ini diduga karena ikan bandeng memiliki kandungan protein lebih
besar, yaitu ±20% sedangkan ikan nila memiliki kandungan protein ±17
%. Ikan patin merupakan salah satu jenis ikan yang memiliki kandungan
protein cukup tinggi, yaitu 16-20%. Ini menunjukkan bahwa BAL yang
memiliki kemampuan proteolitik dapat ditemukan pada bekasam ikan
patin.
E. Hipotesis
Hipotesis yang diajukan dalam penelitian ini adalah
1. BAL dari bekasam ikan patin mampu menghasilkan enzim protease.
2. BAL dari bekasam ikan patin memiliki nilai indeks proteolitik yang
berbeda-beda.
3. Aktivitas enzim protease BAL dari bekasam ikan patin dipengaruhi
oleh pH, suhu dan ion-ion logam.
20
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2017 sampai dengan bulan
April 2017 di Laborartorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini, yaitu oven, inkubator, shaker
incubator, laminar air flow cabinet, autoclave, hot palte magnetic stirrrer,
centrifuge, spektrofotometer, mikroskop, water bath, cawan petri, tabung
reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, mikropipet, mikrotip, botol aquadest,
kuvet, vortex mixer, alumunium foil dan jarum ose.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu bekasam ikan
Patin (Pangasius sp.), Skim Milk Agar (SMA), MRSA, MRS Broth,
Trichloroacetic Acis (TCA), Na2CO3, folin ciocalteau, buffer fosfat,
alkohol 70%, aquadest, garam fisiologis, ion logam MgSO4, MnSO4,
CaCl2, FeCl3, CuSO4, inhibitor EDTA dan kasein hammerstein.
7
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Deskripsi Ikan Patin
1. Ikan patin (Pangasius sp.) berasal dari sungai Mekong di Vietnam
sampai sungai Chao Praya di Thailand. Keberadaan ikan patin di
Indonesia merupakan hasil introduksi pada tahun 1975 di Bogor. Ikan
patin merupakan ikan air tawar yang tergolong catfish, yaitu ikan yang
memiliki kumis atau antenna. Ikan patin biasanya hidup di sungai
terutama di liang-liang tepi sungai dan merupakan hewan yang aktif
pada malam hari atau nocturnal. Kepala ikan patin berbentuk relatif
kecil dengan dua pasang antenna pada sudut mulutnya. Antenna pada
ikan patin berfungsi untuk petunjuk arah atau radar saat berenang serta
sebagai alat peraba. Tubuh ikan patin berbentuk memanjang dengan
warna putih perak dan kebiru-biruan pada bagian punggung serta tidak
memiliki sisik. Ikan patin dewasa dapat mencapai ukuran panjang 120
cm (Khairuman, 2002).
2. Ikan patin memiliki sirip pada bagian punggung berbentuk jari-jari
lunak sebanyak 6-7 buah. Pada bagian perut terdapat sirip yang terdiri
dari 6 jari-jari lunak dan memiliki sirip anal yang tersusun dari 30-33
jari-jari lunak.
8
3. Selain itu ikan patin juga memliki sirip pada bagian dada sebanyak 12-
13 jari-jari lunak dan satu jari-jari keras sebagai patil (Khairuman,
2002)
Berikut ini adalah gambar morfologi ikan Patin (Pangasius sp.)
Gambar 1. Morfologi ikan Patin (Zarkasih, 2014).
Menurut Hernowo (2001), klasifikasi ikan Patin adalah sebagai berikut :
Kerajaan : Animalia
Filum : Chordata
Kelas : Pisces
Bangsa : Ostoriophisi
Suku : Schilbeidae
Marga : Pangasius
Jenis : Pangasius sp.
9
4. Ikan Patin merupkan salah satu ikan yang memiliki kandungan protein
cukup tinggi, yaitu 16%-20%. Selain itu ikan Patin juga memiliki
kandungan air sebesar 56,79%, abu 2,5%-4,5%, lemak 5,85%,
karbohidrat 0,5%-1,5%, vitamin A 50.000 IU/g, vitamin D 20-200.000
IU/g, asam amino esensial 10%, asam amino non esensial 10% dan
kolesterol 70 mg/g (Muhamad dan Mohamad, 2012). Ikan Patin dapat
hidup pada kisaran pH antar 5-9, kandungan oksigen (O2) terlarut 3-6
ppm dan (CO2) 9-20 ppm. Ikan Patin hidup pada suhu optimum 28-30
oC (Khairuman dan Dodi, 2000).
B. Bekasam
1. Bekasam merupakan makanan fermentasi yang berasal dari ikan.
Bekasam banyak ditemukan di daerah Sumatera, Jawa Tengah dan
Kalimantan dengan nama yang berbeda-beda. Bekasam merupakan
salah satu cara pengawetan ikan yang memanfaatkan nasi sebagai
sumber karbohidrat dan garam dengan proses fermentasi selama
beberapa hari. Fermentasi pada bekasam akan mengubah 95% glukosa
menjadi asam laktat (Hidayati, 2102). Ikan yang sering digunakan
untuk membuat bekasam adalah jenis ikan air tawar. Pembuatan
bekasam di daerah Kalimantan Selatan menggunakan jenis ikan air
tawar, seperti ikan sepat siam, gabus, sepat rawa dan betok. Selama
proses fermentasi ditambhakan garam sekitar 15-20% dan
ditambahkan samu atau beras ginseng sebanyak 15%. Bekasam
difermentasi selama lebih kurang satu minggu (Adawyah, 2007).
10
Bekasam juga ditemukan di berbagai negara lainnya dengan nama
yang berbeda. Burong isda, Bangus merupakan nama bekasam di
Philipina, heshiko dan nakazuke (Jepang) dan pla-ra, pla-chom, som-
fak (Thailand). Ikan hasil fermentasi bekasam akan memiliki aroma
yang khas, rasa asin, asam dan tekstur ikan lebih kenyal (Wikandari,
2012).
2. Menurut Irianto (2008), pembuatan bekasam diawali dengan
pemotongan dan pembersihan isi perut ikan, penggaraman dan
penambahan sumber karbohidrat. Ikan segar dipotong kemudian
dibersihkan sisiknya, insang dan isi perutnya. Ikan yang telah bersih
selanjutnya dicuci dengan air bersih. Setelah dicuci bersih ikan
direndam dalam larutan air garam 16-20% dari bobot segar ikan
selama 24-48 jam. Perendaman dengan larutan garam berfungsi untuk
mencegah terjadinya pembusukan sehingga tidak boleh ada kontak
langsung antara ikan dengan udara luar dan larutan garam harus
merendam secara sempurna. Ikan yang telah digarami kemudian dicuci
dengan air bersih lalu ditiriskan. Setelah larutan garam ditiriskan
selanjutnya ditambahkan sumber karbohidrat beupa campuran nasi dan
tape ketan masing-masing 50% dan 25% berat ikan segar. Ikan
kemudian dimasukkan ke dalam wadah yang tertutup rapat. Proses
fermentasi biasanya dilakukan selama satu minngu atau lebih
tergantung citarasa bekasam yang diinginkan.
11
3. Selama proses fermentasi bekasam dari hari ke 1 sampai 11 terjadi
peningkatan kadar air dan total asam sebalikanya terjadi penurunan
kadar protein, nilai pH, kadar abu, kadar lemak dan total volatile base
(TVB). Pada hari ketujuh fermentasi penurunan kadar abu dan
pningkatan kadar air dianggap konstan karena tidak terlihat perubahan
yang signifikan. Sebaliknya kadar protein menurun dari 10,2%
menjadi 7,8%, pH menurun dari 5,22 menjadi 3,68, kadar lemak
menurun dari 4,2% menjadi 0,7%, pati menurun dari 6,12% menjadi
3,23%, TVB meningkat dari 0,12% menjadi 0,15% dan total asam
meningkat dari 0,2% menjadi 0,55% (Yahya, 1997).
4. Garam merupakan salah satu bahan yang ditambahkan dalam proses
fermentasi bekasam. Menurut Purwaningsih (2011), penambahan
garam berfungsi untuk pemberi cita rasa bekasam dan juga berperan
dalam seleksi mikroba golongan lipolitik dan proteolitk. Selama proses
fermentasi protein akan dipecah oleh enzim proteolitik yang dihasilkan
BAL menjadi molekul-molekul yang lebih sederhana (Thariq, 2014).
Selama proses fermentasi bekasam garam akan menyebabkan kadar air
berkurang sehingga menghambat pertumbuhan bakteri tertentu. Garam
akan menyebabkan kondisi fermentasi lebih terkontrol sehingga hanya
mikroorganisme halofilik yang mampu menghasilkan enzim
proteolitik yang dapat bertahan hidup. Enzim proteolitik akan
memecah protein menjadi asam amino khususnya asam glutamat yang
12
berperan dalam pembentukan rasa gurih pada makanan (Estiasih,
2009).
Karbohidrat merupakan sumber energi utama dalam fermentasi
bekasam. Karbohidrat akan dipecah menjadi molekul sederhana seperti
glukosa oleh enzim amilase. Selanjutnya glukosa dipecah menjadi
senyawa-senyawa lain tergantung jenis fermentasi. (Sastra, 2008).
Menurut Setiadi (2001), penambahan sumber karbohidrat pada
fermentasi bekasam dilakukan karena dapat dimanfaatkan sebagai
sumber energi bagi pertumbuhan bakteri terutama BAL. BAL akan
mengubah karbohidrat menjadi asam laktat sehingga terjadi penurunan
pH dan menciptakan suasana asam yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba yang tidak tahan pH rendah.
C. Bakteri Asam Laktat (BAL)
1. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan golongan bakteri yang dapat
menghasilkan asam laktat sebabgai produk akhir fermentasi. BAL
memiliki cici-ciri, yaitu berbentuk batang atau kokus, tidak motil, tidak
dapat menghasilkan spora, katalase negatif, gram positif, tahan
terhadap kondisi asam dan bersifat anarob fakultatif (Hutkins, 2006).
BAL umumnya bersifat mesofilik namun ada beberapa jenis yang
dapat tumbuh pada suhu 4 oC. BAL memiliki pH pertumbuhan 4,0-4,5
namun beberapa galur tahan pada pH 3,2 dan pH di atas 9,0
(Bamforth, 2005).
13
2. Menurut Salminen (2004) terdapat beberapa jenis BAL, yaitu :
1. Lactobacillus lactis, L. achidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum
dan L. delbrueckii.
Bakteri dari genus Lactobacillus banyak ditemukan pada sayuran,
berbentuk batang, sering berbentuk pasangan atau rantai dan gram
positif.
2. Leuconostoc mesenteroides dan L. dextranicum
Bakteri dari genus Leuconostoc umumnya ditemukan pada fermentasi
sayuran, sari buah dan anggur. Leuconostoc berbentuk bulat, tersusun
berpasangan seperti rantai dan gram positif.
3. Streptococcus thermophilus, S. lactis, S. cremoris.
Bakteri ini umumnya ditemukan pada fermentasi susu, berbentuk bulat
yang tersusun seperti rantai dan gram positif.
4. Pediococcus cerevisae
Bakteri ini biasanya ditemukan pada fermentasi sayuran dan daging,
gram positif, berbentuk bulat berpasangan dua-dua atau empat-empat
(tetrads).
3. BAL merupakan golongan bakteri yang mampu menghasilkan asam
laktat, antimikroba, hidogen peroksida dan hasil metabolisme lainnya.
BAL juga bermanfaat bagi kesehatan, diantaranya dapat menurunkan
kolesterol, menghambat tumor, memperbaiki daya cerna laktosa,
mengendalikan bakteri patogen dalam saluran pencernaan,
14
antikarsinogenik, antimutagenik, produksi vitamin B, dan dapat
mencegah sembelit (Bachrudin et al., 2000). Menurut Diop et al.
(2007), BAL dalam industri pangan berperan dalam mengawetkan
kualitas nutrisi bahan baku dan menghambat pertumbuhan bakteri
patogen dan pembusuk.
4. Menurut Suardana (2007) BAL dapat dibedakan menjadi 2 kelompok
berdasarkan hasil fermentasinya, yaitu:
1. BAL homofermentatif, yaitu BAL yang hanya menghasilkan asam
laktat sebgai produk akhir fermentasi. Contohnya yaitu
Pediococcus, Streptococus, dan beberapa Lactobacillus.
2. BAL heterofermentatif, yaitu BAL yang menghasilkan beberapa
jenis produk akhir fermentasi seperti asam laktat, etanol, asam
asetat dan CO2. Contohnya yaitu Leuconostoc, dan beberapa
spesies Lactobacillus.
D. Enzim Protease
1. Enzim merupakan katalisator yang berfungsi untuk meningkatkan
suatu reaksi kimia. Suatu reaksi yang menggunakan enzim akan
berlangsung 103-108 kali lipat lebih cepat dibandingkan tanpa enzim.
Enzim dapat merubah 100-1000 molekul substrat menjadi produk tiap
detiknya. Enzim memiliki sisi aktif tempat terikatnya substrat. Substrat
15
yang terikat akan membentuk kompleks enzim substrat kemudian akan
dihasilkan produk. Kemampuan katalik enzim dapat hilang akibat
denaturasi. Denatutasi merupakan kondisi putusnya struktur tiga
dimensi enzim. Penyebab terjadinya denaturasi, yaitu suhu tinggi, ion
logam berat, asam dan basa kuat dan adanya pelarut organik
(Campbell dan Farrell 2006).
2. Enzim protease merupakan enzim golongan hidrolase yang mampu
memecah protein menjadi molekul-molekul sederhana seperti asam
amino dan oligopeptida pendek. Enzim ini diperlukan oleh semua
makhluk hidu karena bersifat esensial dalam metabolisme protein
(Poliana, 200). Enzim protease merupakan enzim yang memiliki
banyak manfaat dalam bidang industri, baik industri pangan maupun
nonpangan. Beberapa industri pangan yang menggunakan protease,
contohnya industri susu, roti dan bir. Enzim dalam industri pangan
bermanfaat untuk mengkonversi bahan baku menjadi bahan yang lebih
mudah diolah dan lebih aman. Sedangkan dalam bidang nonpangan
enzim protease dimanfaatkan untuk industri kulit, pembuatab detergen
dan pakan ternak (Sawat dan Nagendran 2014).
Menuurut Poernomo (2004), pemilihan bakteri dalam memproduksi
enzim protease memiliki beberapa keunggulan, yaitu biaya produksi
enzim relatif lebih murah, skala dalam produksi enzim mudah
ditingkatkan, kondisi produksi tidak tergantung musim dan waktu dan
16
bakteri lebih mudah tumbuh dengan pertumbuhan yang lebih cepat
dibandingkan organisme lainnya.
3. Enzim protease terdiri dari beberapa golongan yang dapat diisolasi dari
hewan, tumbuhan dan mikroorganisme. Berikut ini adalah golongan
enzim protease dan sumbernya menurut Motyan et.al (2013) :
Tabel 1. Golongan Enzim Protease
*Enzim protease golongan eksopeptidase
Golongan Protease Jenis Protease Sumber
Tripsin Hewan
Kimotripsin Hewan
Enterokinase Hewan
Endoproteinase Mikroorganisme
Protease Serin Elastase Hewan
Substilin Mikroorganisme
Protease K Mikroorganisme
Trombin Hewan
Faktor Xa Hewan
WNV Protease Mikroorganisme
Bromelin Tumbuhan
Papain Tumbuhan
Protease sistein Fisin (ficain) Tumbuhan
Rhinovirus 3C Mikroorganisme
TEV protease Mikroorganisme
TVWV protease Mikroorganisme
Endoproteinase Mikroorganisme
Termolisin Mikroorganisme
Metaloprotease Kolagenase Mikroorganisme
Dispase Mikroorganisme
Protease aspartat Pepsin Hewan
Katepsin D Hewan
Protease serin* Karboksipeptidase Y Mikroorganisme
Protease sistein* Katepsin D Hewan
DAPase Hewan
Metaloprotease* Karboksipeptidase A Hewan
Karboksipeptidase B Hewan
17
E. Faktor-faktor Yang Mempengaruhi Aktivitas Enzim
1. Suhu
Aktivitas suatu enzim sangat dipengaruhi oleh suhu. Enzim
memerlukan sejumlah panas tertentu agar dapat aktif. Peningkatan
suhu akan menyebabkan aktivitas enzim juga meningkat hingga titik
optimum tercapai. Aktivitas enzim akan meningkat sebanyak dua kali
lipat seiring peningkatan suhu sebsesar 10 0C di atas suhu minimum.
Aktivitas enzim akan terus menigkat hingga tercapai titik optimum.
Akan tetapi peningkatan suhu melebihi titik optimum akan
menyebabkan aktivitas enzim mengalami penurunan (Pratiwi, 2008).
Suhu maksimum akan menyebabkan enzim mengalami denaturasi.
Denaturasi terjadi karena struktur protein terbuka dan gugus non polar
yang berada di dalam molekul menjadi terbuka keluar. Hal ini
menyebabkan kelarutan protein di dalam air menjadi turun, sehingga
aktivitas enzim juga mengalami penurunan (Lehninger, 2005).
Hubungan antara aktivitas enzim dengan suhu ditunjukkan dalam
Gambar 2.
Gambar 2. Hubungan aktivitas enzim dengan suhu (Poedjiadi, 1994)
18
2. pH
Enzim memiliki konstanta disosiasi pada gugus asam maupun basa
sehingga disebut amfolitik. Sifat amfolitik enzim ini terjadi terutama
pada gugus terminal amino dan gugus residu terminal karboksilnya.
Enzim mengalami perubahan kereaktifan disebabkan pengaruh pH
lingkungan. Kenaikan dan penurunan pH akan mempengaruhi
efektivitas enzim dalam membentuk kompleks enzim-substrat.
Peningkatan pH di atas titik optimum akan menyebabkan enzim
mengalami denaturasi sehingga mengakibatkan menurunnya aktivitas
enzim (Winarno, 1989).
Hubungan kecepatan reaksi dengan pH ditunjukkan pada Gambar 3.
Gambar 3. Hubungan kecepatan reaksi dengan pH (Page, 1997).
19
3. Aktivator dan Inhibitor
Beberapa enzim memerlukan aktivator dalam reaksi katalisnya.
Aktivator adalah senyawa atau ion yang dapat meningkatkan
kecepatan reaksi enzimatis. Ion logam yang dapat bertindak sebagai
aktivator, diantaranya Ca, Mg, Zn dan Fe yang menginduksi aktivitas
enzim protease ( Emmanuelle, 2013).
Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh senyawa penghambat enzim
(inhibitor). Inhibitor dapat bersaing dengan substrat untuk berikatan
dengan sisi aktif enzim sehingga dapat terjadi pengurangan laju reaksi.
Inhibitor biasanya menyerupai substrat normal dengan bentuk tiga
dimensinya. Karena persamaan ini, enzim dapat berikatan dengan
inhibitor (Pratiwi, 2008). Ion logam yang dapat menjadi inhibitor
enzim, yaitu Cd2+
dan Hg2+
dapat menghambat aktivitas protease
(Nailola dkk., 2008).
21
C. Metode Penelitian
Isolat BAL proteolitik diisolasi dari bekasam ikan patin melalui pengayaan
pada media selektif MRSA+ skim milk. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan dan mengetahui kemampuan proteolitik secara kualitatif dan
kuantitatif isolat BAL dari bekasam ikan patin serta mengaetahui
karakteristik enzim yang dihasilkan. Uji kualitatif ditentukan berdasarkan
indeks proteolitik melalui perbandingan antara diameter zona bening
dengan diameter koloni bakteri. Isolat terpilih kemudian dilanjutkan
dengan uji kuantitatif. Uji kuantitatif ditentukan berdasarkan aktivitas
enzim protease melalui metode Bergemeyer dan Grassl (1983) dengan
mengukur jumlah tirosin yang terbentuk. Jumlah tirosin yang terbentuk
diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm.
Karakterisasi terbatas enzim protease meliputi pengaruh pH, suhu dan ion-
ion logam.
D. Analisis Data
Data hasil uji kualitatif dan kuantitatif yang diperoleh pada penelitian ini
dianalisis secara deskriptif.
22
E. Cara Kerja
1. Pembuatan Bekasam
Ikan patin segar ditimbang seberat ± 250 gram kemudian insangnya
dibuang dan dibersihkan isi perutnya. Setelah dibersihkan dilakukan
penggaraman dengan jumlah garam 10% bobot ikan. Selanjutnya
ditambahkan nasi dengan perbandingan ikan dan nasi 1:1 dan inkubasi
sampai 7 hari pada suhu ruang (Wikandari, 2012).
2. Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik dari Bekasam ikan Patin
Isolasi dilakukan dengan cara menghaluskan bekasam sebanyak 1
gram. Kemudian bekasam dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril
yang telah berisi 9 ml larutan pengencer garam fisiologis 0,85%
sehingga diperoleh larutan pengenceran 10-1. Untuk pengenceran 10-2
diambil 1ml suspensi bekasam dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
yang berisi 9 ml ml larutan pengencer garam fisiologis lalu
dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Pengenceran dilakukan
sampai 10-8 dengan cara yang sama (Candra, 2006).
Selanjutnya dipipet sebanyak 1ml suspensi dari pengenceran 10-6-10-8
dan diinokulasikan pada media MRSA yang telah ditambahkan susu
skim 1%, kemudian diinkubasi pada inkubator pada suhu 37 oC
23
selama 48 jam (Desniar, 2012). BAL proteolitik ditandai dengan
pembentukan zona bening disekitar koloni bakteri.
3. Pemurnian Isolat BAL Proteolitik
Koloni BAL proteolitik terpilih dimurnikan dengan metode goresan
pada medium MRSA miring di dalam tabung reaksi. Isolat kemudian
diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 37 oC.
4. Karakterisasi BAL Proteolitik
Karakterisasi BAL proteolitik dilakukan untuk membedakan anatara
isolat BAL terpilih. Karakter yang diamati adalah morfologi koloni,
morfologi sel (pewarnaan Gram dan pewarnaan spora) motilitas dan
uji katalase (Candra, 2006).
5. Peremajaan Isolat BAL Proteolitik
BAL proteolitik yang telah dikarakterisasi kemudian diremajakan pada
medium MRSA miring. Isolat diinkubasi di dalam inkubator selama 24
jam pada suhu 37 oC.
24
6. Penentuan Indeks Proteolitik
Isolat BAL diuji kemampuan proteolitik secara kualitatif
menggunakan metode Brown (2007), pada media Skim Milk Agar
(SMA). Isolat BAL berumur 24 jam diambil sebanyak 1 ose kemudian
di point plate ke dalam cawan petri yang berisi media Skim Milk Agar
(SMA). Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
Kemampuan proteolitik BAL ditunjukkan dengan terbentuknya zona
bening disekitar koloni (Kurniati, 2015 ). Perbandingan antara
diameter area zona bening dengan diameter koloni bakteri disebut
sebagai indeks proteolitik (Baehaki, 2011).
Rumus indeks proteolitik:
Keterangan:
a = diameter zona bening
b = diameter koloni (Setyaningsih, 2013).
Gambar 4. Penentuan Indeks Proteolitik BAL
25
7. Karakterisasi Terbatas Aktivitas Enzim Protease
7.1. Pembuatan Starter Isolat Bakteri Asam Laktat
Isolat BAL proteolitik berumur 24 jam pada media MRSA
miring diambil sebanyak 3 ose kemudian diinokulasikan ke
dalam erlenmeyer 250 ml yang berisi 50 ml media MRS
Broth + Skim milk 2%. Selanjutnya diinkubasi pada Shaker
Incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 24 jam.
7.2. Produksi Enzim Protease
Enzim protease diproduksi dengan cara menginokulasikan
10% starter isolat proteolitik ke dalam 50 ml media MRS
Broth + Skim Milk. Isolat kemudian diinkubasi di atas
Shaker Incubator dengan kecepatan 120 rpm selama 24
jam. Setelah 24 jam, kultur dipindahkan ke dalam tabung
dan enzim dipanen dengan cara disentrifugasi selama 10
menit dengan kecepatan 4000 rpm. Supernatan yang
diperoleh merupakan ekstrak kasar enzim yang akan diukur
aktivitas proteasenya (Baehaki, 2011).
26
7.3. Penentuan pH Optimum Aktivitas Enzim Protease
Penentuan pH optimum aktivitas enzim protease
mengunakan berbagai macam buffer yang berbeda. Buffer
yang digunakan, yaitu buffer sitrat pH 4 dan 5, buffer posfat
pH 6 dan 7 dan buffer tris-HCl pH 8 dan 9. Penentuan
aktivitas enzim protease diiukur berdasarkan metode
Bergemeyer dan Grassl (1983). Pada uji ini dilakukan
karakterisasi pH, suhu dan pengaruh ion-ion logam.
Sebanyak 0.1 ml ekstrak kasar enzim ditambahkan pada
campuran yang berisi 0.5 ml bufer fosfat dengan substrat
kasein pH 7, 0.1 ml tirosin standar dan 0,1 ml aquadest.
Selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu 37 oC
Setelah 10 menit ditambahkan 0,5 ml TCA (0.1 M).
Larutan diinkubasi kembali selama 10 menit pada suhu 37
oC dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 10
menit pada suhu 4 oC. Kemudian diambil 0.375 ml
supernatan dan ditambahkan 1.25 ml larutan Na2CO3 (0.4
M) dan 0.25 ml pereaksi Folin, selanjutnya diinkubasi
selama 20 menit pada suhu 37 oC dan absorbansinya diukur
pada panjang gelombang 578 nm. Satu unit aktivitas enzim
protease merupakan jumlah enzim yang dapat menghasilakn
1 mmol tirosin per menit pada kondisi pengukuran.
27
Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit)
per ml ekstrak enzim.
7.4. Penentuan Suhu Optimum Aktivitas Enzim Protease
Suhu optimum enzim diketahui melalui proses inkubasi
enzim dengan variasi suhu yang berbeda yaitu 35 oC, 37 oC,
40 oC, 45 oC, 50 oC, 55 oC, 60 oC dan 65 oC pada pH
optimum. Selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas
enzim dengan mengikuti metode Bergmeyer dan Grassl
(1983). Suhu yang menghasilkan aktivitas enzim tertinggi
menunjukkan suhu optimum.
7.5. Penentuan Pengaruh Ion-ion Logam TerhadapAktivitas Enzim Protease
Pada penelitian ini digunakan senyawa inhibitor asam etilen
diamintetraasetat (EDTA), sedangkan logam yang
digunakan, yaitu MgSO4, MnSO4, CaCl2, FeCl3 dan CuSO4
dengan konsentrasi 1 mM dan 5 mM. Uji ini dilakukan
dengan pH dan suhu optimum enzim protease yang telah
diketahui berdasarkan metode Bergmeyer dan Grassl
(1983).
28
Tabel 2. Metode Pengujian Aktivitas Enzim Protease
Aktivitas ptotease dihitung dalam satuan PU (Protease Unit) per ml
ekstrak enzim (Djajasukma, 1993).
PU = X
Keterangan :
PU : Unit Aktivitas Protease (Unit/ml)
Asb : Nilai Absorbansi Sampel
Ast : Nilai Absorbansi Standard
Abl : Nilai Absorbansi Blanko
T : Waktu
Blanko
(ml)
Standars
(ml)
Sampel
(ml)Kasein 2 mM dalam bufferFosfst (0.01) M pH 7EnzimTirosin standardAquadest
0.5
--
0.1
0.5
-0,1-
0.5
0.1--
Inkubasi pada 37 oC selama 10 menitTCA (0,1 M)EnzimAquadest
0.50.1-
0.50.1-
0.5-
0.1
Inkubasi pada 37 oC selama 10 menitSentrifugasi 10000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 oCSupernatanNa2CO3 (0,4M)Pereaksi Folin (1:2)
0.3751.250.25
0.3751.250.25
0.3751.250.25
Diamkan selama 20 menit pada suhu 37 oCBaca absorbansinya pada panjang gelombang 578 nm
29
F. Diagram Alir
Diagram alir penelitian adalah sebagai berikut.
Gambar 5. Diagram Alir Penelitian
Pemurnian Isolat BAL Proteolitik
Karakterisasi BAL Proteolitik
Peremajaan Isolat BAL Proteolitik
Uji Kemampuan Proteolitik
Penentuan Indeks Proteolitik (IP) Penentuan Aktivitas Enzimprotease
- Pembuatan Starter BAL- Produksi Enzim Protease- Penentuan Pengaruh pH,
Suhu dan Ion-ion Logam
Isolasi dan Seleksi BAL Proteolitik
Pembuatan Bekasam Ikan Patin
47
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan hasil penelitian maka dapat disimpulkan :
1. BAL dari Bekasam Ikan Patin mampu menghasilkan enzim protease.
2. Enam isolat BAL dari bekasam ikan patin memiliki nilai indeks
proteolitik yang berbeda-beda.
3. Aktivitas tertinggi enzim protease isolat BP2 terjadi pada pH 8 dan
suhu 40 oC sebesar 0,57 U/ml. Logam Fe3+, Mg2+ dan Mn2+ (5 mM)
digolongkan kedalam aktivator enzim protease, sedangkan logam Fe3+,
Mg2+ dan Mn2+ (1 mM), Ca2+, Cu2+ dan EDTA ( 1 mM dan 5 mM)
digolongkan kedalam inhibitor enzim protease.
B. Saran
Disarankan dilakukan pengujian lanjutan dengan pemurnian enzim
protease terlebih dahulu, sehingga diperoleh karakter pH, suhu, pengaruh
inhibitor dan ion-ion logam yang lebih tepat.
48
DAFTAR PUSTAKA
Adawyah R. 2007. Pengolahan dan Pengawetan Ikan. Jakarta: Bumi Aksara.
Anggrahini, D.N.D. 2016. Produksi, Pemekatan dan Karakterisasi Enzim Proteasedari Lactobacillus plantarum SK(5). Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Atlas, M., R. Bartha. 1997. Microbial Ecology : Fourth Edition. Addison WesleyLongman. USA.
Axelsson L. 2004. Lactic acid bacteria: classification and physiology. Di dalamSalminen S, Wright SV, Ouwehand A, editor. Lactic Acid Bacteria.Microbiological and Functional Aspects Third edition, Revised andExpanded. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 19-68.
Bachrudin, Z., Astuti, dan Y.S. Dewi. 2000. Isolasi dan seleksi mikroba penghasillaktat dan aplikasinya pada fermentasi. Limbah Industri Tahu. ProsidingSeminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi. Mikrobiologi Enzimdan Bioteknologi.
Baehaki, A., Suhartono, M.T., Palupi, N.S., dan Nuhayati, T., 2004, Karakterisasiprotease dari bakteri patogen Staphylococcus aureus dan Klebsiella sp.ProsidingSeminar Nasional dan Kongres PATPI, ISBN: 979-99965-0-3,281 – 287.
Baehaki, A., T. Nurhayati, dan M.T. Suhartono. 2005. Karakteristik Protease DariBakteri Patogen Saphylococcus epidermidis. Buletin Teknologi Hasil
Pertanian. Vol. VIII Nomor 2.
Baehaki, A., Suhartono, M.T, Palupi N.S dan Nurhayati, T. 2008. Purufikasi danKarakterisasi Protease dari Bakteri Patogen Pseudomonas aeruginosa.Jurnal Teknologi dan Industri Pangan Vol. XIX No. 1 Th. 2008.
Baehaki, A., Rinti dan A. Budiman. 2011. Isolasi Dan Karakterisasi Protease DariBakteri Tanah Rawa Indralaya, Sumatera Selatan. Jurnal Akta Agrosia EdisiKhusus No. 2 : 172-175.
Bamforth CW. 2005. Food, Fermentation and Micro-organisms. Iowa:University of California. Blackwell Science Ltd. hlm 31-33.
Beg, Q.K., dan Gupta, R., 2003, Purification and Characterization of AnOxidation-stable, Thioldependent Serine Alkaline Protease from Bacillusmojavensis, Enzyme and Microbial Technology, 32(2), 294 – 304.
49
Bergmeyer, H.U. and M. Grassl. 1983. Methods of Enzymatic Analysis Vol 2.Verlag Chenie. Weinheim.
Brown, A.E. 2007. Laboratory Manual In General Microbiology. Mc Graw Hill.New York.
Campbell MK, Farell SO. 2006. Biochemistry. Ed ke-5. Weinheim (US):Yhomson Learning Inc.
Candra, J.I. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Dari ProdukBekasam Ikan Bandeng (Chanos chanos). Skripsi. Institut Pertanian Bogor.
Desniar. 2012. Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Produk Fermentasi Ikan(Bekasam). Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Dewi, K.W. 2006. Pemurnian dan Pencirian Protease dari Isolat Bakteri W-1 yangDihasilkan Oleh Tauco Hitam. Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Djajasukma. 1993. Isolasi Enzim Protease Dari Mucor javanicus. Pros. SeminarHasil Litbang SDH.
Diop MB, Dubois-Dauphin R, Tine E, Ngom A, Destain J, Thonart P. 2007.Bacteriocin producers from traditional food products. Biotechnol Agron SocEnviron. 11(4): 275–281.
Elfahri K. 2012. Release of bioactive peptides from milk proteins byLactobacillus spesies [tesis]. Melbourne (US): Victoria University.
Emmanuelle, Amanda. 2013. Integrated Process Production and Extraction of theFibrinolytic Protease from Bacillus sp. UFPEDA 485. BiochemBiotechnol (2013) 170:1676–1688.
Fathimah, A.N dan Wardani A.K. 2014. Ekstraksi dan Karakterisasi EnzimProtease dari Daun Kelor (Moringa olifera Lamk.). Jurnal TeknologiPertanian Vol. 15 No. 3.
Fatoni, A., Zusfhair dan Lestari, P. 2008. Isolasi dan Karakterisasi ProteaseEkstraseluler dari Bakteri dalam Limbah Cair Tahu. Jurnal NatureIndonesia. 10(2): 83-88.
Femi-Ola TO, Oladakun DO. 2012. Partial purification and characterization of athermostable alkaline protease from Lactobacillus brevis. Mal J Microbiol.8: 1-5.
Fithri, Choirunnisa,. Joni, Kusnadi. dan R. Chrisnasari. 2008. Viabilitas danDeteksi Subletal Bakteri Probiotik pada Susu Kedelai Fermentasi InstanMetode Pengeringan Beku (Kajian Jenis Isolat dan Konsentrasi Sukrosasebagai Krioprotektan). Jurnal Tek.Pertanian, Vol. 9 No. 1. 40-51.
Hames BD, Hooper NM. 2000. Biochemistry: The Instant Notes 2nd ed.Hongkong: Springer-Verlag. p83-84.
50
Hernowo. 2001. Pembenihan Ikan Patin. Penebar Swadaya. Jakarta.
Huang G, Ying T, Huo P, Jiang J. 2006. Purification and characterization of aprotease from thermophilic Bacillus strain HS08. Biotechnology. 5:2433-2438.
Hutkins RW. 2006. Microbiology and Technology of Fermented Foods. Lowa:IFT Press. Blackwell Publishing Ltd. hlm 3-49.
Hidayati, L., Chisbiyah, L.A., Kiranawati, T.M. 2012. Evaluasi MutuOrganoleptik Bekasam Ikan Wader. Jurnal TIBBS Vol. 3 No. 1: 44-51.
Irianto HE. 2008. Produk ikan fermentasi tradisional Indonesia. Balai Besar RisetPengolahan Produk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, Badan RisetKelautan dan Perikanan. Departemen Kelautan dan Perikanan. Jakarta
Khairuman. 2002. Budidaya Patin Secara Intensif. PT. Agromedia Pustaka.Jakarta
Khairuman dan Dodi, S. 2000. Budidaya Patin Secara Intensif. Agromedia Pustaka.Jakarta.
Kosim, M., dan Putra, S.R., 2010, Pengaruh Suhu Pada Protease Dari Bacillussubtilis, Prosiding Skripsi Semester Genap 2009-2010, Jurusan KimiaFMIPA ITS, Surabaya.
Kurniati, N. 2015. Produksi Enzim Protease Dari Bakteri Asam Laktat Asal Bekasam.Tesis. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Kwok, J. De Vos W.M. 1994. The Proteolytic System of Lactic Acid Bacteria. In :Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Ed Gasson abd DeVos. 1994. Balckie Academic & Profesional. Glasgow.
Lehninger, A.L. 2005. Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Motyan JA, Toth F, Tozser J. 2013. Research application of proteolytic enzymesin molecular biology. Biomolecules. 3: 923-942.
Muhamad NA, Mohamad J. 2012. Fatty Acids Composition of selected Malaysianfishes. Sains Malaysiana 41(1):81–94.
Murniyati dan Sunarman. 2000. Pendinginan, Pembekuan dan Pengawetan Ikan.Kanius. Yogyakarta.
Murti, T.W., dan T. Hidayat. 2009. Pengaruh Pemakaian Kultur Tiga MacamBakteri Asam Laktat dan Pemeraman Terhadap Komposisi Kimia danFlavour Keju. Journal of the Indonesian Tropical Animal Agriculture.
Murtini JT. 1992. Bekasam Ikan Mas. Kumpulan Hasil-hasil Penelitian PascaPanen Perikanan. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian.Pusat Penelitian dan Pengembangan Perikanan
51
Nailola, E dan Nunuk W. 2008. Semi Purifikasi dan Karakterisasi Enzim ProteaseBacillus sp.. Jurnal Bidang Mikrobiologi LIPI. 13(51-56).
Page, D.S. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Erlangga. Jakarta.
Poedjiadi, A.1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta.UI-Press. 155, 158-160.
Poernomo, A. T., dan Purwanto, D.A., 2003. Uji Aktifitas Crude EnzimProteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 Hasil Fermentasi Curah. MajalahFarmasi Airlangga, 3: 103–107.
Poliana J dan Mac CAP. 2007. Industrial enzymes: structure, function, andapplications. Dordrecht: Springer Hal: 24.
Pramono, Y. B., Rahayu, E. S., Saparno dan Utami, T. 2007. TheMicrobiologycal, Physical, and Chemical Changes of Petis Liquid duringDry Spontaneous Fermentation. [J.Indon.Trop.Anim.Agric. 32 [4] Dec2007]. Universitas Diponegoro, Semarang.
Pratiwi, S.T.2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Yogyakarta.
Purwaningsih, S, Garwan, R dan Santoso, J. 2011. Karakteristik OrganoleptikBakasang Jeroan Cakalang (Katsuwonus pelamis, Lin) sebagai PanganTradisional Maluku Utara. [Journal of Nutrition and Food, 2011, 6(1): 13–17]. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Putranto, WS. 2006. Purifikasi dan karakterisasi protease yang dihasilkanLactobacillus acidophilus dalam fermentasi susu sapi perah. SeminarNasional Bioteknologi “Capturing opportunities through biotechnology”;2006 November 15-16; Cibinong, Indonesia. Cibinong (ID): PusatPenelitian Bioteknologi.
Rahayu WP, Ma’oen S, Suliantari, Fardiaz S. 1992. Teknologi FermentasiProduk Perikanan. Bogor: Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi.Institut Pertanian Bogor
Rahmani, Yunianta dan Martati, E. 2007. Pengaruh Penggaraman Basah terhadapKarakteristik Produk Ikan Asin Gabus (Ophiocephalus striatus). [JurnalTeknologi Pertanian, Vol.8 No.3]. Teknologi Hasil Pertanian, UniversitasBrawijaya, Malang.
Ross RP, Morgan S, Hill C. 2002. Preservation and fermentation: past, presentand future. Int J Food Microbiol 79:3-16.
Said I.M. dan Ningrum E.M. 2009. Karakterisasi dan purifikasi protease bakteriBacillus sp. dan jamur Aspergillus sp. serta aplikasinya sebagai soakingagent pada proses penyamakan kulit kambing (Abstrak). Hibah PenelitianKerjasama (Hibah Pekerti) : LP2M, UNHAS. Makasar.
Salminen, S., A.V. Wright, dan A. Ouwehand. 2004. Lactic Acid BacteriaMicrobiological and functional Aspects. Marcel Dekker, Inc, New York.
52
Sastra, W. 2008. Fermentasi Rusip. [Skripsi]. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Saravanakumar K, Baskaran R, Kubendran TR. 2010. Acoustic andthermodynamic properties of binary liquid mixtures of acetophenone andbenzene. J Appl Sci. 10: 1616-1621.
Setiadi, A.N. 2001. Mempelajari Penggunaan Cairan Pikel ketimun sebagaiSumber Bakteri Asam Laktat pada Pembuatan Bekasam Ikan Tawes.[Skripsi]. IPB. Bogor.
Setyanigsih, I., Nurhayati,T., Aremhas, U. 2013. Pengaruh Media KultivasiChaetoceros gracilis Terhadap Kandungan Kimiawi dan Potensi InhibitorProtease. J.Teknol. dan Industri Pangan 24(2). Institut Pertanian Bogor.Bogor.
Sharmin S, Hossain T, Anwar MN. 2004. Proteolytic activity of a Lactobacillusspesies isolated from rumen. Pakist J Biol Sci. 7: 2105-2108.
Suardana, W. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari CairanRumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. J. Veter. 8(4) : 155-159.
Suri WL, Syukur S, Jamsari. 2013. Optimization of protease activity from lacticacid bacteria (LAB) Pediococcus pentosaceus isolated from soursopfermentation (Annona muricata L.). J Kimia Unand. 2:1.
Tanasupawat S, Visessanguan W. 2008. Thai fermented foods: microorganismsand their health benefits. Dalam: Farnworth ER, editor. Handbook ofFermented Functional Foods. Edisi. ke-2. Boca Raton: CRC Press Taylor& Francis Group. hlm 495-512.
Thariq, A.S., Swastawati, F. dan Surti, T.2014.Pengaruh Perbedaan KonsentrasiGaram padaPeda Ikan Kembung (Rastrelliger neglectus) terhadapKandungan Asam Glutamat Pemberi Rasa Gurih (UMAMI). JurnalPengolahan dan Bioteknologi Hasil Perikanan. Vol. 3 No. 3: 104-111.
Vichasilp C, Sangjindavon M, Wiliapun P. 2008. The use of selected lactic acidbacteria isolates for accelaration of fermented fish (Pla-ra) process.Kasetsart Univ Fish Res Bull. 32(3) :17-25.
Wanenoor. 2011. Sentral Dogma Biologi, Pengertian Gen, DNA, RNA, EkspresiGen, serta Transkripsi DNA. http://wanenoor.blogspot.com/2011/11/sentral-dogma-biologi-pengertian-gen.html. Diakses tanggal 15 April 2017.
Wardani AK, Nindita LO. 2012. Purifikasi dan karakterisasi protease dari bakterihasil isolasi dari whey tahu. J Teknol Pertan. 13: 149-156.
Widowati, T.W, Taufik M, dan Wijaya A. 2011. Pengaruh Pra Fermentasi GaramTerhadap Karakteristik Kimiawi Dan Mikrobiologis Bekasam Ikan Patin.Prosisding Semirata BKS Barat Bidang Ilmu Pertanian.
53
Wikandari PR, Suparmo, Marsono Y, Rahayu ES. 2012. Karakterisasi bakteriasam laktat proteolitik pada bekasam. J Natur Indones. 14(2):120-125.
Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan dan Gizi. PT. Gramedia Pustaka Utama.Jakarta. Halaman 155.
Yahya D, Wibowo P, Darmadji. 1997. Karakteristik bakteri asam laktat danperubahan kimia pada fermentasi "bekasam" ikan mujair (Tilapiamossambica). Berkala Penelitian Pasca Sarjana. X(1): 105-118.
Yanti. 2003. Pemurnian dan karakterisasi protease cacing tanah Lumbricusrubellus yang bersifat fibrinolitik [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor.
Yuningsih, S. 2006. Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Nato.Skripsi. Institut Pertanian Bogor. Bogor
Zelvina, O. 2009. Analisis Pendapatan Usaha Pembenihan dan Pemasaran BenihIkan Patin di Desa Tegal Waru Kecamatan Ciampea Kabupaten Bogor.[Skripsi]. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Zarkasih, M.H. 2014. Pengaruh Pemberian Cacing Sutera (Tubifex sp.) dan KeongSawah (Pila ampullacea) Terhadap Pertumbuhan Ikan Patin (Pangasius sp.)Skripsi. Universitas Sumatera Utara. Medan.