sawar darah otak: karakteristik molekuler dan model in vitro … · 2020-03-05 · metode ini tetap...

Tinjauan Pustaka

Neurona Vol. 33 No. 2 Maret 2016 141

PENDAHULUAN

We are who we are because of our brain. Otak bersama medulla spinalis membentuk susunan saraf pusat (SSP) yang merupakan kontrol utama fungsi tubuh. Jaringan saraf yang berharga dan penting dalam kehidupan ini dilindungi oleh struktur rumit berupa

SDO (blood brain barrier). SDO memiliki peranan penting dalam mempertahankan homeostasis otak dan fungsi-fungsi neuron.1,2 Bagaimana persisnya struktur ini mempertahankan keadaan fisiologis, serta apa saja perubahan yang terjadi pada SDO dalam keadaan patologis menjadi tantangan untuk dipahami oleh para peneliti maupun praktisi di bidang ini.

SAWAR DARAH OTAK: KARAKTERISTIK MOLEKULER DAN MODEL IN VITRO KULTUR PADA APARATUS

TRANSWELL

BLOOD-BRAIN BARRIER: MOLECULAR CHARACTERISTICS AND IN VITRO CULTURE MODEL ON TRANSWELL APPARATUS

Agatha Grace Muljono*

ABSTRACT

We are who we are because of our brain. Our central nervous system, the brain and spinal cord, is protected by a complex structure known as the blood-brain barrier. Blood-brain barrier, in spite of its protective function, also poses as an obstacle towards drug development targeting the central nervous system. This is particularly due to most drugs being unable to penetrate the barrier and reach the concentration needed to achieve therapeutic concentration in the brain. Various blood-brain barrier models have been developed to facilitate central nervous system drugs-screening tests; being one of the most widely used is the endothelial cells culture on Transwell apparatus method. Cultured cells may come from a variety of organisms, either as primary culture or cell line. Transwell apparatus itself constructs a culture support system with side-by-side vertical diffusion system through micro porous semi permeable membrane which separates luminal (vascular) from abluminal (parenchymal) compartments. Owing to this method’s intrinsic simplicity, the blood-brain barrier model generated makes possible high-throughput drug permeability testings and binding affinity (receptor-ligand) measurements. Despite those aptitudes, there are also some limitations caused by lack of critical features important to actual blood-brain barrier characteristics development, for instance shear stress. However, recognition, comprehension, and appreciation for this method is something appropriate and refining the method for establishing a better blood-brain barrier model is still the foremost objective.

Keywords: Blood-brain barrier, endotelial cells culture, in vitro model, Transwell apparatus

ABSTRAK

We are who we are because of our brain. Sistem saraf pusat (SSP) kita, yaitu otak dan medulla spinalis dilindungi oleh struktur kompleks berupa sawar darah otak (SDO). Sawar ini selain berfungsi sebagai proteksi, juga memberikan rintangan dalam pengembangan obat bagi SSP. Hal ini terutama karena banyak obat yang sulit menembus sawar ini dan mencapai konsentrasi yang dibutuhkan untuk menimbulkan efek terapetik di dalam otak. Berbagai model SDO telah dikembangkan untuk memfasilitasi uji penapisan obat bagi sistem saraf pusat; salah satu model yang paling luas digunakan adalah metode kultur sel endotel pada aparatus Transwell. Sel yang dikultur dapat berasal dari bermacam organisme, baik kultur primer maupun galur sel. Aparatus Transwell sendiri membentuk sistem penyokong kultur dengan sistem difusi vertikal berdampingan melintasi membran semipermeabel berpori mikro yang memisahkan kompartemen luminal (vaskuler) dan abluminal (parenkimal). Oleh karena kesederhanaan intrinsik metode ini, model SDO yang dihasilkan memungkinkan pengujian permeabilias obat dan pengukuran afinitas pengikatan (reseptor-ligan) yang high throughput. Namun terdapat pula sejumlah kekurangan model ini, yaitu kurangnya fitur-fitur kritis yang penting untuk perkembangan karakter SDO yang sesungguhnya, misalnya shear stress. Walau demikian, pengenalan, pemahaman, dan apresiasi untuk metode ini tetap diperlukan dan disempurnakan demi menghasilkan model SDO yang lebih baik.

Kata kunci: aparatus Transwell, SDO, kultur sel endotel, model in vitro

*Program Studi Ilmu Biomedik, Kekhususan Farmakologi, FK Universitas Indonesia. Korespondensi: [email protected]

Neurona Vol. 33 No. 2 Maret 2016142

Tinjauan Pustaka

Selain memberikan fungsi proteksi, SDO juga memberikan hambatan bagi pengembangan obat-obat baru bagi sistem saraf pusat.1-3 Hal ini terutama karena sulitnya bagi banyak obat untuk menembus sawar ini dan mencapai konsentrasi yang dibutuhkan untuk menimbulkan efek terapetik di dalam otak. Saat adanya obat baru yang dikembangkan, mampu tidaknya sebuah obat mencapai sistem saraf pusat tidaklah etis untuk diujicobakan pada manusia. Hal ini menimbulkan hambatan terutama bagi klinisi untuk mengetahui potensi sebuah obat digunakan sebagai tatalaksana sentral. Dibutuhkan informasi yang didapatkan dari model yang sahih untuk menjadi pegangan praktisi saat menggunakan obat-obatan sistem saraf pusat, terutama agen-agen baru, guna memastikan tatalaksana pasien yang semaksimal mungkin.

Banyak upaya telah dilakukan untuk meng-hasilkan model SDO yang dapat membantu mem-prediksi permeabilitas obat ke dalam jaringan otak, namun sangat sulit untuk benar-benar meniru respons fisiologis dan fungsional dari struktur ini.3,4 Berbagai metode yang dapat memberikan hasil cukup representatif cenderung memiliki metode yang rumit dan biaya yang besar, sehingga kedua faktor ini hampir selalu menjadi rintangan bagi pengembangan model yang ideal.2,4 Walau demikian, perkembangan teknik-teknik kultur sel baru dan teknologi in vitro yang semakin baik memberikan pemahaman yang lebih menyeluruh terhadap SDO.

Salah satu model SDO yang paling luas digunakan memanfaatkan aparatus Transwell sebagai penyokong kultur sel. Sel-sel yang ditanam berasal dari kultur primer berbagai hewan, baik sapi, babi, tikus, primata non-manusia, sampai manusia.2,4 Tentu saja, model ini memiliki kelebihan dan kekurangannya sendiri dan menarik untuk mengetahui bagaimana model ini dikembangkan serta perannya dalam dunia neurosains saat ini. Dalam kehidupan praktis, adanya informasi bahwa sebuah obat telah diuji pada model aparatus Transwell dapat dijadikan panduan bahwa obat tersebut potensial digunakan oleh klinisi sebagai terapi di SSP.

SDO DAN SAWAR DARAH CAIRAN SEREBROSPINAL

SSP dilindungi dari komponen darah oleh SDO dan sawar darah cairan serebrospinal. SDO

merupakan bagian dari komponen vaskuler otak yang terletak pada level sel-sel endotel di dalam pembuluh darah mikro SSP. Di sisi lain, sawar darah cairan serebrospinal dibentuk oleh sel-sel epitel pleksus koroidalis. Kedua sawar ini penting dalam menjaga komposisi milleu jaringan otak dan cairan serebrospinal otak dari darah, serta memainkan peran yang serupa walaupun pada lokasi yang berbeda dengan komponen-komponen sawar yang berbeda pula.5

SDO menghambat difusi paraseluler molekul-molekul larut air melalui jaringan kompleks taut erat yang menghubungkan sel-sel endotel penyusunnya. Bersama dengan ketiadaan fenestrasi dan aktivitas pinositosis yang sangat rendah, keunikan morfologis ini membentuk fungsi sawar fisik pada SDO.5

Serupa dengan sawar endotel pada SDO, sawar darah cairan serebrospinal dapat ditemukan pada level sel-sel epitel pleksus koroidalis berupa taut erat apikal unik yang menghambat difusi paraseluler molekul-molekul larut air melintasi sawar ini.5 Pleksus koroidalis dapat ditemukan di ventrikel lateral, ketiga, maupun keempat, berupa massa jaringan epitel bervaskularisasi tinggi dengan pembuluh darah yang memiliki fenestrasi. Struktur ini berperan penting dalam pertukaran zat antara darah dan cairan serebrospinal dalam ventrikel-ventrikel otak.6 Walau demikian, selain berfungsi sebagai sawar, sawar darah cairan serebrospinal juga memiliki fungsi sekretorik dan memproduksi cairan serebrospinal oleh sel-sel epitel pleksus koroidalis.5 Selain itu, sawar darah cairan serebrospinal juga disusun oleh lapisan araknoid dan vili araknoid pada lapisan luar otak.6 Sawar ini berfungsi sama dengan SDO, namun memfasilitasi transpor zat-zat yang berbeda ke dalam otak oleh karena perbedaan karakteristik struktural antara kedua sistem sawar.

Karakteristik SDOSDO adalah istilah kolektif untuk karakteristik

sel endotel spesifik otak yang membatasi pergerakan molekul dari darah ke dalam jaringan otak, tetapi memastikan penghantaran nutrien dan biomolekul-biomolekul tertentu. Selain itu, mayoritas dari neurotransmiter menunjukkan permeabilitas terhadap SDO yang rendah sehingga menghasilkan pemisahan antara neurotransmiter perifer dan sentral.1,3

Tinjauan Pustaka


Pada invertebrata, SDO lebih didasarkan pada peranan sel-sel glia. Selama evolusi, fungsi sawar semakin bergeser kepada sel-sel endotel pembentuk lapisan endotelium, sementara sel-sel glia terspesialisasi untuk mengontrol lingkungan ionik lokal. Fitur karakteristik utama SDO vertebrata terletak pada taut antar sel yang erat, laju transitosis yang rendah, ekspresi berbagai transporter, serta adanya sawar enzim yang memberikan lapisan perlindungan tambahan.1,3 Banyaknya faktor yang berperan dalam mempertahankan karakteristik SDO tersebut penting untuk diperhatikan selama pengembangan model. Karakteristik yang dihasilkan diharapkan menggambarkan keadaan SDO yang sesungguhnya.2

SDO memiliki dua fungsi, fungsi sawar (barrier) dan fungsi transpor (carrier). Fungsi sawar disebabkan oleh restriksi transpor zat-zat yang berpotensi toksik dari darah ke otak dan dibentuk oleh empat lini pertahanan berupa: (1) sawar paraseluler oleh taut interendotel, (2) sawar transeluler oleh laju endositosis dan transitosis yang rendah, (3) sawar enzimatik oleh seperangkat enzim yang kompleks, dan (4) fungsi sawar dan karier oleh transporter.1 Fungsi karier memastikan transpor nutrien dan pembuangan metabolit berjalan lancar dan fungsi barier akan dijelaskan lebih lanjut di bawah ini.

Dari sudut pandang permeabilitas, jenis sel paling penting di SDO adalah sel-sel endotel yang membentuk jalinan kontinyu melapisi permukaan dalam kapiler. Sel-sel endotel dihubungkan satu sama lain oleh taut erat (tight junction) yang menghasilkan struktur serupa sabuk pada bagian apikal sel. Sel-sel endotel memiliki fitur mirip endotel sekaligus mirip epitel, antara lain garis kontinyu taut erat, laju pinositosis yang rendah, dan resistensi elektrik transendotel (transendothelial electrical resistance/TEER) yang tinggi.2

Taut antar sel berperan sebagai sawar fisik yang memaksa pergerakan molekuler melalui rute transeluler dan menutup jalur paraseluler menembus taut seperti umumnya pada endotel.1 Taut erat antar sel endotel terdiri atas dua jenis taut yang berbeda, taut erat dan taut lekat (adherens junction). Kedua taut ini dibentuk dari protein transmembran yang memediasi interaksi ekstraseluler homofilik dan

berhubungan dengan sitoskeleton aktin di dalam sel. Oleh karena itu, integritas sitoskeleton juga penting dalam mempertahankan karakteristik SDO.

Taut-taut antar sel juga diperlukan untuk menjaga polarisasi endotel sehingga memastikan protein transpor SDO terlokalisasi dengan tepat. Adanya taut antar sel akan memisahkan domain membran apikal dan basolateral sehingga menghasilkan polarisasi sel (fungsi pagar) dan restriksi jalur paraseluler menghasilkan fungsi gerbang.1

Taut lekat tersusun atas protein kaderin endotel vaskuler yang krusial terhadap integritas semua pembuluh darah di dalam tubuh. Selain itu, sel-sel endotel mengekspresikan kaderin neural yang penting untuk asosiasi dengan perisit. Di dalam sel, taut lekat terhubung ke kompleks protein sitoskeleton yang tersusun atas banyak protein dengan komponen molekuler sitoplasmik yang penting bagi mempertahankan integritas vaskuler.3

Taut erat tersusun atas beberapa protein transmembran dengan komponen utama berupa klaudin, okludin, dan molekul adesi taut (junction adhesión molecules/JAMs). Di dalam sitoplasma, molekul-molekul ini berasosiasi dengan sejumlah protein sitoplasmik, termasuk protein zonula okludens.3 Fungsi taut lekat yang baik diperlukan untuk pembentukan taut erat dan diperkirakan bahwa kedua taut ini terhubung satu sama lain secara struktural.1

Transporter Influks dan EfluksSehubungan dengan tertutupnya sifat taut

endotel otak, endotelium dilengkapi dengan sistem transpor yang tidak hanya menyediakan rute selektif untuk nutrien, ion, dan makromolekul bioaktif, tetapi juga memastikan eliminasi molekul-molekul toksik. Transporter-transporter ini diekspresikan secara terpolarisasi sehingga memungkinkan pertukaran efektif molekul dan ion antara darah dan parenkim otak.3

Berbagai karier solut (solute carriers/SLCs) dan transporter adenosine triphosphate-binding cassette (ABC) diekspresikan di SDO. Famili transporter SLC meliputi lebih dari 300 protein dalam 48 subfamili.1,2 Sel-sel endotel otak


Tinjauan Pustaka

mengekspresikan banyak transporter berbeda yang memungkinkan influks glukosa, asam amino, nukleosida, neurotransmiter, dan lain-lain.2 Beberapa transporter influks yang diekspresikan, misalnya: transporter glukosa (GLUT1, famili SLC2), famili transporter anion/kation organik (OAT/SLCC22), anion organik (OATP/SLC21), asam amino kationik (SLC7), monokarboksilat (MCT/SLC16), dan proton/oligopeptida (PEPT1 dan 2, PHT1 dan 2 / SLC15). Obat-obat yang merupakan substrat dari transporter-transporter ini mencapai sistem saraf pusat dalam konsentrasi yang tinggi.1

Dari sudut pandang permeabilitas obat, transporter efluks terutama penting karena banyak obat yang merupakan substrat dari transporter ABC tidak mampu mencapai sistem saraf pusat dalam konsentrasi yang adekuat.1,3 Salah satu transporter efluks yang paling penting adalah P-glikoprotein (P-gp/ABCB1) yang mampu mentranspor sejumlah besar obat-obat lipofilik keluar dari sel-sel endotel. Selain itu, sel-sel endotel juga mengekspresikan banyak anggota keluarga protein resistensi multi-obat (multidrug resistance proteins/MRPs), dengan kontribusi yang signifikan terhadap resistensi obat, serta protein terkait kanker payudara (breast cancer-related protein/BCRP). Ekspresi transporter ABC dipengaruhi oleh inflamasi dan penurunan ekspresi P-gp dapat ditemukan pada penyakit-penyakit neurodegeneratif.3 Profil ekspresi transporter-transporter ini besar perannya dalam menentukan permeabilitas SDO dan fungsionalitas transporter merupakan salah satu persyaratan utama kualitas model in vitro.2,4

TransitosisPeptida dan protein dengan berat molekuler

besar memasuki otak melalui transitosis. Transitosis dapat bersifat spesifik (dimediasi reseptor) maupun non-spesifik (dimediasi adsorpsi). Protein dan kompleks protein yang memasuki otak melalui transitosis dimediasi reseptor, misalnya Fe-transferrin, lipoprotein, imunoglobulin G, insulin, dan leptin. Jarangnya pembentukan vesikel endositosis di endotelium otak telah banyak dilaporkan dan dianalisis menggunakan mikroskop elektron, walau demikian regulasi laju transitosis yang rendah ini masih belum jelas. Studi-studi terbaru menunjukkan

bahwa perisit mengatur transitosis endotel di dalam sistem saraf pusat.4

Sawar EnzimSebagai tambahan perlindungan, SDO

memiliki lapisan berupa sawar enzim. Sawar enzim terbentuk oleh glikokaliks endotel bermuatan negatif yang terlibat dalam pengaturan permeabilitas vaskuler yang rendah dan distribusi enzim yang asimetris. Enzim-enzim ini akan menginaktivasi substrat-substrat spesifik masing-masing, sehingga menurunkan kadarnya di dalam parenkim otak. Enzim-enzim tersebut, antara lain asetilkolinesterase, alkalin fosfatse, gamma-glutamil transpeptidase, monoamin oksidase, dan lain lain.3

Peran AstrositSelain sel-sel endotel, karakteristik SDO

juga dipertahankan oleh berbagai komponen seluler maupun nonseluler unit neurovaskuler penyusun SDO, antara lain: sel-sel mural (sel-sel otot polos dan perisit), mikroglia, makrofag perivaskuler, astrosit, dan membran basal (Gambar 1).

Gambar 1. Struktur Seluler Sawar Darah Otak2

Astrosit adalah sel makroglia sistem saraf pusat yang memberikan karakteristik unik lain pada pembuluh darah otak. Astrosit-astrosit tertentu melapisi dan membungkus seluruh sisi abluminal pembuluh darah dengan prosesus khusus yang disebut kaki astrosit (astrocyte end feet).1,3 Kaki astrosit adalah prosesus-prosesus ramping yang kaya akan kanal air dan kalium. Kaki astrosit tertanam ke dalam membran basal pembuluh darah melalui kompleks distroglikan.

Tinjauan Pustaka


Astrosit mengalami spesialisasi di sistem saraf pusat relatif lebih lambat pada tahap akhir perkembangan. Oleh karena itu, astrosit tampaknya tidak terlalu penting dalam induksi awal sifat SDO oleh sel-sel endotel. Walau demikian, astrosit merupakan regulator penting fungsi-fungsi SDO. Saat ini, masih sedikit yang diketahui dari komunikasi antara endotel dan astrosit selain bukti-bukti yang menunjukkan pentingnya sinyal-sinyal dari astrosit dalam regulasi perkembangan dan pemeliharaan SDO.1,3 Astrosit di otak merupakan populasi heterogen dan pemahaman fungsi spesifik per populasi diperlukan dalam memahami fungsi astrosit dalam unit neurovaskuler. Selain itu, mekanisme seluler dan molekuler yang membentuk kaki astrosit juga masih belum dimengerti dengan jelas.3

Beberapa hasil yang telah ada menunjukkan bahwa persinyalan protein bone morphogenetic protein tipe 1 pada astrosit penting untuk penanaman kaki astrosit di sekitar vaskulatur. Sinyal-sinyal yang berasal dari perisit berperan dalam polarisasi kaki astrosit, sedangkan sonic hedgehog (Shh) dari astrosit diperlukan untuk pemeliharaan sistem imun endotel.1,3 Meskipun pengetahuan akan peran astrosit masih terbatas, pentingnya komponen astrosit dalam mempertahankan karakteristik SDO telah terbukti, antara lain melalui pengembangan metode ko-kultur antara endotel dan astrosit.

Model Sawar Darah Otak Perkembangan dan kemajuan model SDO

dalam dua dekade terakhir terutama disebabkan oleh dua faktor.2,4 Pertama, adanya kebutuhan yang mendesak untuk meningkatkan pemahaman akan mekanisme molekuler kompleks yang meregulasi lingkungan otak. Sampai saat ini, meskipun sudah demikian banyak yang diketahui akan SDO, pemahaman menyeluruh masih belum dapat dicapai. Kedua, diperlukannya fasilitasi perkembangan strategi farmakologi, baik alternatif maupun yang lebih efektif, dengan target sistem saraf pusat. Perkembangan obat-obatan sistem saraf pusat relatif lebih lambat berkembang dibandingkan dengan sistem organ lain, misalnya obat-obatan jantung dan diabetes melitus. Salah satu rintangan bagi neurofarmakologi masih berupa hambatan klasik, yaitu hambatan fisiologis yang kita kenal sebagai

SDO itu sendiri. Kemampuan untuk meniru dan

mendemonstrasikan sifat fungsional dari struktur SDO yang sangat kompleks ini sangat kritis dalam perkembangan obat-obat sistem saraf pusat baru dan merupakan tantangan yang besar. Meskipun telah mengalami banyak kemajuan, kemampuan ilmu pengetahuan saat ini masih sangat jauh dari mereproduksi semua fungsi SDO ex situ. Saat ini, terdapat sejumlah persyaratan utama yang harus dimiliki sebuah model SDO in vitro.4 Sebuah model SDO terutama harus mampu mengekspresikan taut erat interendotel. Berikutnya, model tersebut idealnya mampu mengekspresikan transporter dengan distribusi asimetrik, baik jenisnya maupun orientasinya (basal dan luminal) yang serupa in vivo. Transporter yang diekspresikan tersebut harus memiliki mekanisme yang terekspresi baik dan sawar enzim yang ada harus mampu memetabolisme obat secara fungsional.

Syarat lain adalah kemampuan model untuk mendiskriminasi permeabilitas berbagai zat (tanpa sistem transpor spesifik) dengan bergantung pada koefisien partisi minyak/air dan berat molekuler masing-masing. Terakhir, model SDO yang ideal harus mampu mereka ulang efek variatif dari gangguan hemodinamik dan sistemik/inflamasi pada SDO yang telah diamati in vivo dan dapat mengacu pada patogénesis dan progresi penyakit-penyakit sistem saraf pusat yang umum.

Model in vitro mulai berkembang di awal tahun 1990an karena memiliki sejumlah keuntungan, antara lain.2,4,8 (1) cost effective, di mana metode-metode ini relatif murah bila dibandingkan dengan eksperimen menggunakan hewan coba serta memiliki throughput yang lebih tinggi untuk uji permeabilitas obat; (2) lingkungan kerja yang lebih sederhana karena lingkungan artifisial yang tersedia oleh model in vitro memungkinkan pembelajaran dan manipulasi SDO tanpa banyaknya variabel yang harus diperhitungkan seperti di dalam organisme utuh; dan (3) tingkat keserbagunaan yang tinggi karena lebih luasnya stimulus fisiologis dan eksperimental yang dapat diujikan dibandingkan pada in vivo.

Model berbasis sel dapat dibuat dengan menggunakan sumber sel jenis apapun (manusia,


Tinjauan Pustaka

hewan, atau derivat cell line),2 termasuk sel endotel dan astrosit yang diisolasi langsung dari manusia (misalnya pasien lobektomi, reseksi tumor otak, aneurisma, dll). Meski demikian, biaya dan kompleksisitas prosedur yang menggunakan sel isolasi langsung ini menjadi hambatan utama sehingga dikembangkan metode-metode lain,8 terutama kultur sel. Metode kultur pun menimbulkan tantangan karena sel-sel yang dikultur ex situ pada lingkungan artifisial akan mengalami dediferensiasi karena kurangnya pajanan pada faktor fisiologis (baik melalui difusi dari jaringan/sel-sel di sekitarnya ataupun bergantung pada stimulus mekanis dan fisik, seperti shear stress dan kontak antar sel).4 Dengan demikian, kultur sel berpotensi mengubah fisiologi SDO in vitro dan responsnya terhadap stimulus endogen maupun eksogen. Oleh karena itu, validasi hasil studi in vitro dalam kondisi in vivo sangat penting dilakukan.8

Salah satu langkah penting dalam per-kembangan model SDO adalah keberhasilan isolasi kapiler otak pada tahun 1973 oleh Joo dan Karnushina.9 Beberapa tahun kemudian, kultur endotel otak pertama berhasil dilakukan oleh Panula (1978)10 dan De Bault (1979).11 Berikutnya kultur endotel pada penyokong semipermeabel dikembangkan (Bowman 1983)12 dan seiring meningkatnya pemahaman terkait pentingnya faktor glia, metode ko-kultur pun ditemukan.13

Model SDO yang paling luas dan umum digunakan sebenarnya dikembangkan dengan

amat menyederhanakan SDO, di mana sawar ini digambarkan sebagai selapis tunggal/monolayer sel-sel endotel mikrovaskuler otak yang sangat terspesialisasi. Sistem ini dikenal sebagai aparatus Transwell yang merupakan sistem difusi vertikal berdampingan melintasi membran semipermeabel berpori mikro yang memisahkan kompartemen luminal (vaskuler) dan abluminal (parenkimal) seperti dapat dilihat pada Gambar 2.

Sel-sel endotel otak dari berbagai sumber, misalnya sapi, tikus, babi, primata-nonmanusia, dan manusia, dapat digunakan pada sistem ini. Sel-sel endotel ditumbuhkan pada permukaan atas/luminal membran yang direndam dalam media pertumbuhan spesifik. Keuntungan dari metode ini adalah potensi untuk menggunakan populasi sel murni dan viabilitas yang relatif lebih tinggi. Permukaan membran yang berpori mikro juga memungkinkan pertukaran nutrien dan pergerakan zat-zat baik yang dihasilkan sel maupun eksogen, namun tidak memungkinkan pergerakan sel melintasi kedua kompartemen.

Oleh karena kesederhanaan intrinsik metode ini, model SDO yang dihasilkan memungkinkan pengujian permeabilias obat dan pengukuran afinitas pengikatan (reseptor-ligan) yang high throughput. Secara khusus, metode monokultur sel-sel endotel ini merupakan sistem yang ideal untuk mempelajari kinetik transpor Michaelis-Menten karena volume yang tetap dalam tiap kompartemen.2

Walaupun demikian, terdapat sejumlah kekurangan model ini karena kurangnya fitur-fitur

Gambar 2. Aparatus Transwell

Tinjauan Pustaka


kritis yang penting untuk perkembangan karakter SDO yang sesungguhnya. Tidak adanya stimulus fisiologis alami, misalnya interaksi antar sel dengan astrosit perivaskuler dan sel-sel parenkimal lain serta pajanan terhadap shear stress14 dan sel-sel darah intralumen, membatasi kemampuan endotel vaskuler untuk berkembang sempurna dan/atau mempertahankan karakteristik intrinsik dan fungsi

SDO seperti yang diamati in vivo.8

Sel-sel endotel yang ditumbuhkan di Transwell cenderung memiliki pola adhesi sel yang ireguler sehingga menghasilkan ‘efek tepi’. Istilah ini mengacu pada kondisi di mana endotel tidak mampu membentuk taut erat yang baik antar sel di sepanjang tepi membran dan dinding dalam ruang lumen.

Gambar 3. Gambar Skematis Teknik Monokultur dan Ko-Kultur pada Aparatus Transwell


Tinjauan Pustaka

Adanya efek tepi mengakibatkan mungkinnya terjadi difusi paraseluler dan mempengaruhi reliabilitas pengukuran permeabilitas melintasi endotel selapis ini.16 Efek tepi terutama menjadi masalah bagi zat-zat yang sangat hidrofilik dan sebenarnya sulit melintasi membran lipid bilayer sel. Selain itu, kultur sel endotel monolayer ini terpapar pada protein serum pada kedua sisi (luminal dan abluminal), di mana pada kenyataannya (in situ) hanya terjadi pada sisi luminal/vaskuler sementara sisi abluminal terpapar pada faktor-faktor yang dilepaskan oleh parenkim/astrosit.

Untuk memperbaiki metode monokultur, astrosit ditambahkan pada sisi abluminal13 dalam posisi sejajar dengan endotel monolayer (lihat Gambar 3). Penambahan ini berhasil memfasilitasi pembentukan taut erat interendotel yang lebih erat dan secara umum menghasilkan fitur-fitur SDO yang lebih menyerupai keadaan in situ. Hal ini terkait bukti-bukti dari penelitian sebelumnya yang mengindikasikan bahwa interaksi astrosit dengan endotel otak membantu fungsi SDO, baik dalam morfologi dan ekspresi protein.13 Penelitian-penelitian lain menunjukkan bahwa polaritas sel dapat diinduksi pada sel-sel endotelial saat di-lakukan ko-kultur dengan glia atau saat médium yang digunakan telah dikondisikan dengan glia. Paparan terhadap glia memicu ekspresi enzim-enzim penanda endotel otak (misalnya OX-26, alkalin fosfatase, asetil-kolinesterase, Na/K-ATPase, dll) serta sejumlah sistem transpor dan efluks tertentu (misalnya GLUT1, P-gp, dll) yang serupa dengan sel-sel endotel SDO in vivo.4 Pengukuran TEER sebagai parameter permeabilitas juga lebih tinggi pada sistem ko-kultur dibandingkan dengan sistem monokultur.13,15

KESIMPULANSistem saraf pusat beserta SDO yang

melindunginya merupakan salah satu struktur paling kompleks dalam ilmu pengetahuan. Pentingnya pemahaman akan SDO dalam keadaan fisiologis maupun patologis, serta perlunya membatasi biaya yang besar untuk studi eksperimental, penapisan, dan validasi bagi terapi-terapi dengan target sistem saraf pusat terus meningkatkan kebutuhan akan model SDO in vitro yang baik. Dengan kelebihan

dan kekurangan yang dimilikinya, model berbasis kultur sel-sel endotel pada aparatus Transwell masih merupakan salah satu metode andalan yang paling luas digunakan. Bagi klinisi, adanya informasi bahwa sebuah agen farmakologis telah diujicobakan pada aparatus Transwell menjadi panduan bahwa agen tersebut dapat digunakan sebagai obat bagi sistem saraf pusat. Pengenalan, pemahaman, dan apresiasi untuk metode ini adalah sesuatu yang pantas dan penyempurnaan metode demi dihasilkannya model SDO yang lebih baik tetap merupakan tujuan yang utama.

DAFTAR PUSTAKA

1. Strazielle N, Ghersi-Egea JF. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Mol Pharmaceutics. 2013;10(5):1473-91.

2. Wilhelm I, Fazakas C, Krizbai IA. In vitromodels of the blood-brain barrier. Acta neurobil Exp. 2011;71:113-28.

3. Keller A. Breaking and building the wall: the biology of the blood-brain barrier in health and disease. Swiss Med Wkly. 2013;143:13892.

4. Naik P, Cucullo L. In vitroblood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 2012;101(4):1337-54.

5. Engelhardt B, Sorokin L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 2009;31(4):497-511.

6. Liddelow SA. Devlopment of the choroid plexus and blood-CSF barrier. Front Neurosci. 2015;9:32.

7. Goodwin JT, Clark DE. In silico predictions of blood-brain barrier penetration: considerations to “keep in mind”. J Pharmacol Exp Ther. 2005;315(2):477-83.

8. Ball K, Bouzom F, Scherrmann JM, Walther B, Decleves X. Physiologically based pharmacokinetic modeling of drug penetration across the blood-brain barrier—towards a mechanistic IVIVE-based approach. AAPS J. 2013;15(4):913-32.

9. Joo F, Karnushina I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 1973;8(29):41-8.

10. Panula P, Joo F, Rechardt L. Evidence for the presence of viable endothelial cells in cultures derived from dissociated rat brain. Experentia. 1978;34(1):95-7.

11. DeBault LE, Kahn LE, Frommes SP, Cancilla PA. Cerebral microvessels and derived cells in tissue cultura: isolation and preliminary characterization. In Vitro. 1979;15(7):473-87.

12. Bowman PD, Ennis SR, Rakey KE, Betz AL,

Tinjauan Pustaka


Goldstein GW. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: a model for study of blood-brain barrier permeability. Ann Neurol. 1983;14(4):396-402.

13. Rubin LL, Hall DE, Porter S, Barbu K, Cannon C, Horner HC, dkk. A cell culture model of the blood-brain barrier. J Cell Biol. 1991;115(6):1725-35.

14. Colgan OC, Ferguson G, Collins NT, Murphy RP, Meade G, Cahill PA, dkk. Regulation of bovine brain microvascular endothelial tight junction assembly

and barrier function by laminar shear stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;292(6):H3190-7.

15. Nakhlband A, Omidi Y. Barrier functionality of porcine and bovine brain capillary endothelial cells. BioImpacts. 2011;1(3):153-9.

16. Bachmeier CJ, Trickler WJ, Miller DW. Comparison of drug efflux transport kinetics in various blood-brain barrier models. Drug Metab Dis. 2006;34(6):998-1003.

sawar darah otak: karakteristik molekuler dan model in vitro … · 2020-03-05 · metode ini tetap...

Documents