Review Video Animasi Youtube

Cara Penggunaan Alat dan Tahapan “Polymerase Chain Reaction (PCR)”

Dari hasil video yang saya amati bersama dengan rekan-rekan kelompok, beberapa hal dapat

saya rangkum mengenai penggunaan alat dan tahapan dari Polymerase Chain Reaction atau yang

biasa kita kenal dengan sebutan PCR. PCR merupakan suatu teknik biologi molekuler yang

digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA spesifik hingga jutaan kali semula. Terdapat tiga

tahapan dalam siklus PCR, yaitu:

1. Denaturasi atau penguraian untai ganda DNA

2. Annealing atau pelekakatan primer

3. Polimerisasi atau pemanjangan pasangan DNA komplementer

Bahan baku dalam reaksi PCR yaitu reaction mixture. Reaction mixture merupakan suatu

campuran yang mengandung zat-zat pendukung berlangsungnya reaksi. PCR dilakukan dengan

bantuan mesin thermal cycler yang dapat mengubah suhu sesuai dengan waktu dan urutan yang

ditentukan. Hasil dari teknik PCR ialah jumlah untai DNA yang jumlahnya terus bertambah pada

tiap siklus sebanyak 2n, dengan n merupakan nomer siklus. DNA hasil amplifikasi dengan PCR

tidak dapat dilihat secara kasat mata, tetapi dapat diidentifikasi dengan teknik elektroforesis.

Dalam animasi yang berdurasi sekitar 7 menit, dijelaskan bahwa pertama terdapat

komponen-komponen reaction mixture, yaitu DNA template, primer, DNA polimerase,

buffer/penyangga, dan dNTPS. Pertama, DNA template. Fungsi DNA template di dalam proses

PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. DNA template

ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asalkan di dalam

DNA template tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju. Kedua, primer. Primer

yaitu suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang mempunyai urutan nukleotida

yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat, dNTPs (Deoxynucleotide

triphosphates), buffer PCR, dan enzim DNA polymerase. Primer berfungsi sebagai pembatas

fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH)

pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Ketiga, DNA polimerase.

Polimerase DNA merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan. Umumnya digunakan enzim

Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus). Keempat, buffer / dapar. Fungsi buffer yaitu

untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya buffer PCR mengandung senyawa MgCl2.

MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polymerase.

Kelima, dNTPS. dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin

trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP

(deoksiguanosin trifosfat). dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam

proses ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer

membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA template.

Siklus PCR meliputi tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan elongasi. Pertama,

denaturasi. Jika larutan DNA dipanaskan, maka energi termal akan memecahkan ikatan hidrogen

dan ikatan lain yang menentukan kestabilan heliks ganda, akibatnya kedua untai akan memisah

atau mengalami denaturasi. Molekul DNA heliks tunggal dari proses denaturasi cukup stabil.

Jika suhu diturunkan, molekul tersebut biasanya tidak mengalami renaturasi menjadi molekul

DNA heliks ganda asal tetapi membentuk pola kusut, namun untai yang saling komplemen dapat

mengalami renaturasi secara perlahan-lahan. Sifat ini menjadi dasar teknik hibridisasi asam

nukleat.

Kedua, annealing. Merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer

merupakan tahap yang penting dalam PCR karena jika terdapat sedikit saja kesalahan pada tahap

ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor

yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Annealing umumnya

berlangsung pada suhu 54 oC.

Ketiga, elongasi. Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polimerase

akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA

cetakan, dan nukleotida. Jika dilakukan pengulangan terhadap ketiga tahapan tersebut, maka

untai DNA yang baru dibentuk akan kembali mengalami proses denaturasi, penempelan, dan

pemanjangan untai DNA menjadi untai DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan

menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru secara eksponensial.