reaksi uji protein_kelompok 7_b1

LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM BIOKIMIA

REAKSI UJI PROTEIN

KELOMPOK : 7

HARI/ TANGGAL PRAKTIKUM : SENIN, 17 MARET 2015

ASISTEN :1. DEVI RAHMAWATI

2. SHINTA A. SIHOMBING

LABORATORIUM BIOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

JATINANGOR

2015

Abstrak

Tujuan percobaan kali ini adalah untuk mengidentifikasi adanya senyawa protein dalam sampel dengan berbagai macam metode secara kualitatif. Percobaan inididasarkan pada sifat asam amino pada protein yang mudah mengalami perubahanstruktur dan kelarutan protein pada suhu dan pH tertentu. Sampel yang digunakanpada percobaan ini adalah 2 mL albumin dari putih telur ayam yang dilarutkan dalam 10 mL aquades. Larutan albumin selanjutnya dibagi ke dalam lima perlakuan daribeberapa metode uji protein, seperti uji Biuret, pengendapan oleh garam organikNH4Cl, pengendapan oleh alkohol dalam kondisi asam, basa, dan dapar asam, ujikoagulasi protein, dan uji denaturasi pada suhu dan pH tertentu, kemudian masing-masing perlakuan diberi indikator pereaksi yang sesuai seperti Millon dan Biuret. Pada uji biuret, larutan albumin memberikan hasil positif berupa perubahan warnamenjadi ungu saat diteteskan biuret dan larutan CuSO4 suasana basa. Pada metodepengendapan protein oleh garam NH4Cl, larutan albumin memberikan hasil positif yang terlihat dari endapan putih yang terbentuk saat ditambahkan garam NH4Clhingga larutan lewat jenuh dan ditambahkan pereaksi Millon, sedangkan filtratlarutan yang ditambahkan biuret menjadi warna biru keunguan yang menunjukanadanya sedikit protein yang terkandung di dalamnya, begitu pula hasilnya pada ujikoagulasi. Sedangkan untuk hasil uji pengendapan protein oleh alkohol dan ujidenaturasi protein, pada suasana asam (1 mL HCl 0,1 N) dan dapar asam (1 mLbuffer asetat) terdapat endapan putih sebagai hasil positif untuk protein pada albumin yang mengalami penurunan kelarutan, sedangkan pada suasana basa (1 mL NaOH 0,1 N) larutan tetap bening yang menunjukkan protein tidak mengalami pengendapan.

Kata kunci : Protein, albumin, biuret, pengendapan, millon.

Abstract

The purpose of this experiment is to identify proteins in the sample by using some qualitative methods. This experiment based on characteristics of amino acid of protein which are easily get changing on its structure and its solubility on certain pH and temperature. The sample of this experiment is 2 mL albumin of chickens egg white solved in 10 ml water. Next, the albumin solution is devided into five different methods, these are Biuret test, precipitation test by inorganic salt NH4Cl and alcohol on acid base situation, coagulation test, and also denaturation of protein test, further the result will be observed by Millon and Biuret as reagents. On biuret test, albumin solution gave positive result as the color changed to slight violet when added by biuret and CuSO4 in base situation. On precipitation test by NH4Cl, the solution also gave a positive result observed from white sediment which was formed by saturated solution, and the filtrate gave purple color by biuret reagent. As the result same as coagulation and denaturation test of protein. In the acidic and acidic buffer

condition, solution got white sediment as the positive result of protein in albumin, while in the base condition, the mixing solution didnt change which shows that protein wouldnt get any precipitation in base condition.

Keywords :protein, albumin, biuret, precipitation, millon.

Pendahuluan

Istilah protein, yang

dikemukakan pertama kali oleh pakar

kimia Belanda, G. J. Mulder pada

tahun 1939 berasal dari bahasa Yunani

proteios. Proteios mempunyai arti

yang pertama atau yang paling

utama . Protein mempunyai peranan

yang sangat penting yaitu dalam

struktur, fungsi, dan reproduksi.

Karena protein tersusun atas

asamasamalfa amino, maka susunan

kimianya mengandung unsure seperti

karbon, oksigen, hidrogen, dan

nitrogen. Pada protein majemuk, selain

unsur- unsure tersebut, kemungkinan

masih mengandung fosfor, besi atau

magnesium. Susunan bagian berbagai

macam protein tidak jauh berbeda,

yaitu sekitar 52,40-54,50% karbon;

6,90-7,30% hidrogen; 15,50-18,00%

nitrogen; 21,00-23,30% oksigen; dan

0,80-2,00% belerang (Sumardjo,

2008).

Struktur protein dapat

dikelompokkan menjadi empat

golongan, yaitu struktur primer,

sekunder, tersier, dan kuartener.

Struktur primer adalah struktur linier

dari rantai protein. Dalam struktur ini

tidak terjadi antar aksi, baik dengan

rantai protein yang lain maupun rantai

protein itu sendiri. Struktur sekunder

adalah dua dimensi dari protein.

Terdapat ikatan hidrogen dan ikatan

protein polipeptida. Struktur tersier

merupakan struktur tiga dimensi

sederhana dari rantai protein. Dalam

struktur ini selain terjadi ikatan

polipeptida juga terjadi antar aksi van

der waals dan antar aksi gugus

nonpolar yang mendorong terjadi

lipatan. Struktur tertinggi dari protein

adalah struktur kuartener. Pada

struktur ini di samping memiliki ikatan

hidrogen, gaya van der waals, dan

antar aksi gugus nonpolar, juga

memiliki ikatan nonkovalen yang

membentuk struktur 3 dimensi

kompleks (Sunarya, 2007).

Albumin mempunyai bobot

molekulnya 17.000 - 70.000. Albumin

mengandung belerang, tetapi miskin

akan residu asam amino glisin.

Larutannya dalam air menggumpal

apabila dipanaskan, dan dapat

mengendap apabila ditambah dengan

larutan ammonium sulfat jenuh.

Albumin susu disebut laktabumin,

sedangkan albumin gandumdisebut

leukosin. Albumin plasma berperan

dalam memberikan tekanan osmotik

koloid, yang selanjtunya mencegah

plasma keluar dari sel (Kuchel, 2006).

Metode

Pembuatan Larutan Protein dengan

Mengggunakan Albumin Telur

Alat dan bahan disiapkan, seperti:

tabung reaksi, gelas ukur, pipet, dan

zat yang akan diuji, yaitu albumin

telur. Albumin telur yang akan diuji

dilarutkan dalam air secukupnya.

Dengan perbandingan kurang lebih

1:5. Lalu aduk hingga homogen,

setidaknya albumin telur tidak

mengendap di bawah.

Pengujian Kadar Protein

Menggunakan Reaksi Biuret

3 mL larutan protein diambil, dan

ditetesi dengan NaOH 2,5 N sebanyak

1 mL. Setelah itu ditambahkan 1 tetes

CuSO4 0,01 M. Kemudian campuran

tersebut diaduk. Jika belum ada

perubahan warna, ditambahkan terus

NaOH dan CuSO4 secukupnya

perlahan lahan. Sampai terbentuk

kompleks warna.

Pengendapan Protein oleh Garam

Anorganik.

Albumin telur yang sebelumnya telah

dibuat, diambil sebanyak 10 mL, untuk

dijenuhkan dengan ammonium sulfat,

dengan cara penambahan kristal

ammonium sulfat secara perlahan-

lahan, campuran tersebut diaduk

hingga semua kristal larut. Garam

ammonium sulfat ditambahkan terus

menerus hingga tidak bisa larut

kembali oleh solven. Ini menunjukkan

larutan telah dalam keadaan lewat

jenuh. Endapan dan filtratnya disaring

dan dipisahkan. Untuk endapannya

diuji dengan reagen millon dan

filratnya diuji dengan reagen biuret.

Perubahan diamati.

Uji Koagulasi

Larutan protein yang telah disiapkan

dimasukkan ke dalam tabung reaksi

sebanyak 5 mL. lalu ditambahkan 2

tetes asam asetat 1M atau secukupnya.

Tabung tersebut dicelupkan ke dalam

tabung mendidih selama kurang lebih

5 menit. Setelah terbentuk endapan,

pemanasan dihentikan, dan dipisahkan

antara filtrat dan endapannya,

kemudian endapannya dibagi 2 bagian.

1 bagian diuji dengan air dan 1 bagian

yang lain diuji dengan pereaksi millon.

Hasil diamati.

Pengendapan oleh Alkohol

3 tabung berisi masing masing protein

disiapkan sebanyak 5 mL. Tabung

pertama ditambahkan 1 mL HCl 0,1 M

dan 6 mL etanol 95%.

Tabung kedua ditambahkan 1 mL

NaOH 0,1 M dan 6 mL etanol 95%.

Pada tabung ke tiga ditambahkan 1

mL buffer asetat dan 6 mL etanol 95%.

Perubahan diamati

Denaturasi Protein

Protein disiapkan di dalam tabung

reaksi sebanyak 3 buah masing-

masing sebanyak 9 mL. Larutan

protein pertama ditambahkan sebanyak

1 mL HCl 0,1 M, tabung kedua

ditambahkan 1 mL NaOH 0,1 M, dan

pada tabung ketiga ditambahkan 1 mL

buffer asetat dengan pH 4,7.

Celupkan ketiga tabung kedalam air

mendidih selama 15 menit lalu

didinginkan. Perubahan yang terjadi

diamati. Tabung 1 dan 2 ditambahkan

kembali buffer asetat kurang lebih

sebanyak 10 mL tiap tabungnya.

Hasil

Uji Biuret

Tabung Pereaksi Hasil Keterangan

1 Biuret Terbentuk kompleks ungu (+) Protein

Gambar 1. Hasil Uji Biuret

Pengendapan Protein oleh Garam Anorganik


I (endapan) Millon Endapan kuning (+) Protein

II (filtrat) Biuret Kompleks biru

keunguan

(+) Protein

Tabung 1 Tabung 2

Gambar 2. Hasil Uji Pengendapan oleh Garam Anorganik

Pengendapan oleh Alkohol


I 1 ml HCl 0.1 N + Etanol

95%

Putih keruh (+) protein

II 1 ml NaOH 0.1 N +Etanol

95%

Bening (-) protein

III 1 ml Buffer asetat +Etanol

95%

Putih keruh (+) protein

Tabung 1

Tabung 2

Tabung 3

Gambar 3. Hasil Pengendapan oleh Alkohol

Uji Koagulasi


I (endapan) Air Bening (-) protein

II (endapan) Millon Endapan Putih (+) protein

Gambar 4. Hasil Uji Koagulasi

Denaturasi Protein


I 1 ml HCl 0.1N Terjadi endapan (+) protein

II 1ml NaOH 0.1 N Tidak ada endapan (-) protein

III 1 ml buffer asetat Endapan (+) protein

IV(hasil tabung I

+buffer)

10ml buffer asetat Endapan (+) protein

V(hasil tabung

II+buffer)

10 ml buffer asetat endapan (+) protein

Tabung 1

Tabung 2

Tabung 3

Tabung 4

Tabung 5

Gambar 5. Denaturasi Protein

Pembahasan

Pengujian kadar protein yakni pada

sampel albumin telur dilakukan

dengan menggunakan lima metode

pengujian, yakni Uji Biuret,

Pengendapan oleh Garam Anorganik,

Pengendapan oleh Alkohol, Uji

Koagulasi, dan Denaturasi.

1. Uji Biuret

Sampel berupa albumin telur diuji

kadar proteinnya menggunakan uji

biuret yang memiliki prinsip pengujian

yakni pengukuran serapan cahaya

kompleks warna ungu dari protein

yang bereaksi dengan pereaksi biuret,

yang bertindak sebagai pembentuk

kompleks warna adalah protein dengan

ion Cu2+ yang terdapat pada pereaksi

biuret dalam suasana basa. Sampel

albumin telur dilarutkan dalam

aquades kemudian diteteskan pereaksi

CuSO4 pada tabung reaksi yang

kemudian menimbulkan kompleks

warna ungu. Reagen CuSO4 berperan

sebagai penyedia ion Cu2+ yang akan

membentuk kompleks warna jika

direaksikan dengan protein.

Gambar 1. Hasil Uji Biuret

Tabel 1. Hasil Uji Biuret

Tabung Pereaksi Hasil

I Biuret Kompleks

warna ungu

Hasil yang diperoleh adalah larutan

albumin mengalami perubahan warna

menjadi ungu hal ini menunjukkan

bahwa albumin telur positif

mengandung protein. Reaksi yang

terjadi adalah sebagai berikut :

CuSO4.5H2O + 2NaOH Cu(OH)2 +

NaSO4 + 5H2O

Cu(OH)2 Cu2+ + 2OH-

Pereaksi biuret memiliki komposisi

senyawa kompleks yang mengandung

atom karbon, hidrogen, oksigen, dan

nitrogen serta merupakan hasil reaksi

antara dua senyawa urea (CO(NH2)2).

Pada keadaan basa yakni dengan

penambahan NaOH, ion Cu2+ yang

berasal dari CuSO4 akan bereaksi

dengan gugus CO dan NH dari

rantai peptida pada sampel protein

yang digunakan yakni albumin telur.

2. Pengendapan oleh Garam

Anorganik

Sampel protein yang digunakan

yakni albumin telur dilakukan uji

pengendapan oleh garam anorganik.

Garam anorganik yang digunakan

adalah amonium sulfat. Larutan

sampel dijenuhkan dengan

penambahan garam amonium sulfat

sampai lewat jenuh kemudian diuji

kelarutannya menggunakan pereaksi

Millon dan filtrat yang dihasilkan diuji

oleh pereaksi Biuret.

Gambar 2. Hasil Uji Pengendapan

oleh Garam Anorganik

Tabel 2. Hasil Uji Pengendapan oleh

Garam Anorganik


I Millon Endapan

bewarna kuning

II Biuret Filtrat berwarna

biru keunguan

Endapan yang terbentuk terjadi

karena kelarutan protein yang

berkurang akibat larutan protein

ditambahkan garam anorganik yakni

amonium sulfat pembentukkan

endapan protein ini disebut salting out.

Kemampuan ion garam untuk

menghidrasi menyebabkan

pengendapan terus terjadi, sehingga

terjadi kompetisi antara ion garam

anorganik dengan molekul protein

untuk mengikat air. Karena garam

anorganik lebih menarik air maka

jumlah air yang tersedia untuk

molekul protein akan berkurang.

Reaksi yang terjadi adalah sebagai

berikut :

Larutan albumin dalam air

dapat diendapkan dengan penambahan

ammonium sulfat ((NH4)2SO4)

hingga jenuh. Setelah larutan albumin

dijenuhkan dengan (NH4)2SO4,

endapan yang terbentuk diuji

kelarutannya dalam millon.

Berdasarkan percobaan, endapan yang

dihasilkan memberikan uji yang positif

karena menghasilkan endapan.

Endapan tersebut menunjukkan protein

yang mengendap dan akan

menghasilkan warna merah jika

dipanaskan.

Selanjutnya filtrat larutan tersebut

direaksikan dengan pereaksi biuret dan

berdasarkan percobaan, albumin

telur menunjukkan hasil positif yang

ditandai larutan berwarna biru

keunguan. Pengujian filtrat

dengan pereaksi biuret bertujuan untuk

mengetahui ada tidaknya gugus amida

pada filtrat yang dihasilkan.

3. Pengendapan oleh Alkohol

Uji pengendapan oleh alkohol

pada larutan albumin dilakukan

dengan penyiapan tiga tabung reaksi

yang telah diisi oleh larutan protein.

Kemudian pada tabung I ditambahkan

HCl dan etanol 95%, tabung II

ditambahkan NaOH dan etanol 95%,

tabung III ditambahkan buffer asetat

dan etanol 95%. Pengujian endapan

protein oleh alkohol ini bertujuan

untuk mengidentifikasi pengaruh

alkohol terhadap kelarutan protein

pada suasana asam dan basa serta pada

pH isoelektriknya.

Tabel 3. Hasil Pengendapan oleh

Alkohol


I HCl + etanol

95%

Endapan

putih

II NaOH +

etanol 95%

Bening

III Buffer asetat

+ etanol 95%

Endapan

putih

Gambar 3. Hasil Pengendapan oleh

Alkohol

Etanol yang digunakan berperan

sebagai penurun konstanta dielektrik

larutan sehingga gaya tarik - menarik

antar molekul jadi semakin kuat.

Gugus positif dari asam amino

dikondisikan oleh etanol untuk

bereaksi dengan gugus negatif yang

ada dalam larutan, sehingga pada

suasana tertentu mampu membentuk

endapan. Pada tabung reaksi I larutan

sampel albumin ditambahkan

HCl menghasilkan endapan namun

endapan yang dihasilkan sedikit, ini

terjadi karena gugus positif pada

protein berikatan dengan gugus Cl- dan

gugus negatif yang ada pada larutan

sehingga terbentuk endapan pada

suasana asam. Pada tabung reaksi II

yang ditambahkan dengan NaOH tidak

terjadi pengendapan karena pH nya

terlampau jauh dari titik isoelektrik

protein. Pada tabung reaksi III yang

ditambahkan dengan larutan

penyangga (buffer) pH 4,7

menghasilkan endapan yang banyak,

hal ini terjadi karena pH tersebut

merupakan titik isoelektrik protein.

4. Uji Koagulasi

Uji Koagulasi yang dilakukan pada

sampel larutan albumin memiliki dua

parameter yakni pengaturan nilai pH

dan suhu. Larutan albumin yang telah

dimasukan ke dalam tabung reaksi

ditambahkan dua tetes asam asetat

kemudian diletakkan dalam air

mendidih selama lima menit. Endapan

yang diperoleh kemudian diuji

kelarutannya dalam air dan pereaksi

Millon.

Gambar 4. Hasil Uji Koagulasi

Tabel 4. Hasil Koagulasi


I Air Bening

II Millon Endapan

putih

Penambahan asam asetat

menyebabkan albumin mengendap dan

menghasilkan hasil positif terhadap

pereaksi Millon dengan terbentuknya

kompleks warna endapan putih.

Endapan yang terbentuk adalah hasil

perubahan struktur tersier albumin.

Protein pada albumi terkoagulasi oleh

pemanasan pada suhu 600C.

Terjadinya koagulasi disebabkan

karena ion H+ dari CH3COOH terikat

pada gugus negatif pada protein.

Ketika ion H+ dari asam asetat masuk

ke dalam larutan, akan mempengaruhi

keseimbangan dan pengkutuban

muatan dari molekul protein. Kutub

muatan protein pada albumin yang

telah dipengaruhi oleh ion H+ dari

asam asetat menyebabkan konformasi

alamiah protein seperti struktur tersier

dan struktur kuartener protein pada

albumin akan rusak. Rusaknya

konformasi alamiah protein

menyebabkan terganggunya stabilitas

dari larutan albumin, sehingga larutan

albumin mengalami koagulasi.

5. Denaturasi Protein

Denaturasi sampel larutan albumin

dilakukan dengan larutan albumin

ditempatkan pada tiga tabung reaksi

yang kemudian pada tabung I

ditambahkan HCl, tabung II

ditambahkan NaOH, dan tabung III

ditambahkan buffer asetat pH 4,7.

Ketiga tabung ditempatkan pada air

mendidih selama 15 menit. Hasil pada

tabung I dan II ditambahakan buffer

asetast pH 4,7. Prinsip denaturasi

yakni pemecahan struktur sekunder,

tersier, dan kuartener dari protein

namun tidak untuk struktur primernya.

Tabel 5. Hasil Denaturasi


I HCl Terdapat

endapan

II NaOH Tidak ada

endapan

III Buffer

asetat

Terdapat

endapan

Hasil I Buffer

asetat

Terdapat

endapan

Hasil II Buffer

asetat

Terdapat

endapan

Gambar 5. Hasil Denaturasi

Proses denaturasi albumin terjadi

akibat pecahnya ikatan hidrogen,

ikatan garam, interaksi hidrofobik, dan

terbentuknya lipatan molekul protein

pada larutan protein.

Pada tabung reaksi I dengan

penambahan HCl 0.1 M terbentuk

endapan. Tabung reaksi II dengan

penambahan NaOH 0.1 M tidak

terjadi pengendapan, dan tabung

reaksi III ditambahkan buffer asetat

terdapat endapan. Tabung reaksi I

dan II didinginkan lalu pada tabung I

dan II ditambahkan Buffer asetat pH

4,7. Kedua tabung tersebut

menimbulkan endapan. Endapan

yang terjadi pada tabung I yang

ditambahkan HCl memiliki jumlah

paling banyak. Pada tabung reaksi III

yang ditambahkan buffer asetat

menghasilkan endapan karena

memiliki pH 4,7 yang sama dengan

pH albumin yaitu 4,5-4,9. Titik

isoelektrik memiliki hubungan

dengan sifat fisika dan kimia.. Titik

isoelektrik pada albumin adalah pH

4,5-4,9. Berdasarkan percobaan

albumin berdenaturasi lebih banyak

pada penambahan HCl, dengan

demikian dapat disimpulkan bahwa

pada protein albumin, asam amino

yang mendominasi adalah asam

amino yang bersifat asam.

Denaturasi yang umum ditemukan

adalah proses presipitasi dan

koagulasi protein seperti asam

amino, protein yang larut dalam air

akan membentuk ion yang

mempunyai muatan positif dan

negatif. Protein pada albumin akan

membentuk muatan positif pada

suasana asam, sedangkan dalam

suasana basa akan membentuk ion

negatif.

Simpulan

Pada percobaan ini digunakan

albumin putih telur, yang dihasilkan

positif protein pada uji biuret, uji

pengendapan alkohol dalam

suasana asam, uji koagulasi pada

millon, dan denaturasi pada proses

pemanasan dan susasana asam.

Adapun semua hasil yang didapat

berada dalam suasana asam, dan

ketika pada suasana basa protein

tidak mengalami reaksi positif

protein.

Daftar Pustaka

1. Kuchel, P. 2006. Biokimia.

Jakarta: Erlangga.

2. Sumardjo, D. 2008. Pengantar

Kimia Buku Panduan

Mahasiswa Kedokteran dan

Program Strata I Fakultas

Bioeksata. Jakarta: EGC.

3. Sunarya, Y. 2007. Mudah dan

Aktif Belajar Kimia. Bandung:

Setia Purna Inves.

reaksi uji protein_kelompok 7_b1

Documents