BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Alat penelitian yang digunakan adalah Spektrofotometri UV-

Visibel, pH meter, plat silica KLTP, neraca analitik, blender,

ayakan mesh 44, chamber, plat silica gel, penangas air, maserator,

gelas ukur 100 ml, beaker glass 50 ml, beaker glass 250 ml, beaker

glass 1000 ml, gelas ukur 10 ml, rak tabung, tabung reaksi, corong,

spatula, pisau, pipet tetes, thermometer, klem, statif, pipa kapiler

3.1.2 Bahan

Bahan penelitian yang digunakan adalah aquadest, Methanol p.a ,

n-heksan, etil asetat, etanol, buffer sitrat (pH 4), buffer fosfat (pH

7), serbuk KBr, pereaksi mayer, dragendorf, logam magnesium,

HCL 5 M, amil alkohol, FeCl3 larutan gelatin 1%, eter, vanillin

sulfat, pereaksi Lieberman-burchad, NaOH

3.2 Sampel Penelitian

Sampel penelitian adalah Biji Buah Galinggem (Bixa orelanna L)

yang diperoleh dari Kebun Percobaaan Tanaman Obat STIKes BTH

Tasikmalaya.

18

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Determinasi

Tujuan determinasi adalah untuk menetapkan kebenaran sampel

yang digunakan dalam penelitian. Determinasi tanaman galinggem

dilakukan dengan cara mencocokan ciri-ciri morfologi yang ada

pada tanaman galinggem terhadap kepustakaan Flora of Java

volume I, dan juga dilakukan identifikasi dan determinasi tanaman

galinggem, berdasarkan ciri fisiologis seperti daun, batang, serta

akar di Institut Teknologi Bandung.

3.3.2 Pembuatan Simplisia

Sampel diambil langsung kemudian diolah di Laboratorium

Farmakologi STIKes BTH Tasikmalaya. Biji buah galinggem

diolah dengan dikeringkan selama 3 jam dengan oven suhu 30o C.

Setelah sampel kering kemudian dihaluskan hingga halus bobot

simplisia yang didapat sebanyak 50 gram.

3.3.3 Skrining Fitokimia (Fransworth, 1966)

a. Pemeriksaan Saponin

Skrining fitokimia saponin dilakukan dengan cara sebanyak 10

mL larutan uji dalam tabung reaksi dikocok vertikal selama 10

detik kemudian dibiarkan selama 10 detik. Pembentukan busa

setinggi 1-10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit,

19

menunjukkan adanya saponin dan pada penambahan 1 tetes

HCl 2N, busa tidak hilang (Depkes RI, 1989).

b. Pemeriksaan Flavonoid

Skrining fitokimia flavonoid dilakukan dengan cara sebanyak 1

mL larutan uji diuapkan hingga kering, sisanya dibasahkan

dengan aseton P, ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat

P dan serbuk halus asam oksalat P, dipanaskan hati-hati di atas

penangas air dan dihindari pemanasan berlebihan. Sisa yang

diperoleh dicampur dengan 10 mL eter P. Diamati dengan sinar

UV 366 nm; larutan berflurorensensi kuning intensif,

menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Depkes RI, 1989).

c. Pemeriksaan Triterpenoid dan Steroid

Pada pemeriksaan triterpenoid dan steroid dilakukan dengan

menggunakan reaksi Liebermann Burchard. Larutan uji

sebanyak 2 mL diuapkan dalam cawan porselen. Residu

dilarutkan dengan 0,5 mL kloroform, setelah itu ditambahkan

dengan asam asetat anhidrat sebanyak 0,5 mL. Selanjutnya

ditambahkan 2 mL asam sulfat pekat melalui dinding tabung.

Adanya triterpenoid ditandai dengan terbentuknya cincin

kecoklatan atau violet pada perbatasan larutan, sedangkan

adanya steroid ditandai dengan terbentuknya cincin biru

kehijauan (Ciulei, 1984).

20

d. Pemeriksaan Minyak Atsiri

Skrining fitokimia minyak atsiri dilakukan dengan cara, larutan

uji dipipet sebanyak 1 mL kemudian diuapkan di atas cawan

porselen hingga diperoleh residu. Hasil positif minyak atsiri

ditandai dengan bau khas yang dihasilkan oleh residu tersebut

(Ciulei, 1984).

e. Pemeriksaan Alkaloid

Skrining fitokimia alkaloid dilakukan dengan cara sebanyak 2

mL larutan uji diuapkan di atas cawan porselen. Residu yang

terbentuk dilarutkan dengan 5 mL HCl 2 N. Larutan yang

dihasilkan dibagi ke dalam 3 tabung reaksi. Tabung pertama

berfungsi sebagai blanko yang ditambahkan dengan HCl 2 N,

tabung kedua ditambahkan 3 tetes pereaksi dragendorff dan

tabung ketiga ditambahkan 3 tetes pereaksi mayer. Hasil positif

adanya alkaloid terbentuknya endapan jingga dan kuning

(Farsnworth, 1966).

f. Pemeriksaan Tanin

Skrining fitokimia tanin dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL

larutan uji direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%,

adanya tanin ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru tua

atau hitam kehijauan (Robinson, 1991).

21

3.3.4 Ekstraksi Zat Warna dari Biji Galinggem (Bixa orelanna L)

Biji buah galinggem (Bixa orelanna L) yang sudah

dihaluskan ditimbang 250 gram kemudian dimaserasi dengan

pelarut methanol yang mengandung 1% HCl hingga semua biji

galinggem terendam (Lestario et al., 2011) Filtrat disaring dengan

kertas sarinng Whatman. Hasil filtrate diuji stabilitas, ditetapkan

kadarnya.

3.3.5 Pemekatan Ekstrak

Filtrat yang dipeoleh selanjutnya dipekatkan menggunakan

rotary evaporator pada suhu 60oC hingga diperoleh ekstrak pekat.

Ekstrak pekat yang diperoleh akan digunakan untuk menentukan

kadar bixin dalam Biji buah galinggem (Bixa orelanna L).

3.3.6 Pemantauan Ekstrak

Identifikasi bixin dalam Biji buah galinggem (Bixa

orelanna L) menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis

(KLT) ( Harbone, 1996). Plat KLT diaktivasi disalam oven pada

suhu 105oC selama 13-15 menit. Kemudian dubuat tanda 1 cm dari

bagian ujung bawah dan atas pada plat KLT. Ekstrak kental bixin

ditotolkan 1 cm dari bagian bawah plat KLT kemudian diangin-

anginkan hingga kering. Fase gerak yang digunkan dioptimasi

mana yang paling banyak menimbulkan bercak noda. Fase gerak

22

yang digunakan merupakan campuran dari pelarut organic polar

dan non polar atau semi polar. Bercak yang terbentuk diamati

dibawah lampu UV254 dan UV365 kemudian nilai Rf dihitung.

3.3.7 Penetapan Kandungan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Giusti dan

Wrolstad (2000) kandungan bixin total dapat ditentukan dengan pH

perbedaan (pH differensial). Ekstrak bixin dilarutkan kedalam

buffer KCl-HCl (pH 1) serta buffer NaOAc (pH 4,5) dengan

perbandingan ekstrak : buffer ( 1:5 v/v ). Larutan tersebut

diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang kemudian diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 470-700 nm.

Kemudian hasil dihitung dengan rumus :

Kemudian dimasukkan pada rumus :

Total bixin (mg/L)=

Keterangan :

A =

= Koefisien ekstingsi molar (L x mol-1 x cm-1)

23

= 26.900 molar

MW = bobot molekul (449,2 untuk sianidin 3-glukosida)

DF = faktor pengenceran

1 = tebal kuvet (1 cm)

103 = faktor konversi dari gram ke mg

3.3.8 Uji Stabilitas Warna Biji Buah Galinggem Terhadap pH

Ekstrak methanol Biji Buah Galinggem sebanyak 100 mg

dimasukkan kedalam gelas kimia dan ditambhakna pelarut

methanol-HCl 1 % kemudian ditambahkan HCl hingga mencapai

pH 4, 5, 6 dan 7 selanjutnya ditambahkan buffer sitrat atau buffer

fosfat. Semua zat dihomogenkan dan disaring menggunakan kertas

saring. Masing-masing filtarat yang diperoleh diperiksa

menggunakan spekrofotomer UV-Vis pada panjang gelombang

maksimal.

3.3.9 Uji Stabilitas Zat Warna dari Biji Galinggem terhadap suhu

Timbang ekstrak dengan seksama sebanyak 100 mg

dilarutkan dengan pelarutnya lalu disaring kemudian dipanaskan

pada suhu 50oC, 60 oC, 70 oC, 80 oC, 90 oC dan 100 oC, dinginkan

beberapa saat kemudian filtrate diukur absorbansinya

menggunakan spekrtofotometer UV-Vis pada panjang gelombang

maksimal

24

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman

Biji buah galinggem (Bixa orellana L) yang digunakan sebagai

sampel diperoleh dari Kebun Percontohan Tanaman Obat STIKes BTH

Tasikmalaya pada bulan April 2016. Sebelum digunkan biji buah

galinggem dideterminasi untuk memastikan identitas tumbuhan

berdasarkan sifat morfologi dan fisioligisnya. Determinasi tanaman

dilakukan di Laboratorium Herbarium Sekolah Tinggi Ilmu dan

Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung

Hasil determinasi menunjukkan bahwa biji buah gainggem yang

digunkan sebagai sampel berasal dari Divisi Magnoliophyta, Kelas

Magnoliopsida, Ordo Cistales, Famili Bixaceae, Genus Bixa,

Spesies Bixa orelllana L.

4.2 Preparasi Sampel

Biji galinggem yang diperoleh disortasi kering dari tanah dan

kotoran yang menempel. Kemudian dicuci dengan air hingga benar-

bernar bersih, setelah itu dikeringkan dengan cara diangin-anginkan.

Biji buah galinggem yang sudah kering kemudian dikeringkan di dalam

25

kotak berwana hitam dan diterangi oleh lampu pada suhu 40oC selama 3

hari hingga menjadi simplisia kering.

Pengeringan dengan sinar matahari tidak langusng atau dengan

menggunkan lampu bohlam 35-40oC bertujuan agar kandungan bixin

yang terdapat dalam biji buah galinggem tidak rusak, selain sebagian

zat warna bixin merupakan senyawa antioksidan sehingga secara umum

diketahui bahwa cahaya dan oksigen mampu mempercepat degradasi

bixin (Fennema, 1996; Nollet, 1996). Paparan cahaya dapat

menimbulkan degradasi molekul bixin sehingga kehilangan pigmen

warna berhubungan dengan hidrolisis bixin (Ozella, 2007)

Simplisia kering kemudian diserbukan menggunakan blender

kemudian diayak dengan ayakan mesh 44 hingga didapatkan serbuk

kasar biji galinggem. Ukuran partikel sampel dibuat kasar dengan

tujuan untuk ekstraksi maserasi karena untuk maserasi digunakan

sampel serbuk kasar. Hal ini berkaitan tujuan maserasi digunakan

sampel serbuk kasar. Hal ini berkaitan dengan tujuan maserasi yaitu

tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dengan jaringan

yang diekstraksi sehingga sampel yang digunakan tidak mudah rusak

(Guenther, 1987). Hasil penyerbukan simplisia biji galinggem yaitu

serbuk yang berwarna merah dan berbau khas. Untuk selanjutnya

serbuk biji galinggem merah dapat digunakan untuk skrining fitokimia.

26

4.3 Skrining Fitokimia

Hasil dari skirning fitokimia pada serbuk biji galinggem merah adalah :

Tabel 4.1 Hasil Skrining Fitokimia Serbuk Biji Galinggem

Golongan Senyawa Hasil

Alkaloid +

Flavonoid +

Tannin -

Polifenol -

Steroid/ Triterpenoid +

Saponin +

kuinon -

Keterangan :

(+) = mengandung senyawa

(-) = tidak mengandung senyawa

Dari hasil pengujian skrining fiotokimia pada serbuk simplisia biji

galinggem merah menunjukkan bahwa dalam serbuk ini mengandung

alkaloid, flavonoid, steoid dan saponin. Bixin merupakan salah satu

senyawa golongan apokarotenoid yang bersifat nonpolar. Senyawa

flavonoid ditandai dengan bagian yang kaya akan pigmen dan bixin

merupakan pigmen yang menghasikan warna kuning hingga merah.

Pada uji skirning fitokimia flavonoid menunjukkan hasil yang positif

27

karena bixin merupakan golongan senyawa flavonoid selain flavon,

flavonol, isoflavon, katekin dan proantosianidin ( Walker, 1995)

4.4 Ekstraksi Zat Warna dari Biji Galinggem

Metode ekstraksi yang digunkan yaitu metode maserasi. Serbuk bij

galinggem merah ditimbang 250 gram direndam dengan pelarut

methanol yang mengandung 1 % HCl pekat hingga semua serbuk biji

galinggem terendam kemudian dimaserasi dalam alat maserator

direndam 1 x 24 jam kemudian pelarut diganti hingga warna maserat

memudar. Lamanya maserasi tergantung pada intensitas warna yang

diperoleh dari proses ekstraksi.

Metode ini dipilih karena sifat bixin mudah rusak oleh sinar

matahari langsung dan pemanasan. Penekanan pada metode maserasi

ini yaitu tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dengan

jaringan yang diekstraksi (Guenther, 1987). Methanol merupakan

pelarut organic polar dimana bixin dapat dengan mudah larut, selain itu

titik didih meetanol yang rendah dapat mencegah kerusakan antosianin

akibat pemanasan yang tinggi serta proses pemekatan dapat lebih cepat.

Penambahan HCl 1 % pada methanol bertujuan untuk mendenaturasi

sel vakuola tanaman sehingga senyawa target dapat terlarut lebih

banyak terlarut dalam pealrutnya, selain itu bixin tidak stabil dalam

kondisi netral ataupun basa sehingga kondisi larutan harus bersifat asam

(Arisandi,2001)

28

Efesiensi ekstraksi bixin dan koefisien difusinya dipengaruhui oleh

suhu dan pH, smakin rendah pH maka koefisien distribusi akan semakin

tinggi, begitu juga dengan suhu. Namun bixin merupakan senyawa

fenolik yang termolabil sehingga berakibat pada penurunan

bioaktivitasnya (Turker dan Erdogdu, 2006). Maka penambahan HCl 1

% dalam ekstraksi bixin menyebabkan hidrasi sebagian hingga total

bikin yang terasetilasi sehingga akan mempengaruhi absrobansinya,

karena dari kedua pengaruh yaitu suhu dan pH, pengaruh pH lebih

signifikan daripada pengaruh temperature ( Revilla, 1998)

Hasil dari maserasi yang berwarna merah pekat pada hari pertama

dan hari kedua kemudian memudar di hari ke tiga dan selanjutmya.

Sesuai dengan prinsip maserasi yaitu “like dissolve like” methanol

menyari banyak zat warna yang ditandai dengan tersarinya maserat

yang berwarna pekat. Penambahan HCl membuat zat warna yang tersari

lebih banyak hal ini menandakan bahwa bixin stabil pada pH asam dan

dalam kondisi ini bixin berada dalam bentuk flavium klorida

4.5 Pemekatan Ekstrak

Maserat yang diperoleh dipekatkan menggunakan alat rotary

evaporator pada suhu 62oC hingga diperoleh ekstrak pekat, titik didih

methanol yaitu 64,5oC. Kemudian dituangkan kedalam wadah

penampung ekstrak pekat. Tujuan dari pemekatan ekstrak yaitu untuk

menguapkan pelarut berdasarkan titik didihnya lalu dipisahkan dari

29

senyawa analit dengan adanya kondensor dan pendingin balik sehingga

pelarut yang menguap berubah menjadi fasa cair sehingga yang terdapat

dalam labu penyari adalah ekstrak pekat.

Pemekatan pada suhu diatas titik didih akan merusak senyawa

yang diisolasi sehingga saat proses rotary evaporator harus diperhatikan

dengan baik. Penguapan yang dilakukan pada suhu tinggi akan merusak

senyawa analit maka dari itu penguapan yang baik dilakukan pada

kondisi vakum sehingga menghemat energy dan proses penguapan

berlangsung lebih cepat dan mencegah kerusakan bixin (Arisandi,

2001)

Setelah pemekataan diperoleh ekstrak kental yang berwarna merah

tua atau warna merah pekat. Selanjutnya ekstrak kental dapat ditentukan

selanjutnya mulai dari uji stablitas dan penetapan kadar.

4.6 Penetapan Kadar Bixin dari Ekstrak kasar

Berdasarkan Giusti dan Wrolstad (2001) dalam Lee (2005),

analisis kadar bixin dapat dilakukan dengan metode pH differensial.

Ekstrak kental dilarutkan dengan buffer KCl-HCl 1,0 dan buffer

NaOAc pH 4,5. Larutan dengan suasana pH yang berbeda diukur

absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ 470-700

nm dan aquadest sebagai blanko. Kandungan bixin total dalam ekstrak

biji buah galinggem dihitung ekivalen dengan sianidin 3-glukosida

30

Berdasarkan penelitian Giusti dan Wrolstad (2001) prinsip

penetapan konsentrasi bixin menggunakan pH differensial ini karena

bixin mempunyai ikatan rangkap terkonjugasi. Kondisi ini yang

dijadikan acuan dalam menentukan absorbansi menggunakan

spektrofotometer UV-Vis. Perubahan warna bixin disebabkan oleh

perbedaan stabilitas pada tingkatan pH

Lee (2005) menambahkan bahwa perbedaan absorbansi pigmen

pada panjang gelombang 470 nm sebanding dengan konsentrasi pigmen

sianidin-3-glukosida bixin terdegredasi dalam bentuk polimer yang

tahan terhadap perubahan warna tanpa pH, namun tidak termasuk

kedalam pengukuran absorbansi karena absorbansi yang dikehendaki

yaitu pada pH 1,0 dan pH 4,3. Hasil dar penentuan kadar bixin total

yang dihitung sebagai sianidin 3-glukosida menggunakan metode pH

diferensiasi yaitu 12,74 mg/L

4.7 Uji Stabilitas Zat Warna Biji Galinggem Terhadap pH

Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam pelarutnya yaitu

methanol-HCl 1% kemudian ditambahkan buffer sitrat (asam sitrat-

natrium sitrat) atau buffer fosfat hingga mencapai pH 4, 5, 6, dan 7.

Kemudian diukur absorbansinya menggunakan spktrofotometer UV-

Vis. Pengukuran pH ini untuk menunjukkan stabilitas bixin terhadap

perbedaan pH.

31

Dari hasil pengukuran didapat pH 4 menghasilkan absorbansi

0,654, pH 5 menghasilkan absorbansi 0,278 , pH 6 menghasilkan

absorbansi 0,104 dan pH 7 menghasilkan absorbansi 0,084. Semakin

naik nilai pH maka zat warna bixin semakin kurang stabil hal ini

ditandai dengan penurunan absorbansi yang terjadi karena adanya

perubahan atau pergantian gugus yang terikat pada struktur dasar posisi

ikatannya. Gugus krmofor dari senyawa ini menyerap radiasi

elektromagnetik sehingga menghasilkan absorbansi. Absorbansi

berbanding terbalik dengan nilai pH. Semakin tinggi nilai pH maka

absorbansinya semakin kecil (Panji, 2012)

4.8 Uji Stabilitas Zat Warna Biji Buah Galinggem Terhadap Suhu

Pada dasarnya zat warna memiliki karakteristik kestabilan

terhadapa pemanasan tersendiri. Bixin selain sebagai zat warna

merupakan senyawa antioksidan yang tidak stabil terhadap pemanasan

yang tinggi

Sebanyak 400 mg ekstrak kental biji buah galinggem ditimbang

seksama kemudian dilarutkan dalam 100 ml pelarutanya hingga

homogen. Kemudan dari larutan tersebut dimasukkan kedalam botol

vial dan dipanaskan pada suhu 40o, 50o, 70o, 80o, 90o, dan 100o selama 5

menit kemudaian diukur absorbansinya menggunakan spetrofotometer

Uv-Vis

32

Dari hasil percobaan menunujukkan semakin tinggi suhu maka

absorbansinya semakin besar, hal ini terjadi karena penguapan yang

terjadi pada pelarut yang digunakan yaitu methanol yang memiliki titik

didih 64,5oC sehingga yang terjadi adalah penguapan pelarut yang

sangat cepat sebanding dengan kenaikan suhu pemanasan. Semakin

besar suhu maka semakin besar absorbansi yang artinya pelarutnya

semakin mudah menguap maka ketika pelarut habis karena penguapan

yang akan kontak langusng dengan panas adalah senyawa bixin. Semaik

besar absorbansi maka semakin pekat larutan dan semakin cepat bixin

rusak. Dari hasil yang diperoleh menunjukkan adanya perubahan

karakteristik bixin pada suhu 90o bixin sudah memiliki rentang yang

cukup jauh dari suhu 80oC. Hal ini menunjukkan bahwa bixin sudah

tidak stabil pada suhu 90oC tetapi masih stabil pada suhu 80oC.

Kerusakan bixin disebabkan oleh dekomposisi bixin dari bentuk

aglikon menjadi kalkon (Wijaya et al., 2001)

Suhu pemanasan bersifat “irreversible” artinya tidak dapat kembali

menjadi bentuk semula seperti khalkon yang tidak berwarna tidak dapat

kembali menjadi kation. Bixin terdegradasi akibat dari suhu . (Arthey

dan Ashurst, 2001)

33

BAB V

SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan kadar zat warna bixin

pada biji buah galinggem (Bixa orellana L) yaitu 12,74 mg/L, stabilitas zat

warna bixin stabil hingga pH 4 dan pemansan pada suhu 80oC.

5.2 Saran

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai struktur senyawa

bixin yang terdapat dalam biji buah galinggem dengan isolasi senyawa

murni kemudan elusidasi struktur hingga diperoleh jenis bixin yang

spesifik.

34