ptek99-27.pdf

Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

TEKNIK PEMBUATAN KULTUR MEDIA BAKTERIYUSUF HIDAYAT DAN SUTARMA

Balai Penelitian Veteriner, JI.R.E. Martadinata 30, Bogor 16114.

RINGKASAN

Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri . Untukmenaikan tekanan osmose dan menjaga keseimbangan fisikokhemis sel-sel bakteri yangtumbuh, kedalam media harus ditambahkan NaCL. Wadah yang digunakan padapembuatan media dipakai alat-alat gelas dan stainless, sedangkan pH (derajat keasaman)media bisa diukur dengan kertas penunjuk, pH meter dan zat penunjuk . Untuk sterilisasimedia dapat dilakukan dengan uap air panas bertekanan (autoclave), uap air panas yangmengalir (steam) atau dengan saringan Seitz EK, sedangkan alat-alat gelas disterilisasidengan udara panas kering (oven) . Setiap batch media yang sudah dikontrol sterilitasdan mutunya harus disimpan pada suhu 5°C-8°C, selama belum/tidak dipakai .

PENDAHULUAN

Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik(mikroorganisme) . Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) .Didalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi,pengujian sifat-sifat phisis dan biokhemis bakteria serta untuk diagnosa suatu penyakit .Zat makanan yang dibutuhkan bakteri pada umumnya sangat bervariasi, dapatberbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek(majemuk). Untuk menumbuhkan bakteri pada tanah cukup dengan mempergunakansenyawa organik sederhana, tetapi bakteri patogen membutuhkan media' yangmengandung ekstrak daging bagi pertumbuhan dan perkembang biakannya. Ekstrakdaging mengandung antara lain : asam-asam amino dan pepton (Supar dan Ibrohim,1981) . Pepton adalah sebagai sumber/persediaan nitrogen bagi pertumbuhan bakteri,mudah larut dalam air, tidak rusak/menggumpal pada suhu tinggi dan juga berfungsisebagai buffer (penyangga) . Pepton dapat dibuat dengan pengasaman atau hidrolisadengan enzym dari protein hewani atau protein nabati, seperti : otot, hati, darah, susu,kasein, laktalbumin, gelatin dan kacang kedelai (Cowan, 1975) . Selain mengandung zatmakanan, media harus mengandung NaCL untuk menaikan tekanan osmose media .Tekanan ini sangat penting bagi keseimbangan fisikokhemis suatu sel bakteri yangtumbuh dalam media tersebut .

Lebih dari 200 macam media tersedia dan dikenal untuk pembiakan,pemeliharaan dan identifikasi bakteri, namun demikian tidak semua media dapatmendorong pertumbuhan bakteri . Ada bakteri tertentu yang memerlukan . media

149

TAHAPAN PEMEMBUAT MEDIA


spesifik/khusus untuk pertumbuhannya . Menurut jenis dan kegunaannya media dapatdikelompokan sebagai berikut : media dasar, media penyubur, media selektif, mediadisferensial dan media yang mengandung karbohidrat .

Unit Media Balai Penelitian Veteriner Bogor dalam penyiapan kebutuhan mediauntuk penelitian bakteriologi khususnya yang bersifat umum, dilakukan tahapan-tahapansebagai berikut : penimbangan, penggunaan bahan pelarut dan wadah, pengukuranderajat keasaman (pH), pengisian dan sterilisasi, kontrol sterilitas dan uji pertumbuhanserta penyimpanan .

Tulisan ini disajikan sebagai informasi cara membuat kultur media bakterisecara umum .

Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah

Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnyatinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yangharus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1982 dan 1994) .Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yangmempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) .

Untuk menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan(solubilitas) zat yang digunakan, merubah warna media jika kena panas, meracuni(bakterisidal) atau dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam pembuatannyadigunakan air suling (aquadest) sebagai pelarutnya . Sedangkan untuk wadah •tempatmelarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelaspiala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat daristainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinyakelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dankorosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akanbersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) .

Pengukuran derajat keasaman (pH)

Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangatpenting. Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampirsemua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yangtumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteritahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukanpada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bisadilakukan dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk .Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutanNaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N .

Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandungkarbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri .Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karenapH 7 .0 - 7.5 . Kemudian jika terjadi fermentasi karbohidrat oleh bakteri, maka media

1 50

Lokakarva Fungsional Non Pene lai 1999

akan berubah menjadi asam, pH nya akan turun yang menyebabkan warna . mediaberubah menjadi kuning . Bermacam-macam zat penunjuk yang biasa dipakai serta jarakperubahan warnanya dapat dilihat pada Tabel 1 .

Pengisian dan Sterilisasi

Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknyajangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan .. Untukbentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larutdan homogen. Sedangkan untuk pembuatan media agar plat . dimasukan kedalamerlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil .

Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uapair jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yangdiinginkan dengan tekanan uap airnya (Tabel 2) . Dengan sterilisasi sel-sel vegetatif danspora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bisadisterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya100°C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit,tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahan-bahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamindilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saringashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekanudara. Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering (hotair open), suhunya 160°C selama I jam atau 170°C selama 40 menit (Collin danPatricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptikdidalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dariudara. Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yangmasih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikiansehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung . Pengisian mediakedalam tabung/botol dan cawan petri yang biasa digunakan dapat dilihat pada Tabel 3 .Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan

Setiap batch media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontrol dahulusterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu 37"C selama 24jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang .

Beberapa sampel media yang sudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannyadengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agarBrilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC)digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG denganpertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC denganpertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah .

1 5 1

Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selainabelum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 5"C-8‚C .Beberapa contoh media siap pakai dapat dilihat pada gambar 1 .

st)It)1b+1ttlit)11 °1 t . -SC At1141I1)14+1fJ!111I t 11011+0f4I1)It)14I4 ° ° t t)tt4h1-0101t°1 4 44 4)a0 1uIt+11-04t)1 0 I01 411414 . Of t)It) 1 0It °1 f utt01014 1)ttIIU4t °+01444$1141-14)4+)14110Ift11+I1 . 01to1411t , It1 II °I tkoIt)Ift1U ,09t)ft4-04.4101t,14-)4it11)14111+0f ~OI1)141f011)11 14 , if+IIt1It114If+)tt)90lh °001ft10a41410a4 , 04 .144t' 11 1014014111VIt 111014111)141It4otoatiIV1o .4f-Oft4,+04 )01 1164)14)44ttz011)t4 .04 . 01 1 )a1110141of , it II IIt01014 .14, 90u 8 01f.1 0 4- 14-2W .e10a004- .04 t+)10 f411 4 , I1+14 04t01t111114 , 11 . 0Ito9t)I(I 01 . 04 °I ftV ,Z1146414f , 0411114

1

14+114 1,tiIIt0140a41

11'6 1 .bItIIt1&4 . 4 . 6 0 9 t0i °+ i1+1f )i1134+01 +1 t11114 , 11)14 , 14 to I111111fl-I6to9toIt)ttt °O f . 0ttf0ft) 9 412 4 °0 441111 t/ 441(t1 0 1t11411 . II If+) ftott)$4 , 1t , ~0010a01 0 1>s1)t04.14 )t u114 ,- 1+1 . 1410411t , 04of0 411t)It)1f .,04(Itfle(0C . 0#' . 10t404+)1ut1 ° ° ---e014, 4 4 844 ~11 1 1411+,1414 41016)9 4 +* ° . It 1 9 01t)I)It1auaa.ii + ))4

4ttlN

t A~I4

1 . :,, 11++) t11n

f

f O

a ti a (I 14),

152

Lokakarva Fungsionu! Non Penelitt 1999

Gambar 1 . Contoh media siap pakai

KEMUNGKINAN KESALAHAN YANG BISA TERJADIKesalahan pertama kemungkinan dalam penimbangan, pencampuran bahan,

penggunaan bahan yang salah serta pengukuran keasaman (pH) media . Kesalahanselanjutnya yang bisa terjadi antara lain adalah

° Berkurangnya kapasitas pertumbuhan : disebabkan oleh sterilisasiberlebihan (over sterilisasi), pencairan yang berulang dari media padat,tercampur dengan garam-garam logam, dan salah penggunaan moralitaslarutan yang dapat merubah pH .

° Penyusutan kekentalan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, hidrolisismedia yang mengandung agar karena pH rendah, dan pencairan berulangdari media padat .

f+ ° 1 f°))1U11+'t. .)40)1141)1a4' .+41 11 4 041 °1 -11141F 4191t01ltHtOS41t t)tt 14L,~ t t)t+ to 41

1) 1 , , 14' . t•1 014- . 4It °11~i4H~"tf 4 ) 1t)`

'14

''S141 ))1'4L f to 1 t*t

' 1t(0 9 00 91 °00 :,- )e ! t 10, 0° 00, ;1011$ , .04W °fv)


Warna menjadi keruh (gelap) : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan akibatterjadi karamelisasi karbohidrat (gula-gula), dan pemanasan yang tidak merata .

Perubahan pH : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pencampuran yang tidakmerata (homogen), hidrolisis dari bahan-bahan yang dipakai, menggunakan wadah yangbersifat alkali, dan pemanasan berulang .

Pengendapan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pemanasan media agaryang terlalu lama dengan temperatur tinggi, dan bahan-bahan yang dipakai tidak sesuai .

KESIMPULAN

Dalam pembuatan kultur media yang perlu diperhatikan adalah1 . Mengandung zat-zat makanan (nutrisi) yang bisa dipergunakan untuk

pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri .2 . Mempunyai tekanan osmosis/tegangan permukaan dan derajat keasamari (pH)

yang sesuai .3 . Tidak mengandung zat-zat penghambat/inhibitor dan bakterisidal .4 . Steril .

DAFTAR BACAAN

ANONYMOUS 1994 . Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents forMicrobiological and Clinical Laboratory Procedures . Tenth edition . Detroit,Michigan USA .

ANONYMOUS 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and otherLaboratory Service, Fifth edition . Basingstoke - England .

COLLIN.CH and PATRICIA M .LYNE 1987 Microbiological Method, Fifth edition .Butterworths, London .

COWAN ST 1975, Cowan and Steel's Manual for identification of medical bacteria .Second edition, Cambridge University Press . Cambridge .

SUPAR dan IBROHIM 1981 . Kultur Media dan Cara Pembuatannya . Balai PenelitianPenyakit Hewan Bogor .

1 5 3

154


Lampiran I

Tabel 1 . Zat penunjuk yang biasa dipakai untuk pembuatan kultur mediabakteri ')

") Surnber Cowan 1975 ; ") 30 nil NaOH I N ; x"x) 10 ml larutan penunjuk untuk 1 liter media

Tabel 2 . Hubungan antara suhu dan tekanan uap air jenuh pada sterilisasidengan autoclave ')

'' Sumber : Cowan 1975 Keterangan : 1 lb = 454 gram

Suhu (° C) Tekanan uap air Waktu Sterilisasi(menit)kg/cm2 Win'

100 0 0 -105 0,20 2,8 30110 0,43 6,1 25115,5 0,72 10,2 20121 1,06 15,0 15127 1,50 21,2 6134,5 2,11 30 2

PenunjukKonsen

trasi(%) xx )

PenambahanNaOH 0,05N per gram

penunjuk (ml)

PelarutJarak pH

Perubahan warnaasam ke basa

-Methyl red 0,2 - alkohol 50% 4,2-6,3 merah - kuning- Andrade's 0,5 30 "1 air 5 - 8 merah muda -

kuning (pink)-Litmus 2,5 - alkohol 40% 5 - 8 merah - biruBromcresolpurple

0,2 37 air/alkohol 50 % 5,2-6,8 kuning - unggu

Bromthimol blue 0,2 32 air/alkohol 50 % 6,0-7,6 Kuning - biru

Neutral red 0,1 - air/alkohol 50% 6,8-8,0 Merah - kuningPhenol red 0,2 57 air 6,8-8,4 Kuning - merah

Lampiran 2.

Tabel 3 . Pengisian kultur media kedalam botol, tabung clan cawan petri


Keterangan : Bentuk padat dalam tabung/botol untuk pembuatan media agar slope/agar miring

155

Alat gelasSpesifikasi Isi Media (ml)

Tinggi(cm)

Diameter(cm)

Isi(MI)

Cair SemiSolid

Padat

Tabung 10 1,20 8 5 5 412,50 1,50 17 8,50 8,50 7 .15 1,50 21 10 10 810 1,00 7 3,50 3,50 2,50

Botol- MacCartney 8 2,50 24 12 12 10- Universal 9 2,60 30 13 13 10,50- Universal 7.20 2,70 30 14 - 12- Bijou 4,80 2,00 6,50 3 3 2,50-Bijou 6,50 2,30 15,50 7 - 6-Roux 26,50 - 1100 - - 150Cawan petri 1,40 9,00 62,50 - - 15 - 20

1,20 6,50 35 - - 12- 151,60 11,50 125 - - 25 - 301,50 10,00 100 - - 20-25

I

ptek99-27.pdf

Documents