UAS BioTek Ridwan Firmansyah - 1209704029

Soal

Jelaskan tahapan dan strategi dalam produksi enzim menggunakan mikroba ? (max. 2 lembar)

Jawab :

Tahap-tahap dan strategi yang dilakukan dalam produksi enzim menggunakan mikroba :

1. Screening awal

2. Dikulturkan dalam media cair

Tujuannya adalah untuk mengamati pola pertumbuhannya dan menentukan waktu

produksinya. Konsentrasi sel dapat diukur dengan alat spektrofotometer dengan melihat nilai

absorbansinya (optical density). Kurva pertumbuhan diawali dengan fase awal (lag) yang

merupakan masa penyesuaian mikroba. Pada fase tersebut terjadi sintesis enzim oleh sel

yang dipergunakan untuk metabolisme metabolit. Setelah fase awal selesai, baru mulai

terjadi reproduksi selular. Konsentrasi selular meningkat, mula-mula perlahan kemudian

makin lama makin meningkat sampai pada suatu saat laju pertumbuhan atau reproduksi

seluler mencapi titik maksimal dan terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau eksponesial.

Selanjutnya setelah subtrat atau persenyawaan tertentu yang diperlukan untuk pertumbuhan

bakteri dalam media biakan mendekati habis dan terjadi penumpukan produk-produk

penghambat , maka terjadi penurunan laju pertumbuhan bakteri tersebut. Fase penurunan

ditandai oleh berkurangnya jumlah sel hidup (viable) dalam media akibat terjadinya

kematian (mortalitas).

3. Diidentifikasi dan diekstraksi kasar (crude extraction)

Setelah diidentifikasi, kemudian dilakukan ekstraksi kasar (crude extraction)

4. Disentrifugasi

Kemudian di sentrifugasi dengan 5000 rpm.

5. Pengendapan Ammonium sulfate

Sebelum dilakukan pemurnian dengan filtrasi gel, protease terlebih dahulu dipekatkan

menggunakan garam amonium sulfat. Pengendapan menggunakan garam didasarkan pada

kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan

garam, dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (pada pH

dan suhu tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan

kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Penambahan garam tertentu akan

Ridwan Firmansyah - 1209704029

UAS BioTek Ridwan Firmansyah - 1209704029

menyebabkan kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan

ion-ion garam semakin banyak yang akhirnya menyebabkan penarikan selubung air yang

mengelilingi permukaan protein, sehingga menyebabkan protein saling berinteraksi ,

beragregasi, dan kemudian mengendap. Amonium sulfat merupakan garam yang paling

sering digunakan untuk mengendapkan protein karena memiliki daya larut tinggi didalam air,

relatif tidak mahal.

6. Dimurnikan dengan kromatografi filtrasi gel

Terdapat beberapa metoda kromatografi kolom antara lain kromatografi filtrasi gel,

kromatografi penukar ion, kromatografi interaksi hidrofobik, dan kromatografi afinitas.

Pemilihan metode kromatografi kolom didasarkan pada sifat protein enzim yang dipisahkan.

Sehingga perlu dilakukan pencarian informasi tentang karakterisasi enzim tersebut, antara

lain perkiraan berat molekul, derajat hidrofobisitas, dan adanya ikatan sulfidril.

Kromatografi filtrasi gel merupakan teknik pemisahan protein berdasarkan pada ukuran

molekul. Matrik filtrasi gel merupakan gel yang berpori yang dikemas dalam kolom . Pori-

pori matrik dapat menampung molekul yang berukuran kecil dan memisahkannya dari

molekul yang mempunyai berat molekul tinggi, sehingga teknik ini dapat pula digunakan

untuk estimasi berat molekul. Protein yang berukuran besar akan keluar terlebih dahulu

daripada protein yang berukuran lebih kecil.

7. Hasil pemurnian dianalisis dengan Sodium Dodecyl Sulphate Polyachrilamide (SDS-

PAGE) gel elektroforesis

Protein hasil pemurnian dianalisa dengan Sodium Dodecyl Sulphate polyachrilamide Gel

Electroforesis (SDS-PAGE). Peralatan elektroforesis yang digunakan adalah tipe vertikal.

Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan sistem gel diskontinue yang terdiri dari stacking

gel dan separating gel. Marker yang digunakan adalah High molecular Weight. Satuan

berat molekul protein adalah Dalton (D).

8. Ditentukan karakeristik enzim yang diperoleh

Ridwan Firmansyah - 1209704029