Produksi Kultur Sel Tumbuhan

Pertanyaan pertama yang harus dijawab untuk aplikasi komersial kultur sel tanaman untuk

produksi bahan kimia kekhawatiran teknologi dan ekonomis kelayakan. Di pabrik prinsipnya

kultur suspensi sel dapat diperoleh dari tanaman apapun, meskipun beberapa tanaman yang lebih

mudah untuk membuat kultur sel daripada yang lain. Kendala utama, bagaimanapun, dianggap

sensitivitas geser sel tumbuhan. Jika dibandingkan dengan mikroorganisme, sel-sel tumbuhan

jauh lebih besar, terutama karena adanya vakuola besar. Sel tumbuhan menjadi seperti kantong

air dengan dinding sel tipis, ia berpikir bahwa diaduk dalam fermentor besar akan menyebabkan

sel-sel runtuh karena gaya geser yang diproduksi di aduk massa kental sel (stres hidrodinamik).

Sebuah studi oleh Wagner dan Vogel (1977) di mana ia mencatat bahwa produksi antrakuinon

dari garis sel citrifolia Morinda lebih rendah dalam fermentor diaduk daripada di fermentor airlift

telah berkali-kali dikutip sebagai contoh dari efek gaya geser pada sel . Namun, dalam hal ini

berpengaruh pada pertumbuhan sel kecil. Studi tentang pengaruh gaya geser oleh Meijer et al.

(1987) dan Leckie et al. (1990) pada kenyataannya menunjukkan bahwa sensitivitas geser sel

tumbuhan tidak seperti masalah seperti thought.In sel tumbuhan fakta dapat tumbuh di tangki

jenis diaduk bioreaktor, pengaduk geser rendah dapat menguntungkan untuk jalur sel lebih

sensitif. Hal ini juga ditegaskan oleh praktek, beberapa percobaan skala besar telah dilaporkan

dalam literatur, dan produksi komersial dari produk tanaman menggunakan jenis tangki diaduk

bioreaktor telah dicapai (Hibino dan Ushiyama, 1999; Westphal, 1990).

Teknologi yang layak, perekonomian suatu produksi bioteknologi sel tanaman adalah pertanyaan

penting lainnya. Sepuluh Hoopen dan rekan kerja (van Gulik et al 1988;.. Verpoorte et al 1991,

1999) membuat perhitungan biaya untuk berbagai jenis proses, berdasarkan desain untuk fasilitas

untuk sel tanaman produksi bioteknologi dari metabolit sekunder. Sebuah suspensi sel

Catharanthus roseus digunakan sebagai Model, dengan asumsi produktivitas 0,3 g / l Ajmalisin

per 2 minggu, yaitu sekitar maksimum yang telah dilaporkan untuk kultur sel tanaman ini.

Sebuah kepadatan biomassa dari 40 g / l (DW) diasumsikan dicapai dalam langkah pertama dari

proses. Setelah fase pertumbuhan ini dari 1 minggu, media diubah menjadi media produksi yang

mengandung 8% sukrosa (Knobloch dan Berlin, 1980). Sel-sel dipanen setelah 1 minggu dalam

medium produksi. Untuk menghasilkan 3.000 kg Ajmalisin alkaloid indole 6 bioreaktor dari 145

m3 diperlukan. Menghitung biaya berdasarkan depresiasi bioreaktor, dan biaya media dan

energi, harga US $ 1500 / kg disimpulkan. Dari jumlah ini sekitar 65% pergi ke depresiasi. Jika

produktivitas akan meningkat 10 kali lipat menjadi 3 g / l, dengan harga US $ 430 / kg dihitung.

Juga kemungkinan sistem produksi kontinyu dianggap. Dalam sistem seperti sel-sel yang tetap

hidup, dan produk dikumpulkan dari media. Ini, bagaimanapun, mensyaratkan bahwa produk ini

diekskresikan ke medium gratis di luar sel. Dalam sistem fed-batch yang dijelaskan di atas,

dengan kepadatan biomassa dari 40 g / l hampir tidak ada media gratis. Jadi untuk sistem

kontinyu seperti kepadatan biomassa harus menurun. Yang membutuhkan ukuran yang lebih

besar dari bioreaktor (250 m3) dan peningkatan biaya penyusutan, media dan energi. Bahkan

hasil ini dalam dua kali lipat harga dari yang dalam kasus budaya umpan curah system.In bahwa

produk ini tidak diekskresikan ke media, yang paling umum, langkah tambahan diperlukan untuk

permeabilize sel, yang lebih jauh meningkatkan biaya. Kesimpulan dari perhitungan ini adalah

demikian bahwa jenis batch atau makan-batch kultur suspensi sel adalah yang paling ekonomis.

Tujuannya demikian harus untuk meningkatkan produktivitas sel untuk datang ke proses

komersial.

Peningkatan

a. Screening, seleksi dan optimasi Media

Pendekatan paling umum digunakan yaitu screening, seleksi sel dengan produksi tinggi

dan optmimasi media tumbuh. Pendekatan ini telah banyak digunakan untuk sistem produksi

mikroba dan juga untuk sel tumbuhan seperti kultur Coptis japonicell dimana dihasilkan 7 g/l

(Sato et al., 1982; Sato and Yamada) dan untuk shikonin dengan produksi 3 g/l. Namun untuk

kultur sel produksinya kurang berhasil karena produk yang dihasilkan kurang stabil dan

beberapa subkultur awal produktivitasnya jauh lebih rendah (for a review see Ohta and

Verpoorte, 1992). Contohnya yaitu morfin, vinblastine dan vincristine yang tidak ditemukan

produk kultur sel awalnya. Dapat dikatakan bahwa untuk kultur sel tumbuhan dengan

pendekatan ini tidak dihasilkan produk apapun (nol).

b. Kultur dengan Sel berbeda

Metabolit sekunder merupakan produk turunan, dalam kultur sel suspensi tidak terjadi

produk turunan. Maka dari itu dilakukan penelitian dengan kultur in vitro pada sel yang berbeda.

Akar, tunas dan embrio dibudidayakan secara in vitro dan dihasilak kultur organ yang mirip

dengan metabolit sekunder. Contohnya yaitu alkaloid tropan hiosiamin dan skopolamin yang

dihasilkan dari kultur akar dan minyak esensial yang dihasilkan dari kultur tunas (diulas lihat,

mis, Oksman-Caldentey et al., 2000; Verpoorte et al., 1991),. Dari penelitian Doran dan

Narassu, dengan adanya transformasi Rhizogenes Agrobacterium atau yang disebut akar rambut

dapat diperoleh. Rhizogenes Agrobacterium atau akar rambut merupakan produsen yang baik

untuk metabolit sekunder akar contonya yaitu hyocyamus muticus . Namun, pendektan kultur

organ ini harus dilakukan dalam skala besar. Meskipun dalam pendekatan ini digunakan

bioreactor yang baik untuk kultu akar dan tunas, produksinya memerlukan biaya yang sangat

mahal. Contohnya yaitu akar ginseng (Hibino and Ushiyama, 1999).

c. Imobilisasi Sel

Immobilisasi yaitu …... Pendekatan lain yang dilakukan yaitu imobilisai sel dimana

produktivitas dapat ditingkatkan dengan adanya interaksi sel. Pendekatan ini juga dilakukan

dalam skala besar.

d. Elisitasi

Sebuah pendekatan lain untuk memperbaiki produk yang dihasilkan pada kultur sel

tanaman adalah alterasi metabolisme sel melalui faktor-faktor eksternal, misalnya faktor stress,

penambahan ion logam berat dan garam anorganik. . Enzim-enzim dari metabolisme sekunder

juga diinduksi oleh pathogen yang menginvasi yang menghasilkan fitoaleksin. Dalam hal ini

elicitor berperan penting dalam menginduksi enzim yang terlibat dalam siklus metabolisme.

Fitoaleksin itu sendiri merupakan senyawa antibiotik yang mempunyai berat molekul rendah,

dan dibentuk pada tumbuhan tinggi sebagai respons terhadap infeksi mikroba patogen. Senyawa

yang merupakan bagian dari mekanisme tersebut dapat dianalogikan dengan antibodi yang

terbentuk sebagai respons imun pada hewan. Induksi ini dikarenakan molekul yang terbentuk

dari degradasi dinding sel tumbuhan atau dinding sel mikroba.

Sebagai respon terhadap stres faktor, seperti kejutan osmotik, penambahan ion logam

berat, garam anorganik, homogenat mikroba atau radiasi UV, akumulasi beberapa metabolit

sekunder dapat ditingkatkan pada tanaman atau kultur sel tanaman. Pada tumbuhan jalur

metabolit sekunder tertentu yang disebabkan oleh infeksi dengan mikroorganisme. Senyawa

yang terbentuk adalah phytoalexins, senyawa molekul rendah berat badan dengan aktivitas

antimikroba (Smith 1996). Induksi adalah karena molekul tertentu yang terbentuk dari degradasi

dinding sel tanaman atau dinding sel mikroba. Ini disebut Elisitor biotik juga dapat digunakan

untuk memicu produksi phytoalexins dalam kultur sel tanaman. Ini menawarkan model yang

sangat baik untuk mempelajari sistem pertahanan tanaman. Sejumlah turunan fenilpropanoid

bertindak sebagai agen defensif terhadap cekaman biotik atau abiotik (Dixon dan Paiva, 1995),

oleh karena itu sebagian besar kemajuan yang telah diperoleh pada penjelasan jalur ini dan

regulation.Elicitation mereka juga dapat diterapkan pada skala besar untuk mendorong produksi

senyawa tertentu di pra-waktu yang ditetapkan dalam proses; Selain itu, produk ini sering

diekskresikan ke medium, sehingga sel-sel dapat didaur ulang dan re-menimbulkan. Kurz et al.

(1987) menunjukkan bahwa untuk produksi sanguinarine dalam kultur sel poppy, proses yang

berkesinambungan layak di mana urutan elisitasi dan perubahan media dapat digunakan untuk

menghasilkan alkaloid ini. Juga dalam kasus produksi paclitaxel elisitasi telah terbukti

menyebabkan peningkatan yang jelas dalam produktivitas (Laskaris et al., 1999). Sayangnya,

sebagian besar metabolit sekunder tanaman bunga tidak phytoalexins. Akibatnya produksi

mereka tidak diinduksi atau meningkat sebesar elisitasi. Di sisi lain, elisitasi dari kultur sel

tanaman dapat menyebabkan produksi dalam jumlah besar untuk setiap tanaman metabolit

sekunder tertentu, yang menawarkan sumber yang menarik dari chemodiversity untuk skrining

untuk pelanggan baru untuk pengembangan obat (McAlpine dkk., 1999).

Hal demikian dapat disimpulkan bahwa untuk produksi komersial budaya suspensi sel

tanaman yang sangat memproduksi adalah yang paling menjanjikan. Penelitian demikian harus

fokus pada metode untuk meningkatkan produktivitas, dengan meningkatkan laju pertumbuhan

dan dengan meningkatkan akumulasi metabolit sekunder. Untuk ini, rekayasa metabolik

menawarkan perspektif yang menarik untuk meningkatkan produktivitas pabrik sel tanaman.

Akibatnya dalam beberapa tahun terakhir satu telah pergi ke studi tentang jalur

biosintesis, dengan tujuan untuk memetakan jalur lengkap, mengidentifikasi tingkat

kemungkinan membatasi langkah, dan mempelajari lebih lanjut tentang peraturan (Dixon, 1999;

Facchini, 2001; Hashimoto dan Yamada, 1994 ; Kutchan, 1995; Verpoorte et al, 1998, 1999;.

Zenk 1991, 1995). Informasi ini akhirnya harus mengarah pada pendekatan baru untuk

meningkatkan sekunder produksi metabolit dalam tanaman atau kultur sel tanaman. Rekayasa

metabolik jelas membutuhkan pengetahuan menyeluruh dari semua langkah dalam jalur, dan gen

yang mengkode langkah-langkah. Pemetaan biosintesis jalur merupakan langkah pertama dalam

pendekatan ini.

PEMETAAN JALUR BIOSINTESIS

Pengetahuan tentang jalur metabolit sekunder pada kenyataannya terbatas. Sebagian

besar pengetahuan kita didasarkan pada pekerjaan dari tahun 1960-an, 1970-an, ketika banyak

pekerjaan dilakukan dengan makan berbagai zat antara berlabel radioaktif. Berdasarkan

penggabungan dan argumen kimia kemudian jalur yang diperkirakan untuk sebagian besar kelas

metabolit sekunder, dan dalam senyawa penting secara farmasi tertentu. Namun, banyak

langkah-langkah individu masih belum jelas, karena tidak ada zat antara yang tersedia untuk

menguji langkah-langkah. Meskipun banyak pekerjaan yang baik dilakukan di sepanjang garis-

garis ini, melihat penggabungan radioaktivitas juga membawa risiko bahwa radioaktivitas masuk

ke produk akhir bersama dengan cara yang berbeda dari yang diharapkan, misalnya, setelah

kerusakan prekursor ditambahkan dan penyaluran berikutnya ke dalam produk akhir bersama

jalur yang berbeda. Contoh terbaik dari ini mungkin adalah biosintesis terpenoid. Banyak

penelitian telah dilakukan pada penggabungan mevalonate di berbagai terpenoid, termasuk

alkaloid indol terpenoid juga (Banthorpe et al, 1972;. Cordell, 1974) .Tapi dalam tahun terakhir

telah menunjukkan bahwa ada biosintesis terpenoid lain jalur yang tidak pergi melalui

mevalonate, tetapi melibatkan deoxyxylose sebagai perantara penting (Rohmer, 1999;

Lichtenthaler, 1999). Karena tampaknya jalur plastidial ini menyebabkan karotenoid, monoand

diterpenes. Juga alkaloid indol terpenoid baru-baru ini terbukti berasal dari jalur ini (Contin et al,

1998;.. Eichinger et al, 1999). Keterlibatan jalur ini dalam biosintesis alkaloid dilakukan melalui

pendekatan retrobiosynthetic, di mana prekursor sangat awal seperti gula atau piruvat, label

khusus pada satu posisi dengan label 13C, dimasukkan ke pabrik, organ tanaman atau tumbuhan

sel. Dengan cara NMR-analisis produk, jalur biosintesis yang terlibat dapat disimpulkan

(Eisenreich dan Bacher, 2000). Masih ini hanya menunjukkan rute yang dilalui, tetapi langkah-

langkah individu masih perlu dibentuk. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan memberi makan

dengan intermediet berlabel yang diusulkan, atau dengan inkubasi in vitro dari ekstrak protein

dari tanaman memproduksi dengan intermediate dan jika perlu, co-faktor yang mungkin

dibutuhkan untuk reaksi yang diharapkan. Kedua pendekatan ini terhambat oleh fakta bahwa

antara mungkin tidak tersedia, dan bisa sulit untuk mendapatkan oleh isolasi dari bahan tanaman

atau sintesis. Dalam kasus in vivo tes ada kemungkinan bahwa perantara tidak mencapai lokasi

yang tepat untuk konversi, dan bukannya diubah menjadi produk lain. Dalam kasus uji in vitro,

masalahnya mungkin bahwa enzim tidak dapat dipisahkan dalam bentuk aktif stabil. Ini juga

mungkin bahwa agregat enzim bertanggung jawab atas serangkaian langkah-langkah berikutnya,

yang tidak dapat dipisahkan menjadi individu contoh reactions.For dalam biosintesis flavonoid

dalam Arabidopsis beberapa enzim tampaknya dikumpulkan (Burbulis dan Winkel-

Shirley,1999).

Dalam mikroorganisme satu telah menggunakan mutan untuk identifikasi enzim dan gen

yang terlibat dalam langkah-langkah tertentu. Pendekatan ini dapat diterapkan ketika sejumlah

besar mutan dapat dengan mudah diperoleh dan tumbuh. Hal ini membutuhkan analisis semua

mutan untuk akumulasi perantara. Dalam kasus senyawa berwarna ini dapat dengan mudah

dilakukan secara visual. Hal ini antara lain alasan bahwa salah satu yang terbaik dipelajari jalur

biosintesis pada tanaman adalah salah satu yang mengarah ke anthocyanin (Davies, 2000; Holton

dan Cornish, 1995; Mulder-Krieger dan Verpoorte, 1994). Mutan dalam warna bunga dapat

dengan mudah dibedakan dengan mata. Ketersediaan berbagai intermediet untuk konfirmasi

kegiatan enzim juga untuk pendekatan ini biologi akhirnya important.Molecular menawarkan

beberapa pendekatan baru untuk kloning gen. Dalam kasus metabolisme sekunder, mereka

memiliki penerapan yang terbatas. Misalnya, hasil transposon tagging pada tanaman yang

mungkin diblokir pada langkah tertentu, tetapi seperti dengan mutan, ini mensyaratkan bahwa

seseorang dapat mengidentifikasi blok. Ini berarti analisis sejumlah besar plants.The pendekatan

yang lebih menjanjikan adalah kombinasi dari analisis Transkriptome, proteome dan

metabolome, dan membandingkan tanaman atau sel-sel tanaman yang menghasilkan atau tidak

menghasilkan senyawa yang menarik. Pendekatan ini sekarang sedang dikembangkan di banyak

tempat (Jacobs et al, 2000;. Fiehn et al, 2000;. Trethewey, 2001). Masalah utama adalah bahwa

tidak ada langsung hubungan logis antara metabolome dan proteoma, karena merupakan kasus

untuk proteome dan gen. Selain itu, tiga tingkat memiliki kinetika yang berbeda, sehingga

mereka perlu dihubungkan melalui waktu melalui metode statistik. masalah dengan proteoma

adalah bahwa hal itu akan sulit untuk memetakan semua protein (Jacobs et al., diterima untuk

diterbitkan). Selain itu, untuk metabolisme sekunder ada masalah tingkat yang sangat rendah

protein yang terlibat jika dibandingkan dengan metabolisme primer. Dalam hal orang dapat

dengan mudah mengisolasi jaringan memproduksi tertentu, seperti misalnya rambut kelenjar atau

lateks (Fairnbairn dan Steele, 1981;. Paniego et al, 1999) satu set yang lebih spesifik enzim dapat

diperoleh. Dalam tahun-tahun mendatang metode baru perlu dikembangkan untuk mengatasi

permasalahan tersebut.

Dalam kesimpulan untuk saat ini pendekatan klasik mengidentifikasi setiap langkah

individu dalam langkah biosintesis, dan kemudian isolasi enzim dan kloning gen encoding

tampaknya cara paling pasti untuk mencapai tujuan pemetaan jalur biosintesis. Dengan cara ini

tropane, isoquinoline dan jalur biosintesis alkaloid indol sedang dibedah dan informasi yang

diperoleh dari studi ini sedang diterapkan untuk rekayasa metabolik (Facchini, 2001; Hashimoto

et al 1993;. Kutchan, 1995; Sato et al., 2001; Verpoorte et al, 2000;. Verpoorte dan Alfermann,

2000; Yun et al., 1992).

Airlift fermentor (ALF) umumnya diklasifikasikan sebagai reaktor pneumatik tanpa

pengaturan pengadukan mekanis untuk pencampuran. Turbulensi yang disebabkan oleh aliran

fluida menjamin pencampuran yang memadai dari cairan. Draft tube disediakan di bagian tengah

reaktor. Pengenalan cairan (air / liquid) menyebabkan gerakan ke atas dan menghasilkan aliran

peredaran darah di seluruh reaktor. Para kecepatan udara / cairan akan rendah dan karenanya

konsumsi energi juga rendah. Alfs dapat digunakan untuk kedua sel bebas dan amobil. Ada

sangat sedikit laporan tentang Alfs untuk produksi metabolit. Keuntungan dari reaktor Airlift

adalah penghapusan efek gesekan umumnya ditemui dalam reaktor gelisah mekanis. Hal ini

cocok untuk budaya aerobik sejak koefisien perpindahan massa oksigen yang cukup tinggi

dibandingkan dengan reaktor tangki berpengaduk. Ini sangat ideal untuk produksi SCP dari

metanol sebagai substrat karbon. Hal ini digunakan terutama

untuk menghindari kelebihan panas yang dihasilkan selama agitasi mekanik.

Kesimpulan

Kultur sel tanaman dalam skala besar telah terbukti layak untuk produksi industri.

Namun, untuk phytochemical saat ini digunakan hanya untuk proses beberapa telah berhasil

dikembangkan. Untuk yang lain produksi terlalu rendah untuk bersaing dengan metode produksi

ini ada. Sebagai pasar untuk sebagian besar produk yang mapan, dan keuntungan kecil, sedikit

uang yang tersedia untuk berinvestasi dalam produksi bioteknologi baru. Dengan kapasitas besar

penyaringan throughput tinggi untuk senyawa biologis aktif yang baru, tanaman merupakan

sumber yang sangat menarik dari chemodiversity untuk program skrining tersebut. Hal ini tentu

akan menghasilkan obat yang berasal dari tanaman baru. Kultur sel tanaman tawarkan di sini

kemungkinan untuk produksi selama fase pertama dari pengembangan obat, di mana juga

metode produksi lainnya dapat dipertimbangkan. Hal ini akan menghindari masalah seperti yang

dihadapi dengan pasokan paclitaxel. Rekayasa metabolik adalah dalam konteks ini alat penting

untuk meningkatkan pabrik sel tanaman untuk produksi phytochemical yang diinginkan. Hal ini

dapat digunakan baik untuk tanaman dan kultur sel tanaman, dan bahkan jalur pendek

(bioconversions) dapat diperkenalkan ke mikroorganisme. Namun, perlu pengetahuan dasar

tentang jalur dan regulasi. Seperti banyak langkah dalam jalur biosintesis melibatkan aspek

fisiologis (misalnya, transportasi, akumulasi) dan tidak langsung terkait dengan reaksi kimia,

penggunaan gen pengatur dapat menjadi alat penting untuk meningkatkan dengan seluruh jalur.