Media Kultur

3. Formulasi media

Pada awal penelitian, media yang digunakan berupa cairan tubuh.◦ Cairan plasma, limfe, serum dan ekstrak jaringan.

Media basal awal◦ Garam, asam amino, gula, vitamin –

disuplementasi dengan serum

Define media

Formula define media

a. Ion-ion anorganik• Keseimpangan osmotik dan volume sel

b. Unsur mikro (trace element)• Cofactor untuk reaksi biokimiawi (Zn, Cu)

c. Asam amino• Sintesis protein• Glutamin dibutuhkan dalam konsentrasi tinggi

d. Vitamin• Metabolik coenzim untuk replikasi sel

e. Sumber energi• glukosa

f. serum

Formula define media (lanjutan

Serum menyediakan◦ Nutrisi dasar◦ Hormon dan growth factor◦ Faktor untuk penempelan dan penyebaran sel◦ Protein pengikat (binding protein): albumin,

membawa hormon, vitamin, mineral dan lipid◦ Protease inhibitor◦ pH buffer

4. Fase gas

a. Oksigen, diperlukan untuk• Metabolisme aerob• Kandungan di atmosfer 20%• Kandungan dalam jaringan 1-7%

b. CO2

• Sebagai buffer

5. Monitoring pH

a. pH fisiologis ± 7

b. pH dapat mempengaruhi:◦ Metabolisme sel◦ Laju pertumbuhan sel◦ Sintesis protein◦ Ketersediaan nutrien

c. Co2 bertindak sebagai agensia pembuffer dalam kombinasi dengan bikarbonat dalam media

6. Temperatur dan Kelembaban Temperatur normal tobuh hewan endoterm

37°C Kelembaban harus dipertahankan pada

level jenuh -- evaporasi dapat mengubah◦ Osmolaritas◦ Volume media dan bahan aditif

Animal cell culture can be described as in vitro maintenance and propagation of animal cells using a suitable nutrient media.

Culturing is a process of growing animal cells artificially.

The most important and essential step in animal cell culture is selecting appropriate growth medium for in vitro cultivation.

The selection of the medium depends on the type of cells to be cultured and also the purpose of the culture:

growth differentiation, or even production of desired products like pharmaceutical compounds.

Animal cells are cultured using a completely natural media, or an artificial media along with some of the natural products.

Introduction:

In the early years of this in vitro cultivation of animal cell culture technique natural media are obtained from biological sources were used. For eample 1. Body fluid such as plasma, serum, lymph, amniotic fluid and much more are used. These fluids used as animal cell culture media after testing for toxicity and sterility.

2. Tissue extract such as extract of liver, spleen, bone marrow and leucocyes also used as animal cell culture media. But most commonly used tissue extract is from chick embryo.

3. Plasma clots are also used as media for animal cell culture and now they are commercially produced as culture media.

4. Bovine embryo extract are also prepared using bovine embryos of up to 10days age, and are used as animal cell culture media.

Natural Media:

1. The artificial media contains partly or fully defined components.

2. The basic criteria for choosing a artificial media for animal cell culture are the culture media should provide all the required nutrients to the cell.

3. Media should maintain the physiological pH at around 7 with the help of buffering system.

4. The animal cell culture media should be sterile, and isotonic to the culturing cells. The basis for the animal cell culture media is the balanced salt solution, which are used to create a physiological pH and osmolarity required to maintain the animal cells in vitro or in laboratory conditions.

5. For promoting cell growth and proliferation, many types of animal cell culture media are designed by adding or varying different constituents. For example serum containing media and serum-free media.

Artificial Media:

Apakah keunggulan dan kelebihan media alami???

PLASMA

Ross Harison : Menumbuhkan potongan kecil jaringan (1907) dari dekat pipa syaraf dalam jendalan

limpe katak

Carrel (1910) : Jendalan plasma sbgai media kultur Sekarang bukan sebagai media kultur melainkan sbg matriks melekat sel /penyokong

Digunakan terutama pada kultur jaringan tradisional: Koagulum

1. Menyediakan substrat dan struktur penyokong yang mengandung nutrisi pada berbgai tipe kultur

◦ Penyediaan matriks bagi sel baru selama proses penyembuhan luka pada tubuh

2. Memfasilitasi perlekatan sel pada permukaan gelas

3. Menyediakan sarana proteksi terhadap trauma terhadap sel akibat proses sub-kultur dan pergantian media

4. Menyediakan “kantung” medium di sekitar sel

Keunggulan plasma

Karena : 1. plasma lebih jernih 2. Kadar Ca darah lebih konstan 3. koagulum lebih kental

4. Hewan sumber mudah didapat 5. Prosedur pembuatan sederhana dan mudah

Plasma ayam dewasa lebih baik dari plasma mamalia

Ayam Jantan muda

Pengambilan darah

◦Ayam: sayap, jantung , arteri carotid

◦Mamalia: carotid arteri, jantung

◦Perlu penambahan antikoagulan: heparin dan EDTA

Centrifugasi darah

Pengambilan plasma

Prosedur pembuatan plasma

Prosedur pembuatan plasma

Gambar 1. Pengambilan darah dari vena Gambar 2. Pengambilan darah intrakardial cara 1.

Gambar 3. Pengambilan darah intrakardial cara 2. Gambar 4. Arteri carotis pada ayam

Cara pengambilan darah pada ayam

Pengambian darah ayam dari vena branchial

Teknik pengambilan darah ikan

Caudal vain puncture

Caudal Peduncle cut

Cardiac puncture

Serum: plasma tanpa fibrinogen Dapat digunakan sebagai medium utuh

atau sebagai suplemen

◦des Ligneris (1928): kultur sel mamalia

◦Parker (1933, 1936): kultur jaringan ayam

◦Simms (1936), Simms dan Sanders (1942): ultrafiltrat serum sebagai madium dasar untuk berbagai tujuan ternasuk menumbuhkan virus

◦Risher et al. (1948): growth factor bermolekul rendah penting untuk kultur

Serum

1. Serum media is an example for natural media. Natural media are very useful and convinient for a wide range of animal cell culture. But they also have got some disadvantages such as poor reproductability due to lack of knowledge of exact composition of these natural media.

2. Major reasons for using synthetic media are for immediate survival of cells, for prolonged survival, for indefinite growth and also for specialized functions.

a. Balanced diet solution with specific osmotic pressure and pH are used for the immediate survival

b. Serum or balanced salt solution along with amino acids, oxygen, vitamins and serum proteins are used for long survival.

c. Minimum Essential Medium also known as Eagles media are used for mammalian cell culture

d. Role of serum in animal cell culture is very complex and also it contains mixture of many biomolrcules such as growth factors and also growth inhibitory factors.

SERUM MEDIA

1. Serum is bound to proteins and basic nutrient in solution.

2. Serum also contains hormones and growth factors, which play a major role in stimulating cell growth and function

3. Serum also helps in attachment of the cells

4. Serum also acts as spreading factor.

5. Serum also function as binding protein such as albumin carrying factor

6. Serum also helps in carrying hormones, vitamins, minerals, lipids and much more biological substances.

7. Serum also minimizes mechanical damage and also damage caused by viscosity

8. Serum also acts as natural buffering agent and helps in maintaining the pH of the culture media.

The function of Serum

1. Serum may contain inadequate amount of cell specific growth factors and may need to suppliment the media or it may also contain in abundance of cytotoxic compounds.

2. Serum media has got high risk of contamination with virus, fumgi and mycoplasma.

3. There is no uniformity in the composition of serum, as still we do not know the exact composition of the serum

4. Special tests are done to maintain the quality of the each batch of serum before it is used in cell culture media.

5. Serum may also contain some of the growth inhibiting factors, these in turn will inhibit the cultured cell growth and proliferation.

6. Serum availability is restricted as they are extracted from cattle

7. Presence of serum in the culture media may interfere with the purification and isolation of cell culture products, such as pharmaceutical compounds. Due to this additional steps are added for the isolation of cell culture products.

Disadvantage of Serum in Media:

As using serum in animal cell culture media has got some disadvantages, to overcome this serum free media are designed and developed.

Advantages of Serum Free Media:

1. Main and important advantage of serum free media is scientists or researchers can control the growth of cultured cells as required by changing the composition of the media.

2. Serum free media can be designed using specific factors, which will help in differentiation of cultured cells with specific desired functions.

Serum Free Media:

1. cell proliferation is very slow in serum free media.

2. Cultured cells may need more than one type of media to obtain desired cell culture products.

3. Purity of reagents used in the serum free media

4. Availability

Disadvantages of Serum Free Media:

serum

Serum

Serum Autolog

Serum Heterolog

Sumber Serum

Manusia Dewasa

Kuda

Tali Pusar

Fetus sapi

PalingBaik

Pembuatan SerumPembuatan Serum

Penjendalan Penyaringan UjiSterilitas

Penyimpanan

Pembekuan(Jangka Panjang)

Temperatur LemariPendingin

(Beberapa Minggu)

Pengambilan darah (tanpa anti koagulan)

Pembekuan darah Centrifugasi

( 3000rpm) Pengumpulan

serum

Prosedur pembuatan serum

Komponen SerumKomponen Serum

Healy dan Parker

Orosomukoid (α1= acid glikoprotein)

α2 makroglobulin

Hilang dari medium selama kultivasi mencit

Makroglobulin

Dalam keadaan terpisah (α1= acid glikoprotein dan α2 makroglobulin) memiliki efek kecil dalam merangsang pertumbuhan.

Tetapi, secara bersama-sama efek pertumbuhannya mencolok dan dapat menggantikan serum.

Molekul-molekul non-protein Ex: Dextran/ficol

Acid glikoprotein Tidak dapat digantikan

Serum sering bersifat toksik dan toksisitas dapat dikurangi

dengan pemanasan 60OC selams 30 menit

Cara mendapatkan darah dari tali pusar yaitu dengan membiarkan darah menetes sendiri dan ditampung dalam suatu wadah darah dibiarkan menjendal serum yang terbentuk dipisahkan dengan hati-hati dengan jalan memipetnya disentrifugasi disimpan dalam suhu kamar selama 2 atau 3 minggu

Serum Darah Tangkai Ari-AriSerum Darah Tangkai Ari-AriDr.Gey dan Dr. Margaret Murray

PengurutanTuk mengel darah

Pengumpulan darah dari tali pusat

Cairan AmnionCairan Amnion

Cara:

Bagian luar uterus sapi dicuci, digantung, area dekat pangkal uterus diolesi yodium/ betadin.

Setelah kering dimasukan dalam tocar, disiapkan tabung canula dan tabung penampung untuk menyadap cairan amnion.

Cairan amnion disterilisasi, siap digunakan.

Amnion yang paling baik adalah amnion sapi

Cairan Asites dan Cairan PleuraCairan Asites dan Cairan Pleura

Cairan ini diperoleh dari cairan asites pasien dengan carsinomatis peritonial.

Bahan ini diperoleh dari rumah sakit dan dapat digunakan secepat mungkin setelah disterilkan.

Dianjurkan untuk menguji toksisitasnya karena beberapa pasien yang menjadi sumber cairan ini sedang mendapat terapi medik dan beberapa obat dalam cairan tersebut dapat bersifat toksik.

Humor AkuosaHumor Akuosa

Humor akuosa dari mata telah diusulkan sebagai suatu nutrien yang baik untuk kultur karena in vivo cairan ini sebagai satu-satunya sumber

nutrisi untuk epitel retina

SumberTerbaik

Mata lembu jantan

Serum UltrafiltrasiSerum Ultrafiltrasi

Komponen penting dalam serum adalah molekul molekul yang lebih besar: protein dan material

yang terikat pada protein.

Serum yang diultrafiltrasi merupakan nutrien pensuplemen yang sangat berguna.

Pembuatannya memerlukan alat khusus. Serum ultrafiltrasi telah tersedia secara

komersial dan dapat dipakai sebagai suplemen berdaya guna dalam menumbuhkan jaringan yang sangat dibutuhkan.

Serum DialisisSerum Dialisis

Strain sel yang tumbuh dalam medium buatan seluruhnya sangat sedikit

Strain sel kebanyakan tumbuh dalam medium buatan yang diberi suplemen dialisis. Dalam media ini sangat tepat menetapkan komponen molekul kecil

Cara:Tetapkan volume didialisis dengan air suling selama 48 jam tambahkan 1/5 volume x stok BSS Volume dijadikan 2x volume asli dengan ditambahkan air suling filtrasi menggunakan filter Millipolar material yang tersususn 50% serum dialis

Hemolimph InsektaHemolimph Insekta

Digunakan sebagai basis untuk beberapa media kultur jaringan insekta.

Hemolimph dapat diperoleh dengan memotong dua atau tiga segmen pupa yang besar dan mengeluarkan cairan

Substrat fibrin cenderung menjadi cair Dibuat dari tendo ekor tikus/cakar ayam Sebelum digunakan didialisis/diencerkan

dalam aquades Baik untuk kultur dalam tabung dan gelas

penutup Untuk pengkajian morfologik

Kolagen

Hampir seluruh media kultivasi jar. mengandung salah satu ekstrak jaringan. ex: Ekstrak embrio

EKSTRAK JARINGAN

Sel dapat tumbuh tanpa ekstrak embrio dan beberapa jaringan telah berhasil dikultivasi dengan sukses dalam serum dan larutan balans.

Komponen paling penting dalam ekstraks embrio terletak pada fraksi-fraksi molekul kecil dan bisa diganti secara efektif oleh suplemen sintetik yang biasanya sebagai campuran asam amino

Pembuatan Ekstrak EmbrioPembuatan Ekstrak Embrio

Ada dua macam:

1. Ekstrak embrio yang dibuat dengan kerusakan jaringan yang minim.

2. Ekstrak embrio yang melibatkan penghancuran secara total jaringan embrio sampai terbentuk homogenat.

Pembuatan Ekstrak Embrio AyamPembuatan Ekstrak Embrio Ayam

Cara:

• Embrio dari telur yang diinkubasi lebih dari 10 hari dihancurkan

• 2 atau 3 embrio diletakkan dalam tabung injeksi 20 ml steril, tekan dengan kuat ke dalam penampung steril

• Tambahkan larutan garam balans sampai 50 %, kemudian disentrifugasi

• supernatan yang dihasilkan mengandung ekstrak embrio (ekstrak embrio 50:50)

Gambar 5. Pembuatan Ekstrak Embrio ayam.

Pembuatan Ekstrak Embrio SapiPembuatan Ekstrak Embrio Sapi

• Uterus sapi yang mengandung embrio sapi dicuci setelah kering, dilumuri iodin.

• cairan amnion amnion dikeluarkan.• Uterus diletakkan pada nampan steril, diiris

memanjang.• Dinding yang diiris dilipat keluar, embrio diambil,

dipotong-potong dan dimasukkan dalam blender ditambah dengan BSS dan dihomogenkan.

• Ekstrak dipindahkan ke tabung sentrifugasi, supernatan yang keruh merupakan EE-50 embrio sapi.

Ekstrak embrio ultrafiltrasiEkstrak embrio ultrafiltrasi

Kelompok Earle memperlihatkan bahwa ekstrak embrio yang telah diultrafiltrasi memili potensi untuk menyokong pertumbuhan yang

sama seperti ekstrak embrio sendiri

Suplemen Medium

Suplemen yang paling berguna adalah:

1. Laktabumin hidrosilat (Nutritional Biochemical) yang dipakai pada konsentrasi 0,1-0,5%

2. Difco bactopecton 0,5% yang dipakai untuk menggantikan komponen asam amino buatan

3. Ekstrak dehidrasi yeast 0,1% sebagai sumber vitamin dan Co-enzim

Medium yang digunakan untuk menjaga stok sel dalam laboratorium virologi mengandung 0,5%

laktabumin hidrosilat, 0,5% ekstrak yeast dan 5-10% serum anak sapi atau manusia.

Suplemen lain yang bermanfaat:

1. Ekstrak Yeast2. Aryptic meat both3. Susu krim4. Medium filde

2. MEDIA BUATAN

Media kultur jaringan yang komponenpenyusunnya sudah diketahui dengan pasti

DMEM

Inorganic ions◦ Osmotic balance – cell volume

Trace Elements◦ Co-factors for biochemical pathways (Zn, Cu)

Amino Acids◦ Protein synthesis◦ Glutamine required at high concentrations

Vitamins◦ Metabolic co-enzymes for cell replication

Energy sources◦ glucose

Media Formulation

Basic nutrients Hormones and growth factors Attachment and spreading factors Binding proteins (albumin, transferring)

carrying hormones, vitamins, minerals, lipids

Protease inhibitors pH buffer

Serum provides the following

Freshney.(1992) Animal Cell Culture.

Media diklasifikasikan menjadi 4 kelompok :

1. Esensial untuk pertumbuhan sesaat

2. Esensial untuk memperpanjang keberhasilan tumbuh

3. Esensial untuk pertumbuhan yang tidak terbatas

4. Esensial untuk fungsi – fungsi spesial

Media untuk Jaringan Vertebrata Endoterm

Pertimbangan dalam pemilihan bahan media

1. Kelarutan bahan : Beberapa bahan kimia yang dipakai di dalam media sintetik harus sebagai sumber yang sangat mudah larut & sangat penting untuk menyiapkan menjadi bahan yang mudah larut.

2. Kesesuaian komponen :Di dalam mengkombinasikan bahan-bahan tertentu, harus diingat bahwa material yang digunakan kemungkinan saling bereaksi sehingga menghasilkan substansi yang sangat berbeda

3. Kemurnian bahan :Beberapa komponen yang langka dari beberapa media hanya mungkin dijumpai dalam keadaan murni sekitar 85 %

4. Ketidakstabilan kimiawi :Berbagai komponen yang ditambahakan ke dalam media sintetik kadang tidak stabil sehingga pemyimpanan perlu mendapat perhatian

5. Larutan stok :Kemungkinan penyimpanan media dalam jumlah besar & dalam waktu yang lama dapat diatasi dengan membuat media menjadi serangkaian stok, yang nantinya dapat dikombinasikan untuk membuat medium yang komplit pada saat diperlukan

Seluruh media yang digunakan di dalam kultur jaringan berbasis pada suatu campuran sintetik garam – garam anorganik

yang disebut larutan garam fisiologik atau larutan garam balans (BSS)

Fungsi :a. Menjaga pHb. Menjaga tekanan osmotik di dalam mediumc. Menyediakan konsentrasi yang mencukupi ion – ion anorganik esensial

Larutan garam fisiologik dibagi menjadi 2 tipe :

1. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan udara2. Larutan garam yang diperuntukkan berekuilibrasi dengan fase gas yg mengandung tekanan karbon dioksida (C02) tinggi (sekitar 5 %)

Larutan Garam Balans (Balance Salt Solution = BSS)

Kesulitan utama : pencegahan timbulnya

endapan kalsium magnesium karbonat dan

posfat

Penyiapan Larutan Garam Balans

Basal cell culture media:◦ BME, DMEM, MEM, E199 and Fischer's media

Improved Cell Culture Media: ◦ 199 (HB), DMEM (HED) and MEM (HBS)

The Balance Salt Solution: ◦ 199 Earle's , Hanks and Dulbeco's

Substituted Natural Media:◦ SUB-1, SUB-2 and SUB-H

Serum Free Media:◦ 199 SAF CHO and SAF NSO

Low serum Culture Media:◦ SXQ-1, 199 SLM, 199 SLM-BR and MEM SLM (HB), DMEM

(HED) and MEM (HBS)

Media Kultur untuk sel mamalia