KAJIAN HUBUNGAN STRUKTUR – AKTIFITAS DERIVAT QUINOXALIN-2(1

H )-ONE YANG MENGANDUNG THIAZOL-2-AMINE

TERHADAP VIRUS HEPATITIS C YANG MENUNTUN PENEMUAN BH6870

TUGAS KIMIA MEDISINAL YOSSI FITRIANTI 1421012009

FITRIA HARYA TIKA 1421012010PASCASARJANA FAKULTAS FARMASI UNAND

ABSTRAK Infeksi kronik virus hepatitis C merupakan masalah kesehatan masyarakat

global yang serius, terutama dalam menyebabkan fibrosis, sirosis dan karsinoma hepatoselular.

Dari senyawa lead 2 berhasil disintesa 35 senyawa derivat quinoxalinone, dimana dari kajian SAR tsb dihasilkan senyawa BH6870 yang menunjukkan potensi anti-HCV (EC50 = 0,21 µM) dan indeks keamanan yang baik (SI = 47,19).

Analisis SAR menunjukkan bahwa quinoxalinone-2(1H)-one mengandung gugus 4-aryl yang disubtitusi thiazol 2-amin menjadi optimal aktifitas antivirusnya.

Penambahan acceptor ikatan hidrogen (seperti : kelompok ester atau amida) pada posisi C-3 dari quinoxalinone-2(1H)-one bermanfaat bagi potensi antivirusnya dan terutama amida N,N disubtitusi amida jauh lebih kuat akktifitasnya dibandingkan N monosubtitusi amida.

Penggabungan lebih dari 1 atom halogen (atom fluorine atau chlorine) atau gugus yang menarik kuat elektron pada cincin benzene dari bagian thiazol-fenil dapat menurunkan kerapatan awan elektron lebih lanjut sehingga menyebabkan kehilangan aktifitasnya.

Gugus NH pada bagian lactam jelas diperlukan untuk aktifitas anti-HCV.

GRAPHICAL ABSTRACT

Disain dan sintesa derivat quinoxalin-2(1H)-one menjadi senyawa non nukleosida molekul kecil inhibitor HCV : BH 6870 menunjukkan potensi antivirus yang paling kuat dan cell safety index yang bagus.

- Ditemukan virus Hepatitis C (HCV), infeksi dapat berkembang menjadi fibrosis, sirosis dan kanker hati.- HCV genotipe tipe 1, penyebab infeksi terbesar di AS, Eropa dan Asia dan sangat sulit diobati (150 juta orang terinfeksi HCV di sel. Dunia, 3-4 juta orang baru terinfeksi tiap tahun dan > 350 ribu kematian tiap tahun).

Standar rawatan (SOC) infeksi HCV : kombinasi obat modulatory imun non spesifik pegylated interferon (PEG-IFN) + obat antivirus RIBAVIRIN, namun khasiatnya terbatas untuk genotype tipe 1 dan menimbulkan ES yang parah.

DILAKUKAN KAJIAN UNTUK MENDAPATKAN ANTIVIRUS YANG BEKERJA LANGSUNG SEBAGAI OBAT ANTI HCV.

- Penelitian antivirus kerja langsung dan berhasil disetujui generasi pertama HCV NS3/4A protease inhibitor : BOCEPREVIR dan TELAPREVIR.- SOC berubah menjadi kombinasi NS3/4A protease inhibitor (BOCEPREVIR dan TELAPREVIR) dengan PEG-IFN dan RIBAVIRIN » Meningkatnya kecepatan Sustained Virologic Response hampir 70%.

Di launching generasi ke dua NS3/4A protease inhibitor : SIMEPREVIR, yang dikombinasikan dengan PEG-IFN dan RIBAVIRIN

1989

2011

2013

Inhibitor NS5B polymerase (nucleoside)Inhibitor NS5B polymerase (non-nucleoside)NS3/4A protease inhibitor

Tingkat mutasi yang tinggi dari HCV dan

munculnya resistensi obat yang cepat

membutuhkan usaha terus menerus untuk

menemukan dan mengembangkan obat

dengan efikasi / keampuhan yang tinggi

dan mekanisme aksi yang baru.

TANTANGAN

Derivat Quinoxalin-2(1H)-one telah dilaporkan memiliki kemampuan penghambatan tehadap HCV. Pemahaman tentang sitotoksisitas dari analog dengan gugus thiourea seperti senyawa 1, dilakukan strategi siklisasi untuk menentukan senyawa 2 sebagai inhibitor yang poten terhadap HCV dengan sifat toksisitas sel yang rendah secara invitro (gambar2). Bagian thiazol-fenil yang optimal untuk aktifitas anti HCV dan konformasi ruang pada posisi C6 diperlukan untuk penghambatan system replica HCV. Dikarenakan adanya hambatan ruang pada posisi C3 dari quinoxalinone, sehingga kajian lebih diarahkan pada optimasi pada posisi C3 dan explorasi subtitusi pada cincin benzene dari thiazol-fenil.

Hasil dan Diskusi

Kimia

ANALOG QUINOXALINON TERSUBSTITUSI ESTER

Langkah Amin sekunder sebagai nukleofil menggantikan 1 atom F dari 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (DFDNB) secara kuantitatif dengan adanya N,N-diisopropiletilamin (DIPEA) atau kalium karbonat (K2CO3). F digantikan oleh amin primer sehingga menghasilkan senyawa 4a-f. Kemudian palladium 10% yang telah diaktifkan dengan karbon digunakan untuk menambah gugus dinitro menjadi diamino intermediet diikuti dengan siklisasi sendiri untuk menghasilkan senyawa intermediet 5a-f. Penambahan nukleofilik dengan benzoil isotiosianat dalam aseton diikuti dengan deproteksi gugus benzoil menghasilkan senyawa tiourea 7a-f setelah pemberian K2CO3.Pembentukan cincin tiazol, tiourea digunakan untuk bereaksi dengan 2-bromoasetofenon tersubstitusi yang sesuai untuk menghasilkan senyawa target 8-19.

Kimia

ANALOG QUINOXALINON TRISIKLIK DIPERSIAPKAN DENGAN 6 TAHAP DARI DFDNB

Reaksi antara monosubstitusi intermediet 3a dengan dimetil-1H-imidazol-4,5-dikarboksilat dalam aseton dengan K2CO3 refluks 6 jam, menghasilkan 4,6-dinitro intermediet 20. Siklisasi reduktif dari senyawa 20 menjadi imidazole (1,5-α)- quinoxalin-4-one 21 diawali dengan prosedur seperti yang di atas. Sayangnya, yang ditemukan adalah produk campuran kompleks dari beberapa senyawa, hanya sejumlah kecil senyawa 21 yang diinginkan yang diteliti dengan HPLC-MS, tetapi produk utamanya adalah intermediet hidroksilamin. Kombinasi Na ditionit yang terlarut dalam HCl merupakan kondisi yang efektif untuk pemilihan konduksi siklisasi reduktif senyawa 20 dan 21, dan produk hidrolisis ester yang nantinya akan dirubah menjadi senyawa 21 yang diinginkan setelah campuran reaksi disaring dan dipekatkan dengan vakum diikuti dengan reaksi esterifikasi oleh methanol dalam H2SO4.Senyawa target 24-27 lebih mudah diperoleh melalui pengenalan bagian tiourea pada gugus amino bebas dari intermediet 21 dan kemudian proses siklisasi 3 langkah diikuti reaksi-reaksinya dijelaskan pada skema 1.

Kimia

ANALOG QUINOXALINON TERSUBSTITUSI AMIDA

Perlakuan terhadap senyawa 5 dengan LiOH menghasilkan beberapa intermediet asam karboksilat. Kemudian senyawa intermediet tersebut bereaksi dengan adanya larutan metilamin atau dimetilamin dalam THF menggunakan EDCI dan HOBt sebagai pengkondensasi untuk menghantarkan senyawa intermediet 28a-h tersubstitusi amida. Kemudian senyawa target 31-48 dapat diperoleh melalui keterangan di atas dari bagian tiourea dan pada kondisi siklisasi.

Kimia

SINTESA 1-N-SUBSTITUTED QUINOXALINONE 53

Perlakuan terhadap larutan laktam 5d dengan metiliodida menggunakan K2CO3 sebagai basa menghasilkan 1-N-substituted quinoxalinone intermediet 49 diikuti dengan hidrolisa ester dan penggandaan dengan dimetilamin untuk memperoleh amida 50. Senyawa target 53 diperoleh mengikuti protokol dari skema 1.

AKTIFITAS ANTI-

HCV INVITRO

& KAJIAN

SAR

Aktifitas anti HCV dan sitotoksisitas turunan quinoxalinon sintetik dievaluasi pada sistem replikasi RNA HCV terhadap sel Huh7-ET.

Hasil yang diperoleh diringkas pada tabel 1,2,3,4.

rIFNα-2b (Interferon manusia rekombinan α-2b) adalah gabungan dari IFNα-2b dengan serum albumin manusia yang digunakan sebagai kontrol positif untuk menghambat HCV dengan EC50 = 0,08 UI/ml.

Konsentrasi senyawa untuk menghambat aktifitas replikasi RNA HCV sebesar 50% (EC50), konsentrasi senyawa untuk mengurangi viabilitas sel 50% (CC50), dan indeks selektifitas (SI) yang diperoleh dari CC50/EC50.

Kajian SAR sebelumnya : adanya hambatan ruang pada posisi C3 pada quinoxalinon-2(1H)-one. Pertama, atom H pada C3 diganti dengan gugus ester, bertujuan untuk memperkenalkan penerima ikatan hidrogen dan merubah jarak antara gugus ester dan rangka quinoxalinon. Menghasilkan senyawa yang memperlihatkan peningkatan aktifitas anti HCV.

Pemindahan atom H pada posisi C3 dari senyawa 2 dengan rantai samping propionat menghasilkan senyawa 8 dengan EC50 = 7,13 µM dengan aktifitas 4x lipat aktifitasnya dibandingkan senyawa 2 (EC50 = 1,67 µM).

Penggabungan atom F pada cincin fenil dari senyawa 8 menghasilkan senyawa 9 yang tidak memiliki aktifitas anti virus HCV. Pemindahan N-metilsikloheksilamin pada C6 dari senyawa 8 dengan rantai samping N-metilanilin menghasilkan senyawa 10-11. Senyawa tersubstitusi F (Senyawa 11) memiliki aktifitas penghambatan HCV dengan EC50 = 1,3 µM, sebanding dengan senyawa inhibitor 2.

Pengenalan gugus morfolin (12 dan 13) pada posisi C6 tidak menguntungkan untuk kemampuan anti virus karena suatu senyawa mengandung gugus hidrofob yang secara efektif meningkatkan kemampuan ikatnya pada protein target. Ketika substitusi pada C6 dipertahankan sebagai N-metilsikloheksilamin, penurunan jarak antara gugus ester dan rangka quinoxalinon menghasilkan senyawa 14 dan 15.

Senyawa 14 mengandung sebuah atom F yang memiliki kemampuan sel yang mengagumkan terhadap penghambatan HCV dengan EC50 = 1,14 µM.

Peningkatan interaksi π- π (Senyawa 15) secara signifikan menurunkan kemampuan terhadap aktifitas anti virusnya. Tidak ada pengenalan rantai samping N-metilanilin pada posisi C6 (16 dan 17) tanpa gugus morfolin (18 dan 19) memberikan kemampuan yang nyata dalam melawan HCV atau peningkatan pada indeks selektifitasnya.

Tidak ada senyawa tunggal yang menunjukkan penurunan aktifitas secara signifikan terhadap replikasi HCV dibandingkan dengan senyawa 2 yang mendorong untuk mencari lebih lanjut aktifitas dari senyawa yang tersubstitusi ester.

Kajian SAR sebelumnya : Ekspresi ikatan rangkap 3,4 pada quinoxalinon melalui cincin segi limanya memberikan perbaikan pada kemampuannya dalam berikatan. Dalam hal keseimbangan pada koefisien partisi lemak/air, dipilih cincin imidazole hidrofilik untuk mengekspresikan ikatan rangkap 3,4 dari quinoxalinon dan penggabungan dengan gugus ester pada cincin segi 5 yang dikaji lebih lanjut terhadap efek terhadap hambatan ruang.

Persiapan senyawa inhibitor 25 yang mengandung atom F pada posisi para, menghasilkan kemampuan yang lebih rendah (EC50 = 4,14 µM) dibandingkan senyawa 14 (EC50 = 1,14 µM). Menggantikan atom F dengan atom Cl (Senyawa 26, EC50 = 4,94 µM) atau menghilangkan halogennya (Senyawa 24, EC50 = 3,94 µM) gagal untuk memberikan peningkatan pada kemampuan berikatannya.

Penambahan interaksi ikatan π-π (Senyawa 27, EC50 = 6,14 µM) tidak menunjukkan afinitas ikatan yang mengagumkan dengan target. Peningkatan halangan ruang dan hidrofilisitas tidak baik untuk aktifitas anti HCV, tetapi ikatan rangkap 3,4 dapat menjadi perluasan ekspresi melalui cincin segi lima.

Bioisosteres » Memodulasi aktifitas biologis suatu senyawa dengan perubahan kecil pada sifat fisikokimianya.

Melibatkan 2 ikatan tunggal : -O- dan -NH-

Dasar penelitian SAR » Mendapatkan senyawa yang memiliki aktivitas antivirus terhadap HCV dengan mengganti

atom H pada posisi C3 dengan kelompok amida (table 3)

Banyak dilakukan untuk proses penemuan obat.

Potensi antivirus inhibitor 36 sangat meningkat dengan N-methylcyclohexylamine sebagai gugus R1 dengan EC50 = 0,21 µM lima kali lebih poten dibandingkan dengan analog dari jenis ester yang sesuai 14. Selain itu, jelas bahwa penerapan bioisostere memberikan selektivitas yang lebih baik (SI = 47,19).

• Dari SAR diketahui bahwa penggabungan bagian N, N-disubstitusi formamida meningkatkan aktivitas antivirus terhadap HCV.

• Untuk lebih mengeksplorasi analog amida dengan potensi tinggi dan selektivitas yang baik, disintesislah senyawa dengan berbagai macam substituen halogen yang terikat pada cincin benzene dengan tetap mempertahankan N-methylcyclohexylamine sebagai rantai samping R1 (karena menunjukkan aktivitas terhadap HCV yang lebih baik dibandingkan dengan gugus R1 lain). Tabel 4

• Penambahan lebih dari satu halogen (atom fluorine atau klorin) atau gugus yang menarik kuat elektron pada cincin benzena dapat mengurangi kepadatan awan elektron lebih lanjut dan mempengaruhi interaksi π-π dan menyebabkan perbedaan potensi dan sitotoksisitas

• Modifikasi dengan memblokir gugus NH laktam dari quinoxalin-2 (1H) -one menghasilkan 53 dengan EC50= 3.43 µM, terjadi penurunan aktifitas 21 kali lipat, sehingga disimpulkan bahwa gugus NH pada laktam sangat diperlukan untuk aktivitas anti-HCV

Penjelasan tabel 4

KESIMPULAN

1. Quinoxalin-2 (1H)-one yang mengandung 4-aryl tersubstitusi gugus thiazol-2-amina optimal aktivitasnya sebagai antivirus HCV.

2. Peningkatan halangan ruang dan hidrofilisitas tidak menguntungkan untuk aktifitas anti-HCV.

3. Penambahan akseptor ikatan hidrogen (seperti ester atau kelompok amida) pada posisi C-3 dari quinoxalin-2(1H)-one bermanfaat untuk potensi antivirus, terutama bila N, N-disubstitusi amida akan jauh lebih kuat dibanding N-monosubstituted amida.

4. Penambahan lebih dari satu halogen (atom fluorine atau klorin) atau gugus yang menarik kuat elektron pada cincin benzena dari gugus tiazol-fenil dapat mengurangi kepadatan awan elektron yang lebih lanjut dapat mengakibatkan kehilangan potensi.

5. Gugus NH dari bagian laktam sangat diperlukan untuk kegiatan anti-HCV.