plagiat merupakan tindakan tidak terpujidilusi padat. penelitian uji daya antibakteri ekstrak...

UJI DAYA ANTIBAKTERI EKSTRAK ETANOLIK DAUN SALAM

(Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) TERHADAP BAKTERI Streptococcus

mutans PENYEBAB KARIES GIGI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Wanda Indriani Wibowo

098114003

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2013

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat, rahmat, tuntunan serta penyertaan dan kasih karunia yang telah

diberikanNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan

skripsi yang berjudul “Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam

(Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) terhadap Bakteri Streptococcus mutans

Penyebab Karies Gigi” dengan baik sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Kesarjanaan Strata Satu (S1) Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis menyadari bahwa keberhasilan penulisan skripsi ini tidak terlepas

dari bantuan serta dukungan dari berbagai pihak secara langsung maupun tidak

langsung baik berupa moral, materiil maupun spiritual. Oleh sebab itu, penulis

menghaturkan banyak terima kasih kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2. Agustina Setiawati, S.Farm., M.Sc., Apt. selaku Dosen Pembimbing Utama

yang dengan sabar membimbing dan memberikan arahan, saran, kritikan serta

dukungan kepada penulis selama proses penelitian dan penulisan skripsi.

3. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji yang memberikan saran

dan kritikan serta dukungan kepada penulis dalam proses menyempurnakan

naskah skripsi.


viii

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku Dosen Penguji yang memberikan saran dan

kritikan serta dukungan kepada penulis dalam proses menyempurnakan

naskah skripsi.

5. Segenap dosen Fakultas Farmasi Sanata Dharma yang telah mengajar dan

membimbing penulis selama masa perkuliahan.

6. Teman-teman kelompok penelitian, Johanes Putra Wicaksono, Hermawan

Deny Prasetyo, dan Bernadetta Arum Wijayanti yang telah saling menguatkan,

memberikan semangat dan bantuan kepada penulis serta bersama-sama

menjalani suka dan duka selama menjalankan penelitian ini.

7. PMK Apostolos yang sudah seperti keluarga dan selalu memberikan

dukungan doa, kekuatan, dan semangat bagi penulis untuk dapat

menyelesaikan penelitian dengan baik.

8. Sahabat-sahabatku A.A.S Suari Dewi, Intan Yunita Sari, Dharmesti Wijaya,

A.A Nara Kusuma, Yudha Wijaya, Ida Bagus Dwi Indrawan, Christiana

Lambang Christanti, Yosin Guruh Herawati, dan Bertha Trifina Mardhani

yang selalu memberikan dukungan semangat, dan doa.

9. Pak Wagiran, Pak Mukmin, Pak Heru, dan Pak Parlan dan seluruh staf laboran

yang telah bersedia memberikan bantuan bagi penulis dalam mengerjakan

penelitian.

10. Teman-teman kelas FST A 2009, kelompok praktikum A FST, dan seluruh

teman-teman angkatan 2009 terima kasih atas 4 tahun kebersamaannya dan

pengalaman yang tidak akan pernah terlupakan selama menjalani kuliah dan


ix

praktikum serta dorongan semangat dan doa yang telah diberikan kepada

penulis selama penyusunan skripsi ini hingga dapat terselesaikan dengan baik.

11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, atas segala bantuannya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa tidak ada yang sempurna dalam kehidupan ini.

Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran agar skripsi ini

dapat menjadi lebih baik. Akhir kata, dengan segala kerendahan hati penulis

berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat untuk menambah pengetahuan bagi

yang membutuhkan, terutama untuk kemajuan pengetahuan dalam bidang ilmu

Farmasi.

Penulis


x

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i

PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................................................ ii

PENGESAHAN SKRIPSI .................................................................................. iii

HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................. v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. vi

PRAKATA ........................................................................................................ vii

DAFTAR ISI ....................................................................................................... x

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xv

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvi

INTISARI ........................................................................................................ xvii

ABSTRACT ..................................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR ......................................................................................... 1

A. Latar Belakang ......................................................................................... 1

B. Perumusan Masalah .................................................................................. 3

C. Keaslian Penelitian ................................................................................... 3

D. Manfaat Penelitian .................................................................................... 4

1. Manfaat teoritis .................................................................................... 4

2. Manfaat praktis .................................................................................... 4

E. Tujuan Penelitian ...................................................................................... 5

1. Tujuan umum ....................................................................................... 5

2. Tujuan khusus ...................................................................................... 5


xi

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................. 6

A. Syzygium polyanthum (Wight.) Walp. ....................................................... 6

B. Karies Gigi ............................................................................................... 7

1. Peran karbohidrat makanan ................................................................ 10

2. Lingkungan gigi ................................................................................. 11

3. Waktu ................................................................................................ 12

C. Streptococcus mutans ............................................................................. 13

D. Uji Daya Antibakteri .............................................................................. 16

1. Metode dilusi ..................................................................................... 16

2. Metode difusi ..................................................................................... 16

E. Kromatografi Lapis Tipis........................................................................ 17

F. Landasan Teori ....................................................................................... 18

G. Hipotesis ................................................................................................ 19

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN........................................................... 20

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................................. 20

B. Variabel Penelitian ................................................................................. 20

1. Variabel utama ................................................................................... 20

2. Variabel pengacau .............................................................................. 20

C. Definisi Operasional ............................................................................... 21

D. Bahan Penelitian ..................................................................................... 22

E. Alat Penelitian ........................................................................................ 23

F. Tata Cara Penelitian ............................................................................... 23

1. Pengumpulan bahan daun salam ......................................................... 23

2. Pembuatan serbuk daun salam ............................................................ 23

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun salam ............................................. 24


xii

4. Skrining fitokimia serbuk daun salam ................................................ 24

5. Analisis flavonoid dan tanin serbuk daun salam dengan KLT ............. 24

6. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap

Streptococcus mutans ......................................................................... 25

a. Pembuatan konsentrasi ekstrak etanolik daun salam ......................... 25

b. Pembuatan stok bakteri Streptococcus mutans .................................. 25

c. Pembuatan suspensi bakteri Streptococcus mutans ........................... 26

d. Pembuatan kontrol kontaminasi media ............................................. 26

e. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Streptococcus mutans ... 26

f. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap

Streptococcus mutans dengan metode difusi sumuran ...................... 26

g. Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh

Minimum (KBM) ekstrak etanolik daun salam terhadap

Streptococcus mutans dengan metode dilusi padat ........................... 27

G. Analisis Data .......................................................................................... 28

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 30

A. Pengumpulan Bahan Daun Salam ........................................................... 30

B. Pembuatan Serbuk Daun Salam .............................................................. 30

C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Salam ............................................... 31

D. Skrining Fitokimia Ekstrak Etanolik Daun Salam ................................... 33

1. Uji flavonoid ...................................................................................... 34

2. Uji tanin ............................................................................................. 35

E. Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam Terhadap

Streptococcus mutans dengan metode Difusi Sumuran ........................... 37

F. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanolik Daun Salam dengan

Metode Dilusi Padat ............................................................................... 49


xiii

G. Uji Penegasan Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam dengan

Metode Streak Plate ............................................................................... 50

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 52

A. Kesimpulan ............................................................................................ 52

B. Saran ...................................................................................................... 52

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 53

LAMPIRAN ...................................................................................................... 57

BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 91


xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Hasil skrining fitokimia serbuk daun salam ...................................... 33

Tabel II. Rata-rata diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Streptococcus

mutans yang dihasilkan pada uji daya antibakteri ekstrak etanolik

daun salam ....................................................................................... 42

Tabel III. Hasil uji statistik keberbedabermaknaan antara diameter zona

hambat dengan berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun

salam terhadap Streptococcus mutans dengan metode Kruskal-

Wallis .............................................................................................. 47

Tabel IV. Data hasil uji Wilcoxon .................................................................... 48

Tabel V. Hasil pengamatan penentuan nilai KHM dan KBM .......................... 49


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Syzygium polyanthum .................................................................... 6

Gambar 2. Proses terjadinya karies gigi .......................................................... 7

Gambar 3. Empat lingkaran yang menggambarkan paduan faktor penyebab

karies gigi ................................................................................... 10

Gambar 4. Streptococcus mutans. ................................................................. 13

Gambar 5. Hasil skrining fitokimia serbuk daun salam ................................. 33

Gambar 6. Penampakan bercak flavonoid sesudah diuapi amoniak. .............. 35

Gambar 7. Penampakan bercak tanin setelah disemprot dengan FeCl3. ......... 37

Gambar 8. Zona hambat yang terbentuk pada difusi sumuran ekstrak

etanolik daun salam terhadap bakteri Streptococcus mutans. ....... 43

Gambar 9. Hasil dilusi padat pada konsentrasi 15 dan 18 mg/mL.................. 50

Gambar 10. Hasil streak plate pada konsnetrasi 15 dan 18 mg/mL. ................ 51


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi ...................................................... 57

Lampiran 2. Surat keterangan sertifikasi hasil uji Streptococcus mutans .......... 58

Lampiran 3. Hasil pengeringan dan penyerbukan daun salam .......................... 59

Lampiran 4. Hasil uji tabung dari skrining fitokimia serbuk daun salam .......... 60

Lampiran 5. Identifikasi flavonoid dan tanin dengan KLT ............................... 62

Lampiran 6. Hasil ekstraksi daun salam menggunakan pelarut etanol 96% ...... 65

Lampiran 7. Konsentrasi larutan uji pada metode difusi sumuran dan dilusi

padat ........................................................................................... 67

Lampiran 8. Hasil uji kelarutan ekstrak etanol daun salam .............................. 68

Lampiran 9. Hasil pengamatan zona hambat pada metode difusi sumuran ....... 70

Lampiran 10. Uji normalitas Shapiro-Wilk ........................................................ 74

Lampiran 11. Analisa data dengan uji Wilcoxon ................................................ 76

Lampiran 12. Hasil pengamatan dilusi padat ..................................................... 87

Lampiran 13. Hasil uji penegasan dengan metode streak plate untuk menentukan

nilai KHM dan KBM................................................................... 89


xvii

INTISARI

Daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) merupakan tanaman

obat yang banyak digunakan dalam pengobatan tradisional dan digunakan sebagai

bumbu masak untuk penyedap makanan. Kandungan kimia yang terdapat dalam

daun salam yaitu tanin, flavonoid, dan minyak atsiri yang terdiri dari sitral dan

eugenol yang diketahui memiliki aktivitas sebagai antibakteri. Tujuan dari

penelitian ini yaitu untuk mengetahui daya antibakteri pada berbagai variasi

konsentrasi ekstrak etanolik daun salam terhadap bakteri penyebab karies gigi

Streptococcus mutans. Diameter zona hambat pertumbuhan bakteri ditentukan

dengan menggunakan metode difusi sumuran dan penentuan Kadar Hambat

Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) dilakukan dengan metode

dilusi padat.

Penelitian uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap

bakteri Streptococcus mutans penyebab karies gigi merupakan jenis penelitian

eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Data berupa

diameter zona hambat pada pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans dianalisis

secara statistik menggunakan uji Shapiro-Wilk dan uji Kruskal-Wallis yang

selanjutnya harus dilakukan analisis Wilcoxon, lalu pada metode dilusi padat

dianalisis secara deskriptif.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanolik daun salam

memiliki daya antibakteri terhadap Streptococcus mutans, dan memiliki nilai

KHM yaitu 15 mg/mL serta KBM yaitu 18 mg/mL.

Kata kunci: daun salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.), Streptococcus

mutans, daya antibakteri, Kadar Hambat Minimum (KHM), Kadar

Bunuh Minimum (KBM).


xviii

ABSTRACT

Bay leaf (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) is a medicinal plant used

in traditional medicine and food seasoning. Profile chemical constituents present

in these leaf are tannins, flavonoids, and essential oil (citral and eugenol) that

known have antibacterial activity. This study was aimed to determine antibacterial

activity of the Bay leaf ethanolic extract at various concentrations againts

Streptococcus mutans that causes dental caries. Diameter of inhibitory zone of

bacterial growth was determined by using diffusion method and determination of

Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal

Concentration (MBC) is done with solid dilution method.

This study purely experimental study used randomized study design

complete unidirectional pattern. Inhibition zone diameter data on the growth of

bacteria Streptococcus mutans were statistically analyzed using the Shapiro-Wilk

test and the Kruskal-Wallis test to do next Wilcoxon test, and the dillution test

were analyzed descriptively.

The results showed that the Bay leaf ethanolic extract had antibacterial

activities against Streptococcus mutans, and the MIC value is 15 mg / mL and

MBC value is 18 mg / mL.

Keywords: bay leaf (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.), Streptococcus

mutans, antibacterial activity, Minimum Inhibitory Concentration

(MIC), Minimum Bactericidal Concentration (MBC).


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Menurut Ardani, Pratiwi, dan Hertiani (2010) karies gigi merupakan

masalah yang sering terjadi karena kesadaran masyarakat yang rendah dalam

menjaga kesehatan mulut. Berdasarkan data Riset Kesehatan Dasar (2007)

menunjukkan bahwa prevalensi nasional karies gigi aktif adalah sebesar 43,4%

dimana D.I. Yogyakarta termasuk diantara 14 provinsi yang memiliki prevalensi

karies aktif diatas prevalensi nasional. Selain itu, untuk penduduk usia 12 tahun

keatas sebesar 72,1% penduduk pernah memiliki pengalaman karies dan sebesar

46,5% diantaranya merupakan karies aktif yang belum dirawat. Menurut Astoeti

(2011) apabila karies gigi tidak ditangani dengan baik maka dapat menurunkan

produktivitas, menjadi sumber infeksi, bahkan bisa mengakibatkan atau

memperparah beberapa penyakit sistemik diantaranya stroke, diabetes, dan

penyakit jantung.

Menurut Alcamo (1996) bakteri berperan penting dalam proses

terjadinya karies gigi. Salah satu spesies bakteri yang dominan dalam mulut yaitu

Streptococcus mutans. Streptococcus mutans adalah bakteri gram positif fakultatif

anaerob yang merupakan bakteri penyebab karies gigi.

Streptococcus mutans bersifat kariogenik dan memiliki suatu enzim pada

permukaannya yang diproduksi oleh gtfB disebut dengan glucosyl transferase


2

(GTF) yang dapat menyebabkan polimerisasi glukosa pada sukrosa dengan

pelepasan dari fruktosa, sehingga mampu mensintesis polisakarida ekstraseluler

(EPS) glukan ikatan α (1-3) yang tidak larut dalam air dan sangat lengket. Glukan

bersama dengan bakteri melekat dengan erat pada enamel gigi sehingga akan

terbentuk biofilm pada permukaan gigi dan lebih bersifat asidogenik. Hal ini akan

menyebabkan terjadinya demineralisasi pada gigi yang selanjutnya mengarah

pada pembentukan karies (Smith, 2003). Oleh karena itu, bakteri ini menjadi

target utama dalam upaya mencegah terjadinya karies gigi.

Penggunaan antibiotika dalam pemberantasan plak seperti penisilin,

vankomisin, dan klorheksidin secara rutin dapat menyebabkan terjadinya

resistensi bakteri dan efek samping seperti diskolorisasi gigi (Schuurs, 1993). Jika

suatu bakteri resisten terhadap antibakterial, maka organisme itu akan terus

bertumbuh walaupun telah dilakukan pemberian obat antibakterial (Kee and

Hayes, 1994). Salah satu usaha yang dapat dilakukan untuk mengatasi masalah

resistensi bakteri, yaitu dengan memanfaatkan bahan alam. Pada saat ini, banyak

orang yang kembali menggunakan bahan alam untuk mengobati berbagai

penyakit. Pemanfaatan bahan alam sebagai antibakteri banyak dikembangkan

karena efek samping yang dihasilkan tidak merugikan dibandingkan dengan obat

yang dibuat dari bahan sintetis (Kardinan dan Kusuma, 2004).

Tanaman asli Indonesia, yaitu daun salam banyak digunakan oleh

masyarakat sebagai bumbu masak untuk penyedap makanan. Selain itu, daun

salam digunakan sebagai pengobatan tradisional untuk mengobati hipertensi,


3

diabetes, dan diare. Daun salam kaya akan kandungan, tanin, flavonoid, dan

minyak atsiri 0,05% yang terdiri dari eugenol dan sitral (Winarto, 2003).

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan kepada

masyarakat mengenai manfaat daun salam sebagai antibakteri terhadap bakteri

Streptococcus mutans untuk salah satu terapi alternatif penyakit karies gigi dan

dapat dikembangkan dalam bentuk sediaan farmasi sehingga lebih praktis dan

mudah dalam pemakaiannya.

B. Perumusan Masalah

Permasalahan yang akan diteliti adalah :

1. Apakah ekstrak etanolik daun salam memiliki daya antibakteri terhadap bakteri

Streptococcus mutans penyebab karies gigi?

2. Berapakah Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum

(KBM) ekstrak etanolik daun salam terhadap bakteri Streptococcus mutans

penyebab karies gigi?

C. Keaslian Penelitian

Berdasarkan penelusuran pustaka dan jurnal yang dilakukan, penelitian

mengenai daya antibakteri ekstrak etanol daun salam terhadap bakteri

Streptococcus mutans penyebab karies gigi belum pernah dilakukan.

Penelitian terkait yang pernah dilakukan adalah Daya Antibakteri

Minyak Atsiri Daun Salam (Eugenia polyantha Wight.) terhadap Bakteri Shigella

dysenteriae (Widyastuti, 2002), Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun


4

Salam (Syzygium polyanthum [Wight.] Walp.) terhadap Bakteri Penyebab Diare

(Hustani, 2009), dan Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium

polyanthum (Wight.) Walp.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan

Escherichia coli ATCC 11229 secara in vitro (Sari, 2012).

D. Manfaat Penelitian

1. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi bagi ilmu

pengetahuan mengenai khasiat antibakteri dari daun salam dan konsentrasi yang

paling efektif dari ekstrak etanolik daun salam untuk menghambat bakteri

Streptococcus mutans penyakit karies gigi.

2. Manfaat praktis

Penelitian mengenai daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam

terhadap Streptococcus mutans penyebab karies gigi diharapkan dapat

memberikan pengetahuan kepada masyarakat mengenai manfaat daun salam

sebagai antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mutans untuk salah satu terapi

alternatif penyakit karies gigi, serta dapat dikembangkan dalam formulasi bahan

alam menjadi sediaan farmasi dengan dosis terapi ekstrak etanolik daun salam

yang dapat digunakan secara mudah oleh masyarakat sehingga prevalensi karies

gigi di Indonesia dapat diturunkan.


5

E. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Mengetahui manfaat daun salam sebagai antibakteri terhadap bakteri

Sterptococcus mutans penyebab karies gigi akibat infeksi bakteri untuk

meningkatkan status kesehatan masyarakat dan menjadi terapi alternatif penyakit

karies gigi di masyarakat.

2. Tujuan khusus

a. Mengetahui daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap bakteri

Streptococcus mutans penyebab karies gigi.

b. Menentukan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh Minimum

(KBM) ekstrak etanolik daun salam terhadap bakteri Streptococcus mutans

penyebab karies gigi.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Syzygium polyanthum (Wight.) Walp.

Klasifikasi dari tanaman salam menurut Backer and Van Den Brink

(1963) yaitu :

Kerajaan : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub Kelas : Rosidae

Bangsa : Myrtales

Suku : Myrtaceae

Marga : Eugenia

Jenis : Syzygium polyanthum (Wight.) Walp. Gambar 1. Syzygium

polyanthum

Sinonim : Eugenia polyantha Wight. (Morad, 2011).

Pohon salam pada umumnya tumbuh di hutan maupun rimba belantara,

namun dapat juga tumbuh di kebun. Pohon ini dapat ditemukan di dataran rendah

sampai pegunungan dengan ketinggian 1.800 meter di atas permukaan laut. Pohon

salam merupakan tumbuhan berbatang besar, bertanjuk rimbun, dengan tinggi

mencapai 25 m, akar lurus dan besar. Daunnya apabila diremas berbau harum,

berbentuk lonjong sampai elips atau bundar telur sungsang, pangkalnya lancip

sedangkan ujungnya lancip sampai tumpul, panjangnya 5 cm sampai 15 cm, lebar


7

35 mm sampai 65 mm; terdapat 6 sampai 10 urat daun lateral, panjang tangkai

daun 5 mm sampai 12 mm. Perbungaan berupa malai, keluar dari ranting, dan

berbau harum. Kelopak bunga berbentuk cangkir yang lebar, ukuran lebih kurang

1 mm. Mahkota bunga berwarna putih, panjang 2,5 mm sampai 3,5 mm. Benang

sari terbagi dalam 4 kelompok, panjang lebih kurang 3 mm berwarna kuning

lembayung. Buah buni, berwarna merah gelap, bentuk bulat dengan garis tengah 8

mm sampai 9 mm, pada bagian tepi berakar lembaga yang sangat pendek

(Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1980).

Tanaman ini mengandung tanin, flavonoid, minyak atsiri (0,05%) yang

terdiri dari sitrat dan eugenol (Winarto, 2003). Kandungan dari daun salam

merupakan bahan aktif yang diduga mempunyai efek farmakologis. Menurut

Robinson, 1995 cit Sumono dan Wulan, 2009 tanin dan flavonoid memiliki efek

antiinflamasi dan antimikroba. Khasiat dari daun salam yaitu untuk mengobati

diabetes melitus, sakit maag, katarak, gatal-gatal, kudis, dan diare (Kurniawati,

2010).

B. Karies Gigi

Gambar 2. Proses terjadinya karies gigi (Ford, 2012)


8

Karies gigi adalah suatu penyakit jaringan keras gigi yang diakibatkan

oleh mikroorganisme pada karbohidrat yang dapat difermentasikan sehingga akan

terbentuk asam dan menurunkan pH di bawah pH kritis (5,2-5,5). Hal ini dapat

menyebabkan terjadinya demineralisasi jaringan keras gigi (Sumawinata, 2002).

Menurut Kidd and Bechal (1992) karies merupakan penyakit jaringan

keras gigi, yaitu email, dentin dan sementum, yang disebabkan oleh adanya

aktivitas mikroorganisme dalam suatu karbohidrat yang diragikan. Penyakit ini

ditandai dengan adanya demineralisasi pada jaringan keras gigi sehingga

menyebabkan kerusakan bahan organiknya. Bakteri yang menyebabkan terjadinya

karies gigi, yaitu Streptococcus sp, diantaranya adalah Streptococcus mutans,

Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, dan Streptococcus mitis

(Alcamo, 1996).

Beberapa jenis karbohidrat makanan misalnya sukrosa dan glukosa, dapat

diragikan oleh bakteri tertentu dan membentuk asam sehingga pH plak akan

menurun sampai di bawah 5 dalam waktu 1-3 menit. Penurunan pH yang

berulang-ulang dalam waktu tertentu akan mengakibatkan demineralisasi

permukaan gigi yang rentan dan proses karies terjadi (Kidd and Bechal, 1992).

Menurut Anggraeni et al., 2000, cit Yunilawati 2002 komposisi plak

terdiri dari 80% air dan 20% materi organik, yaitu 40-50% protein, 13-18%

karbohidrat dan 10-14 lipid serta materi anorganik sebagai materi tambahan

seperti kalsium dan fosfor. Plak mengandung 70-80% bakteri yang di dalamnya

terdapat lebih kurang 200-400 spesies yang berbeda. Setiap 1 mm plak seberat 1

mg mengandung lebih dari 108 bakteri.


9

Adanya akumulasi plak gigi memegang peranan penting dalam proses

terjadinya karies gigi. Plak merupakan massa yang lengket berisi bakteri beserta

produk-produknya yang terbentuk pada semua permukaan gigi. Akumulasi bakteri

ini tidak terjadi secara kebetulan melainkan terbentuk melalui serangkaian

tahapan. Jika email yang bersih terpapar dalam rongga mulut maka akan ditutupi

oleh lapisan organik yang amorf yang disebut pelikel. Pelikel ini terutama terdiri

atas glikoprotein yang diendapkan dari saliva dan terbentuk segera setelah

penyikatan gigi tanpa adanya bakteri. Sifatnya sangat lengket dan mampu

membantu melekatkan bakteri-bakteri tertentu pada permukaan gigi. Pada awal

pembentukan plak, kokus gram positif merupakan jenis yang paling banyak

dijumpai seperti Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus

mitis dan Streptococcus salivarius serta beberapa strain lainnya. Walaupun

demikian, Streptococcus mutans yang diakui sebagai penyebab utama karies oleh

karena Streptococcus mutans mempunyai sifat asidogenik dan asidurik (resisten

terhadap asam). Karies gigi dapat terjadi jika terdapat empat faktor yang

digambarkan dalam empat lingkaran yang bersitumpang (Kidd and Bechal, 1992).


10

Gambar 3. Empat lingkaran yang menggambarkan paduan faktor penyebab karies gigi

(Kidd and Bechal, 1992)

Akumulasi bakteri ini terjadi melalui serangkaian tahap, yaitu :

1. Peran karbohidrat makanan

Dibutuhkan waktu tertentu untuk plak dan karbohidrat menempel pada

gigi untuk dapat membentuk asam dan mengakibatkan demineralisasi email.

Karbohidrat menyediakan substrat untuk pembuatan asam bagi bakteri dan sintesa

polisakarida ekstra sel. Karbohidrat dengan berat molekul yang rendah seperti

gula dimetabolisme dengan cepat oleh bakteri. Dengan demikian, makanan dan

minuman yang mengandung gula menurunkan pH plak dengan cepat sampai level

yang menyebabkan demineralisasi email. Plak tetap bersifat asam selama

beberapa waktu. Untuk kembali ke pH normal sekitar 7, diperlukan waktu 30-60

menit. Oleh karena itu, konsumsi gula yang sering dan berulang-ulang tetap

menahan pH plak di bawah normal dan menyebabkan demineralisasi email (Kidd

and Bechal, 1992).


11

2. Lingkungan gigi

Dalam keadaan normal, gigi selalu dibasahi oleh saliva. Karena

kerentanan gigi terhadap karies banyak tergantung kepada lingkungannya, maka

peran saliva sangat besar. Saliva dapat mempengaruhi proses karies dalam

berbagai cara, yaitu :

a. Aliran saliva dapat menurunkan akumulasi plak pada permukaan gigi dan

menaikkan tingkat pembersihan karbohidrat dari rongga mulut.

b. Difusi komponen saliva seperti kalsium, fosfat, ion OH dan F ke dalam plak

dapat menurunkan kelarutan email dan meningkatkan reminalisasi karies dini.

c. Sistem buffer asam karbonat-bikarbonat, serta kandungan amonia dan urea

dalam saliva dapat menyangga dan menetralkan penurunan pH yang terjadi

saat bakteri plak sedang memetabolisme gula. Kapasitas penyangga dan pH

saliva erat hubungannya dengan kecepatan sekresinya.

d. Beberapa komponen saliva yang termasuk dalam komponen non imunologi

seperti lysozyme, lactoperoxydase, dan lactofrein mempunyai daya antibakteri

yang langsung terhadap mikroflora tersebut sehingga derajat asidogeniknya

berkurang.

e. Molekul imunoglobulin (IgA) disekresi oleh sel-sel plasma yang terdapat di

dalam kelenjar liur, sedangkan komponen protein lainnya diproduksi di lapisan

epitel luar yang menutup kelenjar. Kadar IgA di saliva berbanding terbalik

dengan timbulnya karies.

f. Protein saliva dapat meningkatkan ketebalan acquired pellicle sehingga dapat

membantu menghambat pengeluaran ion fosfat dan kalsium dari email.


12

Saliva mampu meremineralisasikan karies yang masih awal terbentuk

karena banyak mengandung ion kalsium dan fosfat. Kemampuan saliva dalam

melakukan remineralisasi meningkat jika ada ion fluor. Keberadaan fluor dalam

konsentrasi optimum pada jaringan gigi dan lingkungannya dapat merangsang

efek anti karies. Kadar fluor yang bergabung dengan email selama proses

pertumbuhan gigi bergantung pada ketersediaan fluor tersebut dalam air minum

atau makanan lain yang mengandung fluor. Keberadaan fluor di sekitar gigi

selama proses pelarutan email akan mempengaruhi proses remineralisasi (Kidd

and Bechal, 1992).

3. Waktu

Kemampuan saliva untuk mendepositkan kembali mineral selama

berlangsungnya proses karies, menandakan bahwa proses karies terdiri dari

periode perusakan dan perbaikan yang silih berganti sehingga jika saliva ada di

dalam lingkungan gigi, maka karies tidak menghancurkan gigi dalam hitungan

hari atau minggu, melainkan dalam bulan atau tahun (Kidd and Bechal, 1992).


13

C. Streptococcus mutans

Klasifikasi dari Streptococcus mutans menurut Bergey’s Manual of

Systematic Bacteriology (2009) yaitu :

Kerajaan : Monera

Gambar 4. Streptococcus mutans dengan

menggunakan scanning electron micrograph

(SEM) pada perbesaran 8000x dengan

ukuran 6x7 cm

(Anonim, 2011).

Divisi : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Lactobacilalles

Famili : Streptococcaceae

Genus : Streptococcus

Spesies : Streptococcus mutans

Streptococcus merupakan bakteri gram positif berbentuk bulat yang

mempunyai karakteristik dapat membentuk pasangan atau rantai selama

pertumbuhannya. Bakteri ini tersebar di alam, dimana beberapa diantaranya

merupakan flora normal pada manusia (Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s, 2005).

Streptococcus mutans merupakan bakteri gram positif, nonmotil, anaerob

fakultatif, bentuk kokus tersusun dalam rantai, tumbuh optimal pada suhu sekitar

180-40

0C. Streptococcus mutans bersifat asidogenik yaitu menghasilkan asam,

asidodurik, mampu tinggal pada lingkungan asam, dan menghasilkan suatu

polisakarida yang lengket disebut dextran. Oleh karena itu, Streptococcus mutans

bisa menyebabkan lengket sehingga mendukung bakteri lain menuju ke email

gigi, dan menghasilkan asam yang dapat melarutkan email gigi (Behrman,

Kliegman, & Arvin, 2000).


14

Streptococcus mutans merupakan bakteri yang kariogenik karena mampu

membuat asam dari karbohidrat yang dapat diragikan. Bakteri tersebut dapat

tumbuh subur dalam suasana asam dan dapat menempel pada permukaan gigi

karena kemampuannya membuat polisakarida ekstra sel yang sangat lengket dari

karbohidrat makanan. Polisakarida ini terdiri dari polimer glukosa yang

menyebabkan matriks plak gigi mempunyai konsistensi seperti gelatin sehingga

bakteri tersebut akan terbantu untuk melekat pada gigi serta saling melekat satu

sama lain. Dan karena plak semakin tebal maka akan menghambat fungsi saliva

dalam menetralkan plak (Kidd and Bechal, 1992).

Koloni Streptococcus mutans ditutupi oleh glukan yang dapat

mengurangi perlindungan dan aktivitas antibakteri pada saliva terhadap plak gigi.

Plak dapat menghambat difusi asam keluar dalam saliva sehingga konsentrasi

asam pada permukaan enamel akan meningkat. Hal ini akan membuat produksi

asam meningkat dan reaksi dalam rongga mulut menjadi asam dan kondisi ini

akan membuat produksi asam meningkat dan reaksi dalam rongga mulut menjadi

asam dan kondisi ini akan membuat deminerasilasi gigi terus menerus yang

merupakan proses awal terjadinya karies (Smith, 2003).

Proses perlekatan Streptococcus mutans dimulai dari adanya interaksi

antara bakteri dengan pelikel. Mekanisme interaksi tersebut dipengaruhi oleh

kekuatan elektrostatik, hidrofobik, komponen organik dan multiple binding sites.

Bakteri yang melekat pada permukaan bahan restorasi karena adanya interaksi

elektrostatik atau melalui calcium bridging, yaitu ion Ca2+

dalam saliva akan

menjembatani dan mengikat permukaan sel bakteri dan pelikel gigi yang


15

bermuatan negatif. Interaksi hidrofobik didasari oleh kontak yang rapat antara

molekul pada pelikel dengan permukaan bakteri. Komponen organik

Streptococcus mutans dengan menggunakan enzim glucosyltransferase (GTF) dan

non-enzym glucan binding protein untuk mensintesis polisakarida ekstraseluler

dan membentuk suatu glukan yang bersifat lengket. Glukan merupakan tempat

perlekatan, sehingga keduanya dapat membantu perlekatan Streptococcus mutans

pada permukaan gigi, sedangkan perlekatan bakteri melalui multiple binding site

karena adanya interaksi lectinlike, yaitu protein yang terdapat pada permukaan

Streptococcus mutans bereaksi dengan high molecular weight salivary

glycoproteins dan mengadsorpsi hidroksiapatit enamel sehingga terjadi interaksi

antara bakteri dengan pelikel gigi (Ferracane, Berge, and Condon, 1994, cit

Anggraeni, Yuliati, dan Nirwana, 2005).

Mekanisme terbentuknya karies gigi dimulai dari perlekatan

Streptococcus mutans pada permukaan gigi. Adhesin pada Streptococcus mutans

yaitu antigen I/II berinteraksi dengan α-galaktosida pada senyawa glikoprotein

turunan saliva pada pelikel gigi. Streptococcus mutans yang terakumulasi pada

permukaan gigi dapat terbentuk apabila mendapat bantuan dari glukosa. Glukosa

diubah oleh enzim glukosiltransferase (GTF) pada bakteri menjadi glukan

ekstraselular. Glukan yang tidak larut ini melekat pada permukaan gigi dan

disebut dengan plak gigi. Streptococcus mutans memiliki glucan binding protein

(GBP) yang dapat berikatan dengan glukan secara spesifik. Selain berikatan

dengan GBP, glukan dapat berikatan dengan GTF yang memiliki glucan binding

domain yang berfungsi sebagai reseptor glukan. Dengan demikian Streptococcus


16

mutans dapat terakumulasi pada permukaan gigi. Proses perubahan glukosa

menjadi glukan menghasilkan asam laktat. Adanya asam menurunkan pH saliva

menjadi 5,5 sehingga dapat melarutkan jaringan keras pada permukaan gigi

(Taubman and Nash, 2006).

D. Uji Daya Antibakteri

Tujuan pengujian ini adalah untuk mengetahui kemampuan suatu agen

dalam menghambat maupun membunuh bakteri. Ada beberapa metode yang

digunakan untuk pengujian daya antibakteri, yaitu :

1. Metode dilusi

Metode ini digunakan untuk menentukan Kadar Hambat Minimal

(KHM), yaitu konsentrasi terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri,

dan menentukan Kadar Bunuh Minimal (KBM), yaitu konsentrasi terendah yang

dapat membunuh bakteri. Prinsip dari metode dilusi, yaitu pengenceran senyawa

antibakteri dalam beberapa konsentrasi dalam media cair yang ditambahkan

bakteri uji hingga didapatkan larutan uji agen antibakteri pada kadar terkecil yang

terlihat jernih tanpa adanya bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang

ditetapkan sebagai KHM selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa

penambahan mikroba uji ataupun agen antibakteri. Media cair yang tetap terlihat

jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM (Pratiwi, 2008).

2. Metode difusi

Metode difusi digunakan untuk mengukur aktivitas antibakteri

berdasarkan pengamatan dari diameter zona jernih yang dihasilkan pada media

karena adanya agen antibakteri yang berdifusi dari tempat awal pemberian.


17

Metode ini dilakukan dengan menempatkan agen antibakteri pada media padat

yang telah diinokulasikan biakan bakteri (Pratiwi, 2008).

Ada beberapa metode difusi, yaitu :

a. Cara sumuran. Cara ini dilakukan dengan mengiinokulasikan

bakteri ke media kemudian setelah memadat dibuat sumuran dengan diameter

tertentu tegak lurus dengan permukaan media. Agen antibakteri kemudian

dimasukkan ke dalam sumuran tersebut. Daya antibakteri yang diukur adalah

diameter zona jernih yang dihasilkan di sekitar sumuran (Pratiwi, 2008).

b. Cara paper disc. Cara ini dilakukan dengan menginokulasikan

bakteri dalam media lalu setelah memadat, paper disc diletakkan di atas media

dan ditetesi dengan agen antibakteri, sehingga agen antibakteri akan meresap ke

dalam paper disc. Daya antibakteri yang diukur adalah diameter zona jernih yang

dihasilkan di sekitar paper disc (Pratiwi, 2008).

E. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan metode kromatografi cair

paling sederhana untuk memisahkan komponen kimia. Prinsip KLT, yaitu

terjadinya pemisahan komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh

fase diam terhadap fase gerak. Terdapat dua fase dalam KLT, yaitu fase diam

(lapisan) dan fase gerak (campuran pelarut pengembang). Fase diam berfungsi

sebagai penyerap yang berupa serbuk halus. Penyerap yang sering digunakan

dalam KLT adalah silika gel, alumina, dan selulosa (Mulja dan Suharman, 1995).


18

Fase gerak berfungsi untuk pengelusi yang terbuat dari berbagai macam campuran

pelarut (Gritter, 1991).

Kromatogram pada KLT berupa noda-noda yang terpisah. Untuk

mengetahui noda-noda yang terpisah dapat digunakan dua cara, yaitu dengan

pereaksi warna (secara kimia) dan diletakkan di bawah sinar UV 254 nm dan 365

nm (secara fisika) (Mulja dan Suharman, 1995).

Pada kromatogram KLT terdapat faktor retardasi dinyatakan dengan :

Rf = jarak titik pusat bercak dari awal

jarak yang ditempuh fase gerak

Angka Rf memiliki rentang dari 0,00 – 1,00. Nilai Rf adalah angka Rf dikalikan

faktor 100(h), menghasilkan nilai dengan rentang antara 0 hingga 100 (Stahl,

1985). Keuntungan dari KLT yaitu pemisahan senyawa dapat dilakukan dalam

waktu singkat dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal, pelarut dan cuplikan

yang digunakan jumlahnya relatif sedikit (Gritter, 1991).

F. Landasan Teori

Karies merupakan suatu penyakit jaringan keras gigi yang disebabkan

oleh bakteri Streptococcus mutans yang menempel pada permukaan gigi karena

kemampuan membuat polisakarida yang lengket dari karbohidrat dan dapat

difermentasikan sehingga akan terbentuk asam dan menurunkan pH di bawah pH

kritis. Penurunan pH yang berulang-ulang dalam waktu tertentu menyebabkan

demineralisasi permukaan gigi dan proses karies pun dimulai. Streptococcus

mutans memiliki suatu enzim, yaitu glukosiltransferase (GTF) yang akan

mengubah glukosa menjadi glukan ekstraseluler yang tidak larut air dan sangat


19

lengket sehingga akan terbentuk plak gigi. Akumulasi plak gigi memegang

peranan yang sangat penting dalam proses terjadinya karies gigi. Oleh karena itu,

untuk mencegah karies gigi dilakukan dengan meminimalisasi pertumbuhan

Streptococcus mutans dengan menggunakan agen antibakteri. Daun salam

memiliki kandungan tanin dan flavonoid yang bersifat sebagai antibakteri

sehingga memiliki potensi untuk dilakukan penelitian mengenai daya antibakteri

terhadap Streptococcus mutans penyebab karies gigi.

Daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam ditunjukkan dengan metode

difusi sumuran berdasarkan diameter zona hambat yang dihasilkan dan metode

dilusi untuk menentukan nilai KHM dan KBM. Prinsip metode difusi, yaitu

pengukuran daya antibakteri berdasarkan pengamatan luas zona hambat

pertumbuhan bakteri karena berdifusinya obat dari tempat awal pemberian ke

daerah difusi.

G. Hipotesis

Ekstrak etanolik daun salam (Syzygium polyanthum) memiliki daya

antibakteri terhadap bakteri penyebab karies gigi Streptococcus mutans.


20

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap

bakteri Streptococcus mutans penyebab karies gigi merupakan jenis penelitian

eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Penelitian

dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Laboratorium Mikrobiologi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, dan Balai

Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian

1. Variabel utama

a. Variabel bebas. Variabel bebas yang digunakan dalam penelitian

ini yaitu variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun salam (uji daya antibakteri: 5,

10, 20, 30, dan 50 mg/mL; konsentrasi penentuan nilai KHM dan KBM: 15, 18,

20, 22, 24, 26, 28, dan 30 mg/mL).

b. Variabel tergantung. Variabel tergantung yang digunakan dalam

penelitian ini yaitu diameter zona hambat ekstrak etanolik daun salam terhadap

Streptococcus mutans, nilai KHM, dan nilai KBM.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali yang

digunakan dalam penelitian ini yaitu asal tanaman dari daerah Kaliurang, umur


21

tanaman, waktu pengambilan tanaman, waktu inkubasi (24 jam), suhu inkubasi

(370C), volume suspensi bakteri uji yang diinokulasikan dalam media (1 mL),

konsentrasi suspensi bakteri uji yang setara dengan kepadatan standar 0,5 Mc

Farland II (diperkirakan 1,5x108 sel bakteri/mL).

b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali

yang digunakan dalam penelitian ini yaitu suhu pengeringan di bawah sinar

matahari, kelembaban ruangan, suhu penyimpanan serbuk, dan lingkungan tempat

tumbuh tanaman.

C. Definisi Operasional

1. Ekstrak etanolik daun salam adalah hasil maserasi dari serbuk daun salam

menggunakan penyari etanol 96%.

2. Ekstrak etanolik daun salam kental yaitu hasil maserasi yang dipekatkan

menggunakan rotary vacuum evaporator kemudian dipanaskan di atas

penangas air selama 15-20 menit pada suhu 500-60

0C sampai didapatkan

ekstrak kental.

3. Zona hambat adalah zona jernih di sekitar sumuran yang ditambahkan ekstrak

etanolik daun salam dimana tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri

Streptococcus mutans dilihat dari kejernihan media yang dibandingkan dengan

kontrol negatif (aquadest steril).

4. Daya antibakteri adalah kemampuan ekstrak etanolik daun salam untuk

menghambat atau membunuh bakteri yang dibandingkan dengan kontrol

negatif melalui uji difusi sumuran dan penentuan KHM dan KBM.


22

5. Metode difusi sumuran adalah metode yang digunakan untuk mengetahui

aktivitas ekstrak etanolik daun salam terhadap bakteri Streptococcus mutans

dengan cara mengukur diameter zona hambat di sekitar sumuran.

6. Metode dilusi padat adalah metode pengukuran aktivitas ekstrak etanolik daun

salam terhadap Streptococcus mutans dengan menentukan KHM dan KBM.

7. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah konsentrasi terendah ekstrak etanolik

daun salam yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus

mutans dilihat dari uji penegasan penentuan KHM dan KBM dengan metode

streak plate yang masih menunjukkan pertumbuhan bakteri.

8. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah ekstrak etanolik

daun salam yang mampu membunuh bakteri Streptococcus mutans dilihat dari

uji penegasan penentuan KHM dan KBM dengan metode streak plate yang

tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri.

D. Bahan Penelitian

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini, yaitu bakteri uji

Streptococcus mutans (asal dari Prof. Yosihara Prev. Dent Dept Kyushu Univ

Japan) yang diperoleh dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta (Lampiran

2), daun salam yang diperoleh dari daerah Kaliurang, etanol 96% sebagai pelarut

untuk maserasi, silika gel GF254, Klorheksidin 0,2% (Minosep®) sebagai kontrol

positif, media Mueller Hinton Agar (Merck), NaCl 0,9%, dan aquadest steril

sebagai kontrol negatif.


23

E. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu alat gelas (Pyrex),

jarum ose, mikropipet, inkubator (Heraeus), autoclave tipe KT-40 (ALP),

Densichek (Vitek), neraca analitik (Mettler Toledo GB 3002), shaker (Innova

2100), oven (Memmert), Microbiological Safety Cabinet, jangka sorong, alat

pembuat sumuran No. 3 (diameter 6 mm), cawan petri (Pyrex), vortex, corong

Buchner, pompa vacuum, rotary vacuum evaporator (IKAVAC®), dan kamera

digital (Samsung).

F. Tata Cara Penelitian

1. Pengumpulan bahan daun salam

Daun salam yang diperoleh dari pohon salam berasal dari daerah

Kaliurang dikumpulkan pada bulan Agustus dan September 2012. Daun salam

yang diambil berwarna hijau tua mulai dari daun ketiga dari ujung dan kedua dari

pangkal dan diambil dalam keadaan segar.

2. Pembuatan serbuk daun salam

Daun salam dicuci bersih dari kotoran dan bagian tumbuhan yang lain

dengan menggunakan air mengalir. Dikeringkan di bawah sinar matahari dengan

ditutup kain hitam. Pengeringan dihentikan jika daun saat diremas mudah remuk

lalu diserbuk dengan menggunakan blender hingga halus. Serbuk daun diayak

menggunakan pengayak No.40. Disimpan di dalam wadah yang kering dan

tertutup rapat.


24

3. Pembuatan ekstrak etanolik daun salam

Maserasi dilakukan pada 50 g serbuk daun salam/ 500 mL pelarut etanol

96% dengan kecepatan 120 rpm selama 5 hari. Disaring dengan kertas saring

dengan bantuan pompa vacuum lalu dipekatkan menggunakan rotary vacuum

evaporator sampai terbentuk cairan kental. Dilanjutkan dengan menggunakan

penangas air selama 15-20 menit dengan suhu antara 500-60

0C sampai diperoleh

ekstrak kental.

4. Skrining fitokimia serbuk daun salam

a. Uji flavonoid. Sebanyak 1 g serbuk daun salam ditambahkan

dengan 5 mL aquadest, lalu dipanaskan selama 10 menit. Selanjutnya disaring,

filtrat ditambahkan dengan NaOH LP kemudian ditambahkan dengan HCl.

Adanya perubahan warna merah menjadi kurang pekat menunjukkan adanya

flavonoid.

b. Uji tanin. Sebanyak 2 g serbuk daun salam ditambahkan dengan 10

mL aquadest, lalu dipanaskan selama 30 menit dalam penangas air hingga

mendidih. Selanjutnya disaring, filtrat sebanyak 5 mL ditambahkan larutan

natrium klorida 2% sebanyak 1 mL. Apabila terbentuk suspensi atau endapan

disaring dengan kertas saring kemudian filtrat ditambahkan larutan gelatin 1%

sebanyak 5 mL. Terbentuknya endapan menunjukkan adanya tanin. Selain itu

dapat juga dengan menambahkan 5 tetes FeCl3 pada filtrat. Dikatakan positif tanin

jika terjadi perubahan warna menjadi biru kehitaman.

5. Analisis flavonoid dan tanin serbuk daun salam dengan KLT

a. Flavonoid. Sebanyak 1 g daun salam ditimbang dan ditambahkan

dalam 10 mL metanol, selanjutnya dipanaskan selama 5 menit pada suhu 600C.


25

Filtrat jernih ditotolkan pada lempeng KLT sebanyak 25-30 µL. Dibuat standar

rutin dengan konsentrasi 0,05% dilarutkan dengan metanol. Fase diam yang

digunakan adalah selulosa dengan fase gerak n-butanol:asam asetat glasial:air

(40:10:50). Deteksi bercak hasil elusi diamati pada sinar UV dengan panjang

gelombang 254 dan 365 nm. Bercak yang muncul ditandai untuk dihitung nilai

Rfnya. Plat KLT kemudian dimasukkan dalam chamber yang telah dijenuhkan

dengan amoniak. Hasil positif ditunjukkan dengan penampakan bercak yang

berwarna merah kekuningan.

b. Tanin. Sebanyak 1 g daun salam ditimbang dan ditambahkan

dalam 10 mL metanol, selanjutnya dipanaskan selama 5 menit pada suhu 600C.

Filtrat jernih ditotolkan pada lempeng KLT sebanyak 25-30 µL. Standar tanin

dibuat dengan membuat larutan asam tanat 0,05% dalam etanol. Fase diam yang

digunakan adalah silika gel GF254 dengan fase gerak kloroform:metanol:air

(14:6:0,8). Penampak noda yang digunakan adalah FeCl3. Apabila timbul warna

biru kehitaman sampai hitam menunjukkan adanya senyawa tanin.

6. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap Streptococcus

mutans

a. Pembuatan konsentrasi ekstrak etanolik daun salam. Dibuat dalam

beberapa konsentrasi (5, 10, 20, 30, dan 50 mg/mL) menggunakan pelarut

aquadest steril dengan suhu pemanasan 400-50

0C.

b. Pembuatan stok bakteri Streptococcus mutans. Diambil 1-3 ose

bakteri dari biakan murni Streptococcus mutans, lalu diinokulasikan secara streak

plate pada media MHA miring, diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C.

Hasil inokulan digunakan sebagai stok untuk tahap penelitian selanjutnya.


26

c. Pembuatan suspensi bakteri Streptococcus mutans. Diambil 1-3 ose

dari stok bakteri Streptococcus mutans, lalu diinokulasikan ke dalam tabung

reaksi yang berisi NaCl 0,9% dan divortex agar tercampur rata, diinkubasikan

selama 24 jam pada suhu 370C. Kekeruhan suspensi bakteri Streptococcus mutans

disetarakan dengan standar 0,5 Mc Farland II (diperkirakan 1,5x108 sel

bakteri/mL) dengan menggunakan Densicheck.

d. Pembuatan kontrol kontaminasi media. Media MHA steril dituang

ke dalam cawan petri, dibiarkan memadat, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu

370C. Setelah diinkubasi, diamati, dan dibandingkan dengan perlakuan.

e. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji Streptococcus mutans.

Media MHA steril dengan suhu 400-50

0C, diinokulasikan suspensi bakteri uji, lalu

dituang ke cawan petri steril dan digoyang sehingga pertumbuhan bakteri merata.

Cawan petri lalu diinkubasi 24 jam dengan suhu 370C. Diamati pertumbuhan

bakteri uji melalui kekeruhan media yang dibandingkan dengan perlakuan.

f. Uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam terhadap

Streptococcus mutans dengan metode difusi sumuran. Diambil 1 mL dari suspensi

bakteri uji yang sudah disetarakan dengan standar 0,5 Mc Farland II (diperkirakan

1,5x108 sel bakteri/mL) menggunakan Densicheck, diinokulasikan ke media MHA

cair secara pour plate, kemudian dituang ke dalam cawan petri steril. Dibuat 7

lubang sumuran dengan diameter 6 mm pada cawan petri yang berisi media MHA

yang telah padat selanjutnya diisi dengan 30 µL media MHA. Ditambahkan

dengan 50 µL ekstrak etanolik daun salam dengan konsentrasi (5, 10, 20, 30, dan

50 mg/mL), aquadest steril sebagai kontrol negatif, dan klorheksidin 0,2%


27

sebagai kontrol positif. Cawan petri diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C,

kemudian diamati serta diukur diameter zona hambat yang dihasilkan dengan

menggunakan jangka sorong.

g. Penentuan Kadar Hambat Minimum (KHM) dan Kadar Bunuh

Minimum (KBM) ekstrak etanolik daun salam terhadap Streptococcus mutans

dengan metode dilusi padat. Diambil 1 ose bakteri uji, kemudian disuspensikan ke

dalam 10 mL NaCl 0,9%, dicampur sampai rata. Hasil suspensi dibandingkan

dengan standar 0,5 Mc Farland II (diperkirakan 1,5x108 sel bakteri/mL)

menggunakan Densicheck, lalu diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam

media MHA cair. Ekstrak dengan konsentrasi 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30

mg/mL masing-masing ditambahkan sebanyak 1 mL ke dalam 30 mL MHA

dengan suhu 400-50

0C. Dituang ke dalam cawan petri secara pour plate. Cawan

petri diinkubasikan selama 24 jam dalam suhu 370C, dan dilakukan pengamatan.

Pertumbuhan bakteri ditunjukkan dengan kekeruhan media. Semakin subur

pertumbuhan bakteri pada media, maka semakin keruh media tersebut. KHM dan

KBM dapat diketahui dengan cara membandingkan kejernihan media yang

diinokulasikan larutan uji dengan kontrol negatif dan kontrol positif.

Pada setiap media pertumbuhan yang jernih, dilakukan pengujian

berikutnya dengan melakukan pemindahan bakteri secara streak ke media MHA

yang baru. KHM adalah konsentrasi terkecil dimana ekstrak mampu menghambat

pertumbuhan bakteri, ditunjukkan dengan media pertumbuhan yang jernih, namun

masih menunjukkan adanya pertumbuhan pada hasil streak. KBM adalah

konsentrasi terkecil yang dapat membunuh bakteri, ditandai dengan tidak adanya


28

pertumbuhan pada hasil streak plate yang menandakan bakteri uji mati karena

larutan uji dengan konsentrasi tersebut.

Uji ini menggunakan dua macam kontrol, yaitu kontrol negatif dan

kontrol positif. Kontrol negatif dibuat dengan menambahkan sebanyak 1 mL

bakteri uji dan 1 mL aquadest ke dalam media MHA pada cawan petri steril

secara pour plate. Kontrol positif dibuat dengan menambahkan sebanyak 1 mL

bakteri uji dan 1 mL klorheksidin pada media MHA secara pour plate pada cawan

petri. Penentuan rentang konsentrasi uji yang digunakan dalam uji ini mengacu

pada hasil uji sebelumnya di mana pada konsentrasi terendah ekstrak etanolik

daun salam masih menunjukkan adanya zona hambat yang terbentuk.

G. Analisis Data

Daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam dengan berbagai variasi

konsentrasi dengan metode difusi sumuran dianalisis berdasarkan besarnya

diameter zona hambat yang dihasilkan pada perlakuan yang dibandingkan dengan

kontrol negatif dan positif. Data berupa diameter zona hambat pada pertumbuhan

bakteri Streptococcus mutans dianalisis secara statistik menggunakan uji Shapiro-

Wilk dan uji Kruskal-Wallis. Pemilihan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui

apakah data yang didapatkan terdistribusi normal atau tidak dengan syarat jumlah

sampel data yang ada berjumlah kurang dari 50 data. Data yang didapatkan

dinyatakan terdistribusi normal jika nilai p>0,05. Selanjutnya dilakukan uji

Kruskal-Wallis untuk mengetahui paling tidak terdapat dua kelompok data yang

mempunyai perbedaan yang bermakna dengan nilai p<0,05 yang selanjutnya


29

harus dilakukan analisis Wilcoxon untuk mengetahui pada variasi konsentrasi

ekstrak etanolik daun salam berapakah terdapat perbedaan yang bermakna dengan

kontrol negatif (aquadest) dan kontrol positif.

Penentuan nilai KHM dan KBM dilakukan dengan metode dilusi padat

berdasarkan tingkat kekeruhan pertumbuhan bakteri yang dibandingkan dengan

kontrol negatif dan kontrol positif. Data berupa nilai KHM dan KBM ditegaskan

dengan metode streak plate lalu dianalisis secara deskriptif dengan disertai data

pendukung berupa foto-foto dan disajikan dalam bentuk tabel.


30

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pengumpulan Bahan Daun Salam

Daun salam yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari daerah

Kaliurang, Yogyakarta yang dikumpulkan pada bulan Agustus dan September

2012. Daun salam yang berwarna hijau dan dalam keadaan segar diambil mulai

dari daun ketiga dari ujung dan kedua dari pangkal. Tidak diambil daun salam

yang masih muda dikarenakan kandungan senyawa didalamnya masih belum

optimal, sedangkan pada daun yang sudah tua kandungan senyawanya sudah

berkurang. Oleh karena itu, diambil daun ketiga dari ujung dan kedua dari pangkal

yang diperkirakan kandungan senyawanya optimal. Daun salam diambil dalam

keadaan segar dimana tidak ada jamur dan bekas gigitan serangga karena adanya

kemungkinan dihasilkannya metabolit sekunder yang bersifat toksik. Jika

dihasilkan metabolit tersebut maka dapat berpengaruh terhadap hasil uji yang

didapat pada penelitian ini.

B. Pembuatan Serbuk Daun Salam

Daun salam yang telah dikumpulkan dicuci bersih dibawah air mengalir

dengan tujuan untuk membersihkan daun dari kotoran-kotoran yang menempel.

Penggunaan air mengalir untuk mencegah menempelnya kembali kotoran pada

daun salam. Setelah dicuci daun dikeringkan di bawah sinar matahari dengan


31

ditutup kain hitam. Pengeringan dilakukan untuk mengurangi kadar air yang ada

dalam simplisia dan dihentikan jika daun saat diremas mudah remuk.

Pengurangan kadar air ini bertujuan untuk menghindari tumbuhnya jamur,

kapang, atau bakteri yang dapat merusak simplisia, selain itu dapat menekan

terjadinya peruraian senyawa kimia akibat adanya reaksi enzimatis yang bisa

menimbulkan perubahan senyawa aktif.

Setelah dikeringkan, daun salam lalu diserbuk dengan menggunakan

blender hingga halus. Serbuk daun selanjutnya diayak menggunakan pengayak

No.40. Penyerbukan dan pengayakan dilakukan untuk memperkecil ukuran

partikel bahan karena dengan ukuran partikel yang kecil maka akan memperluas

permukaan partikel yang kontak dengan cairan penyari, sehingga diharapkan

selama proses penyarian kandungan kimia yang dapat terlarut lebih banyak. Daun

salam yang sudah diserbuk disimpan di dalam wadah yang kering dan tertutup

rapat (Lampiran 3).

C. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Salam

Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dengan pelarut etanol

96%. Ekstraksi serbuk daun salam dilakukan untuk menarik senyawa yang

terkandung dalam bahan. Selama proses maserasi, sel daun salam mengalami

kondisi jenuh sehingga sel-selnya akan mengeluarkan senyawa-senyawa aktif.

Pelarut etanol akan mengikat berbagai senyawa aktif seperti polifenol, flavonoid,

terpenoid, sterol dan alkaloid. Selain itu, pelarut metanol diketahui lebih bersifat

toksik bila dibandingkan dengan etanol. Beberapa keuntungan metode maserasi


32

adalah caranya yang sederhana, peralatan yang digunakan sederhana, dan juga

mudah dilakukan. Prinsip maserasi adalah perbedaan konsentrasi antara larutan

senyawa aktif di dalam sel dengan pelarut ekstraksi, yang menyebabkan terjadinya

difusi sehingga terjadi kesetimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di

dalam sel. Semakin lama waktu ekstraksi, maka kesempatan untuk kontak antara

serbuk daun salam dengan pelarut akan semakin besar sehingga hasil ekstraksi

semakin bertambah banyak. Tidak digunakan metode soxhlet pada proses

ekstraksi karena dikhawatirkan senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak

tidak tahan panas selain itu, senyawa flavonoid mudah teroksidasi pada suhu yang

tinggi.

Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak

500 mL untuk setiap 50 gram serbuk. Sejumlah simplisia kering beserta pelarut

dimasukkan ke dalam erlenmeyer bertutup dan dilakukan di atas shaker dengan

kecepatan 120 rpm selama 5 hari. Penggunaan shaker bertujuan untuk meratakan

konsentrasi senyawa aktif dalam pelarut ekstraksi, sehingga perbedaan konsentrasi

antara larutan di dalam dan di luar sel tetap terjaga.

Hasil ekstraksi kemudian disaring dengan menggunakan kertas saring

yang diletakkan di atas corong Buchner dengan bantuan pompa vacuum, lalu

dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator untuk mempermudah proses

penguapan pelarut dan dihentikan sampai terbentuk cairan kental. Ekstrak

selanjutnya dikeringkan dengan menggunakan penangas air pada suhu antara 500-

600C sampai pelarut penyari hilang yang ditandai dengan ekstrak menjadi kering

(Lampiran 6).


33

D. Skrining Fitokimia Ekstrak Etanolik Daun Salam

Pada penelitian ini dilakukan skrining fitokimia daun salam yang

bertujuan untuk mengetahui senyawa yang terkandung di dalam daun salam.

Bahan yang digunakan dalam skrining fitokimia adalah serbuk daun salam.

Menurut Winarto (2003), kandungan daun salam yang memiliki aktivitas sebagai

antibakteri yaitu flavonoid dan tanin. Dilakukan uji kualitatif yang bertujuan

untuk memastikan keberadaan flavonoid dan tanin di daun salam dengan

menggunakan uji tabung reaksi dan uji KLT. Berdasarkan skrining fitokimia yang

telah dilakukan terhadap keberadaan flavonoid dan tanin, diperoleh hasil yang

dapat diamati pada tabel I.

Tabel I. Hasil skrining fitokimia serbuk daun salam

Uji Hasil uji tabung Penafsiran Hasil

Flavonoid Terjadi perubahan warna dari warna merah menjadi

merah pudar (+)

Tanin Terbentuk endapan dan terjadi perubahan warna menjadi biru kehitaman

(+)

Gambar 5. Hasil skrining fitokimia serbuk daun salam

Flavonoid

Tanin


34

Tanin

1. Uji flavonoid

Pada penelitian ini, uji fitokimia dilakukan untuk mengetahui apakah

ekstrak mengandung senyawa flavonoid. Hasil uji menunjukkan bahwa dari

sampel yang ada, terkandung senyawa flavonoid dimana terjadi perubahan warna

menjadi merah kurang pekat. Identifikasi flavonoid dengan menggunakan fase

gerak n-butanol:asam asetat glasial:air (40:10:50) dan fase diam selulosa diamati

pada sinar UV 254 nm tidak menunjukkan adanya bercak sedangkan pada 365 nm

dapat teramati adanya bercak. Plat selulosa yang sudah diuapi dengan amoniak

terbentuk bercak yang berwarna kuning menunjukkan adanya flavonoid

(Lampiran 5). Nilai Rf untuk standar rutin sebesar 0,58, sedangkan untuk sampel

1 (penotoloan pertama), yaitu 0,68 dan sampel 2 (penotolan kedua), yaitu 0,69.


35

Gambar 6. Penampakan bercak flavonoid sesudah diuapi amoniak

Keterangan :

Fase diam : Selulosa

Fase gerak : n-butanol- asam asetat glasial:air (40:10:50)

A : Standar rutin

B : Sampel penotoloan 1

C : Sampel penotolan 2

2. Uji tanin

Tanin diketahui memiliki aktivitas antivirus, antibakteri, dan antitumor.

Tanin merupakan senyawa fenol. Pereaksi yang sering digunakan untuk

identifikasi senyawa fenol adalah FeCl3. Warna biru kehitaman yang ditimbulkan

dari reaksi FeCl3 menunjukkan adanya kandungan tanin terhidrolisis. Uji lain

yang dilakukan yaitu dengan menggunakan gelatin 1% dengan mengamati

A B C

5,8

cm

6,8

cm

6,9

cm


36

terbentuknya endapan saat direaksikan dengan gelatin. Berdasarkan hasil yang

telah didapatkan maka dapat disimpulkan bahwa daun salam mengandung tanin.

Tanin terdiri dari katekin, leukoantosianin dan asam hidroksi yang

masing-masing dapat menimbulkan warna bila bereaksi dengan ion logam. Warna

ini terbentuk karena adanya kompleks antara logam Fe dari FeCl3 dengan gugus

hidroksil dari tanin sehingga menghasilkan warna yang spesifik karena gugus

hidroksil berkonyugasi dengan ikatan rangkap (Winarno, 2002). Menurut

Lemmens dan Soetjipto, 1991 cit Mukhlisoh, 2010, terbentuknya endapan putih

dengan menggunakan larutan gelatin dikarenakan adanya ikatan hidrogen antara

tanin dan protein pada gelatin. Ikatan hidrogen antara gugus karbonil dari ikatan

peptida dengan gugus hidroksil dari tanin merupakan ikatan yang paling dominan

di dalam kompleks tanin-protein.

Hasil elusi menggunakan fase gerak kloroform:metanol:air (14:6:0,8)

menunjukkan adanya bercak berwarna kuning. Identifikasi tanin dengan

menggunakan plat silika gel 60 GF254 yang diamati pada sinar UV 254 nm dan

365 nm menunjukkan adanya bercak berwarna hitam (Lampiran 5). Nilai Rf untuk

standar tanin sebesar 0,1 sedangkan untuk sampel 1 (penotolan pertama), yaitu

0,13 dan sampel 2 (penotolan kedua) yaitu 0,15. Plat selanjutnya disemprot

dengan menggunakan FeCl3 dan terjadi perubahan warna menjadi hitam yang

menunjukkan bahwa sampel mengandung tanin.


37

Gambar 7. Penampakan bercak tanin setelah disemprot dengan FeCl3

Keterangan :

Fase diam : Silika gel

Fase gerak : kloroform:metanol:air (14:6:0,8) A : Standar tanin

B : Sampel penotoloan 1

C : Sampel penotolan 2

E. Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam Terhadap

Streptococcus mutans dengan metode Difusi Sumuran

Pengujian daya antibakteri ini dilakukan untuk mengetahui sejauh mana

aktivitas suatu bakteri terhadap agen antibakteri. Uji daya antibakteri dengan

menggunakan metode difusi sumuran dilakukan untuk menentukan rentang

konsentrasi yang akan digunakan dalam penentuan nilai KHM dan KBM. Prinsip

A B C

1 cm 1,3 cm 1,5 cm


38

metode difusi yaitu pengukuran daya antibakteri berdasarkan pengamatan luas

zona hambat pertumbuhan bakteri karena berdifusinya obat dari tempat awal

pemberian ke daerah difusi. Pada pengujian difusi sumuran ekstrak daun salam

dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 5, 10, 20, 30, dan 50 mg/mL dengan

menggunakan pelarut aquadest steril (Lampiran 7). Penentuan konsentrasi ini

berdasarkan orientasi yang telah dilakukan peneliti. Berdasarkan hasil orientasi,

konsentrasi tertinggi yang dapat larut sempurna adalah konsentrasi 50 mg/mL,

sedangkan diatas konsentrasi 50 mg/mL ekstrak tidak dapat larut sempurna

sehingga akan berpengaruh pada hasil yang akan didapat.

Pada penelitian ini digunakan kontrol negatif aquadest steril dan kontrol

positif adalah klorheksidin 0,2%. Klorheksidin efektif dalam menghambat

akumulasi plak gigi terutama karena sifatnya sebagai antibakteri dengan spektrum

luas dan poten dalam mempengaruhi pertumbuhan dari Streptococcus mutans

(Koo, Hayacibara, Schobel, Cury, Rosalen, Park, Vacca-Smith, and Bowen,

2003). Aquadest digunakan sebagai pelarut ekstrak dan kontrol negatif karena

berdasarkan hasil orientasi yang telah dilakukan ekstrak dapat larut sempurna.

Selain itu, jika dibandingkan dengan pelarut lainnya seperti DMSO, etanol, CMC-

Na maka aquadest merupakan pelarut yang paling aman dan dapat melarutkan

ekstrak dengan lebih baik (Lampiran 8). Kontrol negatif digunakan untuk

mengetahui apakah pelarut ekstrak yang digunakan memiliki pengaruh terhadap

zona hambat yang terbentuk. Kontrol positif digunakan sebagai perbandingan

daya antibakteri antara klorheksidin dengan ekstrak etanolik daun salam dengan

mengamati diameter zona hambat yang dihasilkan. Apabila zona hambat yang


39

terbentuk pada ekstrak daun salam lebih besar dibandingkan dengan klorheksidin,

maka ekstrak daun salam memiliki potensi yang kuat sebagai antibakteri dan

dapat dikembangkan dalam formulasi bahan alam menjadi sediaan farmasi dengan

dosis terapi ekstrak etanolik daun salam yang dapat digunakan secara mudah oleh

masyarakat.

Pengujian aktivitas antibakteri pada ekstrak etanolik daun salam

dilakukan dengan metode difusi sumuran menggunakan media MHA dengan

konsentrasi 5, 10, 20, 30, dan 50 mg/mL terhadap bakteri Streptococcus mutans.

Kultur bakteri Streptococcus mutans yang digunakan pada penelitian ini

merupakan bakteri yang berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.

Perlu dilakukan sterilisasi media dan alat-alat yang akan digunakan dengan

menggunakan autoklaf. Prinsip kerja dari autoklaf adalah sterilisasi dengan

menggunakan uap panas bertekanan tinggi yaitu 1210C, 1 atm selama 15 menit.

Sterilisasi dengan autoklaf akan mendenaturasi protein sel bakteri dan

mengkoagulasi protoplasma. Pada saat akan disterilisasi, tutup tabung tidak boleh

ditutup terlalu kencang karena digunakannya tekanan tinggi. Tabung yang ditutup

terlalu kencang dikhawatirkan akan pecah karena tekanan yang tinggi.

Pemilihan media Mueller Hinton Agar (MHA) pada penelitian ini karena

media ini telah direkomendasikan oleh FDA dan WHO untuk uji antibakeri

terutama untuk bakteri aerob dan fakultatif anaerob. Media agar ini juga telah

terbukti memberikan hasil yang baik dan reprodusibel dengan kandungan

sulfonamida, trimethoprim, dan inhibitor tetrasiklin yang rendah sehingga

memberikan pertumbuhan bakteri yang memuaskan. Kandungan dari MHA, yaitu


40

ekstrak daging sapi (2 g), asam hidroksilat dari kasein (17,5 g), pati (1,5 g), dan

agar (17 g). Ekstrak daging sapi dan asam hidroksilat dari kasein menyediakan

nitrogen, vitamin, karbon, dan asam amino. Pati ditambahkan untuk menyerap

metabolit beracun yang dihasilkan, dan agar berfungsi untuk memadatkan media

(Acumedia, 2011). Media MHA dibuat dengan cara melarutkan 38 gram bubuk

media MHA dalam aquadest sampai volume 1 L. Larutan dimasukkan ke dalam

erlenmeyer dan dipanaskan sampai larutan menjadi jernih dengan bantuan stearer.

Pengujian ini dilakukan dengan pengulangan sebanyak 3 kali replikasi

dimana setiap replikasi dilakukan 3 kali repetisi. Sebanyak 1-2 ose Streptococcus

mutans dimasukkan ke dalam natrium klorida 0,9% dimana jumlah suspensi

bakteri yang digunakan disetarakan dengan standar 0,5 Mc Farland II

(diperkirakan 1,5x108 sel bakteri/mL) dengan menggunakan Densicheck.

Penggunaan natrium klorida 0,9% berfungsi untuk menjaga sel bakteri dalam

keadaan isotonis, karena jika bakteri dalam keadaan hipotonis atau hipertonis

maka selnya akan pecah sehingga bakteri akan mati. Selain itu, natrium klorida

0,9% merupakan sumber mineral yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri.

Pada setiap petri yang berisi media MHA dibuat sebanyak 7 lubang dengan

menggunakan pelubang berdiameter 6 mm. Sumuran yang terbentuk kemudian

ditambal dengan media MHA cair sebanyak 30 µL, dan dibiarkan memadat.

Selanjutnya masing-masing lubang ditambahkan sebanyak 50 µL yang berisi 5

konsentrasi larutan uji, 1 kontrol positif, dan 1 kontrol negatif.

Pada pengujian digunakan kontrol kontaminasi media, dan kontrol

pertumbuhan bakteri. Kontrol kontaminasi media yang berfungsi untuk


41

mengetahui apakah proses pengujian yang dilakukan aseptis atau tidak dan juga

untuk mengetahui apakah media yang digunakan terkontaminasi atau tidak.

Kontrol pertumbuhan bakteri berfungsi untuk mengetahui pertumbuhan

Streptococcus mutans tanpa pemberian agen antibakteri. Dari hasil pengamatan

untuk kontrol media tidak menunjukkan adanya kontaminasi, hal ini berarti media

yang digunakan adalah media steril dan pengerjaan dilakukan secara aseptis. Pada

kontrol negatif tidak terbentuk zona hambat, hal ini berarti pelarut yang digunakan

tidak memberikan pengaruh terhadap zona hambat yang terbentuk pada perlakuan.

Apabila pelarut memiliki kemampuan untuk dapat menghambat pertumbuhan

bakteri uji maka akan mempengaruhi hasil uji karena zona hambat yang

dihasilkan tidak hanya dari larutan uji, tetapi juga dari pelarut yang digunakan.

Pada kontrol pertumbuhan menunjukkan adanya pertumbuhan Streptococcus

mutans dilihat dari koloni bakteri yang seragam dan tidak terdapat kontaminasi

dari kapang, khamir, dan bakteri lain. Kontrol positif menunjukkan adanya zona

hambat yang berarti bahwa klorheksidin memiliki kemampuan untuk menghambat

pertumbuhan Streptococcus mutans. Inkubasi dilakukan pada suhu 370C selama

24 jam dan saat inkubasi petri tidak diinkubasi terbalik karena jika diinkubasi

terbalik maka ekstrak yang telah dimasukkan ke dalam sumuran akan keluar

sehingga tidak akan berdifusi ke dalam media agar.


42

Tabel II. Rata-rata diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans yang

dihasilkan pada uji daya antibakteri ekstrak etanolik daun salam

Konsentrasi

ekstrak

(mg/mL)

Diameter zona hambat (mm) Rata-rata

I II III

Kontrol negatif 0 0 0 0

Kontrol positif 11 12 12 12

5 6 6 5 6

10 8 8 7 7

20 9 9 8 8

30 10 10 10 10

50 12 11 12 11

Keterangan : Diameter zona hambat sudah dikurangi dengan diameter sumuran sebesar 6 mm

Hasil pengamatan dengan metode difusi sumuran, pada kontrol negatif

tidak terbentuk zona hambat. Hal ini menunjukkan bahwa zona hambat yang

terbentuk pada konsentrasi 5, 10, 20, 30, dan 50 mg/mL berasal dari kemampuan

ekstrak etanolik daun salam bukan karena pengaruh pelarut ekstrak (Lampiran 9).

Penghambatan di sekitar pertumbuhan ditunjukkan dengan luasnya diameter zona

hambat sumuran. Semakin besar zona hambat yang terbentuk, maka aktivitasnya

sebagai antibakteri semakin baik. Zona hambat diukur menggunakan jangka

sorong secara vertikal, horizontal, dan diagonal. Pada konsentrasi 5 mg/mL masih

terbentuk zona hambat, maka konsentrasi ini digunakan sebagai acuan konsentrasi

terendah untuk penentuan nilai KHM dan KBM.


43

Gambar 8. Zona hambat yang terbentuk pada difusi sumuran ekstrak etanolik daun salam

terhadap bakteri Streptococcus mutans

Keterangan :

A : Kontrol Negatif (aquadest)

B : Kontrol Positif (klorheksidin)

C : Konsentrasi 5 mg/mL

D : Konsentrasi 10 mg/mL

E : Konsentrasi 20 mg/mL

F : Konsentrasi 30 mg/mL G : Konsentrasi 50 mg/mL

Menurut Davis Stout cit Moerfiah dan Supomo (2011), menyatakan

bahwa ketentuan antibakteri adalah sebagai berikut :

1. Sangat kuat (diameter zona hambat 20 mm atau lebih)

2. Kuat (diameter zona hambat 10-20 mm)

3. Sedang (diameter zona hambat 5-10 mm)

4. Lemah (diameter zona hambat < 5 mm)

Berdasarkan ketentuan diatas dapat dikatakan bahwa klorheksidin

memiliki kekuatan kuat karena lebar daerah hambat yang dihasilkan sebesar 12

mm dan ekstrak etanolik daun salam memiliki kekuatan yang sedang hingga kuat

karena diameter zona hambat yang terbentuk pada konsentrasi 5 mg/mL yaitu 6

mm hingga 11 mm pada konsentrasi 50 mg/mL.


44

Adanya zona hambat di sekitar sumuran karena adanya flavonoid dan

tanin berdasarkan analisis fitokimia yang merupakan senyawa golongan fenol

yang dapat menyebabkan terjadinya denaturasi dan koagulasi protein sel bakteri.

Turunan fenol dapat berinteraksi dengan membran sitoplasma, enzim, dan lipid

pada bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Menurut

Siswandono dan Soekardjo (2008) fenol pada konsentrasi rendah akan

membentuk kompleks protein fenol dengan ikatan lemah dan segera menyebabkan

penguraian diikuti penetrasi fenol ke dalam sel bakteri dan menyebabkan

presipitasi serta denaturasi protein, sedangkan pada konsentrasi tinggi fenol

menyebabkan koagulasi protein membran sehingga membran sel bakteri menjadi

lisis dan mengalami kematian. Protein merupakan komponen enzim sehingga jika

terjadi kerusakan pada enzim akan mengakibatkan metabolisme menurun yang

mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan dan perkembangan sel bakteri dan

selanjutnya menyebabkan kematian sel.

Pada bakteri, ion H+

dari senyawa fenol akan menyerang gugus polar

(gugus fosfat) pada molekul fosfolipid sehingga akan terurai menjadi gliserol,

asam karboksilat, dan asam fosfat. Hal ini mengakibatkan fosfolipid tidak mampu

mempertahankan bentuk membran sitoplasma, sehingga membran sitoplasma

akan bocor dan menyebabkan zat-zat yang seharusnya digunakan untuk

metabolisme sel bakteri keluar dan menyebabkan kematian bakteri (Parwata dan

Dewi, 2008). Selain itu, adanya interaksi hidrofobik antara gugus alkil pada fenol

dengan lipid menyebabkan terjadinya penurunan permeabilitas membran sehingga


45

bakteri mengalami kematian sel (McKarns, Hansch, Caldwell, Morgan, Moore,

Doolittle, 1997; Hunt, 1975).

Tanin merupakan senyawa fenol maka mempunyai target pada

polipeptida dinding sel yang akan menyebabkan kerusakan pada membran sel

yaitu hilangnya sifat permeabilitas membran sel, sehingga keluar masuknya zat-

zat antara lain air, nutrisi, dan enzim tidak terseleksi. Apabila enzim keluar dari

dalam sel, maka akan mengakibatkan terhambatnya pembentukan ATP yang

diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan sel bakteri sehingga akan

terjadi kematian sel. Mekanisme kerja tanin sebagai antibakteri berhubungan

dengan kemampuan tanin untuk membentuk kompleks dengan karbohidrat dan

protein melalui ikatan hidrogen, hidrofobik, dan kovalen. Dengan demikian, tanin

dapat menonaktifkan adhesin sel mikroba (molekul yang menempel pada sel

inang) yang terdapat pada permukaan sel, enzim yang terikat pada membran sel,

sel protein transport, dan mineral. Apabila terbentuk ikatan hidrogen antara tanin

dengan protein bakteri kemungkinan yang terjadi adalah denaturasi protein.

Protein pada bakteri merupakan salah satu komponen penyusun dinding sel dan

membran plasma. Jika protein bakteri terdenaturasi, maka enzim akan menjadi

inaktif sehingga metabolisme bakteri terganggu yang berakibat pada kerusakan sel

bakteri (Min, Pinchak, Anderson, and Callaway 2007). Selain itu, tanin juga dapat

menghambat pembentukan alfa amilase pada saliva yang mengkatalis hidrolisis

pati menjadi oligosakarida yang membantu Streptococcus mutans menempel pada

enamel gigi sehingga memberikan sumber makanan asidogenik untuk bakteri

kariogenik pada permukaan gigi (Petti and Scully, 2009).


46

Sebagai antibakteri, flavonoid dapat membentuk kompleks dengan

protein ekstraseluler dan dinding sel bakteri. Selain itu, flavonoid yang bersifat

lipofilik dapat merusak membran bakteri (Cowan, 1999). Menurut Cushnie and

Lamb (2005), pada golongan flavonoid, termasuk flavon, flavanon, isoflavon, dan

isoflavanon menunjukan aktivitas antibakteri yang berbeda pada metode difusi

agar paper disc. Pada 5-hidroksiflavanon dan 5-hidroksiisoflavanon dengan

adanya penambahan satu, dua, atau tiga golongan hidroksil pada posisi 7, 2’ dan

4’ menunjukkan adanya penghambatan pertumbuhan Streptococcus mutans.

Selain itu, chalcone 2,4,2’-trihydroxy-5’-methylchalcone dapat menginduksi

terjadinya kebocoran substansi Streptococcus mutans seperti nukleotida dengan

mengubah permeabilitas membran selular dan menyebabkan kerusakan fungsi

membran sitoplasma yang teramati pada panjang gelombang 260 nm.

Analisis secara statistik dilakukan untuk melihat perbedaan bermakna

antara variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun salam dengan kontrol negatif dan

kontrol positif. Menurut Dahlan (2011), analisis diawali dengan menggunakan uji

Shapiro-Wilk yang dilanjutkan dengan uji Kruskal-Wallis terlebih dahulu.

Pemilihan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui apakah data yang didapatkan

terdistribusi normal atau tidak dengan syarat jumlah sampel data yang ada

berjumlah kurang dari 50 data. Data yang didapatkan dinyatakan terdistribusi

normal jika nilai p>0,05 (Dahlan, 2011). Berdasarkan analisis data yang dilakukan

didapatkan bahwa data terdistribusi tidak normal karena pada kelompok data

kontrol negatif didapatkan data yang tidak normal (Lampiran 10). Karena data

terdistribusi tidak normal maka dilakukan uji nonparametrik dengan


47

menggunakan uji Kruskal-Wallis untuk mengetahui paling tidak terdapat dua

kelompok data yang mempunyai perbedaan yang bermakna dengan nilai p<0,05

yang selanjutnya harus dilakukan analisis Wilcoxon (Dahlan, 2011). Hasil uji

Kruskal-Wallis didapatkan nilai p=0,005328 (Tabel III).

Tabel III. Hasil uji statistik keberbedabermaknaan antara diameter zona hambat dengan

berbagai variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun salam terhadap Streptococcus mutans

dengan metode Kruskal-Wallis

Selanjutnya dilakukan uji Wilcoxon (Lampiran 11) untuk mengetahui

kelompok mana yang berbeda secara bermakna. Data hasil uji Wilcoxon

dinyatakan berbeda bermakna apabila nilai p<0,05 (Dahlan, 2011). Analisa data

yang dilakukan menunjukkan bahwa antara variasi konsentrasi ekstrak etanolik

daun salam dengan kontrol positif dan antar variasi konsentrasi ekstrak etanolik

daun salam berbeda bermakna dengan nilai p=0,04953, kecuali antara konsentrasi

50 mg/mL dengan kontrol positif tidak berbeda bermakna karena nilai p>0,05

yaitu p=0,2752, antara variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun salam dengan

kontrol negatif dan antara kontrol positif dan negatif berbeda bermakna dengan

nilai p=0,0369.


48

Tabel IV. Data hasil uji Wilcoxon

K.+ K.- 5 10 20 30 50

K.+ - b.b b.b b.b b.b b.b b.b

K.- b.b - b.b b.b b.b b.b b.b

5 b.b b.b - b.b b.b b.b b.b

10 b.b b.b b.b - b.b b.b b.b

20 b.b b.b b.b b.b - b.b b.b

30 b.b b.b b.b b.b b.b - b.b

50 tb.b b.b b.b b.b b.b b.b - Keterangan :

tb.b p=0,2752

b.b p=0,0369

b.b p=0,04953

Berdasarkan hasil uji Wilcoxon tersebut, berarti semakin besar

konsentrasi ekstrak etanolik memberikan aktivitas daya antibakteri yang berbeda

bermakna. Pada perbandingan yang dilakukan, antara konsentrasi 50 mg/mL

dengan kontrol positif didapatkan hasil yang tidak berbeda bermakna, hal ini

berarti konsentrasi 50 mg/mL memiliki kemampuan yang sama dengan

klorheksidin dalam menghambat pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans.

Perbandingan antar variasi konsentrasi ekstrak etanolik daun salam memiliki

perbedaan yang bermakna dan ekstrak etanolik daun salam memiliki perbedaan

bermakna bila dibandingkan dengan kontrol negatif. Artinya bahwa variasi

konsentrasi ekstrak etanolik daun salam memiliki daya antibakteri terhadap

bakteri Streptococcus mutans penyebab karies gigi, namun daya antibakteri yang

dimiliki tidak sekuat daya antibakteri kontrol positif. Hal ini dimungkinkan karena

ekstrak etanolik daun salam masih merupakan campuran dari banyak senyawa

yang belum seluruhnya teridentifikasi, sehingga mungkin terbentuk interaksi antar

senyawa tersebut yang saling antagonis sehingga menghambat kemampuan

antibakteri dari ekstrak etanol daun salam.


49

F. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanolik Daun Salam dengan

Metode Dilusi Padat

Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi minimal ekstrak

etanolik daun salam yang dibutuhkan untuk mendapatkan efek daya antibakteri

terhadap Streptococcus mutans. Konsentrasi larutan uji yang digunakan dalam

metode dilusi ini mengacu pada hasil uji difusi sumuran. Sebagai perlakuan

digunakan 8 konsentrasi larutan uji, yaitu 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, dan 30

mg/mL (Lampiran 7). Penentuan kosentrasi larutan uji tersebut didasarkan pada

pengujian sebelumnya yang dilakukan dengan menggunakan konsentrasi 1, 2, 3,

4, 5, 6, 7, 8, dan 9 mg/mL dimana pada hasil pengamatan tidak didapatkan media

pertumbuhan yang jernih. Oleh karena itu, konsentrasi larutan uji dinaikkan untuk

mendapatkan hasil media yang jernih dengan tidak adanya pertumbuhan bakteri.

Penilaian uji ini berdasarkan tingkat kekeruhan yang dihasilkan dengan adanya

penambahan larutan uji. Pada metode dilusi padat ini dilakukan pengujian

sebanyak 1 replikasi yang kemudian direpetisi sebanyak tiga kali.

Tabel V. Hasil pengamatan penentuan nilai KHM dan KBM

Konsentrasi (mg/mL) Kekeruhan Replikasi I

15 - 18 - 20 - 22 - 24 - 26 - 28 - 30 -

Kontrol negatif +++ Kontrol positif -

Keterangan : +++ : sangat keruh, ++ : keruh, + : agak keruh, - : jernih


50

Gambar 9. Hasil dilusi padat pada konsentrasi 15 dan 18 mg/mL

Pengamatan kekeruhan hasil dilusi padat dilakukan secara visual yang

dibandingkan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Kekeruhan yang

dihasilkan pada media menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Oleh karena

itu, dilakukan penggolongan tingkat kekeruhan bakteri, apakah sangat keruh

(+++), keruh (++), agak keruh (+), dan jernih (-) yang berarti tidak terdapat

pertumbuhan bakteri uji. Berdasarkan hasil pengamatan, semua petri pada semua

konsentrasi menghasilkan kejernihan yang sama dan tidak terdapat pertumbuhan

bakteri (Lampiran 12).

G. Uji Penegasan Daya Antibakteri Ekstrak Etanolik Daun Salam

dengan Metode Streak Plate

Berdasarkan hasil dilusi padat, pada cawan petri yang tidak menunjukkan

adanya pertumbuhan bakteri dilakukan pemindahan bakteri secara streak plate ke

media MHA dalam cawan petri. Pada setiap konsentrasi yang direpetisi diambil 1

ose kemudian di streak pada cawan petri sebanyak 3 kali, yang selanjutnya

diinkubasi dan diamati setelah 24 jam apakah terdapat pertumbuhan bakteri atau

tidak untuk menentukan nilai KHM dan KBM. Suatu konsentrasi larutan uji


51

dinyatakan sebagai nilai KHM apabila dari pengamatan hasil streak plate masih

menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Sedangkan penentuan nilai KBM

ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan pada hasil streak plate yang

menandakan bakteri uji mati karena larutan uji dengan konsentrasi tersebut.

Gambar 10. Hasil streak plate pada konsnetrasi 15 dan 18 mg/mL

Setelah diinkubasi selama 24 jam, didapatkan hasil pada konsentrasi 15

mg/mL masih menunjukkan pertumbuhan bakteri uji sehingga konsentrasi 15

mg/mL dinyatakan sebagai nilai KHM. Sedangkan nilai KBM dinyatakan pada

konsentrasi 18 mg/mL, dimana pada konsentrasi tersebut tidak menunjukkan

pertumbuhan bakteri uji (Lampiran 13).


52

BAB V

A. Kesimpulan

1. Ekstrak etanolik daun salam memiliki daya antibakteri terhadap bakteri

Streptococcus mutans penyebab karies gigi.

2. Ekstrak etanolik daun salam memiliki Kadar Hambat Minimum (KHM) pada

konsentrasi 15 mg/mL dan Kadar Bunuh Minimum (KBM) pada konsentrasi

18 mg/mL terhadap bakteri Streptococcus mutans penyebab karies gigi.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan kepastian

kandungan kimia yang terkandung dalam ekstrak etanol daun salam yang

menyebabkan efek antibakteri dengan metode identifikasi yang lebih spesifik.

2. Dapat dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengembangan bentuk

sediaan farmasi yang mengandung senyawa aktif daun salam sehingga dapat

digunakan sebagai antibakteri terhadap bakteri Streptococcus mutans dan

menjadi terapi alternatif penyakit karies gigi akibat infeksi bakteri yang dapat

digunakan secara mudah oleh masyarakat, misalnya sediaan pasta gigi atau

mouthwash.


53

DAFTAR PUSTAKA

Acumedia, 2011, Mueller Hinton Agar (77101), http://

www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7101_PI.pdf, diakses 18 Januari

2013.

Alcamo, I.E., 1996, Laboratory Fundamentals of Microbiology, 5th Edition,

Addison Wesley Longman Publishing Company, Canada, p.309.

Anggraeni, A., Yuliati, A., dan Nirwana, I., 2005, Perlekatan Koloni

Streptococcus mutans Pada Permukaan Resin Komposit Sinar Tampak,

Majalah Kedokteran Gigi (Dent. J.), Vol.38. No.1 Januari 2005: 8-11.

Anonim, 2011, Streptococcus mutans em imagens SUPER ampliadas,

http://www.odontoblogia.com.br/curiosidades/streptococcus-mutans-

imagens/, diakses 11 Januari 2013.

Ardani, M., Pratiwi, S.U.T., Hertiani, T., 2010, Efek Campuran Minyak Atsiri

Daun Cengkeh dan Kulit Batang Kayu Manis Sebagai Antiplak Gigi, p. 192.

Astoeti, T. E., 2011, Karies Gigi Masalah Kesehatan Serius di Indonesia,

http://www.beritasatu.com/mobile/kesehatan/14088-karies-gigi-masalah-

kesehatan-serius-di-indonesia.html, diakses 31 Oktober 2012.

Backer C.A., and Van Den Brink, B., 1963, Flora of Java (Spermatophyta Only),

Vol.I, N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands, pp.337-339.

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, 2008, Riset Kesehatan Dasar 2007, Badan Penelitian dan

Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan Republik Indonesia, pp.

xvi, 142.

Behrman, Kliegman, & Arvin, 2000, Ilmu Kesehatan Anak, Edisi 15, Penerbit

Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp.992-994.

Cushnie, T.P.T., and Lamb, A.J., 2005, Antimicrobial Activity of Flavonoids, Int.

J. Antimicrob. Ag., 26 (2005) 343-356.

Cowan, M.M., 1999, Plant Products as Antimicrobial Agents, Clinical

Microbiology Reviews, 1999, 12(4):564.

Dahlan, M.S., 2011, Statistik Untuk Kedokteran dan Kesehatan, Penerbit Salemba

Medika, Jakarta, pp.4, 13, 26.


http://www.neogen.com/Acumedia/pdf/ProdInfo/7101_PI.pdf

http://www.odontoblogia.com.br/curiosidades/streptococcus-mutans-imagens/

http://www.odontoblogia.com.br/curiosidades/streptococcus-mutans-imagens/

54

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1980, Materia Medika Indonesia,

Jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, p.109.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sediaan Galenik, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp.1-2, 10.

Ford, C., 2012, The Disease Called Cavities, http://drcarolford.com/the-disease-

called-cavities/, diakses 12 Januari 2012

Gritter, R.J., 1991, Pengantar Kromatografi, Edisi II, diterjemahkan oleh

Padmawinata, K., Penerbit ITB, Bandung, pp.163, 165.

Hunt, W.A., The Effects of Aliphatic Alcohols On the Biophysical and

Biochemical Correlates of Membrane Function, Adv Exp Med Biol 1975,

56: 195–210.

Hustani, M.N., 2009, Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Salam

(Syzygium polyanthum [Wight] Walp.) terhadap Bakteri Penyebab Diare

Jawetz, Melnick, dan Adelberg’s, 2005, Mikrobiologi Kedokteran, diterjemahkan

oleh Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga,

Penerbit Salemba Medika, Jakarta, p.327.

Kardinan, A., dan Kusuma, F.R., 2004, Meniran Penambah Daya Tahan Tubuh

Alami, PT Agromedia Pustaka, Jakarta, p.2.

Kee, J.L., and Hayes, E.R., 1994, Farmakologi : Pendekatan Proses

Keperawatan, diterjemahkan oleh Anugerah, P., Penerbit Buku Kedokteran

EGC, Jakarta, p.325.

Kidd, E.A.M., and Bechal, S.J., 1992, Dasar-Dasar Karies, Penyakit dan

Penanggulangannya, diterjemahkan oleh Sumawinata, N. dan Faruk, S.,

Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp.1-4, 73-74, 141.

Koo, H., Hayacibara, M.F., Schobel, B.D., Cury, J.A., Rosalen, P.L., Park, Y.K.,

Vacca-Smith, A.M., and Bowen, W.H., 2003, Inhibition Streptococcus

mutans Biofilm Accumulation and Polysaccharide Production by Apigenin

and tt-farnesol, J. Antimicrob. Chemother. (2003), 52. 782-789.

Kurniawati, N., 2010, Sehat & Cantik Alami Berkat Khasiat Bumbu Dapur, PT

Mizan Pustaka, Bandung, p.91.

McKarns, S.C., Hansch, C., Caldwell, W.S., Morgan, W.T., Moore, S.K.,

Doolittle, D.J., Correlation Between Hydrophobicity of Short Chain

Aliphatic Alcohols and Their Ability to Alter Plasma Membrane Integrity,

Fundam Appl Toxicol 1997; 36: 62–70.


http://drcarolford.com/the-disease-called-cavities/

http://drcarolford.com/the-disease-called-cavities/

55

Min, B.R., Pinchak, W.E, Anderson, R.C., and Callaway, T.R., 2007, Effect of

Tannins on the In Vitro Growth of Escherichia coli 0157:H7 and In Vivo

Growth of Generic Escherichia coli Excreted from Steers, J. Food Prot.,

Vol. 770, No. 3, 2007, pp.543-550.

Moerfiah dan Supomo, F.D.S., Pengaruh Ekstrak Daun Sirih Merah (Piper cf

fragile Benth.) terhadap Bakteri Penyebab Sakit Gigi, Ekologia, Vol. 11 No.

1, Oktober 2011:30-35.

Morad, F.A., 2011, Syzygium polyanthum (Wight) Walp.,

http://eol.org/data_objects/17478040, diakses 11 Januari 2013.

Mulja dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, cetakan Pertama, Airlangga

University press, Surabaya, p.223.

Parwata I.M.O.A., dan Dewi P.F.S., 2008, Isolasi dan Uji Aktifitas Antibakteri

Minyak Atsiri dari Rimpang Lengkuas (Alpinia galanga L.), Jurnal Kimia.,

2 (2): 100-104.

Pratiwi, S.T., 2008, Mikrobiologi Farmasi, Erlangga, Jakarta, pp.188-191.

Petti, S., and Scully, C., 2009, Polyphenols, Oral Health and Disease : A Riview,

J. Dent., 37 (2009) 413-423.

Sari, C.D.P., 2012, Uji Daya Antibakteri Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium

polyanthum (Wight.) Walp.) terhadap Staphylococcus aureus ATCC 6538

dan Escherichia coli ATCC 11229 secara In vitro

Schuurs, A.H.B., 1993, Patologi Gigi Geligi Kelainan-Kelainan Jaringan Keras

Gigi, diterjemahkan oleh Suryo, S., Yogyakarta, UGM Press, p.135.

Siswandono, dan Soekardjo, B., 2008, Kimia Medisinal, Airlangga University

Press, Surabaya, p.12.

Smith, D.J., 2003, Caries Vaccines For The Twenty-First Century, J. Dent. Educ.,

Volume 67:1130-1139.

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, dalam A

Practical Supplement to Pharmacopoias, diterjemahkan oleh Padmawinata

K., dan Sudiro, I., Penerbit ITB, Bandung, p.16.

Sumawinata, N., 2002, Senarai Istilah Kedokteran Gigi Inggris Indonesia,

Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, p.34.


http://eol.org/data_objects/17478040

56

Sumono, A., dan Wulan, A., 2009, Kemampuan Rebusan Daun Salam (Eugenia

polyantha W) dalam Menurunkan Jumlah Koloni Bakteri Streptococcus sp.,

Majalah Farmasi Indonesia, 20(3), 112-117.

Taubman, M.A., and Nash, D.A., 2006, The Scientific and Public Health

Imperative for a Vaccine Against Dental Caries,

http://www.nature.com/nri/journal/v6/n7/fig_tab/nri1857_F1.html, diakses 2

November 2012.

Whitman, W.B., 2009, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd

Edition,

Volume 3, Departement of Microbiology 527 Biological Sciences Building

University of Georgia, USA, p.661.

Widyastuti, S., 2002, Daya Antibakteri Minyak Atsiri Daun Salam (Eugenia

polyantha Wight) terhadap Bakteri Shigella dysenteriae.

Winarno, F.G., 2002, Kimia Pangan dan Gizi, PT Gramedia Pustaka Utama,

Jakarta, p.146.

Winarto, W.P., 2003, Sehat dengan Ramuan Tradisional : Memanfaatkan Bumbu

Dapur untuk Mengatasi Aneka Penyakit, PT Agromedia Pustaka, Jakarta,

p.50.

Yunilawati, R., 2002, Minyak Atsiri Daun Sirih Sebagai Antibakteri

Streptococcus mutans Dalam Pasta Gigi, Skripsi, Institut Pertanian Bogor,

Bogor.


http://www.nature.com/nri/journal/v6/n7/fig_tab/nri1857_F1.html

57

LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi


58

Lampiran 2. Surat keterangan sertifikasi hasil uji Streptococcus mutans


59

Lampiran 3. Hasil pengeringan dan penyerbukan daun salam

Hasil pengeringan daun salam

Hasil penyerbukan daun salam


60

Lampiran 4. Hasil uji tabung dari skrining fitokimia serbuk daun salam

Keterangan:

A. Filtrat daun salam sesudah ditambahkan

NaOH

Keterangan:

B. Setelah diberikan HCl terjadi perubahan

warna merah menjadi kurang pekat

Kesimpulan:

Daun salam mengandung flavonoid (+)

Keterangan:

C. Filtrat daun salam sesudah ditambahkan NaCl

2%

Keterangan:

D. Filtrat daun salam sesudah ditambahkan

gelatin 1% terbentuk endapan

Kesimpulan:

Daun salam mengandung tanin (+)


61

Keterangan:

E. Filtrat daun salam sesudah ditambahkan

FeCl3 terjadi perubahan warna menjadi

biru kehitaman

Kesimpulan:

Daun salam mengandung tanin (+)


62

Lampiran 5. Identifikasi flavonoid dan tanin dengan KLT

Identifikasi Flavonoid

A. Hasil elusi flavonoid dengan fase gerak n-

butanol:asam asetat glasial:air (40:10:50)

B. Bercak flavonoid berwarna kuning yang

dihasilkan setelah diuapi dengan amoniak

C. Penampakan bercak pada λ 254 nm

Keterangan:

A : Standar rutin

B : Sampel 1

C : Sampel 2


63

D. Penampakan bercak pada λ 365 nm

Keterangan:

A : Standar rutin

B : Sampel 1

C : Sampel 2

Identifikasi Tanin

A. Hasil elusi tanin dengan fase gerak

kloroform:metanol:air (14:6:0,8)

B. Bercak tanin berwarna hitam yang

dihasilkan setelah disemprot dengan FeCl3


64

C. Penampakan bercak pada λ 254 nm

D. Penampakan bercak pada λ 365 nm Keterangan:

A : Standar tanin

B : Sampel 1

C : Sampel 2


65

Lampiran 6. Hasil ekstraksi daun salam menggunakan pelarut etanol 96%

A. Proses maserasi serbuk daun salam dengan pelarut etanol 96%

B. Proses penyaringan hasil maserasi

menggunakan corong Buchner dengan bantuan pompa vacuum

C. Menggunakan rotary vacuum evaporator

sampai terbentuk cairan kental


66

D. Ekstrak etanolik daun salam


67

Lampiran 7. Konsentrasi larutan uji pada metode difusi sumuran dan dilusi

padat

A. Konsentrasi larutan uji pada metode difusi sumuran

(5, 10, 20, 30, dan 50 mg/mL)

B. Konsentrasi larutan uji pada metode dilusi padat

(15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, dan 30 mg/mL)


68

Lampiran 8. Hasil uji kelarutan ekstrak etanol daun salam

A. Kelarutan pada konsentrasi 50 mg/mL

dengan menggunakan DMSO 5%

B. Kelarutan pada konsentrasi 100 mg/mL dengan

menggunakan DMSO 5%

C. Kelarutan pada konsentrasi 50 mg/mL

dengan menggunakan aquadest

D. Kelarutan pada konsentrasi 75 mg/mL dengan

menggunakan aquadest panas


69

E. Kelarutan pada konsentrasi 50 mg/mL

dengan menggunakan aquadest panas


70

Lampiran 9. Hasil pengamatan zona hambat pada metode difusi sumuran

A. Zona hambat yang terbentuk pada replikasi I dengan 3 kali repetisi Keterangan :






F : Konsentrasi 30 mg/mL

G : Konsentrasi 50 mg/mL

A

A

A

B

B

B

C

C C

D

D D

E

E E

F

F F

G G

G


71

B. Zona hambat yang terbentuk pada replikasi II dengan 3 kali repetisi

Keterangan :



C : Konsentrasi 5 mg/mL D : Konsentrasi 10 mg/mL




A

A A

B

B B

C

C

C

D

D D

E

E E

F

F F

G

G G


72

C. Zona hambat yang terbentuk pada replikasi III dengan 3 kali repetisi Keterangan :








A

A A

B

B B

C

C C

D

D D

E

E E

F

F F

G

G G


73

D. Kontrol media dan kontrol pertumbuhan bakteri


74

Lampiran 10. Uji normalitas Shapiro-Wilk

A. Uji normalitas pada konsentrasi 5 mg/mL

B. Uji normalitas pada konsentrasi 10 mg/mL

C. Uji normalitas pada konsentrasi 20 mg/mL


75

D. Uji normalitas pada konsentrasi 30 mg/mL

E. Uji normalitas pada konsentrasi 50 mg/mL

F. Uji normalitas pada kontrol positif

G. Uji normalitas pada kontrol negatif


76

Lampiran 11. Analisa data dengan uji Wilcoxon

A. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan 10 mg/mL

B. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan 20 mg/mL


77

C. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan 30 mg/mL

D. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan 50 mg/mL


78

E. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan Kontrol Positif

F. Perbandingan antara konsentrasi 5 mg/mL dengan Kontrol Negatif


79

G. Perbandingan antara konsentrasi 10 mg/mL dengan konsentrasi 20 mg/mL

H. Perbandingan antara konsentrasi 10 mg/mL dengan konsentrasi 30 mg/mL


80

I. Perbandingan antara konsentrasi 10 mg/mL dengan konsentrasi 50 mg/mL

J. Perbandingan antara konsentrasi 10 mg/mL dengan Kontrol Positif


81

K. Perbandingan antara konsentrasi 10 mg/mL dengan Kontrol Negatif

L. Perbandingan antara konsentrasi 20 mg/mL dengan konsentrasi 30 mg/mL


82

M. Perbandingan antara konsentrasi 20 mg/mL dengan konsentrasi 50 mg/mL

N. Perbandingan antara konsentrasi 20 mg/mL dengan Kontrol Positif


83

O. Perbandingan antara konsentrasi 20 mg/mL dengan Kontrol Negatif

P. Perbandingan antara konsentrasi 30 mg/mL dengan konsentrasi 50 mg/mL


84

Q. Perbandingan antara konsentrasi 30 mg/mL dengan Kontrol Positif

R. Perbandingan antara konsentrasi 30 mg/mL dengan Kontrol Negatif


85

S. Perbandingan antara konsentrasi 50 mg/mL dengan Kontrol Positif

T. Perbandingan antara konsentrasi 50 mg/mL dengan Kontrol Negatif


86

U. Perbandingan antara Kontrol Positif dengan Kontrol Negatif


87

Lampiran 12. Hasil pengamatan dilusi padat

Konsentrasi 15 mg/mL






A

A

A A

A

A

B

B B

B B

B

C C

C C

C C


88

Konsentrasi 28 mg/mL Konsentrasi 30 mg/mL

Pada semua larutan uji dengan konsentrasi 15, 18, 20, 22, 24, 26, 28, dan 30 mg/mL menghasilkan

kejernihan

Keterangan :



C : Larutan uji ekstrak etanolik daun salam

A A B B

C C


89

Lampiran 13. Hasil uji penegasan dengan metode streak plate untuk

menentukan nilai KHM dan KBM








90




91

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Uji Daya Antibakteri

Ekstrak Etanol Daun Salam (Syzygium polyanthum W.)

Terhadap Bakteri Streptococcus mutans Penyebab

Karies Gigi” ini memiliki nama lengkap Wanda Indriani

Wibowo. Penulis lahir di Mataram pada tanggal 11 Juni

1991. Penulis merupakan putri pertama dari tiga

bersaudara pasangan R. Herman Wibowo (Alm.) dan Noortje Christiana Loesi

mengawali masa studinya di TK Teladan pada tahun 1996 hingga tahun 1997, SD

Aletheia pada tahun 1997 hingga tahun 2000 dan melanjutkan ke SDN Kartika

Udayana I/IX pada tahun 2000 hingga 2003, SMP Negeri 1 Denpasar pada tahun

2003 hingga tahun 2006, SMA Negeri 1 Denpasar pada tahun 2006 hingga 2009,

kemudian penulis melanjutkan pendidikan di Fakultas Farmasi Sanata Dharma

Yogyakarta mulai tahun 2009 hingga tahun 2013. Selama kuliah, penulis aktif

mengikuti berbagai kegiatan kemahasiswaan dalam bidang organisasi dan

kepanitiaan, diantaranya menjadi anggota Konsumsi dan Dana dan Usaha dalam

Hari Anti Tembakau, menjadi Koordinator Dana dan Usaha PMK Apostolos

periode 2010-2011, Bendahara PMK Apostolos periode 2011-2012, dan

Bendahara Retreat PMK Apostolos 2012.


plagiat merupakan tindakan tidak terpujidilusi padat. penelitian uji daya antibakteri ekstrak...

Documents