plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk filei uji efek antiinflamasi topikal ekstrak...

UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN

MAJAPAIT (Crescentia cujete L.) TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL

DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI

KARAGENIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Dui Sostales

NIM : 128114085

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN

MAJAPAIT (Crescentia cujete L.) TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL

DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI

KARAGENIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Dui Sostales

NIM : 128114085

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Our greatest weakness lies in giving up. The most certain way to succeed is

always to try just one more time”

-Thomas Alva Edison-

Takut akan TUHAN adalah permulaan pengetahuan, tetapi orang bodoh menghina hikmat dan didikan

(Amsal 1:7)

Kupersembahkan buat :

Kemulian Tuhan Yesus Kristus sebagai juruselamat hidupku

Kedua orang tuaku dan saudariku tercinta

Para sahabat dan Almamaterku


v


vi


vii

PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus oleh karena berkat dan

rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Efek

Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia cujete L.)

terhadap Jumlah Neutrofil dan Ekspresi Siklooksigenase 2 pada Mencit

Terinduksi Karagenin” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah

satu syarat dalam memperoleh gelar Serjana farmasi (S.Farm.) Fakultas Faramasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penyelesaiaan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari

berbagai pihak, baik secara langsung maupun secara tidak langsung. Oleh karena

itu, penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada :

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

2. Bapak Enade Perdana Istyatono, Ph.D.,Apt., selaku Dosen Pembimbing

Akademik yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, dan dukungan

selama menjalani proses perkuliahan di Fakultas Farmasi hingga saat ini.

3. Ibu drh. Sitarina Widyarini, M.P.,Ph.D., selaku Pembimbing Utama atas

kesabaran dan ketabahan untuk selalu membimbing, menyemangati,

membantu, dan mengarahkan selama proses penelitian hingga penyusunan

skripsi ini.

4. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Pembimbing Pendamping atas

dukungan, bimbingan, dan masukan selama proses penelitian hingga

penyusunan skripsi ini.


viii

5. Ibu Phebe Hendra, M.Si.,Ph.D.,Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.

6. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.

7. Bapak, Ibu, Kak Dea yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat,

bantuan, dan kasih sayang.

8. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas

Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan semua fasilitas

laboratorium yang mendukung dalam penelitian ini.

9. Staf laboratorium, Bapak Heru, Bapak Purwanto, Bapak Wagiran, Bapak

Suparjiman, Bapak Kayatno, dan Bapak Lilik yang telah membantu dalam

proses penelitian di laboratorium.

10. Teman-teman seperjuangan dalam penelitian : Monika, Ruri, Kathrin, Farra,

Sinta, atas bantuan, kerja sama, perjuangan serta suka duka yang dialami

selama penelitian.

11. Penghuni kontrakan Dangau Kamuda Diri (DKD) : Bang Egi, Om Alim,

Vensi, Sambu, Iwan, serta Taufik yang selalu ada dikontrakan untuk

mendukung, menyemangati, membantu dan memberi masukan kepada penulis

dalam menyusun skripsi.

12. Teman-teman FSM B dan FST A 2012 atas kebersamaan, suka duka selama

menempuh pendidikan di Falkutas Farmasi.

13. Teman-teman team dota : Andrew, Daniel, Aris, Gotaro, Maco, dan Rei atas

saran dan mainnya selama penyusunan skripsi ini.


https://www.usd.ac.id/profile_detail.php?id=01619

ix

14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu

penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan

dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang

membangun yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata,

semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan bagi perkembangan

ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Januari 2016

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ……………………………………………………….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING …………………………… ii

HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………………… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ……………………………………………. iv

SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ....................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ……………………………………. vi

PRAKATA …………………………………………………………………. vii

DAFTAR ISI ……………………………………………………………….. x

DAFTAR TABEL ………………………………………………………….. xiii

DAFTAR GAMBAR ………………………………………………………. xiv

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………….. xvi

INTISARI ………………………………………………………………….. xviii

ABSTRACT ..................................................................................................... xix

BAB I. PENGANTAR …………………………………………………… 1

A. Latar Belakang …………………………………………………………. 1

1. Rumusan Masalah ………………………………………………….. 5

2. Keaslian Penelitian …………………………………………………. 6

3. Manfaat Penelitian ………………………………………………….. 7

B. Tujuan Penelitian ……………………………………………………….. 8

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA……………………………………… 9


xi

A. Tanaman Cresc3ntia cujete L. ............................................................... 9

B. Metode Penyarian ..……………………………………………………... 13

C. Kulit ......………………………………………………………………... 14

D. Inflamasi ........................………………………………………………... 16

E. Antiinflamasi ….......……………………………………………………. 20

F. Sistem Imun...........……………………………………………………... 22

G. Flavonoid .................................................................................................. 23

H. Hematoksilin dan Eosin .......................................................................... 24

I. Imunohistokimia ..................................................................................... 25

J. Karagenin ...............…………………………………………………….. 26

K. Hidrokortison ...............................……………………………………… 27

L. Landasan Teori …………………………………………………………. 27

M. Hipotesis ……………………………………………………………… 29

BAB III. METODE PENELITIAN ………………………………………… 30

A. Jenis dan Rancangan penelitian ………………………………………… 30

B. Variael dan Definisi Operasional ………………………………………. 30

C. Bahan Penelitian ……………………………………………………… 32

D. Alat Penelitian ………………………………………………………….. 33

E. Tata Cara Penelitian ……………………………………………………. 35

F. Teknik Analisis Data .....……………………………………………… 39

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………… 41

A. Hasil Determinasi Tanaman …………………………............................. 41

B. Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete……............................................ 41


xii

C. Uji Pendahuluan ….......………………………………………………… 43

D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia

cujete......................................................................................................... 45

E. Metode pengecatan hematoksilin eosin (HE)............................................ 46

F. Metode Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 ....................... 55

G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait.............. 64

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN …………………………………… 68

A. Kesimpulan ……………………………………………………………... 68

B. Saran ……………………………………………………………………. 68

DAFTAR PUSTAKA ……………………………………………………… 69

LAMPIRAN ……………………………………………………………….. 74

BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………………. 110


xiii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok

perlakuan ................................................................................... 49

Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok

perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney .................... 52

Tabel III. Rerata ekspresi enzim COX-2 (dalam %) oleh e ekstrak etanol

daun maja dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi

karagenin 3%.............................................................................. 58

Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi enzim COX-2 (dalam %) masing-

masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann

Whitney......................................................................................

61


xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescantia cujete L...............………… 9

Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal. …………….........………… 16

Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis....... 17

Gambar 4. Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan

jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi …..... 21

Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid............................................ 23

Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam. ….... 44

Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan

ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol

negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400

kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan

jaringan kulit (tanda lingkaran merah).................................. 48

Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol

daun maja masing-masing perlakuan dan kontrol ……… 50

Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap

COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di

daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop

binokuler pada perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b).

Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2,

tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2....... 56

Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan


xv

antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak

etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif

(karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali.

Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan

kulit (tanda lingkaran merah). ……………………..............

57

Gambar 11. Diagram batang ekspresi enzim COX-2 masing-masing

kelompok perlakuan beserta kontrol..................................... 59

Gambar 12.

Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi

melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang

mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1,

NF-κB, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda

pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan

IL6.........................................................................................

65

Gambar 13. Daun Crescantia cujete ………………………………… 76

Gambar 14. Serbuk daun Crescantia cujete ………………………….. 76

Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescantia cujete ……….......... 76

Gambar 16. Mencit betina galur Swiss..................................................... 77

Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran.………………. 77

Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10%…………................ 77

Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak …………….......... 78

Gambar 20. Kontrol Hidrocortisone sebagai kontrol positif..................... 78

Gambar 21. Alat spuit injeksi.................................................................... 78


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman majapait

(Crescentia cujete L).............................................................. 74

Lampiran 2. Serbuk daun Crescentia cujete beserta ekstrak etanol

Crescentia cujete .................................................................... 76

Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit........... 77

Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi ………..... 78

Lampiran 5. Surat Etical Clirens ……………………………………… 79

Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin

eosin (HE) .............................................................................. 80

Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro

Wilk …………….................................................................... 82

Lampiran 8. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Kruskal-

Wallis...................................................................................... 83

Lampiran 9. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Mann-

Whitney................................................................................... 86

Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji

imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2....................... 94

Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 pada uji

imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2.......................

96

Lampiran 12. Hasil uji normalitas persen penekanan enzim COX-2 dengan

uji Shapiro Wilk ..................................................................... 98


xvii

Lampiran 13. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan

Kruskal-Wallis........................................................................ 101


Mann Whitney ....................................................................... 102


xviii

INTISARI

Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman

berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji in-

vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian

ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas

antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit

betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan.

Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan

rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6

kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®,

kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia

cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal.

Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit

hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel

neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode

pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen

penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan

antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji

Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc

Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada

kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67;

2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil

dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang

sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah

8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu

1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait

menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme

aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan

penekanan ekspresi COX-2.

Kata kunci: antiinflamasi, topikal, Crescentia cujete, neutrofil, siklooksigenase


xix

ABSTRACT

Majapait (Crescentia cujete L.) is a plant that has pharmacological effect.

From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete

possessed anti-inflammatory. The research aims is to investigate topical anti-

inflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves

ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3%

subcutaneously.

The study was pure experimental with completely randomized design

direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif

control group, positif control group, Biocream® control group and group of

leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and

3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin

test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The

neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining

Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti

cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-

2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued by Kruskal–

Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitney test with 95% confidence level.

The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extract

of Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13.

44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at

the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2

(in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan

control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete

has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and

suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of

antiinflammatory.

Keywords : antiinflammatory, topical, Crescentia cujete, neutrophils,

cyclooxygenase


1

BAB I

PENGANTAR

A. LATAR BELAKANG

Keanekaragaman hayati (biodiversity) yang dimiliki Indonesia, baik

tumbuhan tropis dan biota lautnya, menduduki peringkat kedua di dunia setelah

Brazil. Sekitar 30.000 jenis tumbuhan dan 7.000 di antaranya ditengarai memiliki

khasiat sebagai obat. Kekayaan keanekaragaman hayati ini diteliti, dikembangkan

dan dimanfaatkan untuk peningkatan kesehatan maupun tujuan ekonomi dengan

tetap menjaga kelestariannya ( Sampurno, 2015).

Tumbuhan berkhasiat obat atau herbal medicine merupakan produk obat

yang berasal dari bagian akar, batang, daun, kulit batang, biji, buah dan bunga

yang digunakan untuk pencegahan dan atau penyembuhan penyakit (Kamboj,

2000). Dewasa ini penggunaan obat herbal cenderung terus meningkat, baik di

negara-negara berkembang maupun di negara-negara maju. Peningkatan

penggunaan obat herbal ini terkait kompatibilitas yang lebih baik dengan tubuh

manusia dan efek samping yang lebih rendah.

Salah satu tumbuhan yang berkhasiat obat adalah tumbuhan majapait

(Crescentia cujete L.) yang tumbuh subur di daerah tropis Indonesia. Tumbuhan

majapait atau disebut juga dengan maja atau berenuk merupakan tanaman perdu

yang termasuk dalam famili Bignoniaceae. Tumbuhan majapait sudah

dimanfaatkan sebagai obat pencuci perut, pencahar dan ekspektoran. Selain itu

juga digunakan sebagai obat cacing, analgesik, antiinflamasi dan obat penurun


2

panas. Kayunya digunakan untuk pengobatan demam dan sakit telinga sedangkan

daun digunakan untuk menurunkan tekanan darah. Tanaman ini sudah digunakan

sebagai pencahar oleh masyarakat di Kosta Rika, sedangkan di Kolombia

digunakan untuk penderitaan gangguan pernapasan (Khan, 2015).

Konstituen fitokimia tanaman majapait dilaporkan oleh Mahbub, Hoq,

Ahmed, dan Sarker (2011) terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid,

crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina,

estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin,

naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Dalam

penelitian yang dilakukan Das, Islam, Jahan, Saiful, Khan, Rafikul, dan Parvin

(2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait

diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan

terpenoids. Ejelonu, Lasisi, Olaremu, dan Ejelonu (2011) juga melaporkan

kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins,

alkaloids, flavonoid, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin.

Proses inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai

respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi.

Respon tersebut penting untuk memungkinkan tubuh bertahan selama infeksi atau

cedera dan mempertahankan homeostasis jaringan saat kondisi berbahaya.

Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor

(panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan) (Corwin, 2008). Respon

inflamasi biasanya disertai dengan rasa tidak nyaman, sehingga mendorong

penderita untuk segera mengatasi dan mengobati inflamasi yang terjadi.


3

Setiap agen atau obat yang bekerja melawan atau menekan proses

peradangan disebut antiinflamasi (Dorlan, 2002). Obat antiinflamasi dapat

digunakan secara oral maupun topikal. Pada penggunaan topikal, antiinflamasi

dioleskan pada daerah yang mengalami inflamasi. Penggunaan anttiinflamasi

topikal semakin banyak dicari terkait keuntungan penggunaan sediaan topikal

yang dapat mempercepat aksi obat ditempat kerja karena tidak melalui sistem

percernaan dan menghindari rusaknya zat aktif disebabkan oleh aktifitas enzim

dan interaksi dengan makanan pada terapi antiinflamasi secara oral (Ansel, 1989).

Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk

pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan

respon imum melalui metabolisme asam arakidonat (Widiastuti, 2011). Protein

COX yang merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non Steroid (OAINS)

terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 bersifat konstitutif,

diekspresikan pada hampir semua jaringan untuk fisiologi normal dan

homeostasis, sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulus

inflamasi dan bertanggung jawab pada biosintesis PG yang terlibat pada reaksi

inflamasi dan rasa nyeri (Ikawati, 2006). Sementara ini dapat disimpulkan bahwa

aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan peranan penting dalam proses

inflamasi.

Fase seluler awal proses inflamasi ditandai dengan migrasi sel neutrofil

polimorfonuklear (PMN), sel leukosit pertama, yang secara kimia tertarik ke

daerah inflamasi. PMN neutrofil muncul dalam jumlah yang besar pada hari-hari

pertama peradangan. Banyaknya PMN neutrofil tersebut disebabkan karena


4

adanya peningkatan permeabilitas vaskular dan vasodilatasi pada proses

peradangan. Penghambatan migrasi sel neutrofil menjadi salah satu kunci

menghambat terjadinya inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara

langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang

tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya

akan menekan jumlah prostaglandin (Rahayu, 2009). Mengingat besarnya peran

sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, maka keduanya dapat

dijadikan sebagai target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang

berperan sebagai agen yang mempengaruhi migrasi sel neutrofil dan regulasi

protein COX-2, melalui penekanan ekspresi protein COX-2.

Hasil uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell)

dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait

pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Aktifitas antiinflamasi

pada ekstrak daun majapait diyakini berasal senyawa flavanoid serta tanin.

Flavonoid seperti quercetin yang diketahui efektif dalam mengurangi peradangan

akut. Adapun efek antiinflamasi dari senyawa flavonoid tertentu bekerja melalui

penghambatan kuat terhadap berbagai enzim seperti proteinkinase C, protein

kinase tirosin, fosfolipase A2, fosfodiesterase (Parvin et al.,2015).

Kusuma, Sulistyo, Susanti, dan Sabikis (2014) melaporkan bahwa

pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60;

dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik

dibandingkan kontrol. Flavonoid serta tanin yang terkandung pada ekstrak etanol

daun majapait diduga berperan dalam penghambatan sintesis lokal dan produksi


5

dari prostaglandin I2 vasodilatasi (prostasiklin) sehingga menyebabkan proses

kontraksi luka (vasokontriksi) menjadi lebih cepat.

Das et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada

konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan

DPPH, FRP dan TAC tests. Senyawa antioksidan seperti phenol dan flavonoids

mengikat radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang

menyebabkan penyakit degeneratif dan lainnya. Aktifitas antioksidan telah

memiliki peran sangat penting dalam pengobatan penyakit akibat terpapar radikal

bebas, seperti kanker, penyakit jantung, diabetes, inflamasi, penyakit degeneratif,

anemia, penuaan, dan iskemia. Adanya aktifitas antiinflamasi senyawa

antioksidan dari uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan peluang

bagi penggunaan ekstrak etanol daun majapait secara topikal. Penelusuran

mengenai mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait perlu

dilakukan lebih lanjut melalui perhitungan jumlah neutrofil menggunakan metode

hematoksilin dan eosin (HE) dan penekanan ekspresi protein COX-2

menggunakan metode imunohistokimia. Penelitian efek antiinflamasi topikal

ektrak etanol daun majapait (Crescentia cujete L.) dilakukan dengan pengujian

terhadap kulit punggung mencit galur Swiss yang diinduksi karagenan 3%.

1. Rumusan masalah

a. Apakah ekstrak etanol daun tumbuhan Crescentia cujete L. memiliki

efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi

siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss ?


6

b. Bagaimana mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun

Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin

3% ?

2. Keaslian penelitian

Penelitian mengenai majapait yang pernah dilakukan antara lain:

a. Penelitian yang dilakaukan Mahbub et al. (2011) melaporkan kandungan

kimia tanaman majapait, yaitu tartaric acid, cianhidric, citric acid,

crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta

amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin,

apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal

glycosides.

b. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) melaporkan bahwa

kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa

steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids.

c. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) juga melaporkan bahwa

ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan

aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC

tests. Penelitian yang dilakukan Kusuma dkk. (2014) juga melaporkan

bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada

konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian

pendarahan luar yang lebih baik dibandingkan kontrol.


7

d. Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) melaporkan bahwa ekstrak

etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-

inflamasi pada uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red

Blood Cell) dengan membrane stabilization.

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang efek antiinflamasi topikal

ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi

COX-2 pada mencit yang diinduksi karagenin 3% melalui pengamatan

histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan

imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) belum pernah

dilaporkan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi dan bukti ilmiah

tentang penggunaan ekstrak etanol daun majapait sebagai antiinflamasi

topikal melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan

pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan

antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) .

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa tumbuhan

majapait merupakan bahan obat dengan aktifitas antiinflamasi, sehingga

dapat mendukung penggunaan dan pengembangan tanaman majapait

sebagai antiinflamasi topikal.


8

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiinflamasi topikal ekstrak

etanol daun Crescentia cujete L.

2. Tujuan Khusus

a. Mengetahui efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun Crescentia

cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada

mencit galur Swiss.

b. Mengetahui mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun

Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin

3%.


9

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Crescentia cujete L.

Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescentia cujete L.

1. Taksonomi tanaman

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Viridiplantae

Infrakingdom : Streptophyta

Divisi : Tracheophyta

Sub Divisi : Spermatophytina

Classs : Magnoliopsida

Superorder : Asteranae

Ordo : Lamiales

Famili : Bignoniaceae


10

Genus : Crescentia

Spesies : Crescentia cujete L. ( Anonim, 2015).

2. Sinonim

Calabash Ayale, Calabacero, Miracle fruit, Vilayati Bel, Beggars bowl

(Khan, 2015).

3. Nama daerah

Sumatera : Tabu kayu (Melayu)

Jawa : Berenuk (Jawa)

Sulawesi : Bila balanda (Makasar),

Maluku : Buah no (Ternate)

Indonesia : Majapait

(Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

4. Penyebaran

Crescentia cujete L. (Gambar 1.) merupakan tanaman yang banyak

dijumpai di daerah tropis. Distribusikan secara luas di kawasan Karibia, Meksiko,

Utara dan Selatan Amerika, Asia, Malesia dan kemudian diperkenalkan ke Afrika,

dari Senegal ke Kamerun kemudian ke bagian lain dari Afrika. Pohon ini banyak

ditanam di bagian utara negara Nigeria (Ejelonu et al., 2011).

Tanaman ini merupakan jenis tanaman dikotil berbunga yang berasal

dari Amerika Tengah dan Selatan. Tanaman ini dapat hidup dengan baik di


11

tempat-tempat yang terbuka dan kena sinar matahari langsung, baik di dataran

rendah maupun dataran tinggi, yakni pada ketinggian 1 – 1.400 m di atas

permukaan laut. Ditanam di tempat yang agak ternaung atau sedikit terlindungi

pun masih dapat juga berbunga dan berbuah. Untuk mendapatkan tanaman yang

sehat, media tanam atau lahan yang akan ditanami harus subur, gembur dan

drainase diatur dengan baik (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan

Sulawesi, 2012).

5. Morfologi

Pohon majapait tumbuh hingga 6-10 m, daun hijau terang, panjang 5

sampai 15 cm dan lebar dan lebar 2,5-5,5 cm , bunganya mekar di malam hari,

berwarna kuning atau hijau dengan merah atau ungu urat, berbentuk cangkir, dan

muncul langsung dari cabang. Buah berbentuk bola (bulat) dengan diameter 12

cm sampai 30 cm, cangkang keras yang halus, mengkilat atau licin yang

menggantung tepat di bawah cabang-cabang. Kulit kayu hijau keras (BTFP,

2005).

Bunganya adalah bunga tunggal atau dalam berkas yang terdiri dari 2-3

bunga, yang muncul pada batang dan cabang, bertangkai, menggantung, panjang

lebih kurang 5 cm, berwarna kuning kehijau-hijauan dengan urat berwarna merah.

Kelopak bunga mula-mula menutup, kemudian terbelah berbentuk upih atau

berbentuk 2-3 taju yang sampai pangkal tidak beraturan, panjang lebih kurang 1

cm. Tabung mahkota bunga membengkok, berbentuk lonceng, berperut dengan

lipatan melintang. Benangsari berjumlah 4, dua di antaranya panjang, terdapat


12

sisa-sisa benang sari yang ke-5. Buahnya berbentuk bola, tertekan sedikit, licin,

berwarna hijau mengkilat, kulit buah berkayu, keras, diameter 25 cm. Setiap buah

berbiji banyak, bentuk biji pipih, terdapat dalam daging buah yang lumat

(Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

6. Kegunaan

Semua bagian dari tanaman majapait dapat dimanfaatkan. Kayunya dapat

digunakan untuk kayu bakar, gagang perkakas, tulang rusuk di perahu, bangunan

dan belenggu ternak, dan labu untuk cangkir, tas dan alat musik. Buah dan

daunnya dilaporkan memiliki khasiat obat (Mahbub, 2011). Daun Crescentia

cujete berkhasiat sebagai obat luka baru dan daging buahnya untuk urus-urus.

Untuk obat luka baru dipakai sebanyak +10 gram daun Cresentia cujete, dicuci

dan diturnbuk sampai halus, ditempelkan pada bagian yang luka dan dibalut

dengan kain bersih (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

Penggunaan secara tradisional, daging buah majapait dapat digunakan

untuk masalah pernapasan seperti asma dan juga digunakan sebagai pencahar.

Kulit kayu digunakan untuk diare berlendir. Rebusan kulit kayu digunakan untuk

membersihkan luka dan ditumbuk daun digunakan sebagai tapal untuk sakit

kepala. Internal, daun digunakan sebagai diuretik dan juga digunakan untuk

mengobati hematoma dan tumor. Buah rebusan digunakan untuk mengobati diare,

sakit perut, dingin, bronkitis, batuk, asma, dan uretritis. Daun juga digunakan

untuk hipertensi (Julia, 1968).


13

7. Kandungan Kimia

Mahbub et al. (2011) melaporkan bahwa konstituen utama tanaman

majapait terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins,

beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol,

palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids

glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Senyawa naphtoquinones, iridoid

glycosides, aucubin, plumieride,and asperuloside telah dilaporkan sebagai

konstituen dari daun tanaman ini (Das et al., 2014).

Dalam penelitian yang dilakukan Das et al.(2014) juga melaporkan

bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa

steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Mereka

melaporkan bahwa semua fraksi dan ekstrak mentah etanol kulit dan daun

memiliki aktifitas antioksidan melalui tes DPPH, FRP dan TAC. Ejelonu et al.

(2011) melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol,

tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, anthraquinone, cardenolides,

phiobatannin. Senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai

antioksidan dan melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas.

B. Metode Penyarian

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari

bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut

(Harbone, 1987). Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen


14

kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip

perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai

terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut

(DepKes RI, 1986)

Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan

menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan.

Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan

penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Cairan penyari akan menembus

dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan

larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel

dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000).

Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia

dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan penyari 75

bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil diaduk

sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi kembali dengan

cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna lagi, lalu

dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak

bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan (DepKes RI, 1986).

C. Kulit

Kulit adalah suatu organ pembungkus seluruh permukaan luar tubuh,

merupakan organ terberat dan terbesar dari tubuh. Seluruh kulit beratnya sekitar


15

16 % berat tubuh, pada orang dewasa sekitar 2,7 – 3,6 kg dan luasnya sekitar 1,5 –

1,9 meter persegi. Tebalnya kulit bervariasi mulai 0,5 mm sampai 6 mm

tergantung dari letak, umur dan jenis kelamin. Kulit tipis terletak pada kelopak

mata, penis, labium minus dan kulit bagian medial lengan atas. Kulit tebal

terdapat pada telapak tangan, telapak kaki, punggung, bahu dan bokong

(Perdanakusuma, 2007).

Kulit merupakan “selimut” yang menutupi permukaan tubuh dan memiliki

fungsi utama sebagai pelindung dari berbagai macam gangguan dan ransangan

luar (Tranggono, 2007). Kulit menjaga bagian dalam tubuh dari gangguan fisik

atau mekanik (tarikan, gesekan,dan tekanan), gangguan kimia (zat-zat kimia yang

iritan), gangguan yang bersifat panas (radiasi,sinar ultraviolet) serta gangguan

infeksi luar dari bakteri atau jamur. Kulit juga menjalankan fungsi absorbsi,

termolegulasi, ekskresi, persepsi, pembentukan pigmen, keratinisasi, dan

pembentukan vitamin D (Djuanda, 2007).

Pembagian kulit secara garis besar tersusun atas tiga lapisan utama yaitu

lapisan epidermis, lapisan dermis, dan lapisan subkutis (Gambar 2.). Tidak ada

garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, subkutis ditandai dengan

adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak Epidermis adalah

lapisan luar kulit, terdiri atas stratum korneum, stratum lusidum, stratum

granulosum, stratum spinosum, dan stratum basale. Lapisan dermis adalah lapisan

dibawah epidermis yang jauh lebih tebal daripada epidermis. Lapisan ini

mengandung pembuluh darah, akar rambut, kelenjar keringat, kelenjar minyak

serta mengandung sejumlah besar ujung saraf yang berkontribusi terhadap sensasi


16

nyeri, suhu, gatal, dan tekanan. Subkutis adalah lapisan di bawah dermis. Tidak

ada garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, Subkutis ditandai dengan

adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak (Perdanakusuma,

2007).

Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal (Perdanakusuma, 2007)

D. Inflamasi

1. Definisi Inflamasi

Inflamasi adalah respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Ketika

proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemen-

elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada

tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme

perlindungan di mana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-

agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaaan

selama proses perbaikan jaringan (Kee dan Hayes, 1996).

Respon inflamasi sering dikategorikan sesuai dengan durasi, yaitu

inflamasi akut atau kronis. Inflamasi akut terjadi sebagai tanggapan langsung


17

terhadap trauma (cedera atau pembedahan) dengan durasi relatif singkat dari

hitungan menit sampai hari. Sedangkan inflamasi kronis mencerminkan respon

inflamasi yang berkelanjutan untuk kondisi jangka panjang dari hitungan hari

sampai tahun (Anonim, 2015).

Inflamasi akut memiliki durasi relatif singkat, yang berlangsung dari

menit sampai dengan hari, dan tergantung dari keparahan cedera yang terjadi.

Karakteristik utama dari peradangan akut adalah eksudasi cairan dan plasma

protein (edema) dan imigrasi leukosit (terutama neutrofil). Setelah respon

inflamasi akut mereda, monosit dan limfosit mendominasi di daerah cedera dan

menjadi ciri dari peradangan kronis. Monosit akan bermigrasi dari darah,

berdiferensiasi menjadi makrofag dalam jaringan di sisi implan. Makrofag ini

akan berfusi atau menyatu menjadi sel raksasa bersama benda asing. Makrofag

dan sel raksasa bersama benda asing yang menonjol pada antarmuka

jaringan/implan (Black and Hastings, 1998). Adapun karateristik biomaterial pada

inflamasi akut dan kronis terhadap waktu dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan

kronis (Black and Hastings, 1998)


18

2. Gejala

Inflamasi menghasilkan gejala-gejala berikut: (1) rasa sakit karena kerja

bahan sitotoksik yang dilepaskan dari elemen-elemen humoral, selular, dan

microbial pada ujung saraf; (2) pembengkakam disebabkan karena filtrasi

makromolekul dan cairan ke dalam jaringan yang terpegaruh; (3 dan 4) kemerah-

merahan dan panas, disebabkan karena vasodilatasi pembuluh-pembuluh dan

aliran darah ke jaringan yang terpengaruh; dan (5) gangguan fungsi, disebabkan

oleh perubahan pada Jaringan yang terpengaruh (Wilmana, 1995).

3. Mekanisme inflamasi

Ketika jaringan terluka, kehadiran infeksi atau kerusakan akan dirasakan

oleh sel tubuh, terutama makrofag termasuk juga sel-sel dendritik, sel mast, dan

sel lainnya. Sel-sel ini mensekresikan molekul (sitokin dan mediator) yang

menginduksi dan mengatur respon inflamasi selanjutnya. Jalur metabolisme

arakidonat bertanggung jawab dalam kegiatan enzimatik untuk menghasilkan

metabolit yang bertindak sebagai mediator dari banyak sisi penting dari proses

inflamasi. Mediator-mediator ini yang menyebabkan vasodilatasi, emigrasi

neutrofil, kemotaksis, dan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Mansjoer,

1999).

Asam arakidonat dilepaskan dari fosfolipid di membran sel untuk

menanggapi rangsangan, baik mekanik ataupun kimia. Pelepasan asam arakidonat

oleh fosfolipase memulai serangkaian reaksi kompleks yang menyebabkan

produksi dari keluarga eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin,

leukotrien, dan metabolit terkait). Sintesis eicosanoid mengikuti salah satu dari


19

dua jalur yaitu: jalur siklooksigenase, yang berpuncak pada sintesis tromboksan

A2, prostacylin (PGI2) dan prostaglandin (PGF). Dan jalur lipoksigenase, yang

memuncak pada sintesis leukortrienes (LTs) dan lipoxins (LX) (Williams and

Wilkins, 2011).

Siklooksigenase merupakan asam lemak (COX-1 dan COX-2), yang

mengaktifkan arakidonat untuk membentuk prostaglandin endoperoxide (PGG2),

PGG2 secara enzimatis diubah menjadi PGH2 dan dengan bantuan oksigen radikal,

PGH2 selanjutnya membentukan 3 metabolit sebagai berikut:

a) Prostaglandin (PGD2, PGE2 dan PGF2-α). PGD2 dan PGE2 menyebabkan

peningkatan permeabilitas vanular, vasodilatasi dan bronkodilatasi dan

menghambat fungsi sel inflamasi. PGF2-α menginduksi vasodilatasi dan

bronkodilatasi

b) Tromboksan A2 (TXA2), dibentuk aktif dalam agregasi plateletyang

menginduksi vasokonstriksi. Trombosit hanya mengepresikan COX-1, sehingga

Laufer (2003) menegaskan bahwa TXA2 hanya dapat dibentuk oleh COX-1

c) Prostasiklin (PGI2), PGI2 menginduksi vasodilatasi dan bronkodilatasi dan

menghambat agregasi platelet

(Mohan, 2011).

Enzim lipooksigenase merupakan enzim yang dominan di neutrofil, yang

mengaktifkan asam arakidonat untuk membentuk asam eicosatetraenoic


20

hydroperoxy (5-HPETE) yang diperoksidasi lebih lanjut membentuk 2 metabolit,

yaitu:

a) Leukotrien (LT), leukotrien A4 (LT4) merupakan hasil enzimatik dari 5-

HPETE untuk membentuk LTB4 (Kemotaktik untuk sel fagosit dan merangsang

sel fagositik adhereence) dan LTC4, LTD4 dan LTE4 yang menyebabkan

vasokonstriksi, bronkokonstriksi dan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah

b) Lipoxins (LX), merupakan mediator antiinflamsi hasil derivat dari leukotrien

(LT4) yang menghambat kemotaksis neutrofil dan adhesi ke endotelium dan

dengan demikian berfungsi sebagai antagonis endogenenous leukotrien.

Trombosit tidak dapat mensintesis LXA4 dan LXB4 tetapi mereka dapat

membentuk mediator ini dari intermediet LTA4 yang berasal dari neutrofil yang

berdekatan, oleh jalur biosintesis transelular

(Mohan, 2011).

E. Antiinflamasi

Obat-obat antiinflamasi non-steroid, atau NSAID (Nonsteroidal

antiinflammatory drugs) merupakan obat-obat yang menghambat sintesa

prostaglandin, mempunyai efek analgesik dan antipiretik yang berbeda-beda tetapi

terutama dipakai sebagai agen antiinflamasi untuk meredakan inflamasi dan nyeri

(Kee dan Hayes, 1994). Mekanisme utama untuk efek mereka adalah

penghambatan ekspresi protein yang disebut siklooksigenase. Protein COX

mengkatalisis pembentukan prostanoids (termasuk PG, Prostacyclins, dan

tromboksan) dari asam arakidonat. Ketika NSAID menghambat protein COX,


21

sintesis prostanoids akan berhenti sehinggaakan mengurangi peradangan. NSAID

selektivitas akan menghambat salah satu dari dua isoform COX, COX -1 dan

COX-2 sedangkan NSAID non-selektif akan menghambat COX-1 dan COX-2

(Porth, 2011). Adapun metabolisme asam arakidonat melalui jalur siklooksigenase

dan lipoksigenase dan tempat aksi kerja obat kortikosteroid dan obat-obat

antiinflamasi non-steroid dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4.` Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan jalur

lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi (Porth, 2011).

Kortikosteroid menghambat aktifitas fosfolipase A2, yang mengurangi

pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat

pembentukan prostaglandin, tromboksan dan leukotrien. Steroid anti-inflamasi

menghambat fosfolipase A2 secara tidak langsung dengan pelepasan protein

penghambatan, yaitu lipocortin-1. Protein ini merupakan anggota dari superfamili

protein yang akan mengikat kalsium dan fosfolipid anionik. Rekombinan


22

lipocortin-1 ini akan mencegah pelepasan eikosanoid dari paru-paru dan

merupakan agen anti-inflamasi yang kuat (Vane, 1996).

F. Sistem Imun

Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh manusia melalui

interaksi yang kompleks pada tingkat molekul, sel, dan jaringan baik lokal dan

sistemik. Sistem imun hanya dapat diaktifkan oleh antigen, baik molekul dan

ataupun organisme, sehingga menimbulkan respon imun. Sistem imun terdiri atas

sistem imun alamiah atau non-spesifik (natural/innate/native) dan didapat atau

spesifik (adaptive/acquired) (Bhagavan, 2011).

Sistem imun non-spesifik (sudah ada sejak lahir) merupakan suatu respon

cepat yang efektif terhadap serangan patogen dan zat asing. Respon imun yang

diperlihatkan selalu respon yang sama. Mekanisme sistem imun non-spesifik bisa

melalaui fagositosis yang menyerang partikel asing oleh sel-sel sistem kekebalan

tubuh (makrofag dan granulosit) dan inflamasi yang berkerja untuk memulihkan

jaringan yang rusak yang ditandai dengan peningkatan aliran darah, peningkatan

permeabilitas kapiler, dan melarikan diri dari cairan dan sel-sel dari kapiler

membesar ke dalam ruang jaringan (Kent, 2000).

Sistem imun spesifik meliputi sel dan protein dalam darah dan getah

bening yang menyerang, menghancurkan, dan mengeluarkan dari tubuh. Respon

yang ditimbulkan terbilang lambat dan hanya efektif melawan patogen yang

spesifik. Respon yang cepat bila terjadi infeksi berulang dengan patogen yang

sama (fenomena yang disebut memori imunologi) (Kent, 2000).


23

Neutrofil adalah sel fagosit yang menjaga kulit dan selaput lendir.

Fungsinya melindungi terhadap antigen yang dirasakan, bermigrasi pada tempat

infeksi serta menghancurkan antigennya. Neutrofil beredar dalam darah selama

sekitar 6-10 jam tapi bisa tetap dalam jaringan dalam keadaan tidak aktif selama

2-6 hari. Migrasi neutrofil dalam inflamasi akut disertai dengan peningkatan

permeabilitas pembuluh darah (Bhagavan, 2011).

G. Flavonoid

Senyawa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mempunyai 15

atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6. Kerangka flavonoid

terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin aromatik B, dan cincin tengah

berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini

dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya (Redha,

2010). Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi karbon di sekitar

molekul flavonoid dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid (Redha, 2010)

Senyawa flavonoid adalah senyawa fenol terbesar yang terdapat pada

semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga,

buah, dan biji. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah,ungu, dan biru

dan sebagian zat kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoids


24

dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan dan mempunyai bioktifitas

sebagai obat. Manfaat flavonoids antara lain adalaha untuk melindungi stuktur sel,

meningkatkan efektifitas vitamin C, antiinflamasi, mencegah keropos tulang dan

sebagai antibiotik (Rathee, 2009).

Jaringan dan sel didalam tubuh akan mengalami kerusakan yang

disebabkan oleh radikal bebas dari aktifitas RSO (reactive oxygen species) yang

dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Meningkatnya produksi

ROS dapat memicu kerusakan pada jaringan sehingga akan memperparah proses

inflamasi. Senyawa flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara

mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan

yang semakin parah (Gomes, 2008).

Mekanisme lain flavonoid dalam menghambat terjadinya radang yaitu

melalui dua cara, yang pertama menghambat pelepasan asam arakidonat dan

sekresi enzim lisosom dari sel neutrofil dan sel endotelial, dan yang kedua

menghambat fase proliferasi dan fase eksudasi dari proses radang. Terhambatnya

pelepasan asam arakidonat dari sel radang akan menyebabkan kurang tersedianya

substrat arakidonat bagi jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, yang pada

akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin, prostasiklin, endoperoksida,

tromboksan di satu sisi dan asam hidroperoksida, asam hidroksieikosatetraienoat,

leukotrien di sisi lainnya (Rahayu, 2009).

H. Hematoksilin dan Eosin

Pewarnaan hematoksilin dan eosin merupakan metode pewarnaan yang

banyak digunakan dalam pewarnaan jaringan sehingga banyak digunakan dalam


25

diagnosa medis dan penelitian. Jaringan yang diwarnai dengan hematoksilin dan

eosin akan menunjukkan sitoplasma berwarna merah jambu-jingga dan nukleus

berwarna gelap, biru atau ungu. Hematoksilin merupakan ekstrak dari pohon

logwood (Haematoxylum campechianum) yang digunakan sebagai bahan pewarna

pada pewarnaan histoteknik (Junquera, 2007).

Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai

unsur basofilik jaringan. Produk oksidasi hematoksilin berupa hematin bertindak

sebagai bahan aktif dalam larutan pewarnaan. Hematin akan membentuk

kompleks berwarna sangat kuat dengan ion logam tertentu, yang paling menonjol

adalah garam Fe (III) dan Al (III). Kompleks logam-haematein digunakan untuk

mewarnai inti sel sebelum diperiksa di bawah mikroskop. Hematoksilin menandai

inti dan struktur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA

dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Eosin yang bersifat asam akan mewarnai

komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen.

Tidak seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi

warna merah muda (IHC World, 2015).

I. Imunohistokimia

Imunohistokimia merupakan metode yang digunakan untuk mendeteksi

adanya protein atau antigen tertentu dalam sel menggunakan antibodi spesifik

(IHC, 2015). Imunohistokimia menggabungkan teknik anatomi, imunologi dan

biokimia yang memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi

komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam jaringan yang tepat sehingga dapat

dilihat di bawah mikroskop (Taylor, 2015).


26

Tahapan metode imunohistokimia terdiri atas empat tahap yaitu (1)

penanaman sel, (2) fiksasi dan perwarnaan dengan antibodi, (3) visualisasi sel

dengan mikroskop, dan (4) analisis ekspresi protein yang telah divisualisasikan.

Tahapan fiksasi menggunakan pelarut organik seperti alkohol dan aseton untuk

melepaskan lipid, mendehifrasi sel,dan mengendapkan protein (The Human

Protein Atlas, 2015). Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan

memberikan warna coklat/gelap, sedangkan sel yang tidak mengekspreiskan

protein memberikan warna ungu/biru. Sel yang mengekspresikan protein tertentu

dari keseluruhan sel dinyatakan dalam satuan persen (%) (Ikawati, 2006).

J. Karagenin

Iritan yang digunakan untuk pengujian efek antiinflamasi beraga

jenisnya, satu diantaranya adalah karagenin. Karagenin merupakan polisakarida

hasil ekstraksi rumput laut dari famili Eucheuma, Chondrus, dan Gigartina.

Bentuknya berupa serbuk berwarna putih hingga kuning kecoklatan, ada yang

berbentuk butiran kasar hingga serbuk halus, tidak 24 berbau, serta memberi rasa

berlendir di lidah. Karagenin juga memiliki sifat larut dalam air bersuhu 80ºC

(Rowe et all., 2009).

Karagenan terdiri dari tiga tipe, yaitu kappa (κ), lambda (α), dan iota (ι),

yang diekstrak dari rumput laut merah. Mereka terutama diambil dari spesies

Gigartina dan Chondrus crispus, yang menghasilkan tipe kappa dan labda dan

spesies Eucheuma cottonii dan spinosum, yang menghasilkan kappa dan iota jenis.

Setiap jenis karagenan memiliki karakteristik tersendiri, meliputi kekuatan gel,

viskositas, stabilitas suhu, sinergisme, dan kelarutannya (Soma et. all, 2013).


27

Karagenin berperan dalam pembentukan edema dalam model inflamasi

akut. Karagenin dipilih karena dapat menstimulasi pelepasan prostaglandin

setelah disuntikkan ke hewan uji. Oleh karena itu, karagenin dapat digunakan

sebagai iritan dalam metode uji yang bertujuan untuk mencari obat-obat

antiinflamasi, tepatnya yang bekerja dengan menghambat sintesis prostaglandin

(Winter et all., 1962).

K. Hidrokortison

Hidrokortison merupankan anti inflamasi steroid yang secara dramatis

menurunkan manifetasi dari inflamasi. Hidrokortison menghambat manifestasi

awan dan akhir inflamasi,yaitu tidak hanya tanda-tanda radang (kemerahan,

panas, sakit, edema, dan gangguan fungsi), tetapi juga stadium lebih lanjut

penyembuhan luka dan perbaikan dan reaksi proliferasi yang terlihat pada

inflamasi kronis. Hidrokortison mempengaruhi semua tipe reaksi inflamasi yang

disebabkan baik oleh invasi patogen, rangsangan kimia atau fisik, ataupun oleh

respon immun yang tidak tepat seperti terlihat pada hipersensitivitas atau

penyakit autoimmun (Tjay, 2007).

L. Landasan Teori

Inflamasi merupakan respons protektif setempat yang ditimbulkan oleh

cedera atau kerusakan jaringan. Respon yang muncul meliputi rubor (kemerahan),

kalor (panas), dolor (nyeri), dan tumor (pembengkakan). Penyebab inflamasi

antara lain mikroorganisme, trauma mekanis, zat-zat kimia, dan pengaruh fisika.

Selama proses inflamasi terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemen-elemen


28

darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat

cedera jaringan atau infeksi. Metabolisme asam arakidonat bertangung jawab

sebagai substrat utama dalam produksi mediator-mediator inflamasi.

Prostaglandin dan tromboksan dihasilkan melalui jalur siklooksgenase.

Leukotriene, lipoksin, dan komponen penginduksi inflamasi lainnya dihasilkan

melalui jalur lipooksigenase.

Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk

pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan

respon imum melalui metabolisme asam arakidonat. Respon imun berupa migrasi

sel neotrofil ke daerah inflamasi merupakan fase seluler awal proses inflamasi.

Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan

asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi

jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin.

Tanaman majapait merupakan salah satu tanaman yang memiliki efek

terapetik dengan kandungan kimia didalamnya teriidentifikasi berupa steroids,

flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Pendekatan penelitian

ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) yang melaporkan

bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan

aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests.

Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) juga melaporkan bahwa hasil uji in-

vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane

stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1

mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Adanya aktifitas antiinflamasi dari


29

pemberian ekstrak daun majapait secara in-vitro, diduga juga akan

memperlihatkan adanya efek antiinflamasi apabila diberikan secara topikal.

Kandungan flavonoid pada daun majapait diduga bertanggung jawab

dalam memberi efek antiinflamasi. Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan

dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah

kerusakan jaringan yang semakin parah akibat aktifitas radikal bebas dari RSO

yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Flavonoid juga

menghambat pelepasan asam arakidonat dari sel radang sehingga menyebabkan

berkurangnya ketersedian substrat arakidonat, baik jalur siklooksigenase dan jalur

lipooksigenase, untuk membentuk mediator inflamasi.

Sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, keduanya

merupakan target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang

berperan sebagai agen antiinflamasi. Pengujian terhadap efek antiinflamasi

ekstrak etanol daun majapait dilakukan melalui pengamatan histopatologis

jaringan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3%. Migrasi sel

neutrofil dapat dideteksi dengan menggunakan metode pengecatan hematoksilin

dan eosin (HE) untuk melihat penghambatan migrasi sel neutrofil. Pengukuran

ekspresi protein COX-2 dapat dilakukan dengan imunohistokimia dengan antibodi

anti-COX-2 untuk melihat penekanan ekspresi COX-2.

M. Hipotesis

Ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. memberikan efek antiinflamasi

topikal dengan berkurangnya migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2

pada kulit punggung mencit diinduksi karagenin 3%.


30

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia

cujete pada mencit betina galur Swiss diinduksi karagenan merupakan jenis

penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap

pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definifi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel utama

1) Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etanol daun majapait.

2) Variabel tergantung :

a) Jumlah sel-sel neutrofil yang bermigrasi

b) Penekanan ekspresi siklooksigenase-2 didaerah subkutan.

b. Variabel pengacau

1) Variabel pengacau terkendali

a) Subyek uji : Mencit betina galur Swiss

b) Umur : 6 – 8 minggu (2-3 bulan)

c) Berat badan : 20-30 gram

d) Keadaan subyek : Sehat

2) Variabel pengacau tidak terkendali : kondisi patofisiologis mencit

yang digunakan dalam penelitian.


31

2. Definisis oprasional

a. Inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon

normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen

mikrobiologi. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor

(kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan).

b. Migrasi Neutrofil merupakan sel leukosit yang bermigrasi dari pembuluh

darah ke daerah subkutan (punggung mencit) dalam 3 bentuk berbeda

yaitu, berinti satu, berinti dua dan beriti ladam kuda pada pengukuran 24

jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.

c. Ekspresi COX-2 merupakan ekspresi COX-2 oleh sel neutrofil yang

berwarna coklat/gelap pada daerah subkutan jaringan kulit mencit selama

pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.

d. Daun Crescentia cujete yang digunakan merupakan daun yang berwarna

hijau segar, tidak berlubang, serta tidak terdapat kotoran dari binatang

kecil yang didapat dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168,

Pringwulung, Yogyakarta.

e. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan hasil ekstraksi

simplisia daun Crescentia cujete seberat 15 gram yang dimaserasi pada

100 mL etanol 70% selama dua hari. Kemudian diremaserasi dalam

jumlah pelarut yang sama selama satu hari, disaring dengan kertas saring,

dan dipekatkan pada waterbath hingga menjadi ekstrak kental.

f. Konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan berat

ekstrak kental etanol daun Crescentia cujete (gram) dalam basis (gram)


32

dengan satuan b/b. Konsentrasi ekstrak kental daun Crescentia cujete

yang digunakan adalah 1,67; 2,5; dan 3,75 %.

g. Efek antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete adalah

kemampuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete untuk mengurangi

migrasi sel-sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada daerah

subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah injeksi

karagenin 3 %.

h. Injeksi subkutan merupakan injeksi yang dilakukan pada jaringan di

bawah kulit pada punggung mencit yang sudah dicukur rambutnya

terlebih dahulu.

i. Pemberian topikal ekstrak daun Crescentia cujete dilakukan dengan cara

mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang menutupi area seluas 2,25

cm2 (1,5 cm x 1,5 cm) pada kulit punggung kulit mencit yang telah

diinduksi karagenin 3% secara subkutan.

C. Bahan penelitian

Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :

1. Hewan uji pada penelitian ini mengunakan mencit betina galur Swiss yang

berumur sekitar 6 – 8 minggu (2-3 bulan) dengan bobot sekitar 20- 30 gram

dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Imuno

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Prosedur penelitian ini telah

memperoleh kelayakan etik dari Ministry of Nasional Education Faculty of


33

Medicine dan Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC)

dengan nomor KE/61/05/2015.

2. Bahan uji daun majapait diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda,

No. 168, Pringwulung, Yogyakarta.

3. Karagenin tipe I (Sigma Chemical co.) sebagai inflamatogen diperoleh dari

Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas

Islam Indonesia, Yogyakarta.

4. Etanol 70% diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70,

Ngampilan, Yogyakarta

5. NaCl 0,9% teknis sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24

Yogyakarta.

6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70,

Ngampilan, Yogyakarta.

7. Biocream® diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman,

Yogyakarta.

8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison

Asetat 2.5% diproduksi oleh Galenium, diperoleh dari dari Apotek K-24

Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta.

9. Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser, diperoleh

dari Alfamart Paingan Sleman.

D. Alat atau Instrument Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari


34

1. Alat Ekstraksi

a) Oven

b) Mesin Penyerbuk

c) Ayakan no. 40

d) Alat-alat Gelas ( Labu ukur, gelas beker, erlemeyer, gelas ukur, cawan

porselen, pipet tetes, batang pengaduk dan gelas arloji)

2. Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain

a) Neraca analitik

b) Gunting

c) Gelas arloji

d) Stopwatch

e) Spuit injeksi 1 mL

f) Stopwatch

g) Mikroskop cahaya Olympus CX21

h) Jangka sorong digital

i) Mortir dan Stamper

3. Alat dan bahan yang digunakan pemotongan organ kulit

a) Formalin 10%

b) Karton

c) Gunting bedah

d) Container

e) Pinset

f) Papan lilin dan pines


35

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman Crescentia cujete dengan cara mencocokkan ciri-

ciri makroskopik yang terdapat pada tanaman yang dilakukan secara benar

menurut Steenis (1992) di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan Bahan

Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa

membandingkan dengan daerah lain. Daun Crescentia cujete didapat dari

warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta dan dipanen serta

dikumpulkan. Daun yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau, segar,

tidak berlubang dan tidak terdapat kotoran binatang.

3. Pembuatan Simplisia

Pembuatan simplisia daun Crescentia cujete diawali dengan mencuci

bersih daun majapait yang telah dipanen menggunakan air mengalir dan

ditiriskan untuk meniadakan airnya. Kemudian dikeringkan kembali

menggunakan oven pada suhu 30-45 derajat celcius hingga benar-benar

kering ditandai dengan warna daun hijau kecoklatan dan mudah dihancurkan.

Selanjutnya daun diserbuk dengan mesin penyerbuk. Serbuk yang diperoleh

diayak menggunakan ayakan nomor 40.

4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete

Ekstraksi etanol daun Crescentia cujete dilakukan dengan mengambil 15

gram serbuk kering daun Crescentia cujete direndam dengan 100 mL etanol


36

70% pada erlemeyer bersumbat. Ekstraksi dilakukan secara maserasi selama

2 hari terlindungi dari cahaya pada temperatur kamar di atas shaker mekanik.

Setelah 2 hari, hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dan

endapannya. Kemudian ampasnya diremaserasi dengan melarutkanya kembali

dalam jumlah dan volume pelarut yang sama selama 1 hari. Kemudian

disaring untuk mendapatkan filtrat. Hasil filtrat maserasi dan remaserasi

disatukan. Selanjutnya pelarut ekstrak diuapkan menggunakan waterbath

hingga diperoleh ekstrak kental dengan bobot yang tetap.

5. Pembuatan Krim Ekstrak Daun Crescentia cujete

Konsentrasi krim ekstrak etanol daum majapait ditentukan bedasarkan

konsentrasi zat aktif hidrokortison asetat 2,5 % sebagai kontrol positif.

Konsentrasi tersebut dijadikan konsentrasi tengah (konsentrasi ke-2) untuk

sediaan krim ekstrak etanol daun Crescentia cujete. Konsentrasi pertama

diturunkan 1,5 kalinya dan konsentrasi ke-3 dinaikan 1,5 kalinya. Maka

didapat tiga konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete dalam krim

yaitu 1,67; 2,5; dan 3,75 % b/b. Pembuatan krim ekstrak etanol daun

Crescentia cujete dengan menimbang ekstrak etanol daun Crescentia cujete

seberat 0,167; 0,25; dan 0,375 g yang dilarutkan dalam 10 g basis

Biocream®.

6. Penyiapan Hewan Uji

Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 33 ekor mencit betina galur Swiss,

berumur 2-3 bulan, dengan bobot 20-30 gram. Hewan uji dibagi secara acak

menjadi 2 kelompok. Kelompok untuk pra-pelakuan sebanyak 3 ekor mencit


37

dan kelompok perlakuan sebanyak 30 ekor mencit. Kelompok perlakuan

terdiri dari enam kelompok yang masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor

mencit.

Hewan uji terlebih dahulu dicukur bulu punggungnya dengan gunting,

kemudian dioleskan Veet® untuk merontokkan bulu yang belum tercukur

sempurna. Kulit punggung yang telah dicukur bulunya dibiarkan selama 1

hari untuk menghindari adanya inflamasi yang disebabkan oleh pencukuran

dan pemberian Veet®.

7. Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkan konsentrasi karagenin

optimal yang akan digunakan sebelum peneliti melakukan uji efek

antiinflamasi topikal. Konsentrasi karagenin 1,5; 2 dan 3% dibuat dengan

menimbang masing-masing karagenin sebanyak 1,5; 2; dan 3g karagenin dan

melarutkanya dengan larutan fisiologis NaCl 0,9% dalam gelas beker yang

kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan larutan

NaCl 0,9% hingga batas tanda.

Tiga ekor mencit yang digunakan dibagi menjadi 3 kelompok

berdasarkan konsentrasi karagenin, yaitu karagenin 1,5; 2; dan 3% masing-

masing kelompok diinjeksi sebanyak 0,1 mL secara subkutan pada kulit

punggung mencit yang telah dicukur bulunya. Tebal lipat kulit diukur setelah

pemberian karagenin setiap 1 jam selama 6 jam. Kelompok karagenin yang

dipilih, apabila edema yang timbul menunjukkan penebalan lipatan kulit

sebesar 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal .


38

8. Pembuatan larutan Karagenin

Karagenin 3% dibuat dengan melarutkan 3 g karagenin dalam larutan

NaCl 0,9% hingga 100 mL sehingga diperoleh larutan Karagenin 3% b/v.

9. Pengujian Ekstrak Etanol daun Crescentia cujete

Sebanyak 30 ekor mencit betina dibagi secara acak menjadi enam

kelompok perlakuan :

a. Kelompok 1

Terdiri dari lima ekor mencit sebagai kontrol negatif (karagenin).

Mencit diinjeksi karagenin dengan konsentrasi 3% secara subkutan.

b. Kelompok 2,3,4, 5, dan 6

Masing-masing terdiri dari lima ekor mencit sebagai perlakuan

Biocream®, Hidrokortison, dan ekstrak etanol daun Crescentia cujete

1,67%; 2,5%; dan 3,75% b/b. Ekstrak Seberat 1,67; 2,5; dan 3,75 gram

masing-masing dicampur dengan basis krim (Biocream®) seberat 10

gram sehingga didapat konsentrasi 1,67; 2,5%; 3,75% b/b. Mencit

terlebih dahulu diinjeksi karagenin dengan kosentrasi 3% secara

subkutan. Selanjutnya Biocream®, Hidrokortison, dan masing-masing

konsentrasi ekstrak dalam basis krim diambil sebanyak 0,1 gram untuk

dioleskan seluas 2,25 cm2 disekitar suntikan segera setelah injeksi

karagenin 3%.

10. Pengambilan bagian kulit punggung mencit untuk data histopatologi

Dua puluh empat jam setelah diinjeksi karagenin 3% mencit dikorbankan

dengan cara dislokasi tulang leher mencit dan dilakukan pengambilan kulit


39

punggung mencit dengan cara dibedah yang dilakukan dipapan bedah. Area

pengambilan kulit disekitar daerah injeksi subkutan dengan ukuran 1 x 1cm.

Hasil pemotongan jaringan kulit diletakkan di container yang telah berisi

larutan fiksatif yaitu formalin 10% hingga potongan kulit terendam sempurna

yang kemudian dibawa ke bagian Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada untuk pembuatan preparat

histologi. Pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dikerjakan di

Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas

Gajah Mada dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 dilakukan di

Laboratorium Patologi Anatomi RS Dr. Sardjito, Yogyakarta. Hasil

pengecatan dianalisis di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan

perbesaran 400x di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Gajah Mada.

F. Teknik Analisis Data

1. Analisis hasil dilakukan dengan menghitung jumlah sel neutrofil yang

bermigrasi dan sel yang mengekspresikan COX-2 pada daerah subkutan

jaringan kulit punggung mencit pada 5 sudut pandang yang berbeda di bawah

mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x.

2. Nilai persentase ekspresi COX-2 masing-masing perlakuan dihitung dengan

persamaan:

(Ikawati, 2006)


40

3. Menghitung persentase penekanan ekspresi COX-2

(Ikawati, 2006)

4. Data yang diperoleh terlebih dahulu dianalisis secara statistik dengan

Shapiro-Wilk untuk melihat kenormalan dan homogenitas distribusi data.

Data yang terdistribusi dengan normal dan homogenitas sama dilanjutkan

dengan uji One Way ANOVA (taraf kepercayaan 95%) karena skala variabel

penelitian adalah skala numerik, data tidak berpasangan dan lebih dari dua

kelompok. Analisis dilanjutkan dengan Post Hoc Test dengan Scheffe tes.

Namun jika syarat uji One Way ANOVA tidak dapat dipenuhi maka

digunakan uji alternatif non-parametrik Kruskal Wallis. Apabila uji Kruskal

Wallis menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05) maka dilanjutkan dengan

Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney.


41

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Determinasi Tanaman

Tanaman majapait yang digunakan pada penelitian efek antiinflamasi

topikal diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung,

Yogyakarta. Tanaman majapait selanjutnya dideterminasi di Laboratorium

Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan

tujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan peneliti.

Bagian tanaman majapait yang digunakan peneliti untuk determinasi

yaitu batang, daun, bunga dan buah. Hasil determinasi berdasarkan buku acuan

menurut Steenis (1992) menunjukan bahwa tanaman yang digunakan dalam

penelitian ini adalah benar tanaman Crescentia cujete L. yang dikenal dengan

nama tanaman majapait atau berenuk (Lampiran 1).

B. Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete

Ekstrak etanol daun Crescentia cujete diperoleh dari penyarian serbuk

simplisia daun Crescentia cujete secara maserasi. Daun majapait yang telah

kering sempurna diserbuk mengunakan mesin penyerbuk. Penyerbukan bertujuan

untuk memperluas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut sehingga

mempermudah penyarian kandungan fitokimia dari daun majapait.

Serbuk daun majapait ditimbang seberat 15 gram dan ditambahkan 100

mL etanol 70% pada Erlenmeyer bersumbat selama dua hari di atas shaker

mekanik. Perendaman dilakukan bertujuan untuk menarik senyawa kimia yang


42

terkandung dalam serbuk agar larut dalam cairan penyarinya. Prinsipnya, cairan

penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi

antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan terdekat didesak

keluar (DitJen POM, 2000). Untuk mempercepat kesetimbangan larutan di dalam

dan di luar sel, dilakukan pengadukan yang kostan dengan bantuan mechanical

shaker sehingga proses ekstraksi hanya memakan waktu dua hari kerja.

Selanjutnya dilakukan proses remaserasi untuk mengoptimalkan penarikan

senyawa kimia yang terkandung dalam serbuk daun majapait dengan

menggunakan pelarut baru karena pelarut pertama sudah jenuh sehingga tidak

dapat melarutkan semua senyawa kimia tersebut.

Hasil filtrat maserasi dan remaserasi disatukan dan selanjutnya diuapkan

di atas waterbath menggunakan cawan porselin pada suhu 50-600C hingga

bobotnya tetap sehingga didapatkan ekstrak kental. Hasil ekstrak kental yang

didapatkan yaitu seberat 2,2 gram ekstrak kental, sudah tidak dapat dituang lagi,

dan tidak berbau etanol. Ekstrak kental yang diperoleh dengan rendemen sebesar

14,67% digunakan untuk pengujian antiinflamasi dalam penelitian ini.

Pemilihan metode penyarian secara maserasi karena mempunyai

keuntungan dari metode penyarian lainnya. Prosedur dan peralatan yang

digunakan pada metode penyarian ini sederhana dan murah, pelarut yang

digunakan juga terbatas (Walton, 1999). Metode maserasi juga dapat menurunkan

resiko terurainya bahan alam karena pemanasan, mengingat kandungan bahan

alam dari daun majapait tidak diketahui secara pasti tahan panas atau tidak.


43

Metode ini dirasa cukup aman untuk dilakukan tanpa harus khawatir rusaknya

bahan alam, khususnya yang mempunyai aktivitas antiinflamasi.

C. Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkan konsentrasi karagenin

optimal yang akan digunakan sebelum peneliti melakukan uji efek antiinflamasi

topikal ekstrak etanol daun majapait. Karagenin bertindak sebagai agen

penginduksi inflamasi yang diinjeksikan secara subkutan pada kulit punggung

mencit. Parameter yang dilihat dari uji pendahuluan yaitu tebal lipat kulit (udema)

punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin. Uji pendahuluan dimulai

dengan melakukan orientasi penetapan konsentrasi karagenin. Konsentrasi

karagenin yang digunakan dalam orientasi ini adalah karagenin 1,5; 2; dan 3%

yang dibagi menjadi tiga kelompok. Setelah diinjeksikan dengan karagenin,

mencit diamati dengan mengukur tebal lipat kulit punggung mencit menggunakan

jangka sorong digital setiap satu jam sekali selama enam jam. Konsentrasi

karagenin dikatakan optimal bila menunjukkan peningkatan tebal lipat kulit

punggung mencit sekitar 2-3 kali dari tebal lipat kulit pada awalnya, sehingga

konsentrasi tersebut yang dipilih menjadi konsentrasi karagenin penginduksi

inflamasi. Pada uji pendahuluan efek antiinflamasi topikal ekstrak daun majapait

pada kulit punggung mencit diinduksi karagenin menunjukkan adanya edema

pada setiap jamnya selama enam jam yang dibuktikan dengan peningkatan tebal

lipat kulit punggung mencit (gambar 6).


44

Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam

Pada kelompok perlakuan konsentrasi karagenin 1,5 % peningkatan tebal

lipat kulit punggung sebesar 1,17 kali. Pada konsentrasi karagenin 2%

peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 2,31 kali. Dan pada konsentrasi

karagenin 3% peningkatan tebal lipat kulit punggung sebesar 4,52 kali. Dari hasil

pengukuran menunjukan bahwa konsentrasi karagenin 1% belum memperlihatkan

peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal. Pada konsentrasi

karagenin 2% sudah menunjukan peningkatan penebalan hingga 2-3 kali dari tebal

lipat kulit awal, tetapi edema ysng terbentuk terdapat gelembung berisi cairan dan

edema yang terbentuk tidak bertahan selama enam jam pengamatan. Konsentrasi

karagenin yang digunakan sebagai penginduksi inflamasi pada penelitian ini

adalah konsentrasi karagenin 3% karena pada konsentrasi karagenin 3% sudah

menunjukan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit pada jam pertama

yaitu lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal dan masih menunjukan edema lebih

dari 2-3 kali dari lipat kulit awal selama enam jam pengamatan.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 1 2 3 4 5 6

Edem

a (m

m)

waktu (jam)

Karagenin 1,5% Karagenin 2% Karagenin 3%


45

D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete

Tujuan dilakukan penelitian ini adalah untuk menguji efek antiinflamasi

dan mekanisme efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait. Ekstrak kental

daun majapait dibuat dalam bentuk sediaan krim. Sediaan krim dipilih karena

mempunyai keuntungan yaitu sederhana dalam pembuatannya, mudah dalam

penggunaan dan penyebarannya pada kulit juga mudah, serta memberikan rasa

dingin pada kulit (Depkes RI, 1995). Pembuatan krim ekstrak daun majapait

menggunakan Biocream® sebagai basisnya sehingga dapat diaplikasikan secara

topikal pada kulit punggung mencit.

Pencukuran rambut pada bagian punggung mencit bertujuan untuk

membersihkan tempat aplikasi (tidak terdapat rambut halus) agar mempermudah

pembedahan kulit mencit. Setelah pencukuran mencit didiamkan selama satu hari

yang betujuan untuk menghindari iritasi yang disebabkan selama proses

pencukuran sehingga saat diinjeksikan dengan karagenin 3% secara subkutan,

reaksi inflamasi yang terjadi murni disebabkan oleh induksi karagenin 3%.

Penelitian efek antiinflamasi topikal ekstrak daun majapait menggunakan

tiga konsentrasi berturut-turut, yaitu konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75 %. Pembuatan

tiga seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada setiap seri

konsentrasi tersebut menunjukan adanya efek antiinflamasi topikal yang berbeda

dan untuk mengetahui masing-masing perbandingan khasiat dari ekstrak etanol

daun majapait terhadap kontolnya sebagai antiinflamasi topikal.

Inflamasi yang terbentuk dilihat dari jumlah sel-sel neutrofil yang

bermigrasi dan peningkatan ekspresi protein siklooksigenase-2 di daerah


46

subkutan. Dan efek antiinflamasi ditunjukkan melalui penurunan jumlah sel

neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan dan penekanan ekspresi

siklooksigenase-2 pada daerah subkutan. Pengujian efek antiinflamasi yang

digunakan dalam penelitian ini mengunakan metode uji pengecatan hematoksilin

dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 pada jaringan

subkutan kulit punggung mencit secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam

setelah diinduksi dengan karagenin 3%. Hasil pengecatan diamati di bawah

mikroskop binokuler (Olympus®) untuk setiap lima bidang pandang berbeda

dengan perbesaran 400 kali.

E. Metode Pengecatan Hematoksilin dan Eosin (HE)

Pengujian dengan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE)

bertujuan untuk memberikan gambaran kemampuan ekstrak etanol daun majapait

dalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah

migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan. Hematoksilin dan eosin merupakan

teknik pewarnaan yang berdasarkan pada prinsip asam basa. Sifat basa pada

larutan hematoksilin akan memungkinkan hematoksilin berikatan terutama

dengan komponen sel yang bersifat asam. Kita dapat mengamati bahwa warna

biru yang ditimbulkan hematoksilin akan banyak ditemukan pada nukleus. Hal ini

terjadi karena nukleus mengandung DNA dan RNA, suatu zat yang bersifat asam.

Sementara itu, eosin akan mengikat komponen sel yang bersifat asam.

Kita dapat menemukan cukup banyak komponen sel yang bersifat asidofilik

seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen pada sitoplasma sel (IHC

World, 2015).


47

Metode ini diawali dengan membedah kulit punggung mencit setelah

diinjeksi dengan karagenin 3% serta pemberian perlakuan pada pengamatan

selama 24 jam. Bagian kulit yang diambil diawetkan mengunakan larutan fiksatif,

yaitu larutan formalin 10%. Pengawetan bertujuan untuk mengawetkan morfologi

sel dan jaringan sesuai dengan kondisi pada saat hewan uji masih dalam keadaan

hidup. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung

(direct counting) dengan mikroskop binokuler (Olympus®) untuk setiap lima

bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali.

Sel neutrofil merupakan sel darah putih pertama yang bermigrasi dari

pembuluh ke daerah cedera yang dijumpai pada waktu tingkat akut atau fase awal

inflamasi. Sel neutrofil ditarik ke daerah inflamasi oleh faktok kemotaktik, yang

dihasilkan oleh bakteri, produk perombakan jaringan, faktor komplemen aktif dan

faktor lainnya (Tambayong, 2000). Neutrofil disebut juga sebagai

polimorfonuklear (PMN), karena intinya memiliki berbagai jenis bentuk dan

bersegmen. Neutrofil matang atau dewasa yang berada dalam peredaran darah

perifer memiliki bentuk inti yang terdiri dari dua sampai lima segmen, sedangkan

neutrofil yang belum matang (neutrofil band) akan memiliki bentuk inti seperti

ladam kuda (Schmeltzer and Norsworthy, 2012). Sel neutrofil mendominasi

infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama, kemudian digantikan oleh

monosit setelah 24 jam sampai 48 jam (Kumar, dkk., 2005). Profil pengecatan

hematoksilin dan eosin (HE) antar kelompok perlakuan beserta kontrol dapat

dilihat pada gambar 7 dan tabel I.


48

Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan ekstrak

etanol daun majapait konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif

(karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel

neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda

lingkaran merah) Keterangan :

1. Kulit normal dengan perbesaran 100

kali


kali

3. Kulit kontrol negatif (karagenin)

dengan perbesaran 100 kali



5. Kulit ekstrak etanol daun majapait

2,5% dengan perbesaran 100 kali




49

Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan

Kelompok

Perlakuan

Perlakuan Rerata Jumlah sel

neutrofil ± SE

I Kontrol negatif 111,36 ± 6,98

II Kontrol Biocream® 109,32 ± 13,26

III Kontrol positif 67,68 ± 7,50

IV Ekstrak etanol daun majapait

1,67%

31,20 ± 1,56

V Ekstrak etanol daun majapait

2,5%

26,36 ± 1,71

VI Ekstrak etanol daun majapait

3,75%

16,76 ± 3,11

Berdasarkan tabel I, menunjukan bahwa pada kelompok kontrol negatif

(injeksi karagenin 3%) dan kelompok Biocream® (basis) menghasilkan rerata

jumlah sel neutrofil yang paling besar dibandingkan dengan kelompok perlakuan

lainya yaitu 111,36 ± 6,98dan 109,32 ± 13,26. Hal tersebut menunjukan bahwa

karagenin menyebabkan inflamasi. Inflamasi yang diinduksi oleh karagenin dapat

digunakan sebagai model peradangan akut. Pada penelitian ini digunakan tipe κ-

karagenin yang merupakan polisakarida sulfat yang dapat menginduksi respon

inflamasi dengan mengaktifkan respon imun. Adapun migrasi sel neutrofil

merupakan respon dari inflamasi akut (Wade, 2014).

Penurunan migrasi sel neutrofil paling besar ditunjukan pada kelompok

perlakuan ekstrak etanol 3,75% dengan rerata jumlah sel neutrofil sebesar 16,76 ±

3,11. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5%, kelompok perlakuan

ekstrak etanol 1,67%, dan kelompok kontrol positif dengan rerata jumlah sel

neutrofil sebesar 26,36 ± 1,71; 31,20 ± 1,56; dan 67,68 ± 7,50. Hasil ini

menunjukkan bahwa kelompok kontrol positif dan masing-masing kelompok


50

ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi yang dibuktikan dari

penurunan migrasi sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah subkutan

dibandingkan dengan kontor negatif karagenin 3 % dan kontrol Biocream®. Profil

rerata jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam

setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada gambar 8.

Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun

majapait masing-masing perlakuan dan kontrol

Profil kurva kontrol negatif dan kontrol Biocream® memiliki migrasi

jumlah neutrofil pada daerah subkutan paling besar dibanding dengan kelompok

lainnya. Hal ini menunjukan bahwa karagenin merupakan zat inflamatogen yang

dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel neutrofil di daerah subkutan. Dan basis

yang digunakan untuk ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam


51

menurunkan migrasi sel neutrofil yang ditunjukan dari profil garis kurvanya

hampir mirip dengan garis kurva kontrol negatif.

Kontrol positif pada penelitian ini mengunakan Hidrokortison asetat

2,5%. Hidrokortison merupakan antiinflamasi steroid yang secara dramatis

menurunkan manifetasi dari inflamasi. Kortikosteroid menghambat aktivitas

fosfolipase A2, yang mengurangi pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian,

kortikosteroid akan menghambat pembentukan prostaglandin, tromboksan dan

leukotrien (Tjay, 2007). Efek dari antiinflamasi kortikosteroid juga mempengaruhi

berbagai sel imuno kompeten seperti sel T, makrofag, sel dendritik, eosinofil,

neutrofil, dan sel mast, dengan cara menghambat respon inflamasi (Sitompul,

2011).

Hasil perhitungan jumlah neutrofil antar kelompok dianalisis menggunakan

uji Shapiro-Wilk untuk menentukan kenormalan data yang diperoleh. Uji Shapiro-

Wilk menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p setiap kelompok

lebih besar dari p=0,05. Namun hasil uji varian menunjukan nilai p=0,01 (p<0,05)

sehingga diambil kesimpulan bahwa varian data tidak sama. Syarat melakukan uji

Anova apabila distribusi data harus normal dan varian data harus sama (Dahlan,

2009). Pada penelitian ini, karena distribusi data normal dan varian data tidak

sama sehingga uji Anova tidak dapat dilakukan.

Menurut Harinaldi (2005) apabila syarat-syarat yang dibutuhkan oleh

metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi, maka peneliti dapat

menggunakan metode alternatif sebagai pengganti analisis varian satu arah (One

way ANOVA) yaitu Kruskal-Wallis Test. Hasil statistik uji Kruskal-Wallis


52

memberikan nilai p=0,000 (< 0,05) yang berarti paling tidak terdapat satu

kelompok yang berbeda secara signifikan dengan taraf kepercayaan 95%.

Kemudian dilanjutkan uji Mann Whitney untuk melihat perbedaan bermakna atau

tidak antar tiap kelompok perlakuan. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok

perlakuan dapat dilihat pada tabel II.

Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok perlakuan

dan kontrol dengan uji Mann Whitney

Kelompok Rerata Sel

Neutrofil ± SE

I II III IV V VI

I 111,36 ± 6,98 TB BB BB BB BB

II 109,32 ± 13,26 TB BB BB BB BB

III 67,68 ± 7,50 BB BB BB BB BB

IV 31,20 ± 1,56 BB BB BB BB BB

V 26,36 ± 1,71 BB BB BB BB TB

VI 16,76 ± 3,11 BB BB BB BB TB

Keterangan:

I : Kelompok perlakuan kontrol negatif (karagenin 3 %)

II : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan basis Biocream®

III : kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan positif (hidrokortison 2,5 %)

IV : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 1,67 %

V : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 2,5 %

VI : Kelompok perlakuan kontrol karagenin 3 % dan ekstrak etanol daun majapait 3,75 %

SE : Standar eror

BB: Berbeda bermakna (p<0,05)

TB : Berbeda tidak bermakna (p>0,05)

Berdasarkan tabel II, menunjukan rerata sel neutrofil kelompok karagenin

3% berbeda tidak bermakna dengan rerata sel neutrofil kelompok Biocream®.

Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek

antiinflamasi. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3% berbeda bermakna

dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak etanol

daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3% pada


53

penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator

inflamasi.

Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki rerata sel

neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol

positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait

1,67% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif.

Hal ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%

memiliki efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi

kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% lebih besar dibandingkan kontrol

positif.

Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% juga memiliki rerata sel

neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol

positif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait

2,5% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal

ini menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% memiliki

efek antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok

ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih besar dibandingkan kontrol positif.

Hasil rerata sel neutrofil kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75%

juga lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hasil

uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% berbeda

bermakna dengan kelompok kontrol negatif dan kontrol positif. Hal ini

menunjukan bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek


54

antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif dan efek antiinflamasi kelompok

ekstrak etanol daun majapait 3,75% lebih besar dibandingkan kontrol positif.


neutrofil yang lebih kecil dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait

2,5%, namun menunjukan perbedaan tidak bermakna secara statistik (p>0,05).

Hal ini berarti bahwa ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek

antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait

2,5%. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% menunjukan perbedaan

yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%. Hal ini

berarti bahwa efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait 3, 75% lebih besar

dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%.


neutrofil yang lebih kecil dibandingkan dengan kelompok ekstrak etanol daun

majapait 1,67% dan secara statistik (p<0,05) berbeda bermakna. Rerata sel

neutrofil ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih besar dibandingkan dengan

kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75%, namun secara statistik (p>0,05)

berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimum dari ekstrak etanol

daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur

Swiss yaitu sebesar 2,5%. Pada ekstrak etanol daun majapait 2,5% sudah

menujukkan efek antiinflamasi yang disebabkan oleh karagenin 3% dan efek

antiinflamasi yang diberikan sudah lebih baik dari perlakuan ekstrak daun

majapait konsentrasi 1,67% serta efek antiinflamasinya sebanding dengan ekstrak

etanol daun majapait pada konsentrasi 3,75%.


55

F. Metode Imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2

Pengujian dengan metode immunohistokimia dengan antibodi anti-

COX-2 bertujuan untuk mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak etanol

daun majapait melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Prinsip dari metode

ini adalah adanya pengikatan antigen pada antibodi yang yang dilekatkan dengan

suatu penanda yang bereaksi dengan kromogen DAB (Diaminobenzidin) sehingga

menjadi substrat berwarna cokelat. Pemeriksaan ekspresi COX-2 ekstrak etanol

daun majapait dilakukan dengan melakukan pengecatan mengunakan antibodi

monoklonal primer COX-2.

Antibodi ini berikatan dengan reseptor COX-2 yang ada di sel radang

sehingga sel yang mengekspresikan COX-2 berwarna coklat ketika diberi

pewarna DAB dari reagen imunohiostokimia. Visiulisasi warna yang dihasilkan

dari ekspresi COX-2 dapat memberikan gambaran kualitatif maupun gambaran

kuantitatif (IHC, 2015). Pewarnaan secara enzimatis oleh peroksidase

menyebabkan adanya warna yang berbeda antara sel yang mengekspresikan COX-

2 dan sel yang tidak mengekspresikan COX-2. Sel yang mengekspresikan COX-2

akan berwarna kecokelatan yang pekat atau gelap (panah warna hitam) dan sel

yang tidak mengekspresikan COX-2 akan berwarna keunguan (panah warna

kuning) (Gambar 9).


56

Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2

pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di daerah subkutan

jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada

perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b). Tanda panah hitam

menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning

menunjukkan hasil negatif COX-2.

Protein siklooksigenase (cyclooxygenase = COX) menghidrolisis asam

arakidonat (AA) menjadi prostaglandin dengan kedua bentuk isoformnya, yaitu

COX-1 dan COX-2. COX-1 hampir pada semua jaringan, terutama pada saluran

cerna dan ginjal, yang mempertahankan fungsi fisiologi normal jaringan (Akmal,

dkk., 2007). COX-2 tidak terdeteksi dalam semua sel dan jaringan normal, akan

tetapi COX-2 akan cepat terinduksi apabila sel menerima stimulus inflamasi

(Widiastuti, 2011). Migrasi sel darah putih (leukosit) pada daerah cedera jaringan

atau infeksi merupakan respon imun tubuh yamg menjadi karakteristik utama

pada inflamasi akut adalah migrasi leukosit (terutama neutrofil). Sel neutrofil

mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama sehingga

ekspresi COX-2 pada penelitian ini diekspresikan oleh sel neutrofil. Hasil

pengecatan immunohistokimia dengan antibodi anti COX-2 masing-masing

perlakuan beserta kontrol dapat dilihat pada gambar 10 dan tabel III.


57

Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan

antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak etanol

daun majapait konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif

(karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi

sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit

(tanda lingkaran merah)

Keterangan : 1. Kulit normal dengan perbesaran 100

kali


kali










58

Tabel III. Rerata ekspresi protein COX-2 (dalam %) oleh ekstrak etanol

daun majapait dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi

karagenin 3%

Kelompok Rerata ekspresi protein COX-2 (dalam %) ± SE

I 98,55 ± 0,37

II 97,98 ± 0,22

III 23,40 ± 0,89

IV 91,67 ± 0,41

V 86,56 ± 1,09

VI 85,87 ± 1,18

Keterangan:







Data pada tabel III menunjukan bahwa kelompok perlakuan kontrol

negatif (karagemim 3%) dan kontrol Biocream® memiliki rerata persen ekspresi

protein COX-2 paling besar dibanding dengan kelompok lainnya yaitu 98,55 ±

0,37 dan 97,98 ± 0,22. Hal tersebut menunjukan terjadi proses peradangan

dengan adanya injeksi karagenin pada daerah subkutan yang ditandai dengan

peningkatan persen ekspresi protein COX-2, serta basis yang digunakan untuk

ekstrak etanol daun majapait tidak memiliki efek dalam menurunkan ekspresi

protein COX-2.

Penurunan rerata persen ekspresi protein COX-2 paling besar ditunjukan

pada kelompok kontrol positif dengan rerata persen ekspresi protein COX-2

sebesar 23,40 ± 0,89. Diikuti kelompok perlakuan ekstrak etanol 3,75%,

kelompok perlakuan ekstrak etanol 2,5%, dan kelompok perlakuan ekstrak etanol

1,67%, dengan rerata persen ekspresi protein COX-2 sebesar 85,87 ± 1,18; 86,56


59

± 1,09; dan 91,67 ± 0,41. Profil rerata ekspresi protein COX-2 pada daerah

subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3% dapat dilihat pada

gambar 11.

Gambar 11. Diagram batang ekspresi protein COX-2 masing-masing

kelompok perlakuan beserta kontrol

Berdasarkan gambar 11 diatas, memperlihatkan terjadi peningkatan

jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-2 setelah pemberian injeksi

subkutan karagenin pada semua kelompok perlakuan. Jumlah sel yang

mengekspresikan protein COX-2 paling tinggi ditunjukkan oleh kelompok kontrol

negatif (karagenin 3%) dan kelompok kontrol Biocream®. Protein COX-2

merupakan protein yang bertanggung jawab terhadap respon inflamasi dan

produksi prostaglandin (Leahy et al., 2000). Hal ini menunjukkan bahwa


60

kelompok perlakuan karagenin 3% menginduksi inflamasi sel pada daerah

subkutan. Profil kelompok kontrol positif (Hidrokortison) dan ketiga kelompok

konsentrasi ekstrak etanol daun majapait menunjukkan jumlah sel yang

mengekspresikan protein COX-2 lebih kecil dibandingkan dengan kelompok

kontrol negatif dan kelompok kontrol Biocream®. Penurunan ekpresi protein

COX-2 menunjukan bahwa kontol positif dan kelompok perlakuan memberikan

aktivitas antiinflamasi. Hidrokortison memiliki aktivitas antiinflamasi melalui

banyak mekanisme molekuler. Salah satunya melalui jalur reseptor glukokortikoid

yang langsung mengatur ekspresi gen. Dalam mekanisme ini, hidrokortison bebas

akan mengikat dan mengaktifkan reseptor glukokortikoid sitosol tertentu (GR).

Kompleks tersebut secara selektif menekan gen inflamasi tertentu yang

mengkodekan sitokin (misalnya IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α), kemokin, molekul

adhesi (misalnya molekul adhesi E-selektin, ICAM-1, VCAM-1), protein

inflamasi (misalnya fosfolipase A2, COX-2, iNOS), mediator lipid inflamasi

(misalnya prostaglandin) (Derendorf & Meltzer, 2008;. Fernandes et al, 2008).

Hasil perhitungan persen ekspresi protein COX-2 dari masing-masing

kelompok perlakuan digunakan untuk menentukan persen penekanan inflamasi

untuk setiap perlakuan. Pengujian distribusi data rata-rata persen penekanan

ekpresi protein COX-2 setiap kelompok perlakuan mengunakan uji Shapiro-Wilk

menunjukan distribusi data normal (p>0,05), sehingga dilanjutkan dengan uji

homogenitas variasi. Data yang diperoleh memiliki variasi data yang tidak

homogen dengan nilai p=0,023 (p<0,05) sehingga uji One Way ANOVA tidak

dapat digunakan. Uji Kruskal-Wallis merupakan metode alternatif sebagai


61

penganti analisis varian satu arah (One way ANOVA) apabila syarat-syarat yang

dibutuhkan oleh metode statistika parametrik tidak dapat dipenuhi. Hasil statistik

uji Kruskal-Wallis memberikan nilai p=0,000 (<0,05) sehingga diambil

kesimpulan paling tidak terdapat satu kelompok yang berbeda yang kemudian

dilanjutkan uji Mann Whitney. Hasil uji Mann Whitney setiap kelompok

perlakuan dapat dilihat pada tabel IV.

Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi protein COX-2 (dalam %) masing-

masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann

Whitney

Kelompok

Rerata penekanan

ekspresi protein

COX-2 (dalam%)±SE

I II III IV V VI

I 1,45 ± 0,37 TB BB BB BB BB

II 2,02 ± 0,22 TB BB BB BB BB

III 76,60 ± 0,88 BB BB BB BB BB

IV 8,33 ± 0,41 BB BB BB BB BB

V 13, 44 ± 1,09 BB BB BB BB TB

VI 14,13 ± 1,18 BB BB BB BB TB

Keterangan:







SE : Standar eror

BB: Berbeda bermakna (p<0,05)

TB : Berbeda tidak bermakna (p>0,05)

Dari tabel IV menunjukan rerata persen penekanan ekspresi protein

COX-2 kelompok karagenin 3% berbeda tidak bermakna dengan kelompok

Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki

efek antiinflamasi. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 karagenin

3% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok


62

konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok

karagenin 3% pada penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang

menginduksi mediator inflamasi, sedangkan kelompok kontrol positif dan ketiga

kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun majapait memiliki efek antiinflamasi.

Kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% memiliki rerata persen

penekanan ekspresi protein COX-2 yang lebih besar dibandingkan kelompok

kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun

majapait 1,67% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini


antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi

protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67% yang lebih kecil

dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini

menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 1,67%

lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif.

Kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% juga memiliki rerata persen


kontrol negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun

majapait 2,5% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini


antiinflamasi dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi

protein COX-2 kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% yang lebih kecil

dibandingkan kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini


63

menunjukan efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5%

lebih kecil dibandingkan kelompok kontrol positif.

Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2 kelompok ekstrak

etanol daun majapait 3,75% juga lebih besar dibandingkan kelompok kontrol

negatif. Hasil uji statistik menunjukan kelompok ekstrak etanol daun majapait

3,75% berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menunjukan

bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% memiliki efek antiinflamasi

dibandingkan kontrol negatif. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2

kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% yang lebih kecil dibandingkan

kontrol positif dan secara statistik berbeda bermakna. Hal ini menunjukan efek

antiinflamasi kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75% lebih kecil

dibandingkan kelompok kontrol positif.



ekstrak etanol daun majapait 1,67% dan 2,5%, namun menunjukan perbedaan

tidak bermakna secara statistik (p>0,05) terhadap kelompok ekstrak etanol daun

majapait 2,5%. Hal ini berarti bahwa kelompok ekstrak etanol daun majapait

3,75% memiliki efek antiinflamasi yang sebanding dengan kelompok ekstrak

etanol daun majapait 2,5%. Kelompok ekstrak etanol daun majapait 3, 75%

menunjukan perbedaan yang bermakna dengan kelompok ekstrak etanol daun

majapait 1,67%. Hal ini berarti bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak etanol

daun 3, 75% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun majapait

konsentrasi 1,67%.


64


penekanan lebih besar dibandingkan kelompok ekspresi protein COX-2 daun

majapait 1,67%. Hal ini menunjukan bahwa efek antiinflamasi kelompok ekstrak

etanol daun 2,5% lebih besar dibandingkan kelompok ekstrak etanol daun

majapait konsentrasi 1,67%. Rerata persen penekanan ekspresi protein COX-2

kelompok ekstrak etanol daun majapait 2,5% lebih kecil dibandingkan dengan

kelompok ekstrak etanol daun majapait 3,75%, namun secara statistik (p>0,05)

berbeda tidak bermakna. Oleh karena itu konsentrasi optimun dari ekstrak etanol

daun majapait yang memiliki efek antiinflamsi topikal terhadap mencit galur

Swiss yaitu sebesar 2,5% karena sudah menujukan efek antiinflamasi yang

disebabkan oleh karagenin 3% dan sebanding dengan ekstrak etanol daun

majapait pada konsentrasi 3,75%.

G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait

Aktivitas antiinflamasi pada ekstrak daun majapait diduga berasal

senyawa flavanoids serta tanin. Ejelonu et al., (2011) menegaskan bahwa

senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai antioksidan dan

melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas. Aktivitas antioksidan

dalam menangkal radikal bebas dapat menggangu sinyal yang memediasi respon

imun seluler melalui modulasi ROS (reactive oxygen species) / RNS (Reactive

nitrogen species). Kedua spesies reaktif ini memiliki peran penting dalam

peradangan yang pada dasarnya menjadi elemen pemicu sistem imun (Gomes,

2008). Flavonoid akan menangkap radikal bebas dari kedua spesies reaktif ini

sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah (Gomes, 2008).


65

Mekanisme antiiflamasi oleh senyawa flavonoid dari daun majapait dalam

penelitian ini diduga dengan menghambat migrasi sel neutrofil yang secara

langsung mengurangi pelepasan asam arakidonat oleh neutrofil dan sel-sel

kekebalan lainnya. Dengan demikian akan memutus metabolisme dari keluarga

eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin, leukotrien, dan metabolit

terkait).

Sifat anti-inflamasi dari flavonoid telah dibuktikan melalui sejumlah

besar tes pada molekul yang beragam dari kelas flavonoid yang berbeda, untuk

mengeksplorasi efek mereka pada berbagai jalur yang terlibat dalam proses

inflamasi. Sifat anti-inflamasi dari senyawa flavonoid tidak hanya berasal dari

aktivitas antioksidan. Peran flavonoid dalam memodulasi ekspresi protein COX-2

dan iNOS telah didokumentasi dengan jelas (gambar 12).

Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui

jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-

faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-κB, dan C/EBP yang

memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2,

iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL-6 (Gomes, 2008).


66

Mekanisme aktivitas antiinflamasi senyawa flavonoid dengan cara menggangu

aktivitas NF-κB aktivator sehingga menghambat pengekspresian protein COX-2.

NF-κB adalah salah satu faktor transkripsi dari empat faktor transkripsi yang

telah diidentifikasi untuk mengikat cis-acting elemen di wilayah promotor dan

mengatur transkripsi protein COX-2 (Gomes, 2008).

Selain itu efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait juga diduga

berasal dari senyawa alkaloid dan saponin. Beberapa alkaloid telah digunakan

pada pengobatan analgesik, anti-spasmodik dan bakterisida di dunia kedokteran.

Alkaloid yang terkandung pada ekstrak daun majapait mungkin dapat

menjelaskan mengapa dapat bertindak sebagai agen anti-inflamasi. Saponin pada

daun majapait dapat berfungsi sebagai agen anti-inflamasi dan antibiotik dalam

mengobati penyakit (Ejelonu et al., 2011).

Hasil uji HE dan immunohistokimia menunjukan efek antiinflamasi

topikal dari ketiga seri konsentrasi ekstrak etanol mengalami peningkatan

seiringan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak etanol daun majapait yang

diberikan. Namun pada ekstrak daun majapait konsentrasi 2,5% dan 3,75% secara

statistik peningkatan efek antiinflamasi tersebut berbeda tidak bermakna . Hal

tersebut menunjukan bahwa pada penelitian ini tidak adanya pengaruh

peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. Range konsentrasi

yang digunakan diduga terlalu kecil sehingga tidak memperlihatkan pengaruh

peningkatan efek antinflamasi seiringan dengan meningkatnya konsentrasi ekstrak

etanol daun majapait. Aktivitas antiinflamasi dari ekstrak etanol daun majapait ini

di dukung melalui uji antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait secara


67

makroskopik menggunakan metode Inflammation-assosiated edema (Monika,

2016) dimana parameter efek antiinflamasi dilihat dari penurunan edema yang

terbentuk setiap 1 jam selama 6 jam dengan jangka sorong digital.

Hasil ekstrak daun majapait pada penelitian ini tidak menggunakan

senyawa aktif tunggal sehingga senyawa aktif lain yang terkandung di dalamnya

dapat mempengaruhi hasil penelitian. Penelitian ini merupakan skrining awal

untuk menunjukan bahwa daun majapait memiliki efek antiinflamasi topikal. Hal

tersebut membuktikan bahwa daun majapait menjadi salah satu tanamana

alternatif pengobatan inflamasi, tidak hanya berpotensi sebagai obat antiinflamasi

oral tetapi sebagai obat antiinflamasi topikal juga. Oleh karena itu diharapkan

adanya penelitian lebih lanjut yang berkaitan untuk memastikan senyawa aktif

yang bertanggung jawab memberikan efek antiinflamasi dari ekstrak daun

majapait.


68

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete mempunyai efek antiinflamasi topikal

terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase-2 pada mencit betina

galur Swiss.

2. Mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstak etanol Crescentia cujete diduga

melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi enzim

COX-2 pada daerah inflamasi.

B. Saran

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, perlu dilakukan

penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa yang bertanggung jawab

dalam ekstrak etanol daun Crescentia cujete yang menunjukkan adanya efek

antiinflamasi topikal.


69

DAFTAR PUSTAKA

Akmal, M., Aulanni’am,dan riawan, Wibi, 2007, Ekpresi Cyxlooxygenase-

2(COX-2) pada jaringan Testis Tikus (Ratus norvegicus) Akibat Paparan

Ekstrak Biji Pinang (Areca catechu), Jurnal Kedokteran Brawijaya,

Vol.XXIII, No.3,pp.121-124.

Anonim, 2015, Key Words : Acute Inflammatori, American College of Foot and

Ankle Surgeons https://www.lakeviewhealth.org/upload/docs/Acute%20

Inflammation.pdf) diakses tanggal 12 September 2015 /15:57 WIB

Anonim, 2015, Key Words: Taxonomi Crescentia cujete http://www.itis.gov/

servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=34332,

diakses tanggal 21 November 2015/ 7:45 WIB

Ansel,H.C., 1989, Pengatar Bentuk sediaan Farmasi, Edisi 4, UI Press,

Jakarta,pp. 96,147.

Bhagavan, N.V., Ha, Chung-eun, 2011, Essetials of Medical Biochemistry with

Clinical Cases, Academic Press, London, pp. 449-450.

Blank, J., Hastings, G., 1998, Handbook of Biomaterial Properties, Springer

Science and Business Media, Berlin, pp. 492-493.

BTFP, 2005, Market Brief in the European Union for selected natural ingredients

derived from native species: Crescentia cujete, UNCTAD, Netherlands, pp. 6.

Corwin, E.J., 2008, Handbook Of Pathophysiology, Third Edition, The Ohio State

University. Columbus, p. 303.

Dahlan, M.A., 2009, Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan, Edisi IV,

Salemba Medika, Jakrta, pp.84-95.

Das, N., Islam, M. E., Jahan, N., Islam, M.S., Khan, A., Islam, M. R.,and Parvin,

M. S., 2014, Antioxidant activities of ethanol extracts and fractions of

Crescentia cujete leaves and stem bark and the involvement of phenolic

compounds, BMC Complementary and Alternative Medicine, Bangladesh,

14(45), 1-9.

Derendorf, H. & Meltzer, E. O., 2008, Review article Molecular and clinical

pharmacology of intranasal corticosteroids: clinical and therapeutic

implications, Allergy, Vol.63, pp. 1292-1300.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1986, Sedian Galenik, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 10-11, 436.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi

IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, p.649.


https://www.lakeviewhealth.org/upload/docs/Acute%20%20Inflammation.pdf

https://www.lakeviewhealth.org/upload/docs/Acute%20%20Inflammation.pdf

http://www.itis.gov/%20servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=34332

http://www.itis.gov/%20servlet/SingleRpt/SingleRpt?search_topic=TSN&search_value=34332

70

Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012, Crescentia cuyete L.,

Informasi Singkat Benih, No. 134.

Ditjen POM, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan

pertama, Departemen Kesehatan RI, Jakarta, pp. 10-12.

Djuanda, A., 2007, Ilmu Penyakit Kulit Dan Kelamin, Edisi Kelima, Balai

Penerbit FKUI, Jakarta, pp. 138-147.

Dorland, W.A.N., 2002, Kamus Kedokteran Dorland, Edisi 29. EGC, Jakarta, p.

68.

Ejelonu, Lasisi, Olaremu, and Ejelonu, 2011, The Chemical Constituents of

Calabash (Crescentia cujete L.), African Journal of Biotechnology, Vol.

10(84), pp. 19631-19636.

Febrianti, Monika, 2016, Uji Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun

Majapait (Crescantia cujete L.) pada Mencit Terinduksi Karagenin, Tugas

Akhir , Fakultas farmasi Universitas sanata Dharma, Yogyakarta.

Fernandes, AM.; Cardoso, F.; Valera, P. & Anselmo-Lima, WT., 2008,

Mechanism of actionof glucocorticoids in nasal polyposis, Rev Bras

Otorrinolaringol, 74(2), 279-283.

Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J.L.F.C., Mira, L., Corvo, M.L., 2008, Molecular

Mechanisms of Anti-inflammatory Activity Mediated by Flavonoids,

Current Medicinal Chemistry, Vol. 15, 1586-1605.

Harinaldi, 2005, Prinsip-prinsip Statistik untuk Teknis dan Sains, Penerbit

Erlangga, Jakarta, p. 224.

Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia Penentuan Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan (Alih bahasa : Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro), ITB

Press, Bandung, pp. 5, 69-76.

IHC World, 2015, Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining Protocol,

https://www.ihcworld.com/ _protocols/special_stains/h&e_ellis.htm diakses

pada tanggal 14 desember 2015/ 22:44 WIB

Ikawati, Z., Nugroho, A.E., Werdhinindah, W., 2006, Efek Ekstrak Etanol Daun

Erythrina fusca Lour (cangkring) terhadap Penekanan Ekspresi Enzim

Siklooksigenase–2 pada Kultur Sel Raji, Majalah Farmasi Indonesia,17(2),

85-90.

Julia, F.M., 1968, The Calabash (Crescentia cujete) in folk medicine, Botanical

Garden Pres, New York, Vol. 22 p. 273–80.

Junqueira, L.C., 2007. Histologi Dasar: Teks & Atlas. Ed. 10. Jakarta, EGC, p.

451.

Kamboj V. P., 2000, Herbal medicine, Current Science, Vol. 78 (1), 35.


https://www.ihcworld.com/%20_protocols/special_stains/h&e_ellis.htm

71

Kent, M., 2000, Advanced Biology, Oxford univerdity Press, New York, pp. 326-

327.

Kee, J.L., dan Hayes, E. R., 1994, Farmakologi Pendekatan Proses Keperawatan,

Edisi 5, diterjemahkan Peter, A., Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp.310-

317.

Khan, 2015, Exotic Arboreal Plants of Bhopal, Their Therapeutic Potential and

Conservation, Indian J. Applied & Pure Bio. Vol. 30(1), 89-95.

Kumar, V., Abbas, A.K., and Fausto, N., 2005, Pathologic Basic of Diseases, 7th

ed, Elsevier Saunders, Philadelphia, pp. 70-73.

Kusuma, A.M., Sulistyo, A.N., Susanti, dan Sabikis 2014, Aktivitas Penghentian

Pendarahan Luar Ekstrak Etanol Daum Berenuk (Crescentia cujete L.)

Secara In-Vivo, Pharm Sci Res, Vol.1(2), 2407-2354.

Laufer, S., Gay S., Brune K., 2003, Inflammation and rheumatic Diseases : The

Molecular basic of Novel Trerapies, Thieme, New York, pp. 22-23.

Leahy, K.M., Ornberg, R.L., Wang, Y., Zweifel, B.S., Koki, A.T., dan Masferrer,

J.L., 2002, Cyclooxygenase-2 Inhibition by Celecoxib Reduces Proliferation

and Induces Apoptosis in Angiogenic Endothelial Cells in Vivo, Cancer

Res., 62, 625–631

Mansjoer, Arif, dkk. 1999. Kapita Selekta Kedokteran, Edisi Ketiga, Jilid 1,

Media Aesculapius Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, p.

158.

Mahbud, K.R., Hoq M.M., Ahmed, M.M., dan Sarker, A., 2011, In Vitro

Antibacterial of Crescentia cujete and Moringa oleifera, Bangladesh

Research Publications Journal , Vol. 5(4), 337-343.

Mohan H., Mohan S., 2011, Essential Pathology for Dental Students, JP Medical,

India, pp. 98-99.

Parvin, M.S., Das, N., Jahan, N., Akhter, M.A., Nahar, L., and Islam, M.E., 2015,

Evaluation of in vitro anti‑inflammatory and antibacterial potential of

Crescentia cujete leaves and stem bark, BMC Res Notes, 8:412, 1-7.

Perdanakusuma, David S., 2007, Anatomi Fisiologi Kulit dan Penyembuhan Luka,

Plastic Surgery Departement Airlangga University School of Medicine,

Surabaya, pp. 1-3.

Rahayu, Yani C., 2009, Respons Antiinflamasi Serbuk Biji Alpukat (Persea

americana mill) terhadap Jumlah PMN Neutrofil Mencit yang Diinduksi

Bakteri E. Coli, Jurnal Kedokteran Meditek, Vol.16(42).

Rathee, P., Chaudhary, H., Rathee, S., Rathee, D., Kumar V., and Kohli, K., 2009,

Mechanism of Action of Flavonoids as Anti-inflammatory Agents: A

Review, Inflammation & Allergy - Drug Targets, Vol. 8, 229-235.


72

Rismayani, Puslitbangbun, 2013, Manfaat Buah Maja sebagai Pestisida Nabati

untuk hama Penggerek Buah Kakao (Conopomorpha cramerella), Warta

Penelitian dan Pengembangan Tanaman Industry, Volume 19, No 3, p.25.

Rowe, R.C., Sheskey, P.J. and Quinn M., E.,2009, Handbook of Pharmaceutical

Excipients, Pharmaceutical Press, London, pp. 418, 685.

Sampurno, 2015, Obat Herbal dalam Prespektif Medik dan Bisnis http://www.

mot.farmasi.ugm.ac.id/files/13OBAT%20HERBAL_Sampurno.pdf diakses

tanggal 19 Desember 2015/18:55 WIB

Schmeltzer, Linda E., and Norsworthy, Gary D., 2012, Nursing The Feline

Patient, John Wiley and Sons, UK, pp. 104-108.

Serhan, C. N., Ward, P. A., Gilroy, D.W., 2010, Fundamentals of Inflammation,

Cambridge University Press, New York, pp. 161-162.

Sitompul, ratna, 2011, Kortikosteroid Dalam Tata Laksana Uveitis: Mekanisme

Kerja, Aplikasi Klinis dan efek samping, Vol.61, J Indon Med Assoc, 265-9.

Soma, P.K., Williams, P.D., Moon, B., Lo,Y.M., 2013, Advancement in

Microbial Polysaccharide Research for Frozen Food and

Microencapsulation of Probiotics, Advences in Food Process Engineering

Research and Applications, Springer Science and Business Media, New

York, pp. 274-275).

Steenis, C.G.G.J. van, 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT Pradnya

Paramita, Jakarta, pp.35-37,49-57, 372-374.

Tambayong, Jan, 2000, Patofisiologi untuk Keperawatan, Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 50.

Taylor, Clive R., 2015, IHC Guidebook, Dako, USA, pp. 11-18.

The Human Protein Atlas, 2015, Immunocytochemistry, http://www.proteinatlas.

org/learn/method/immunocytochemistry diakses pada tanggal 15 Desember

2015/ 00:19 WIB.

Tjay, Tan Hoan dan Rahardja, Kirana, 2007, Obat-Obat Penting : Khasiat,

Penggunaan dan Efek-efek Sampingnya, Elex Media Komputindo, Jakarta,

p.647.

Tranggono, R.I.S dan Latifah, F., 2007, Buku Pegangan Ilmu Pengetahuan

Kosmetik.: Gramedia Pustaka Utama, Jakarta, pp. 7-8, 93-96.

Vane, J., Botting, J., Botting, R., 1996, Improved Non-steroid Anti-inflammatory

Drugs : COX-2 Enzyme Inhibitors, William Harvey Press, London, pp.1-6.

Wade, C. L., Koob, G.F., and Vendruscolo, L.F., 2014, Drug Addiction and

Chronic Pain: A Review of Animal Models, Neurobiological Studies of

Addiction in Chronic Pain States, Springer, New York, Chapter 5, pp. 61-

66.


73

Walton, N.J., Brown, D.E., 1999, Chemicals from Plants : Perspectives on Plant

Secondary Products, Imperial College Press, London, pp.101-102.

Widiastuti, dkk., 2011, Ekspresi Protein Cox-2 pada Karsinoma Nasofaring

Respons Tinggi dan Respon Rendah Pasca-Radioterapi, JBP, Vol.13,

No.12, pp. 105-114.

Porth, Carol M., 2011, Essentials of Pathophysiology : Conceps of Altered Health

States, China, Williams, L. and Wilkins pp. 59-60.

Wilmana, P.F., 1995, Analgesik Anti-inflamasi Nonsteroid dan Obat Pirai, dalam

Ganiswara, S.G.(Editor), Farmakologi dan Terapi, edisi V, Bagian

Farmakologi-Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta, p. 207

Winter, C.A., Risley, E.A., dan Nuss, G.W., 1962. Carrageenin - induced Udem in

Hind Paw of the Rat as an Assay for Antiinflammatory Drugs, Proceedings

of the Society for Experimental Biology and Medicine, Vol 111, p. 544.


74

LAMPIRAN


75

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman majapait

(Crescentia cujete L.)


76

Lampiran 2. Serbuk daun Crescentia cujete beserta ekstrak etanol

Crescentia cujete

Gambar 13. Daun Crescentia cujete

Gambar 14. Serbuk daun Crescentia cujete

Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescentia cujete


77

Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit

Gambar 16. Mencit Betina Galur Swiss

Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran

Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10%


78

Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi

Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak

Gambar 20. Kontrol Hidrokortison sebagai kontrol positif

Gambar 21. Alat spuit injeksi


79

Lampiran 5. Surat Etical Clirens


80

Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin

eosin (HE)

a. Kontrol Negatif

Bidang

pandang

Preparat

I II III IV V

1 84 103 78 164 93

2 125 129 86 133 105

3 94 108 72 111 107

4 138 118 111 142 127

5 128 79 92 102 155

Rerata 113,8 107,4 87,8 130,4 117,4

b. Kontrol Biocream®

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 185 183 100 108 70

2 187 144 103 90 93

3 109 89 85 72 84

4 204 103 75 88 102

5 98 84 101 80 96

Rerata 156,6 120,6 92,8 87,6 89

c. Kontrol Positif

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 77 68 41 94 61

2 43 79 30 96 77

3 38 54 73 92 84

4 49 50 61 89 90

5 62 51 63 83 87

Rerata 53,8 60,4 53,6 90,8 79,8


81

d. Ekstrak etanol daun majapahit 1,67%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 36 30 28 42 48

2 32 29 39 32 30

3 34 23 33 38 23

4 41 26 25 28 38

5 33 22 26 27 17

Rerata 35,2 26 30,2 33,4 31,2

e. Ekstrak etanol daun majapahit 2,5%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 28 30 14 18 27

2 33 35 21 31 27

3 21 33 28 25 22

4 22 30 28 26 29

5 25 36 22 24 24

Rerata 25,8 32,8 22,6 24,8 25,8

f. Ekstrak etanol daun majapahit 3,75%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 41 11 11 25 7

2 24 9 12 13 14

3 21 17 7 12 17

4 29 14 17 15 13

5 28 6 19 21 16

Rerata 28,6 11,4 13,2 17,2 13,4


82

Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro

Wilk

Descriptives

Perlakuan Statistic Std. Error

Mean Sel

Neutrofil

Kontrol

Negatif

Mean 111.3600 6.98467

95% Confidence Interval for

Mean

Lower Bound 91.9675

Upper Bound 130.7525

5% Trimmed Mean 111.6111

Median 113.8000

Variance 243.928

Std. Deviation 15.61819

Minimum 87.80

Maximum 130.40

Range 42.60

Interquartile Range 26.30

Skewness -.656 .913

Kurtosis 1.268 2.000

Kontrol

Biocream

Mean 109.3200 13.26689


Mean

Lower Bound 72.4852

Upper Bound 146.1548


Median 92.8000

Variance 880.052


Minimum 87.60

Maximum 156.60

Range 69.00


Skewness 1.340 .913

Kurtosis .846 2.000

Kontrol

Positif

Mean 67.6800 7.50109


Mean

Lower Bound 46.8536

Upper Bound 88.5064


Median 60.4000

Variance 281.332


Minimum 53.60

Maximum 90.80


83

Range 37.20


Skewness .732 .913

Kurtosis -1.895 2.000

Ekstrak

daun

majapait

1,67%

Mean 31.2000 1.56333


Mean

Lower Bound 26.8595

Upper Bound 35.5405


Median 31.2000

Variance 12.220


Minimum 26.00

Maximum 35.20

Range 9.20


Skewness -.653 .913

Kurtosis .468 2.000

Ekstrak

daun

majapait

2,5%

Mean 26.3600 1.71278


Mean

Lower Bound 21.6046

Upper Bound 31.1154


Median 25.8000

Variance 14.668


Minimum 22.60

Maximum 32.80

Range 10.20


Skewness 1.556 .913


Ekstrak

daun

majapait

3,75%

Mean 16.7600 3.10702


Mean

Lower Bound 8.1335

Upper Bound 25.3865


Median 13.4000

Variance 48.268


Minimum 11.40

Maximum 28.60

Range 17.20


84


Skewness 1.768 .913


Tests of Normality

Perlakuan

Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Mean Sel

Neutrofil

Kontrol Negatif .200 5 .200* .968 5 .860

Kontrol Biocream .311 5 .128 .813 5 .102

Kontrol Positif .268 5 .200* .854 5 .207

Ekstrak daun majapait 1,67% .187 5 .200* .970 5 .878

Ekstrak daun majapait 2,5% .358 5 .035 .840 5 .165


a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Test of Homogeneity of Variance

Levene Statistic df1 df2 Sig.

Mean Sel

Neutrofil

Based on Mean 5.768 5 24 .001

Based on Median 1.455 5 24 .241

Based on Median and with

adjusted df 1.455 5 7.736 .306

Based on trimmed mean 5.258 5 24 .002


85

Lampiran 8. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Kruskal-Wallis

Ranks

Perlakuan N Mean Rank

Mean Sel Neutrofil Kontrol Negatif 5 25.60

Kontrol Biocream 5 24.80

Kontrol Positif 5 18.60

Ekstrak daun majapait 1,67% 5 12.20



Total 30

Test Statisticsb,c

Mean Sel Neutrofil

Chi-Square 25.847

df 5

Asymp. Sig. .000

Monte Carlo Sig. Sig. .000a

95% Confidence Interval Lower Bound .000

Upper Bound .000

a. Based on 10000 sampled tables with starting seed 2000000.

b. Kruskal Wallis Test

c. Grouping Variable: Perlakuan


86

Lampiran 9. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Mann-Whitney

a. Kontrol Negatif vs kontrol Biocream®

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Mean Sel Neutrofil Kontrol Negatif 5 5.80 29.00

Kontrol Biocream 5 5.20 26.00

Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel

Neutrofil

Mann-Whitney U 11.000

Wilcoxon W 26.000

Z -.313

Asymp. Sig. (2-tailed) .754

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .841a

a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Perlakuan

b. Kontrol Negatif vs Kontrol Positif

Ranks



Kontrol Positif 5 3.20 16.00

Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel

Neutrofil


Wilcoxon W 16.000

Z -2.402






87

c. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 1.67%

Ranks



Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00

Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





d. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 2,5%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.619






88

e. Kontrol Negatif vs Ekstrak daun majapait 3,75%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





f. Kontrol Biocream® vs Kontrol Positif

Ranks


Mean Sel Neutrofil Kontrol Biocream 5 7.60 38.00


Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil


Wilcoxon W 17.000

Z -2.193






89

g. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 1.67%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





h. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 2,5%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.619






90

i. Kontrol Biocream® vs Ekstrak daun majapait 3,75%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





j. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 1.67%

Ranks


Mean Sel Neutrofil Kontrol Positif 5 8.00 40.00


Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






91

k. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 2,5%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.619





l. Kontrol Positif vs Ekstrak daun majapait 3,75%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






92

m. Ekstrak daun majapait 1.67% vs Ekstrak daun majapait 2,5%

Ranks


Mean Sel Neutrofil Ekstrak daun majapait 1,67% 5 7.40 37.00


Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil


Wilcoxon W 18.000

Z -1.991





n. Ekstrak daun majapait 1.67% vs Ekstrak daun majapait 3,75%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil


Wilcoxon W 16.000

Z -2.402






93

o. Ekstrak daun majapait 2,5% vs Ekstrak daun majapait 3,75%

Ranks




Total 10

Test Statisticsb

Mean Sel Neutrofil


Wilcoxon W 19.000

Z -1.781






94

Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji

imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2

a. Kontrol Negatif

Bidang

Pandang

Preparat Preparat

I II III IV V I II III IV V

Sel Hitung Sel expresi COX-2

1 126 217 257 179 241 125 216 246 178 237

2 136 161 274 159 258 134 158 267 157 255

3 122 165 260 186 257 121 163 254 185 254

4 136 182 229 143 271 135 180 222 141 268

5 156 184 167 192 258 155 183 163 189 254


Bidang

Pandang

Preparat Preparat



1 228 221 222 239 207 222 217 217 234 203

2 249 261 210 242 210 245 255 205 238 204

3 211 247 184 165 208 206 243 182 164 203

4 195 239 220 285 204 189 237 215 280 200

5 178 268 203 220 140 171 265 199 216 137

c. Kontrol Positif

Bidang

Pandang

Preparat Preparat



1 197 230 228 225 211 40 55 55 58 58

2 206 218 228 209 179 36 48 49 51 40

3 218 195 198 131 164 47 48 48 22 44

4 208 230 256 192 154 58 44 61 42 45

5 223 218 250 144 154 58 56 53 27 43


95

d. Ekstrak daun majapait konsentrasi 1.67%

Bidang

Pandang

Preparat Preparat



1 58 91 42 68 45 52 86 39 61 41

2 81 83 60 72 46 76 76 54 67 43

3 92 69 65 61 90 87 65 60 55 82

4 92 87 62 50 53 86 78 54 44 46

5 103 78 50 101 64 94 72 48 97 57

e. Ekstrak daun majapait konsentrasi 2,5%

Bidang

Pandang

Preparat Preparat



1 66 62 32 37 34 59 49 29 30 28

2 80 63 50 51 39 68 53 46 45 34

3 77 74 44 50 54 70 67 39 42 45

4 87 68 43 49 54 72 61 39 40 44

5 50 71 50 60 58 43 67 44 51 51

f. Ekstrak daun majapait konsentrasi 3,75%

Bidang

Pandang

Preparat Preparat



1 65 55 42 46 16 51 49 34 43 13

2 79 62 59 57 14 68 55 49 50 12

3 62 46 48 68 16 56 40 37 58 13

4 52 53 49 67 21 43 45 41 58 17

5 44 59 43 69 27 39 54 38 63 25


96

Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 pada uji

imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2

a. Kontrol negatif

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 0,79 0,46 4,28 0,56 1,66

2 1,47 1,86 2,55 1,26 1,16

3 0,82 1,21 2,31 0,54 1,17

4 0,74 1,10 3,06 1,40 1,11

5 0,64 0,54 2,40 1,56 1,55


Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 2,63 1,81 2,25 2,09 1,93

2 1,61 2,30 2,38 1,65 2,86

3 2,37 1,62 1,09 0,61 2,40

4 3,08 0,84 2,27 1,75 1,96

5 3,93 1,12 1,97 1,82 2,14

c. Kontrol Positif

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 79,70 76,09 75,88 74,22 72,51

2 82,52 77,98 78,51 75,60 77,65

3 78,44 75,38 75,76 83,21 73,17

4 72,12 80,87 76,17 78,13 70,78

5 73,99 74,31 78,80 81,25 72,08


97

d. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,65%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 10,34 5,49 7,14 10,29 8,89

2 6,17 8,43 10,00 6,94 6,52

3 5,43 5,80 7,69 9,84 8,89

4 6,52 10,34 12,90 12,00 13,21

5 8,74 7,69 4,00 3,96 10,94

e. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 10,61 20,97 9,38 18,92 17,65

2 15,00 15,87 8,00 11,76 12,82

3 9,09 9,46 11,36 16,00 16,67

4 17,24 10,29 9,30 18,37 18,52

5 14,00 5,63 12,00 15,00 12,07

f. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75%

Bidang

Pandang

Preparat

I II III IV V

1 21,54 10,91 19,05 6,52 18,75

2 13,92 11,29 16,95 12,28 14,29

3 9,68 13,04 22,92 14,71 18,75

4 17,31 15,09 16,33 13,43 19,05

5 11,36 8,47 11,63 8,70 7,41


98

Lampiran 12. Hasil uji normalitas persen penekanan enzim COX-2 dengan

uji Shapiro Wilk

Descriptives

Perlakuan Statistic Std. Error

Persen

Penekanan

Enzim COX-2

Kontrol

negatif

Mean 1.4460 .37532


Mean

Lower Bound .4039

Upper Bound 2.4881


Median 1.0600

Variance .704

Std. Deviation .83924

Minimum .89

Maximum 2.92

Range 2.03


Skewness 2.044 .913


Kontrol

Biocream

Mean 2.0180 .22051


Mean

Lower Bound 1.4058

Upper Bound 2.6302


Median 1.9900

Variance .243


Minimum 1.54

Maximum 2.72

Range 1.18

Interquartile Range .93

Skewness .580 .913

Kurtosis -.909 2.000

Kontrol

Positif

Mean 76.6040 .88520


Mean

Lower Bound 74.1463

Upper Bound 79.0617


Median 77.0200


99

Variance 3.918


Minimum 73.24

Maximum 78.48

Range 5.24


Skewness -1.663 .913


Ekstrak

daun

majapait

1,67%

Mean 8.3280 .40798


Mean

Lower Bound 7.1953

Upper Bound 9.4607


Median 8.3500

Variance .832


Minimum 7.44

Maximum 9.69

Range 2.25


Skewness .756 .913

Kurtosis .006 2.000

Ekstrak

daun

majapait

2,5%

Mean 13.4400 1.09280


Mean

Lower Bound 10.4059

Upper Bound 16.4741


Median 13.1900

Variance 5.971


Minimum 10.01

Maximum 16.01

Range 6.00


Skewness -.428 .913

Kurtosis -.888 2.000

Ekstrak Mean 13.7575 1.44399


100

daun

majapait

3,75%


Mean

Lower Bound 9.1621

Upper Bound 18.3529


Median 13.2600

Variance 8.340


Minimum 11.13

Maximum 17.38

Range 6.25


Skewness .621 1.014

Kurtosis -2.153 2.619

Tests of Normality

Perlakuan

Kolmogorov-

Smirnova Shapiro-Wilk

Statistic df Sig. Statistic df Sig.

Persen

Penekanan

Enzim COX-2

Kontrol negatif .355 5 .038 .717 5 .014

Kontrol Biocream .213 5 .200* .925 5 .562

Kontrol Positif .365 5 .028 .820 5 .116



Ekstrak daun majapait 3,75% .255 4 . .919 4 .530

a. Lilliefors Significance Correction

*. This is a lower bound of the true significance.

Test of Homogeneity of Variance

Levene Statistic df1 df2 Sig.

Persen

Penekanan

Enzim COX-2

Based on Mean 3.361 5 23 .020

Based on Median 2.472 5 23 .062

Based on Median and with adjusted df 2.472 5 14.039 .083

Based on trimmed mean 3.278 5 23 .022


101


Kruskal-Wallis

Ranks

Perlakuan N Mean Rank

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Kontrol negatif 5 4.00

Kontrol Biocream 5 7.00

Kontrol Positif 5 28.00




Total 30

Test Statisticsb,c

Persen

Penekanan

Enzim COX-2

Chi-Square 26.915

df 5

Asymp. Sig. .000

Monte Carlo Sig. Sig. .000a

95% Confidence Interval Lower Bound .000

Upper Bound .000

a. Based on 10000 sampled tables with starting seed 1314643744.

b. Kruskal Wallis Test

c. Grouping Variable: Perlakuan


102


Mann-Whitney

a. Kontrol negatif vs kontrol biocream®

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2

Kontrol negatif 5 4.00 20.00


Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2


Wilcoxon W 20.000

Z -1.567





b. Kontrol negatif vs kontrol positif

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






103

c. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2


Ekstrak daun majapait

1,67% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





d. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



2,5% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






104

e. Kontrol negatif vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



3,75% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





f. Kontrol Biocream® vs kontrol positif

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






105

g. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

1,67%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





h. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

2,5%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






106

i. Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

3,75%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





j. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






107

k. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





l. Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






108

m. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 2,5%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611





n. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 3,75%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611






109

o. Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% vs 3,75%

Ranks


Persen Penekanan

Enzim COX-2



Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan

Enzim COX-2


Wilcoxon W 26.000

Z -.313






110

Biografi Penulis

Penulis skripsi dengan judul “Uji Efek Antiinflamasi

Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia

cujete L.) terhadap Jumlah Neotrifil dan Ekspresi

Siklooksigenase 2 pada Mencit Terinduksi Karagenin”

memiliki nama lengkap Dui Sostales, merupakan anak

bungsu dari dua bersaudara pasangan Sopian dan

Illuminata. Penulis dilahirkan di Sidas pada tanggal 26

Agustus 1993, Kalimantan Barat. Pendidikan formal

yang telah ditempuh yaitu mengawali masa

pendididkannya di SDN 2 Sidas (1999-2005),

kemudian melanjutkan pendidikan di SMP Kristen

Makedonia Plasma II (2005-2008). Pendidikan

Sekolah Menegah Atas ditempuh di SMA Kristen

Makedonia (2008-2011). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan serjana di

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 di Falkutas Pendidikan

Fisika. Tahun 2012, penulis memutuskan untuk pindah ke Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Semasa kuliah penulis cukup aktif dalam kegiatan di fakultas, khususnya pada

UKF Basket dan Voli, penulis menjadi anggota aktif (2012-2015). Penulis pernah

menjadi asisten pratikum Farmakologi Toksikologi tahun ajaran 2014/2015, serta

menjadi peserta di beberapa seminar.


plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk filei uji efek antiinflamasi topikal ekstrak...

Documents