PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWA

ISOLASI, PURIFIKASI, DAN STUDI KINETIKA ENZIM INVERTASE PADA Saccharomyces cerevisiae

Bidang Kegiatan:PKM Artikel Ilmiah

(PKM-AI)

Diusulkan oleh:Winahyu Hapsari G84080021 Angkatan 2008Muhammad Iqbal Akbar M

G84070027

Angkatan 2007

Muhammad Iqbal Syukri

G84080010

Angkatan 2008

Amar Muslim G84090019

Angkatan 2009

ii

INSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2012

HALAMAN PENGESAHAN

1. Judul Kegiatan : Isolasi, Purifikasi, dan Studi Kinetika Enzim Invertase pada Saccharomyces cerevisiae

2. Bidang Kegiatan : (√) PKM-AI ( ) PKM-GT3. Bidang Ilmu : ( ) Kesehatan ( ) Pertanian

(√) MIPA ( ) Humaniora ( ) Sosial Ekonomi ( ) Pendidikan ( ) Teknologi dan Rekayasa

4. Ketua Pelaksana Kegiatana. Nama Lengkap : Winahyu Hapsarib. NIM : G84080021c. Jurusan : Biokimiad. Institut : Institut Pertanian Bogore. Alamat rumah dan No Tel./HP : Jl. Babakan Raya III, Desa

Babakan, Dramaga- Bogor No. HP. 08562053794

f. Alamat e-mail : hapsari.winahyu@yahoo.com

5. Anggota Pelaksana Kegiatan : 2 orang6. Dosen Pendamping

a. Nama Lengkap dan Gelar : Waras Nurcholis, S.Si. M.Si.b. NIP : 1980102 200912 1 002c. Alamat / No HP : Komplek Griya Asri Sirnasari

Jalan Rajawali III Blok C No. 4 Pagelaran Ciomas-Bogor / HP. 08179825145

Bogor, 18 Februari 2012

Menyetujui,Ketua Departemen Biokimia

(Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc.)NIP. 19630117 198903 1 000

Ketua Pelaksana Kegiatan

(Winahyu Hapsari)NIM. G84080021

Wakil Rektor Bidang Akademik dan

iii

Kemahasiswaan

(Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS)NIP. 19581228 198503 1 003

Dosen Pendamping

(Waras Nurcholis, S.Si. M.Si.)NIP. 1980102 200912 1 002

SURAT PERNYATAAN SUMBER TULISAN PKM-AI

Saya yang menandatangani Surat Pernyataan ini :nama : Winahyu Hapsari NIM : G84080021

menyatakan bahwa PKM-AI yang saya tuliskan bersama anggota tim lainnya benar bersumber dari kegiatan yang sudah dilaksanakan pada praktikum mata kuliah Pengantar Penenlitian Biokimia. Topik Penelitian ini adalah “Isolasi, Purifikasi, dan Studi Kinetika Enzim Invertase pada Saccharomyces cerevisiae”. Penelitian ini telah dilaksanakan pada tahun 2010 di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Naskah yang kami tulis ini belum pernah diterbitkan/dipublikasikan dalam bentuk prosiding maupun jurnal ilmiah.

Demikian Surat Pernyataan ini dibuat dengan penuh kesadaran tanpa paksaan pihak manapun juga untuk dapat digunakan sebagaimana mestinya.

Bogor, 18 Februari 2012Yang Membuat Pernyataan, Mengetahui/Menyetujui

Ketua Departemen Biokimia

Winahyu Hapsari Dr. Ir. I Made Artika, M. App. ScNIM. G84080021 NIP. 19630117 198903 1 000

ISOLASI, PURIFIKASI, DAN STUDI KINETIKA ENZIM INVERTASE PADA Saccharomyces cerevisiae

Hapsari W1, Mutaqin MIA1, Syukri MI1, Muslim A1

1Departemen Biokimia, Fakultas matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Pertanian Bogor

ABSTRAKInvertase merupakan katalis pada hidrolisis sukrosa

menghasilkan glukosa dan fruktosa (gula invert). Praktikum ini bertujuan mengisolasi dan mempurifikasi enzim invertase dari ragi, menentukan aktivitas dan kuantitas protein enzim invertase menggunakan assay Nelson dan metode Lowry, menentukan nilai Km dan Vmaks dari enzim invretase melalui study kinetika, dan mengkarakterisasi enzim invertase berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH. Assay Nelson berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru. Hasil optimum karakterisasi enzim invertase amobil diperoleh pada kadar Na-alginat 5 gr, konsentrasi substrat (sukrosa) 0,5 M, pH 4,5, dan suhu 30oC. Pengukuran aktifitas enzim invertase dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan reagen Nelson. Dari hasil pengukuran diperoleh aktifitas enzim invertase terbesar pada fraksi I sebesar 1.2256 unit/menit, kadar protein terbesar pada fraksi II sebesar 0,0255 mg/mL, fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931,49% dan 90,14%. Sedangkan Nilai konstanta Michaelis, Vmaks = -1,0940 µmol/mL. menit dan Km = -1,8818 mM.

Keyword: Aktivitas enzim, invertase, studi kinetika.

ISOLATION, PURIFICATION, AND KINETICS STUDY OF INVERTASE ENZYME ON Saccharomyces cerevisiae

Hapsari W1, Mutaqin MIA1, Syukri MI1, Muslim A1

1Departemen Biokimia, Fakultas matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,

Institut Pertanian Bogor

ABSTRACTInvertase enzyme is one of catalyst on hydrolisis of sucrose

for produce glucose and fructose (invert sugar). This research aims to isolate and purification invertase enzyme on yeast, determine the activity and quantity of enzyme by use of Nelson assay and Lowry method, determine the Km and Vmaks on kinetics study, and characterization invertase based on molecular weight, temperature, and pH. The Nelson assay is a method to measure the quantity of reduction sugar. The activity of invertase enzyme is show on increase of product or decrease of substrate. The Lowry method principally is based on Biuret reaction and reduction of arsenmolibdat reagent for produce blue color. The optimum characterization of invertase enzyme is obtained on Na-alginat 5 g, substrate concentration 5 M, pH 4.5, and 300C. The activity of invertase enzyme was conducted by spectrophotometri. The highest activity of invertase enzyme is fraction I 1.2256 unit/min, the amount of protein is fraction II 0,0255 mg/mL. The fold and yield of enzyme respectivelly are 931,49% dan 90,14% whereas Vmaks = -1,0940 µmol/mL min and Km = -1,8818 mM.

Keyword: enzyme activity, invertase, kinetics study.

1

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Indonesia merupakan negara yang memiliki sumber daya alam yang melimpah, baik hayati atau non-hayati. Tetapi masih banyak sumber daya alam yang belum dimanfaatkan secara maksimal oleh masyarakat, padahal sumber daya alam tersebut sangat berpotensi untuk dimanfaatkan lebih optimal lagi. Mikroorganisme merupakan salah satu sumber daya alam yang bisa dirasakan manfaatnya dalam kehidupan. Beberapa macam mikroorganisme dapat menghasilkan enzim adalah khamir, fungi, dan bakteri. Dewasa ini, khamir Saccharomyces cerevisiae yang merupakan mikroorganisme paling komersial saat ini. Penggunaan S. cerevisiae sebagai pabrik etanol telah banyak dikembangkan di beberapa negara maju, seperti Brazil, Afrika Selatan, dan Amerika Serikat. Khamir lebih banyak digunakan untuk memproduksi alkohol secara komersial dibandingkan dengan bakteri (Narita, 2005).

Invertase dikenal sebagai β-fruktofuranoside fruktohidrolase (EC 3.2.1.26) merupakan sebuah katalis untuk hidrolisis sukrosa yang menghasilkan fruktosa dan glukosa (gula invert) (Gambar 1). Enzim invertase banyak ditemukan pada ragi roti yang mengandung khamir S. cerevisiae. Invertase diproduksi oleh bakteri, fungi, tumbuhan tingkat tinggi, dan beberapa sel hewan (Lee Huang et al., 2000). Tetapi banyak penelitian dilakukan pada produksi invertase yang dihasilkan oleh khamir S. cerevisiae Khamir ini banyak terkandung pada ragi roti, dan secara komersil banyak dijual di pasaran. Khamir merupakan mikroorganisme uniseluler berbentuk elips, bulat atau silindris, yang ukurannya 5-10 kali lebih besar dari bakteri. Ragi ini banyak digunakan dalam pembuatan bir dan roti serta dikenal pula sebagai suplemen makanan karena kaya akan vitamin.

Enzim invertase banyak digunakan dalam industri fermentasi karena berfungsi sebagai katalis dalam hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Kemampuan enzim dalam mengkatalisis reaksi kimia dipengaruhi oleh kondisi lingkungan meliputi pH, suhu, waktu inkubasi, dan konsentrasi substrat. Enzim invertase yang dihasilkan oleh S. cerevisiae mempunyai aktivitas paling tinggi pada pH 4.5 dan temperatur 30ºC (Bergamasco et al., 2000).

Setiap enzim mempunyai nilai tetapan Michaelis-Menten tertentu, dimana nilai Km dapat digunakan untuk memperkirakan jumlah substrat yang diperlukan agar reaksi enzimatis berjalan efisien. Dengan mengetahui nilai Km dan Vm suatu enzim, maka dapat dilakukan optimalisasi penggunaan enzim tersebut sebagai biokatalisator reaksi pemecahan substrat menjadi produk. Laju reaksi meningkat saat suhu mencapai nilai optimum dan

2

berkurang saat suhunya maksimum. Sedangkan aktivitas enzim akan meningkat dengan meningkatnya kadar substrat (Lehinger, 1982).

Gambar 1 Reaksi hidrolisis sukrosa oleh enzim invertase.Pemanfaatan enzim secara komersial terus dipelajari dan

diterapkan yaitu pemanfaatan enzim untuk proses enzimatik pada industri makanan, minuman, farmasi, dan biokimia. Salah satu contoh pemanfaatan tersebut adalah pematangan buah-buahan hijau yang dipanen, pelayuan daging, pengawetan keju, pencegahan kekeruhan bir, dan pembentukan tekstur gula. Sedangkan pemanfaatan enzim invertase banyak dilakukan dalam industri makanan dan minuman khususnya pada pengolahan selai, permen, produk gula-gula, dan produksi asam laktat dari fermentasi sirup tebu (Acosta et al., 2000).

Invertase juga digunakan untuk memproduksi etanol dari sukrosa sebagai sumber karbon (Lee Huang, 2000). Adanya isu sosial dan fakta akan terbatasnya sumber bahan bakar fosil telah menstimulasi upaya penggunaan dan pengembangan bahan bakar alternatif yang renewable dan ramah lingkungan. Produksi etanol melalui fermentasi mikroba dianggap sebagai metode alternatif sumber energi bahan bakar fosil dikarenakan keunggulannya, yaitu rendahnya biaya produksi, persentase rendemen yang tinggi, prosesnya relatif lebih cepat, penanganannya sederhana, dan produk samping yang relatif lebih sedikit serta aman bagi lingkungan (Narita, 2005).

Secara umum enzim dapat larut dalam air, sehingga banyak enzim tidak ekonomis untuk digunakan pada pengoperasian tipe batch dalam skala besar di industri, karena hanya dapat digunakan satu kali proses dengan biaya yang cukup mahal. Tetapi dalam tahun-tahun belakangan ini berbagai teknik telah ditemukan untuk memperbaiki kerja enzim, yaitu dengan cara mengikatkan enzim pada bahan-bahan yang tidak larut dalam air, dimana bahanbahan tersebut dapat dipisahkan dari produk dengan mudah. Hal itu memungkinkan penggunaan kembali bahan-bahan tak larut yang mengandung enzim tersebut. Teknik ini disebut dengan amobilisasi enzim. Teknik amobilisasi pada enzim merupakan suatu teknik yang dapat meningkatkan kemampuan hidup enzim sehingga dapat digunakan kembali. Teknik tersebut merupakan metode terbaik untuk mengurangi pengeluaran biaya dalam proses enzimatik

3

secara kontinu khususnya dalam industri makanan dan minuman (Bucke, 1987).

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan pemurnian enzim invertase. Selain itu menentukan aktivitas dan kuantitas protein enzim invertase. Kemudian, menentukan nilai KM dan Vmaks dari enzim invertase melalui studi kinetika, serta melakukan karakterisasi enzim invertase berdasarkan bobot molekul, pengaruh suhu, dan pengaruh pH.

METODE PENELITIAN

Isolasi Invertase RagiEkstraksi Invertase Ragi. Sebanyak 10 g ragi ditimbang

dan sejumlah 2-3 g glass bead dimasukkan ke dalam mortar. Toluen ditambahkan sebanyak 10 mL ke dalam mortar tersebut dan digerus sedikit demi sedikit hingga membentuk pasata halus. Akuades sebanyak 20 mL ditambahkan secara bertahap selama 30 menit, dilanjutkan dengan pengggerusan pada setiap penambahan. Setelah itu, hasil penggerusan dipindahkana ke dalam tabung sentrifugasi 50 mL. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi selama 15 menit pada kecepatan 12.000 rpm (Sorvall refrigerated centrifuge, SS-34 rotor). Lapisan air pada hasil sentrifugasi dipindahkan secara hati-hati, agar fasa toluen tidak terambil. Ekstrak protein dikumpulkan ke dalam tabung. Kemudian diambil sebanyak 1 mL aliquot sebagai sampel ekstrak kasar (fraksi I) untuk diukur aktivitas dan kadar proteinnya. Sisa larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifus 50 mL. Selanjutnya ditambahkan 2-4 tetes asam asetat 1 N untuk dikondisikan pada pH 5 pada larutan.

Pemanasan Ekstrak Invertase Ragi. Ekstrak diinkubasi pada suhu 50o C selama 30 menit. Kemudian didinginkan dalam wadah yang berisi es. Selanjtnya dilakukan sentrifugasi pada kecepatan 15.000 rpm dalam waktu 15 menit. Volume supernatan hasil sentrifugasi diukur. Aliquot sebanyak 2 mL diambil untuk diuji aktivitasnya dan kadar protein ekstrak kasar pemanasan (fraksi III).

Fraksinasi Ekstrak Invertase Ragi. Fraksinasi pengendapan ammonium sulfat dibuat 20%. 40%. 60%. dan 80% dengan penambahan sejumlah garam ammonium sulfat berturut 106 g, 113 g, 120 g, dan 161 g. Garam amonium ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk pada suhu 0oC kurang lebih dalam rentang satu jam. Selanjtnya disentrifugasi selama 30 menit pada kecepatan 30.000 g. Kemudian supernatan dipisahkan dari endapannya. Sementa itu, supernatan ditambahkan dengan amonium sulfat seperti prosedur sebelumnya untuk fraksi pengendapan berikutnya. Endapan

4

pertama diberi nama fraksi IIIa, yakni pengendapan amonium sulfat 20%, endapan kedua fraksi IIIb adalah fraksi pengendapan amonium sulfat 40% dan seterusnya. Endapan disimpan pada suhu -20 oC. Kemudian masing-masing larutan diendapkan dengan bufer 0.05 Tris-HCl pH 7.3.

Penentuan Aktivitas dan Kadar Protein InvertasePembuatan kurva standar. Delapan tabung reaksi

disiapkan. Tabung ke 2-8 diisi dengan glukosa 4 mM berturut 0.02 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.15 mL, 0.20 mL, 0.25 mL, dan 0.30 mL. Selanjutnya dilakukan penambahan air pada tabung1-8 sebanyak berturut-turut 1 mL, 0.98 mL, 0.95 mL, 0.90 mL, 0.85 mL, 0.80 mL, 0.75 mL, dan 0.70 mL. Kemudian dilakukan penambahan reagen kupritatrat sebanyak 1 mL pada masing-masing tabung. Masing-masing tabung ditutup dan selanjutnya didihkan dalam waterbath selama 20 menit. Setelah itu semua tabung didinginkan pada suhu ruang, selanjutnya ditambahkan fosfomolibdat sebanyak 1 mL. Kemudian tabung dikocok dengan vortex, diamkan selama 5 menit. Pada semua tabung ditambahkan 7 mL air. Selanjutnya diukur absorbansinya secara berurutan dari tabung 1-8 pada spektrofotometer 510 nm.

Uji aktivitas enzim invertase dengan Assay Nelson’s. Sebanyak 9 tabung reaksi disiapkan. Tabung 1 sebagai blanko (sukrosa), tabung 2 dan 3 sebagai fraksi I, tabung 4-5 sebagai fraksi II, tabung 6-7 sebagai fraksi III dan tabung 8-9 sebagai standar glukosa. Semua tabung, kecuali tabung 8-9, diisi dengan 0.20 mL bufer asetat 0.2 M pH 4.5. Selanjutnya diisi dengan air pada tabung 1-9 berturut-turut 0.60 mL, 0.55 mL, 0.10 mL, 0.55 mL, 0.10 mL, 0.55 mL, 0.10 mL, 1.00 mL dan 0.8 mL. Pada tabung 2-3 ditambahkan fraksi I 0.05 mL dan 0.5 mL, tabung 4-5 ditambahkan fraksi II sebanyak 0.05 mL dan 0.5 mL, tabung 6-7 ditambahkan fraksi III sebanyak 0.05 mL dan 0.5 mL. Selanjutnya hanya pada tabung 9 ditambahkan glukosa 4 mM sebanyak 0.2 mL. Kemudian semua tabung diassay dengan penambahan substrat sukrosa 0.5 M sebanyak 0.2 mL pada tabung 1-7. Selanjutnya diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan dengan 1 mL reagen kupritatrat pada masing-masing tabung. Masing-masing tabung ditutup dan selanjutnya didihkan dalam waterbath selama 10 menit. Setelah itu semua tabung didinginkan pada suhu ruang, selanjutnya ditambahkan fosfomolibdat sebanyak 1 mL. Kemudian tabung dikocok dengan vortex, diamkan selama 5 menit. Pada semua tabung ditambahkan 7 mL air. Selanjutnya diukur absorbansinya pada spektrofotometer 510 nm.

Penentuan kadar protein dengan metode LowryPembuatan kurva standar. Sebanyak 10 tabung reaksi

disiapkan. Tabung ke 2-10 diisi dengan standar BSA (400 µg/mL) berturut-turut sebanyak 0.05 mL, 0.1 mL, 0.15 mL, 0.2 mL, 0.25

5

mL, 0.3 mL, 0.35 mL, 0.4 mL, dan 0.45 mL. Selanjutnya ditambahkan air pada tabung 1-10 berturut-turut 0.5 mL, 0.45 mL, 0.4 mL, 0.35 mL, 0.3 mL, 0.25 mL, 0.2 mL, 0.15 mL, 0.1 mL, dan 0.05 mL. Selanjutnya semua tabung ditambahkan dengan reagen C sebanyak 5 mL. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan menggunakan vortex. Inkubasi secara pasti selama 10 menit pada suhu ruang, penambahan dengan interval waktu 30 detik. Campur dengan vortex dan inkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Tahap ini dimulai setelah penambahan reagen ke tabung terakhir. Setelah itu diukur absorbansinya dalam spekrtofotometer pada 700 nm.

Pengukuran kadar protein invertase. Perlakuan untuk fraksi I dan II. Sebanyak 7 tabung reaksi disiapkan. Tabung 1 sebagai blanko (sukrosa), tabung 2-4 sebagai fraksi I, tabung 5-7 sebagai fraksi II. Sampel fraksi I dan II diencerkan dengan air dalam perbandingan 1:4. Tabung 2-4 diisi dengan fraksi I sebanyak 0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL. Sementara itu, tabung 5-7 diisi dengan fraksi III sebanyak 0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL. Setelah itu dilakukan penmabahan air pada semua tabung, kecuali tabung 4 dan 7, berturut-turut diisi 0.5 mL, 0.45 mL, 0.3 mL, 0.45 mL, dan 0.3 mL. Prosedur selanjutnya mengikuti metode Lowry seperti pada pembuatan kurva standar protein.

Perlakuan untuk fraksi III. Sampel fraksi III disuspensi dengan bufer Tris. Sementara itu dilakukan preparasi terhadap bufer tris dan fraksi III dengan melakukan pengenceran dengan air (1:1). Tabung sebanyak 6 buah disiapkan. Tabung 1-3 merupakan balanko, sedangkan tabung 4-6 ialah fraksi III. Tabung 1-3 diisi dengan bufer Tris 0.05 M sebanyak 0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL. Sementara itu, tabung 4-6 diisi dengan 0.05 mL, 0.2 mL, dan 0.5 mL fraksi III. Semua tabung, kecuali tabung 3 dan 6, ditambahkan dengan air berturut-turut sebanyak 0.45 mL, 0.3 mL, 0.45 mL, dan 0.3 mL. Selanjutnya prosedur mengikuti metode Lowry seperti pada pembuatan kurva standar protein.

Absorbansi substrat blanko Tris yang dihubungkan dengan fraksi III untuk mendapatkan absorbansi terkoreksi. Kadar protein masing-masing fraksi ditentukan dan rata konsentrasi per mL untuk fraksi I, II, dan III.

Studi Kinetika Enzim Invertase. Pengaruh konsentrasi substrat pada aktivitas

invertase. Sebanyak 8 tabung reaksi disiapkan. Semua tabung diisi dengan bufer asetat 0.2 M pH 4.5 sebanyak 0.2 mL. Semua tabung, kecuali tabung 1, ditambahkan dengan sukrosa 0.02 mL, 0.04 mL, 0.06 mL, 0.08 mL, 0.10 mL, 0.20 mL, dan 0.40 mL. Setelah itu semua tabung dijadikan 0.9 mL dengan air. Setelah itu diisi dengan fraksi terbaik sebanyak 0.1 mL. Kemudian semua tabung di assay dengan penambahan enzim. Semua tabung

6

diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan ditambahkan reagen Nelson’s sebanyak 0.1 mL pada semua tabung. Tabung kemudian ditutup dan ditempatkan pada air mendidih selama 20 menit dan assay untuk gula pereduksi mengikuti prosedur Nelson’s. Kemudian dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 510 nm.

Prediksi Bobot Molekul Enzim InvertasePembuatan gel. Konsentrasi stacking gel dibuat 3%

dengan ditambahkan 1 mL 30 akrilamid, 1.25 mL bufer Tris-HCl 0.5 M pH 7.0. 0.1 mL SDS 10%, 0.005 mL TEMED, 7.54 mL H2O, dan 0.1 mL APS. Konsentrasi running gel dibuat 12.5% dengan ditambahkan 17.5 mL akrilamid stok + 2.5 mL H2O, 5 mL bufer Tris-HCl 3 M pH 8.9, 14.4 mL H2O, dan 0.4 mL APS (0.59 mL dalam 4.5 mL H2O), dicampur dengan magnetic stirer, dan divakumkan. Sebanyak 0.4 mL SDS 10% dan 0.02 mL TEMED dicampurkan perlahan. Campuran dipindahkan dalam plat kaca kemudian dibanjiri n-butanol, disiman 1-2 jam hingga beku. Butanol dibuang dan gel dibilas dengan running gel overlay, diamkan 30 menit. Sumur kemudian diset.

Prosedur elektroforesis SDS-PAGE. Sampel protein diperlakukan dengan bufer sampel dua kali, didihkan selama 90 detik, dinginkan, dan diambil 5 µL ke dalam sumur SDS-PAGE yang telah terhubung dengan power supply.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Ekstrak Kasar Enzim Invertase

Ragi roti digunakan sebagai sumber enzim invertase pada isolasi ekstrak kasar enzim invertase pada penelitian ini. Hal ini didasarkan karena ragi banyak mengandung khamir S. cereviseae. Isolasi diawali dengan mencampurkan ragi roti sebanyak 10 g dan pelarut toluen sebanyak 10 mL lalu diaduk.

Selanjutnya, campuran tersebut dihomogenasikan dengan menggunakan homogenizer supaya lebih merata. Pemecahan sel dilakukan setelah proses inkubasi. Hal ini dikarenakan enzim invertase termasuk enzim yang berada di dalam sel (intraseluler), maka perlu dilakukan proses pemecahan dinding sel untuk mengeluarkan enzim di dalam sel supaya dihasilkan enzim yang lebih banyak. Proses pemecahan sel ini dilakukan dengan cara keras, yaitu dengan glassbed dan digerus selama 30 menit. Inkubasi ragi dilakukan selama 30 menit dengan suhu inkubasi sebesar 50oC. Suhu diatur sebesar 50oC karena jika suhu terlalu panas maka mikroorganisme penghasil enzim invertase akan mati, sehingga enzim tidak akan diperoleh.

Selanjutnya, pemisahan enzim dilakukan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama 15 menit.

7

Hal ini berguna untuk memisahkan pecahan dinding dinding sel dari supernatannya. Prinsip dari metode sentrifuge ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. Sehingga nantinya berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah (Koolman, 2000). Setelah disentrifugasi, supernatan didekantasi dari residu/pecahan dinding-dinding sel, maka hasil yang diperoleh berupa ektrak kasar enzim invertase yang berwarna cokelat. Berdasarkan komposisi tersebut maka jumlah ekstrak kasar enzim invertase yang diperoleh sebanyak 18.02 g.

Ekstrak kasar enzim invertase hasil optimasi ditentukan aktivitasnya dengan menggunakan assay Nelson’s dan kandungan proteinnya menggunakan metode Lowry, diukur aktifitas secara spektroskopi. Assay Nelson berprinsip pada pengukuran jumlah gula pereduksi. Pada metode ini aktivitas enzim invertase ditunjukkan oleh bertambahnya produk reaksi (glukosa dan fruktosa) atau berkurangnya substrat (fruktosa/ satuan waktu). Metode Lowry didasarkan pada reaksi Biuret dan reduksi reagen arsenomolibdat menghasilkan warna biru (Hasanah, 2010).

Uji Aktivitas Invertase Ragi dengan Assay Nelson’sKurva Standar Gula Invert.

Kurva standar gula invert yang diperoleh pada penelitian ini ditunjukkan seperti pada Gambar 1. Kurva standar ini dibuat dengan mengalurkan absorbansi (A) terhadap konsentrasi larutan gula invert (M). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin besarnya konsentrasi larutan gula invert sehingga diperoleh persamaan garis antara konsentrasi dan absorbansi yaitu y = 0.515x+ 0.00372 dengan r2 = 0.985. Persamaan tersebut akan digunakan untuk menghitung konsentrasi gula invert yang terbentuk. Nilai R2 dari kurva diatas adalah 0.985, hal ini menunjukkan bahwa kelinearan kurva standar baik karena hampir mendekati +1, yang mana titik-titik pada kurva standar melewati garis lerengnya.

Perbedaan pH berpengaruh terhadap 2 jenis, yaitu struktur enzim dan gugus fungsional enzim. Suatu enzim dapat menghasilkan produk yang maksimal pada pH optimumnya. Aktivitas maksimum invertase yaitu pada pH 4.5 dengan aktivitas sebesar 1.2256 unit pada fraksi 1, 0.9568 unit pada fraksi 2, dan 1.1232 unit pada fraksi 3. Unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah yang menyebabkan pembentukan 2 µmol gula pereduksi per menitnya. Hasil pH optimum ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Bergamasco et al. (2003), yang melaporkan bahwa aktifitas enzim terjadi pada range pH 3.0 - 5.0 dengan aktivitas maksimum terjadi disekitar pH 4.5. Diatas skala tersebut aktivitas enzim mengalami penurunan.

8

Semakin basa kondisi hidrolisis menyebabkan semakin rendahnya harga aktivitas enzim invertase.

Perubahan pH dapat menyebabkan turunnya aktivitas enzim akibat perubahan ionisasi gugus-gugus fungsionilnya karena gugus ionik berperan penting dalam menjaga konformasi sisi aktif enzim untuk mengikat dan mengubah substrat menjadi produk. Perubahan pH juga dapat menyebabkan enzim terdenaturasi sehingga menyebabkan penurunan katalitik enzim. Denaturasi enzim dakibatkan karena terjadinya pemutusan ikatan penstabil struktur (seperti ikatan ionik, hidrogen, hidrofobik) yang menghubungkan antar polimer protein. Pemutusan tersebut dapat terjadi pada protein kwartener, tersier ataupun sekunder. Pada protein kwartener terjadi pemutusan ikatan penstabil struktur karena bentuknya yang merupakan gabungan antara globular satu dengan globular lainyya sehingga dapat terjadi pemutus an ikatan tersebut pada protein tersier satu dengan protein tersier lainnya dan terjadi seterusnya, pada protein tersier membentuk protein sekunder (Awwalurrizki dan Putra, 2009).

Pada penelitian ini menunjukkan bahwa unit aktivitas tertinggi ada pada fraksi dua sebesar 56.824. sedangkan unit enzim invertase tertinggi adalah pada fraksi 1 dimana fraksi satu merupakan ekstrak kasar enzim invertase dan fraksi 3 merupakan fraksi yang dimurnikan pada enzin invertase.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.40

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

f(x) = 0.514775910364146 x + 0.00371988795518191R² = 0.984813254139756

[glukosa] µmol

Ab

sorb

an

Gambar 1. Kurva standar aktivitas invertase ragi dengan assay Nelson’s.

Tabel 1 Data unit enzim invertase dan unit aktivitas dalam fraksi (total unit).

Larutan

Tabung

A[glukos

a]µmol

unit enzim inverta

se

Rata-rata

FPTotal unit

Rata-rata

B lanko

1 0 - - - - - -

Fraksi 1

2 0.114 2.1567 2.1561 1.2256

12

67.28437.006

3 1.523 2.95 0.295 1. 6.7284

9

2

Fraksi 2

4 0.851 1.645 1.645 0.9568

24

103.3344

56.834

5 1.387 2.686 0.26862.4

10.3334

Fraksi 3

6 1.013 1.959 1.959 1.1232

24

60.6528

33.359

7 1.484 2.874 0.28742.4

6.0653

Standar

glukosa

8-

0.063-0.129 - - - - -

9 0.268 0.513 - - - - -

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Lowry

Pembuatan kurva standard. Sepuluh tabung disiapkan lalu diisi dengan komposisi standard BSA pada tabung 2 sampai 10; H2O dari tabung 1 sampai 10; reagen C (campuran dari reagen A dan B) pada semua tabung. Fungsi dari reagen ini adalah unuk membentuk kompleks Biuret. Setelah itu, semua tabung dikocok dengan vorteks, diinkubasi 10 menit pada suhu ruang. Penambahan reagen harus diatur dengan baik. Pada saat sepuluh menit terakhir ditambahkan 0.5 mL reagen D ke tabung pertama dan seterusnya. Kemudian dicampur dengan vorteks, diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang lalu dibaca serapannya pada panjang gelombang 700 nm.

Kurva standar pada gambar 2 dibuat dengan mengalurkan absorbansi sebagai ordinat (sumbu-Y) dan konsentrasi larutan BSA sebagai absis (sumbu-X). Nilai absorbansi mengalami kenaikan dengan semakin bertambahnya konsentrasi larutan BSA sehingga diperoleh persamaan garis, yaitu y=0.0323x + 2.2497x10-3 dan faktor korelasi sebesar 0.9416. Persamaan yang diperoleh digunakan untuk menentukan kandungan protein.

Kandungan protein yang diukur dalam penelitian ini adalah protein terlarut dan protein total. Protein terlarut merupakan oligopeptida dan mudah diserap oleh sistem pencernaan. Protein total merupakan pengukuran kandungan nitrogen (N) dalam sampel. Oleh karena itu, terdapat senyawa non-protein yang ikut terdeteksi dan terkalkulasi. Namun, interferensi ini relatif kecil dan dapat diabaikan.

Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak dapat mengukur molekul peptida panjang (Alexander dan Griffiths, 1992). Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya. Protein merupakan polimer heterogen molekul-molekul asam amino. Protein yang terkandung dalam kedelai merupakan

10

protein globuler. Dalam protein globuler, rantairantai samping hidrofil dan polar berada di bagian luar dan rantai samping hidrofob dan nonpolar berada di bagian dalam.

Pada penelitian ini didapat kadar protein paling tinggi adalah pada fraksi II yaitu sebesar 0.0225 mg/mL sedangkan paling kecil adalah pada fraksi III sebesar 0.0015 mg/mL. Hal ini dikarenakan pada fraksi III sudah dilakukan perlakuan terus-menerus atau paling banyak sehingga kadar proteinnya paling kecil. Sementara itu kandungan protein Total pada fraksi II juga tertinggi (1.0328 unit) dan fraksi III paling rendah (0.0608 unit). Dari hasil keseluruhan aktivitas spesifik fraksi III paling besar (748.8 unit) dibandingkan fraksi yang lain. Dari konsentrasi tersebut didapat yield enzim sebesar 90.14%, sedangkan fold enzimnya sebesar 931.49%. Yield enzim merupakan perbandingan antara total unit dalam fraksi yang dimurnikan dengan total unit dalam ekstrak kasar, sedangkan fold enzim merupakan perbandingan antara aktivitas spesifik dari fraksi yang dimurnikan dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 2000

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

f(x) = 0.00215333333333334 x + 0.0467999999999998R² = 0.86621711075032

µgram protein

Abs

orba

n

Gambar 2 Kurva standar BSA.

Tabel 2 Data jumlah protein, total protein, dan aktivitas spesifik enzim invertase.

Larutan

Tabung

Aprotein (µg)

[protein]

(mg/mL)

Rata-rata

Total prote

in

Rata-rata

Aktivitas

Spesifik

Blanko

1 0 - -

F1

2-

0.007-

0.286-

0.00570.0155

0.6975

0.3139

80.3873 0.12 3.646 0.01820.1744

4 0.208 6.369 0.01270.0698

F25 0.037 1.076 0.0215

0.0255

2.295

1.0328

37.522

6 0.048 1.416 0.0071 0.574

11

7 0.77523.92

40.0478

0.2295

F3

8-

0.011-0.41

-0.0082

0.0015

0.135

0.0608

748.89-

0.004

-0.193

5

-0.0009

6

0.0338

10 0.027 0.766 0.00150.0135

Penentuan kinetika enzimPenentuan kinetika enzim invertase (Vmaks dan Km)

didasarkan atas plot grafik hubungan antara konsentrasi substrat [S] dan aktivitas enzim (V) (Fayyaz et al. 1995; Dinu 2001). Larutan substrat sukrosa dibuat dengan konsentrasi antara 0.02-0.4 dengan interval 0.02 dan 0.1 dalam larutan bufer asetat 0.2 M pH 4.5 lalu dilakukan pengujian aktivitas enzim sesuai prosedurnya. Setelah itu ditentukan aktivitas enzim (µmol gula pereduksi/ menit) pada masing-masing konsentrasi substrat.

Selanjutnya dibuat tabel V dan [S] dan dikonversi menjadi 1/V dan 1/[S] serta dibuat plot grafik hubungan antara 1/V dan 1/[S]. Lalu ditentukan nilai Vmaks dan Km yang didasarkan atas persamaan kurva Lineweaver-Burk (Whitaker, 1996), dengan cara:- Bahwa dari persamaan: 1/V = 1/Vmaks + Km/ Vmaks.(1/[S])- Bila 1/V = Y dan 1/[S] = X, maka rumusnya dapat ditulis menjadi: Y = a + bX, sehingga: a = 1/Vmaks dan b = Km/Vmaks- Dengan demikian, bila harga 1/Vmaks diketahui maka nilai Vmaks didapat, begitu pula nilai Km akan juga didapat dari persamaan b = Km/Vmaks.

Aktivitas enzim invertase pada beberapa konsentrasi substrat (Tabel 3) menunjukkan bahwa konsentrasinya mula-mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat. Penentuan Vmaks dan Km didasarkan atas persamaan garis regresi grafik hubungan antara 1/[S] dan 1/V (Tabel 3), seperti disajikan pada Gambar 4. Selanjutnya dari persamaan regresi y=1.720x – 0.914. maka diperoleh Vmaks = -1.0940 µg/ menit dan Km = -1.8818 mM

Aktivitas enzim invertase yang mula-mula meningkat secara signifikan sejalan dengan meningkatnya konsentrasi substrat, tetapi tidak signifikan setelah konsentrasi substrat ditingkatkan lagi. Hal ini terjadi karena suatu reaksi enzimatis akan meningkat dengan bertambahnya konsentrasi substrat [S], akan tetapi setelah [S] meningkat lebih lanjut akan sampai pada kecepatan yang tetap. Pada kondisi dimana kecepatan reaksi enzimatis tidak dapat bertambah lagi dengan bertambahnya [S] disebut kecepatan maksimum (Vmaks) (Wiesman, 1989).

12

Penentuan Vmaks akan menghasilkan gambaran tentang sifat-sifat kinetika enzim lain, ½ Vmaks, yaitu suatu konsentrasi substrat yang separuh lokasi aktifnya telah terisi atau bila kecepatan reaksi enzimatis telah mencapai setengah dari kecepatan maksimum, yang dikenal dengan Km (tetapan Michaelis-Menten). Nilai Km digunakan selain sebagai ukuran afinitas E-S juga berhubungan dengan tetapan keseimbangan disosiasi kompleks E-S menjadi E dan S. Fayyaz (1995) menambahkan bila nilai Km kecil berarti kompleks E-S mantap dan afinitas enzim terhadap substrat tinggi, sedangkan bila nilai Km besa afinitasnya menjadi rendah. Harga Km enzim sangat bervariasi tergantung dari jenis substrat, keadaan lingkungan dan kekuatan ion. Pada penelitian kali ini didapat Vm negatif artinya reaksi berjalan sangat lamabat atau mungkin tidak berjalan sama sekali. Hal ini karena kurva yang dihasilkan tidak hiperbolik yang disebabkan saat penambahan enzim ke tabung kurang tepat dengan interval waktunya.

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.30

0.020.040.060.08

0.10.120.140.160.18

f(x) = 0.578563711558865 x + 0.00163196909040215R² = 0.982912825053352

S

V

Gambar 3 Kurva hubungan antara kecepatan dan konsentrasi substrat (Michaelis Menten).

0 10 20 30 40 50 60 70 800

20

40

60

80

100

120

140

f(x) = 1.72056845000515 x − 0.914395194984579R² = 0.983034512003127

1/S

1/V

Gambar 4 Kurva hubungan antara 1/V dan 1/S (Lineweaver burk).

Tabel 3 Data kecepatan da konsentrasi substrat sukrosaTabung

A[sukrosa]

µmolV 1/V [S] 1/[S]

1 0 0 0 0 0 02 0.046 0.082 0.0082 121.95 0.0143 69.933 0.107 0.201 0.0201 49.75 0.0386 34.974 0.111 0.208 0.0208 48.08 0.0429 23.315 0.191 0.364 0.0364 27.47 0.0571 17.516 0.241 0.461 0.0461 21.69 0.0714 14.01

13

7 0.501 0.996 0.0996 10.35 0.1429 6.998 0.826 1.596 0.1596 6.27 0.2857 3.50

Prediksi bobot molekul enzim invertasePrinsip dasar SDS-PAGE adalah makromolekul bermuatan

akan bermigrasi dalam medan listrik dengan laju yang ditentukan oleh ukuran dan muatannya. Sebelum protein dijalankan dalam medan listrik, protein terlebih dahulu akan didenaturasi dengan perubahan kondisi yang tajam misalnya panas, adanya agen pereduksi, penambahan deterjen dan lain-lain, kemudian akan dibungkus dengan deterjen anionik yaitu SDS. Muatan asli molekul protein akan ditimpa oleh molekul SDS yang bermuatan negatif. Adanya 2-merkaptoetanol dapat membantu denaturasi protein dengan cara mereduksi semua ikatan disulfide.

SDS dilakukukan pada pH netral. Pada metode ini digunakan SDS dan β-merkaptoetanol. SDS bersama β-merkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan rusaknya struktur tiga dimensi protein menjadi konfigurasi random coil. Hal ini disebabkan oleh pecahnya ikatan disulfida yang selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus sulfhidril. Denaturasi protein adalah suatu keadaan dimana terjadi perubahan konformsi protein. Perubahan ini meliputi proses destruksi ikatan pada struktur sekunder sehingga konformasi protein asli berubah tetapi ikatan kovalen pada polipeptida tidak mengalami kerusakan. SDS merupakan deterjen anionik, memiliki gugus ion sulfat dan rantai alkil lipfoilik yang menyebabkan peptida dan protein tidak saling berikatan yang dinamakan denaturasi. SDS mengelilingi peptida atau protein sehingga bermuatan negatif, kemudain semua peptida dan protein dalam campuran akan bermigrasi menuju anoda yang pergerakannya tidak dipengaruhi oleh bentuk. Hal ini disebabkan karena adanya denaturasi yang mengakibatkan bentuk molekul seragam yaitu berbentuk rantai lurus yang kemudian diselimuti oleh SDS sehingga bermuatan negatif. Pergerakan protein merupakan fungsi dari berat molekulnya, dimana kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih kecil dibandingkan dengan kompleks yang lebih kecil.

Stacking gel mempunyai fungsi untuk mengumpulkan sampel yang akan dipisahkan sehingga memungkinkan cuplikan untuk bergerak bersama-sama dan membentuk suatu pita cuplikan yang pekat. Resolving gel mempunyai fungsi untuk terjadinya pemisahan yang lebih baik sehingga memungkinkan terjadi perbedaan gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil.

Fungsi bufer elektroforesis untuk mempertahankan pH di dalam reservoir dan gel serta sebagai elektrolit pembawa aliran

14

listrik. Oleh karena itu pemilihan bufer harus memenuhi kriteria antara lain: pemilihan bufer didasarkan pada tidak adanya interkasi yang terjadi antara bufer dengan makromolekul yang dipisahkan, pH yang digunakan tidak mengakibatkan denaturasi protein (kisaran yang digunakan untuk protein biasanya 4.5-9.0. kekuatan ionik dan konsentrasi bufer harus diperhitungkan dengan tepat (kekuatan ionik biasanya berkisar 0.05-0.15).

Sistem bufer kontinyu adalah gel yang digunakan dalam satu slab terdiri dari dua gel yaitu stacking gel dan separating gel. Bufer dan konsentrasi akrilamid yang digunakan pada kedua gel tersebut berbeda. Pada stacking gel digunakan bufer dengan pH 6.8 dan konsentrasi akrilamid rendah. Sedangkan pada separating gel digunakan bufer dengan pH 8.8 dan konsentrasi akrilamid tinggi. Sehingga protein akan terkonsentrasi pada stacking gel dan akan mengalami resolusi yang tinggi pada separating gel. Hal ini menghasilkan pemisahan yang baik dan pita tajam.

Pewarnaan berfungsi untuk memperjelas pita protein hasil pemisahan dengan elektroforesis. Pewarna yang digunakan harus dapat bereaksi dengan molekul sampel yang dipisahkan, tetapi tidak bereaksi dengan gel elektroforesis. Ikatan antara pewarna dan gel bukan ikatan kovalen sehingga mudah dilepaskan oleh pencucian yang intensif dan penyinaran.

Adapun pengamatan yang sudah diujikan, tampak jelas terlihat laju migrasi dan berbedaan gerak yang jelas terlihat antara spesies dengan molekul besar dan spesies dengan molekul yang lebih kecil, dan dengan menggunakan pewarnaan tampak terlihat jelas proses pemisahan pita protein hasil elektroforesis (Gambar 5). Sampel yang dimasukan ke dalam sumur pada stacking gel akan terkonsentrasi atau tertumpuk dan tidak mengalami pemisahan meskipun dibawah pengaruh medan listrik, hal ini disebabkan karena pori gel berukuran besar (4% akrilamid). Mobilitas ion pada stacikng gel secara berurutan adalah ion klorida, protein kemudian ion glisin. Ketika pergerakan mencapai separating gel, konsentrasi glisin meningkat akibat peningkatan pH sehingga mobilitasnya menurun akibat adanya ukuran pori yang semakin kecil. Dengan demikian pergerakan ion pada separating gel secara berurutan adalah ion klorida, ion glisin, dan protein.

Hasil running dari masing-masing sampelnya diekstrak dari sel-sel mikroorganisme. Dua macam konsentrasi ini dipilih untuk membedakan antara populasi mikroorganisme yang resisten dengan yang tidak resisten. Pola Pita protein hasil running dengan menggunakan gel polyakrilamid seperti terlihat pada Gambar 5. Marker protein digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames dan Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat

15

molekul 212 kDa-11.3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap varietas disebut protein mayor. Pada hasil elektroforesis di atas terdapat beberapa buah protein mayor. Berat molekul dari protein mayor ini berkisar 148.7 kDa, 121.6 kDa, dan 105 kDa.

Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping metode tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam medium yang menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe muatan.

Penggunaan SDS dan merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS protein mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran protein. Jadi kompleks SDS-protein yang lebih besar mempunyai mobilitas yang lebih rendah dibandingkan dengan kompleks SDS-protein yang lebih kecil.

Gambar 5 Hasil elektroforesis SDS PAGE.

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian diperoleh kesimpulan bahwa aktivitas optimum invertase dalam mendegradasi sukrosa menjadi gula invert adalah pada kondisi pH 4.5. Berbagai pengujian seperti aktivitas, kadar, kinetika dan bobot molekulnya, dari aktivitasnya ternyata fraksi I memiliki konsentrasi dan aktivitasnya lebih besar dari yang lain (1.2256 unit/menit), hal ini disebabkan pada fraksi I masih segar. Sedangkan pengamatan kadar protein memiliki konsentrasi

16

larutan sampel yang dihitung dengan bantuan kurva standar yang tertinggi ialah dari fraksi II sebesar 0.0255 mg/mL. Dengan data mengenai aktivitas dan kadar pada fraksi II memperkuat literatur yang menyatakan bahwa konsentrasi enzim dapat mempengaruhi aktivitas enzim, ditandai dengan semakin banyaknya substrat yang berubah menjadi produk melalui proses enzimatis. Besarnya fold enzim dan yield enzim berturut-turut adalah 931.49% dan 90.14%, sedangkan Vmaks = -1.0940 µmol/mL.menit dan Km = -1.8818 mM. Bobot molekul diketehui melalui prediksi bobot molekul menggunakan elektroforesis dengan metode SDS-PAGE, yaitu 148.7 kDa, 121.6 kDa, dan 105 kDa.

DAFTAR PUSTAKA

Acosta N, Beldarrain A, Alonso Y. 2000. Characterization of recombinant invertase expressed in methylotropic yeasts Biotechnology and Applied Biochemistry 32: 179-187

Alexander RR, Griffiths JM. 1992. Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss.

Awwalurrizki N, Putra SR. 2009. Hidrolisis Sukrosa dengan enzim invertase untuk produksi etanol menggunakan Zymomonas mobilis [skripsi]. Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember

Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta

Bergamasco R., Bassetti FJ, Moraes FF, Zanin GM. 2000. Characterization of free and immobilized invertase regarding activity and energy of activation. Brazilian Journal of Chemical Engineering 17: 873-880

Bergamasco R, Akgol S, Bulut A, Denizli A, Yakub A.M. 2003. Covalent immobilization of inverase onto a reactive film composed of 2- hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate. Biochemical Engineering Journal 14:117- 126

Bucke C. 1987. Cell immobilization in calcium Alginate. Methods in Enzymology 135: 175-189

Cheng, WH, Im KH, Chourey PS. 1996. Sucrose phosphate synthase expression at the cell and tissue leve1 is coordinated with sucrose sink-tosource transitions in maize leaf. Plant Physiol 111 : 1021-1029.

Dinu D. 2001. Enzymatic hydrolysis of pectic acid and pectins by polygalacturonase from Aspergillus niger. Roum Biotechnol 6 (5) : 397-402.

Fayyaz A, Asbi BA, Ghazali HM, Che-Man YB, Jinap S. 1995. Kinetics of papaya pectinesterase. Jurnal of Food Chemistry 53 : 129-135.

17

Fung RW, Kamper GL, Gardner RC, MacRae E. 2003. Differential expression within an SPS gene family. Plant Sci 164:450-470

Grof CP, Huber JL, McNeil SD, Lunn LE, Campbell JA. 1998. A modified assay method show leaf sucrose phosphate synthase activity is correlated with leaf sucrose content across a range of sugarcane varieties. Aust. J. PlantPhysiol 25 : 499-502.

Hames BD, Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Company

Hasanah EN, Putra SR. 2009. Karakterisasi ekdtrak kasar enzim invertase yang dimobilisasi dengan Na-Alginat [skripsi]. Surabaya: Fakultas matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Teknologi Sepuluh Nopember.

Kim JY, Mahe A, Brangeon J, Prioul JL. 2000. Amaize vacuolar invertase , IVR2, is induced by water stress. Organ/tissue specificity and diurnal modulation of expression. Plant Physiol 124:71-84.

Koch KE. (1996) Carbohydrate modulated gene expression in plants. Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Bio. 47:509-540.

Koolman J, Rohm KH. 1994. Atlas Berwarna Dan Teks Biokimia. Wanandi SI; penerjemah. Terjemahan dari: Color Atlas Of Biochemistry. Jakarta: Hipokrates.

Lee WC, Huang CT. 2000. Modelling of mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose. Biochemical Engineering Journal 4: 217-227.

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid ke-1. Maggy Thenawidjaja; penerjemah. Terjemahan dari: Principles Of Biochemistry. Erlangga: Jakarta.

Lunn JE, Hatch MD. 1997. The role of sucrose phosphate synthase in the control photosynthate partitioning in Zea mays leaves. Aust. J. Plant Physiol 24 : 1-8.

Narita V. 2005. Saccharomyces cerevisiae Superjamur yang Memiliki Sejarah Luar Biasa. Jakarta: Pustaka Utama.

Ohto M, Onai K, Furkawa Y, Aoki E, Araki T, Nakamura A. 2001. Effect of sugar on vegetative development and floral transition in Arabidopsis Plant Physiol. 127 : 252-261.

Wiseman A. 1989. Handbook of Enzyme Biotechnology. 2nd. Edition. New York: Ellis Howard.