perbandingan metode pengujian e. coli … · bglb. ketiga metode cepat yang bisa menguji koliform...
TRANSCRIPT
1
PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN E. coli SECARA KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2010
2
PERNYATAAN MENGENAI TUGAS AKHIR DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa Tugas Akhir yang berjudul:
“Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air” adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkann dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tugas Akhir ini.
Bogor, Januari 2010
Dwi Kusuma Indriani NIM F252050045
3
ABSTRACT
DWI KUSUMA INDRIANI. Comparison of Conventional and Rapid Methods for E.coli Testing in Water Sample. Under direction of RATIH DEWANTI-HARIYADI and SUTRISNO KOSWARA.
Water is very important in food production, either as raw material for food
processing, ice production, or for sanitation purposes. Water for food processing should meet the existing regulation for drinking water quality. According to the Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 the number of Escherichia coli and fecal coliform should be negative per 100 ml sample, consecutively. E. coli testing with conventional MPN methods needs 5-7 days thus it is not appropriate for food products with short expiry date. The aims of this study were to compare the performance of conventional and rapid methods used for testing of E.coli in process water and evaluate the implication of the application of rapid methods in a yogurt industry.
The sample used in this study was process water from PT Yummy Food Utama, a yogurt and cheese industry. Total 30 samples of one litre each was taken from the process water tank outlet from 3 different days as a replication. The culture media used for the conventional methods were according to MPN of FDA/BAM and SNI methods. The culture media used for the rapid methods were Fluorocult LMX Broth (MPN), Chromocult Coliform Agar (TVC), and Readycult Coliform 100 (P/A).
The result of this study showed that rapid methods reduced the testing time of E.coli from 5-7 days to 1-2 days only with an equal performance to conventional method but more convenience to do since it reduce of tubes and petridishes needed from 195 to 2-15 only. Even the rapid media Fluorocult LMX Broth showed the best recovery rate among other medias tested. Besides, rapid methods application saved the total cost by 71% with Readycult® Coliform 100 and Fluorocult® LMX Broth; 82% with Chromocult® Coliform Agar; and the possibility to increase the production capacity per month by 22%. Key Words : Escherichia coli, chromogenic fluorogenic, rapid method
4
ABSTRAK
DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA
Air sangat penting dalam industri pangan, baik untuk bahan baku, pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum sesuai dengan peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. Pengujian E. coli dengan metode APM konvensional memerlukan waktu 5-7 hari karena itu tidak sesuai untuk produk pangan dengan masa pakai yang pendek. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama, suatu pabrik yogurt dan keju. Total 30 sampel masing-masing satu liter diambil dari kran tanki air proses dari 3 hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan adalah media sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Media kultur yang digunakan untuk metode cepat adalah Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), Readycult Coliform 100 (P/A).
Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa metode cepat mengurangi waktu pengujian E.coli dari 5-7 hari menjadi hanya 1-2 hari, dengan hasil yang sebanding tetapi lebih mudah dikerjakan karena penggunaan tabung dan cawan petri yang semula 195 buah menjadi hanya 2-15 buah saja. Bahkan media cepat Fluorocult LMX Broth memperlihatkan hasil recovery rate terbaik diantara media yang diuji. Selain itu, penerapan metode cepat dapat menghemat biaya total sampai 71% dengan media Readycult® Coliform 100 dan Fluorocult® LMX Broth; 82% dengan Chromocult® Coliform Agar; dan kemungkinan meningkatkan kapasitas produksi per bulan 22%. Kata Kunci : Escherichia coli, kromogenik fluorogenik, metode cepat
.
5
RINGKASAN DWI KUSUMA INDRIANI. Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air. Dibimbing oleh RATIH DEWANTI-HARIYADI dan SUTRISNO KOSWARA
Air sangat penting untuk industri pangan, baik untuk bahan baku, bahan
pembuat es, maupun untuk fungsi pembersihan. Air untuk proses pengolahan pangan harus sesuai dengan kualitas air minum menurut peraturan yang berlaku. Menurut Guidelines for Drinking Water Quality World Health Organization and Keputusan Menteri Kesehatan No. 907/2002 jumlah Escherichia coli dan koli fekal harus negatif per 100 ml sampel secara bersama-sama. E.coli adalah indikator keberadaan patogen enterik maupun tingkat sanitasi suatu proses/produk. Pengujian E.coli secara konvensional menggunakan metode Angka Paling Mungkin memerlukan waktu 5-7 hari. Kebanyakan industri pangan terutama untuk produk pangan dengan masa pakai pendek, memerlukan prosedur pengujian yang cepat dan mudah dilakukan karena jumlah sampel yang sangat banyak. Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan performa dari metode konvensional dan cepat dalam pengujian E.coli di sampel air; dan mengevaluasi pengaruh dari penerapan metode cepat tersebut di industri yogurt.
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah air proses dari PT Yummy Food Utama dengan produk yogurt dan keju. Total 30 buah sampel masing-masing satu liter diambil dari kran tanki air proses pada tiga hari yang berbeda sebagai ulangan. Media kultur yang digunakan untuk metode konvensional sesuai dengan metode APM dari FDA/BAM dan SNI. Metode cepat menggunakan Fluorocult LMX Broth (APM), Chromocult Coliform Agar (ALT), dan Readycult Coliform 100 (P/A). Biakan murni Escherichia coli ATCC 25922 digunakan untuk kontrol positif dan perlakuan cemaran. Penelitian ini menggunakan tiga konsentrasi cemaran bakteri dengan konsentrasi akhir pada sampel adalah 4 cfu/ml (cemaran rendah), 40 cfu/ml (cemaran sedang), dan 80 cfu/ml (cemaran tinggi).
Penelitian ini membandingkan kinerja antara metode APM konvensional dengan tiga metode cepat untuk parameter hasil pertumbuhan (recovery rate), total waktu pengujian, dan biaya biaya investasi media awal, biaya laboratorium (dari komponen biaya media per test, tenaga kerja, depresiasi, dan operasional lab), biaya gudang (dari komponen biaya tenaga kerja, depresiasi, dan operasional gudang), dan penghematan yang bisa dilakukan (biaya media, biaya gudang, bunga pinjaman bank, biaya laboratorium). Uji anova dilakukan untuk melihat perbandingan hasil pertumbuhan antara ketiga ulangan yang dilakukan pada hari yang berbeda, antara kedua metode APM dan antara metode APM konvensional dengan ALT cepat.
Pembacaan hasil APM konvensional sesuai dengan prosedur FDA/BAM dan SNI dengan tahapan dari uji penduga sampai dengan uji IMVIC. Pada metode cepat Fluorocult LMX Broth dan Readycult Coliform 100 hasil E.coli ditandai dengan warna hijau kebiruan pada media, fluoresensi dibawah lampu UV 366 nm, dan cincin merah dengan penambahan KOVAC’s indol reagent. Metode cepat dengan Chromocult Coliform Agar koloni E. coli berwarna ungu dan terbentuk warna merah bila diteteskan KOVAC’s.
6
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dengan metode APM, kontrol negatif dan sampel yang tidak dicemari mengandung <1.8 per 100 ml sementara standar air bersih untuk koliform maupun E.coli adalah negatif per 100 ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Dengan konsentrasi bakteri yang sedang dan tinggi metode ini memberikan hasil APM >1600 sehingga tidak mencerminkan nilai sebenarnya. Hasil di kedua metode APM (LST dan LMX) sebanding kecuali konsentrasi bakteri rendah dimana LMX memberikan hasil lebih tinggi, akan tetapi hasil analisis dengan anova menunjukkan tidak ada beda nyata baik antar ulangan dalam perlakuan yang sama maupun antar APM konvensional dan cepat. Kedua metode cepat lainnya yaitu ALT cepat dan P/A cepat juga memberikan hasil yang sama dengan APM konvensional maupun APM cepat. Perhitungan nilai recovery rate untuk ketiga metode kuantitif dari urutan tertinggi adalah media LMX, LST dan CCA dengan nilai 122%, 70%, dan 89%. Readycult tidak dihitung karena memberikan hasil kualitatif, akan tetapi pada dasarnya media yang digunakan adalah LMX.
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa total waktu pengujian metode APM konvensional 5-7 hari, memerlukan 195 buah tabung, dan memerlukan dua suhu inkubasi yang berbeda yaitu 35oC dan 44.5oC. Ketiga metode cepat jauh lebih sederhana karena memerlukan total waktu 1-2 hari, memerlukan 15 tabung untuk APM dan 2 cawan untuk ALT, dan inkubasi hanya dilakukan di 35oC.
Hasil perhitungan biaya investasi untuk pembelian media awal uji E.coli yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 10.813.000 sedangkan untuk uji koliform dan E.coli sebesar Rp 11.899.000 karena perlu tambahan media BGLB. Ketiga metode cepat yang bisa menguji koliform dan E.coli sekaligus memerlukan investasi media lebih rendah yaitu metode APM cepat Rp 8.119.000, metode ALT cepat Rp 4.978.000 dan investasi terkecil adalah metode P/A cepat Rp 1.309.000. Dari perhitungan biaya media per test maka yang terbesar adalah metode APM konvensional Rp 200.763, metode P/A cepat Rp 60.570, metode APM cepat Rp 57.218, dan yang terkecil metode ALT cepat Rp 7.530. Apabila dilakukan duplo maka biaya per test menjadi dua kali lipat. Apabila hasilnya koliform negatif maka biaya media terendah adalah ALT CCA kemudian APM konvensional, APM cepat dan P/A cepat.
Hasil perhitungan biaya laboratorium menunjukkan bahwa ketiga metode cepat memerlukan biaya Rp 84.309 (inkubasi 24 jam) atau Rp 168.619 (inkubasi 48 jam). Metode APM konvensional memerlukan biaya Rp 421.545 (5 hari) atau Rp 590.166 (7 hari). Total biaya gudang pada ketiga metode cepat Rp 186.803 (24 jam) atau Rp 373.607 (48 jam) sementara metode APM konvensional Rp 934.015 (5 hari) atau Rp 1.307.624 (7 hari). Penghematan total biaya yang diperoleh dengan mengganti metode konvensional dengan metode cepat untuk pengujian E.coli dalam air proses di PT Yummy Food Utama dengan model biaya produksi yogurt buah 25 adalah Rp 2.764.778 untuk Readycult®, Rp 2.791.593 untuk Fluorocult® LMX Broth dan Rp 3.189.102 untuk Chromocult® Coliform Agar, sementara kenaikan kapasitas produksi per bulan dengan pemakaian metode cepat adalah 22% atau 22 batch dari 18 batch dengan lima hari kerja seminggu.
Kata Kunci : Escherichia coli, kromogenik fluorogenik, metode cepat
7
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
8
PERBANDINGAN METODE PENGUJIAN E. coli SECARA KONVENSIONAL DAN CEPAT PADA SAMPEL AIR
DWI KUSUMA INDRIANI
Tugas Akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Profesi Teknologi Pangan Pada Program Magister Profesi Teknologi Pangan
SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2010
9
Judul Tugas Akhir : Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat pada Sampel Air
Nama : Dwi Kusuma Indriani NIM : F252050045
Disetujui
Komisi Pembimbing
Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi, MSc. Ir. Sutrisno Koswara, MSi Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Magister Profesi Teknologi Pangan
Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc Prof. Dr Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS
Tanggal Ujian: 26 Januari 2010 Tanggal Lulus: 26 Januari 2010
10
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tugas Akhir : Dr. Ir. Lilis Nuraida, MSc
11
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat rakhmat
dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang
dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan mulai bulan Mei 2008 ini
adalah ”Perbandingan Metode Pengujian E.coli secara Konvensional dan Cepat
pada Sampel Air”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir Ratih Dewanti-Hariyadi,
MSc. selaku ketua komisi pembimbing dan Ir. Sutrisno Koswara, MSi. sebagai
anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan saran. Ucapan terima
kasih juga penulis berikan kepada Ibu Dra. Sumaria Sudian Apt. Beserta seluruh
staff Bagian Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional atas izin
penggunaan laboratorium, masukan dan bimbingan yang diberikan. Disamping itu
penghargaan penulis berikan kepada Ibu Ir. Eny Zulaichah, Ibu Ir. Sri Nurfiani,
Bapak Zainul Ichwan dan seluruh staff PT Yummy Food Utama atas ijin dalam
pengambilan sampel, penggunaan laboratorium dan data pendukung lainnya.
Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktur Chemical
Division PT Merck Tbk. yang telah memberikan beasiswa serta kelonggaran
waktu selama penulis menempuh pendidikan. Yang terakhir ucapan terima kasih
kepada ayah serta seluruh keluarga atas segala doa dan dorongannya.
Penulis menyadari bahwa karya ilmiah ini jauh dari sempurna, sehingga
pada kesempatan ini juga penulis mengharapkan kritik dan saran membangun
demi menyempurnaannya. Jauh dalam lubuk hati yang paling dalam, penulis
berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2010
Dwi Kusuma Indriani
12
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pati (Jawa Tengah) tanggal 21 Desember 1966 dari
Ayah Drs. Soegono dan Ibu S. Haryati BA (Almarhumah). Penulis merupakan
anak kedua dari tiga bersaudara.
Tahun 1985 penulis lulus dari SMA Negeri Pati dan pada tahun yang sama
pula masuk UGM melalui jalur Penelusuran Minat dan Kemampuan (PMDK).
Penulis memilih Program Studi Mikrobiologi Hasil Pertanian, Jurusan Ilmu Tanah,
Fakultas Pertanian dan lulus pada tahun 1991. Selama mengikuti perkuliahan,
penulis menjadi asisten praktikum mikrobiologi dasar (1988-1990) dan praktikum
mikrobiologi pangan (1989-1990). Kesempatan untuk melanjutkan ke program
Magister Profesi Teknologi Pangan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
diperoleh pada tahun 2006 dengan beasiswa dari PT Merck Tbk.
Penulis bekerja sebagai marketing di PT Merck Tbk. Chemical Division
sejak tahun 1994 dengan jabatan terakhir Business Segment Manager for Food
and Beverages setelah sebelumnya menjabat sebagai Product Manager for
Microbiology Hygiene and Microscopy. Selama bekerja di Merck penulis
mendapat banyak pelatihan tentang mikrobiologi, monitoring higiene, HACCP
dan mikroskopi baik di dalam maupun di luar negeri. Selain itu terkait dengan
posisi di kantor, penulis bertugas memberikan pelatihan, presentasi dan seminar di
bidang mikrobiologi.
Penulis menjadi anggota Perhimpunan Mikrobiologi Indonesia, Indonesian
Food Analysis Network dan Masyarakat Standardisasi Nasional (MASTAN).
Publikasi yang sudah diterbitkan adalah buku Biosafety : Pedoman Keselamatan
Kerja di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Sakit, video Biosafety, artikel-
artikel tentang mikrobiologi dan monitoring higiene di majalah Merckimia dan
Foodreview.
13
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ............................................................................................. xiv DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xvi 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang .................................................................................... 1 1.2 Tujuan Penelitian ................................................................................ 6 1.3 Manfaat Penelitian .............................................................................. 6 1.4 Hipotesis Penelitian ............................................................................. 7
2 TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan .................................. 8 2.2 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ....................................... 10 2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum ..................................... 17 2.4 Media untuk Pengujian Bakteri koliform dan E. coli ....................... 19 2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli ........................................... 27
3 BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................ 34 3.2 Bahan dan Alat .................................................................................. 34 3.3 Metode Penelitian .............................................................................. 35 3.4 Analisa data........................................................................................ 39
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel .......................................... 41 4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan metode konvensional 41 4.3 Metode Angka Lempeng Total.......................................................... 55 4.4 Metode Presence Absence ............................. .................................. 63 4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan PA ........................................ 68 4.6 Analisa Ekonomis .............................................................................. 72
5 SIMPULAN DAN SARAN 5.1 Simpulan............................................................................................. 81 5.2 Saran .................................................................................................. 83
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 84
LAMPIRAN ........................................................................................................ 89
14
DAFTAR TABEL
Halaman
1. Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli dan koli fekal ........................................................................................... 3
2. Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 907/MENKES/SK/VII/2002 .......... 17
3. Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam untuk media deteksi E.coli dan koliform .......................................................... 26
4. Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal ................... 28
5. Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX) ....................................... 46
6. Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal bakteri 400 cfu/100 ml (rendah) ........ ............................................. 50
7. Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke LMX Broth dan Readycult® Coliform ............................................................................... 53
8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar ... 56
9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar ................ 58
10. Karakteristik beberapa bakteri dalam media Chromocult® Coliform Agar ......................................................................................................... 58
11. Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel .......................... 62
12. Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult® Coliform 100 ................................................ 65
13. Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (LST & LMX), Angka Lempeng Total (CCA) dan Presence Absence (RC) ........................................................................................ 70
14. Perhitungan biaya dan lama pengujian lengkap E.coli pada metode Angka Paling Mungkin, Angka Lempeng Total, dan Presence Absence 73
15. Analisa biaya pengujian dan gudang di PT Yummy Food Utama .......... 76
16. Perbandingan biaya total antara APM konvensional dan metode cepat .. 79
15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni dibawah lampu UV 366 nm ...................................................................... 21
2. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik menghasilkan warna tertentu pada koloni .................................................. 23
3. Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik dengan dua macam kromogen ...................................................................... 24
4. Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin....................................... 28
5. Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult® Coliform Agar (A), Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total............................................................. 30
6. Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi ................... 31
7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100 ............. 32
8. Skema penelitian ........................................................................................... 38
9. Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham ................... 42
10. Koloni bakteri E.coli di Media LEMBA (Levine EMB Agar) ..................... 44
11. Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli ........................................................... 45
12. Pertumbuhan bakteri E.coli (warna hijau) dalam media Fluorocult LMX Broth ............................................................................................................ 48
13. Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult® LMX dengan lampu UV .. 49
14. Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s ......................................................................................... 51
15. Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA .............. 55
16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult Coliform Agar ............................... 59
17. Pembentukan warna cerry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s ............................................................................. 61
18. Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar................................................................................................ 63
19. Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult® Coliform 100 ........... 64
20. Pertumbuhan bakteri koliform di media Readycult® Coliform 100 ............. 67
21. Fluoresensi dan Reaksi Indol dalam media Readycult® Coliform ................ 67
16
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Rancangan percobaan perbandingan metode APM dengan metode cepat untuk pengujian E. coli di sampel air proses ............................................... 89
2. Cara perhitungan konsentrasi awal suspensi bakteri standar dengan metode Angka Lempeng Total .................................................................... 90
3. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin Konvensional ............................. 91
4. Skema Pengujian Angka Paling Mungkin cepat dengan media Fluorocult LMX Broth .................................................................................................. 92
5. Skema Pengujian Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar ....... 93
6. Skema Pengujian Presence Absence Readycult® Coliform 100 ................... 94
7. Jumlah mikroba ter-recover dalam air proses yang dicemari bakteri E.coli, pada media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan LMX Broth ........................ 95
8. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST)........................................................................ 96
9. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth .................................................................................................. 96
10. Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan Fluorocult LMX Broth ..................................... 97
11. Perhitungan Anova Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult® Coliform Agar ......................................................................... 98
12. Tabel Angka Paling Mungkin Bakteri 100 g (ml) Seri 5 Tabung dengan 10, 1 dan 0.1 g (ml) material uji .................................................................... 99
13 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Angka Paling Mungkin ................................................................................ 100
14 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian koliform negatif dengan Metode Angka Paling Mungkin ................................................................... 101
15 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Cepat Angka Lempeng Total, dan Presence Absence .................................. 101
16 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum Peraturan Menteri Kesehatan Kesehatan 416:1990 ................................................................................... 102
17 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum WHO ............................. 102
18 Skema Pembuatan Air Proses di PT Yummy Food Utama ......................... 103
17
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Air sangat penting bagi kehidupan manusia sehari-hari maupun dalam
industri pangan. Fungsi utama dari air di industri pangan adalah sebagai bahan
baku, untuk pembuatan es, dan untuk fungsi pembersihan (BPOM, 1996; Codex,
2003). Dalam beberapa standar Internasional (Codex, EC dan WHO) maupun
standar Nasional (BPOM, Depkes) tentang kualitas air disebutkan bahwa standar
kualitas air untuk kebutuhan proses pengolahan pangan harus sesuai dengan
kualitas air minum menurut peraturan yang masih berlaku (BPOM, 1996; Codex,
2003; Depkes, 2002; EC, 1998; WHO, 2004). Codex mengacu pada persyaratan
air minum yang dikeluarkan oleh WHO sedangkan CPMB mengacu pada
persyaratan air minum sesuai Keputusan Menteri Kesehatan RI No. 907/2002
yang meliputi persyaratan kimiawi, radioaktifitas, fisik, dan bakteriologis.
Persyaratan kimiawi meliputi bahan kimia yang memiliki pengaruh langsung pada
kesehatan dan bahan kimia yang kemungkinan dapat menimbulkan keluhan pada
konsumen. List bahan kimia yang dipersyaratkan meliputi kelompok bahan-bahan
anorganik, organik, pestisida, serta desinfektan dan hasil sampingannya. Jenis
bahan kimia yang dapat menimbulkan keluhan lebih sedikit dan umumnya dalam
kadar yang lebih rendah daripada kelompok yang berpengaruh langsung pada
kesehatan. Persyaratan radioaktifitas adalah kandungan radioaktif air. Persyaratan
fisik meliputi warna, rasa dan bau, temperatur, dan kekeruhan. Persyaratan
bakteriologis meliputi kandungan Escherichia coli (E.coli) atau koli fekal dan
koliform total (Depkes, 2002).
Persyaratan bakteriologis dalam Kepmenkes 907/2002 untuk air minum
menyebutkan bahwa jumlah E. coli atau koli fekal harus nol per 100 ml sampel.
Persyaratan bakteriologis untuk air yang masuk ke sistim distribusi maupun yang
ada di dalam sistem distribusi menyebutkan jumlah E. coli atau koli fekal harus
nol per 100 ml sampel sedangkan bakteri koliform total harus nol per 100 ml
sampel. Dalam Kepmenkes 907/2002 tidak disebutkan metode apa yang harus
digunakan untuk pengujian bakteriologis tersebut (Depkes, 2002).
18
Kepmenkes 907/2002 hanya mempersyaratkan pengujian E. coli atau koli
fekal dan bakteri koliform dan tidak mempersyaratkan pengujian patogen enterik
seperti Salmonella dan bakteri patogen lainnya, karena keberadaannya bisa
menjadi indikator kualitas mikrobiologis suatu sampel air minum. Prediksi akan
kualitas mikrobiologis suatu produk atau keadaan selama proses produksi
menggunakan bakteri indikator memberikan informasi tentang kegagalan proses,
kontaminasi paska proses, kontaminasi dari lingkungan, dan kondisi umum
tingkat sanitasi dengan cara sederhana, dapat dipercaya dan cepat. Keberadaan
koliform fekal (coli fekal) termasuk E.coli di air minum menjadi indikasi bahwa
kontaminasi fekal kemungkinan telah terjadi pada air tersebut. Terjadinya
kontaminasi fekal menunjukkan resiko adanya bakteri patogen enterik lainnya
dalam sampel tersebut. Koliform fekal dan E.coli lebih cocok digunakan untuk
indikator kontaminasi fekal daripada koliform karena berasal dari fekal,
sedangkan koliform biasa ada yang berasal dari fekal dan ada pula yang dari
lingkungan (Pierson and Smoot, 2001).
Saat ini penggunaan E. coli sebagai komponen kriteria mikrobiologis suatu
produk pangan lebih memberikan keuntungan dari pada penggunaan koliform
fekal karena telah tersedianya metode pengujian E. coli secara cepat (Pierson and
Smoot, 2001). Penelitian mengenai aplikasi substrat fluorogenik dan kromogenik
dalam media (terutama media untuk E.coli dan koliform) dilakukan secara intensif
sejak tahun 1980. Hingga saat ini hasil penelitian tersebut memungkinkan
dilakukannya pengujian E.coli dan koliform secara cepat, tepat dan sederhana
(Manafi, 1996).
Media kultur yang saat ini banyak digunakan dalam standar analisa koliform
dan E.coli maupun koli fekal (Tabel 1) bisa dikelompokkan menjadi dua, yaitu
media konvensional dan media cepat. Media konvensional umumnya berdasar
pada proses fermentasi laktosa yang menghasilkan asam dan gas, yang kemudian
dikonfirmasi dengan uji biokimia atau uji IMViC. Terbentuknya asam bisa
diamati dari perubahan warna indikator yang terkandung dalam media, sedangkan
pembentukan gas diamati dengan tabung durham. Media baru yang cepat
umumnya berdasar pada deteksi keberadaan ensim spesifik pada suatu bakteri
target menggunakan susbtrat fluorogenik dan kromogenik tertentu. Reaksi
19
tersebut akan memberikan warna tertentu dan atau fluoresensi yang spesifik
sehingga bisa dijadikan identifikasi suatu jenis bakteri tertentu. Media berbasis
kromogenik dan fluorogenik dapat memberikan hasil yang lebih cepat karena
menargetkan pada enzim yang dihasilkan oleh mikroba target. Pada media
konvensional, hasil diperoleh dengan menunggu sampai terbentuk asam dan gas
dari hasil fermentasi oleh enzim yang sudah dihasilkan terlebih dahulu (Manafi,
1996).
Tabel 1 Berbagai media dan metode referensi untuk analisa koliform, E.coli dan koli fekal
Jenis analisa dalam prosedur
Jenis Media Metode Standar *** koliform E.coli koli fekal
A 1 Medium * SMWW, EPA, APHA √ Brilliant Green 2% Bile Broth (BGLB) *
SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO, USDA, SNI
√ √ √
EC Broth * SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO,USDA, SNI
√ √
Endo Broth MF * SMDP, SMWW, EPA, APHA √ Lactose Broth (LB) * SMWW, EPA, AOAC, APHA,
USDA, EP, USP √
Lauryl Sulfate Broth * SMWW, EPA, AOAC, BAM, APHA, ISO, USDA, SNI
√ √
LSB with MUG ** AOAC, BAM, APHA, SMWW, ISO
√ √
LMX Broth with MUG ** EPA √ √ MacConkey Broth * EP √ √ Presence Absence Broth * SMWW, EPA √ Readycult Coliform 100 ** EPA √ √ Chromocult® Coliform Agar **
EPA √ √
Endo Agar * SMDP, SMWW, APHA √ √ Lactose TTC Agar w/ Tergitol *
ISO √ √
Levine EMB Agar * SMWW, SNI √ √ m-Endo Agar LES * SMWW, EPA, APHA √ m-FC Agar * SMWW, EPA, AOAC √ MacConkey Agar * SMWW, EPA, EP, USP, AOAC,
BAM, APHA √ √
Violet Red Bile Agar * APHA, SMDP, IDF, BAM, ISO √ √ VRBA with MUG ** BAM, APHA √ √ *) Media konvensional **) Media cepat ***) Keterangan dari singkatan nama : International Organization for Standardization (ISO); American Public Health Association (APHA); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA-BAM), Association of Anorganic Chemistry (AOAC); Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (SMWW-APHA); Standard Methods for Examination of Dairy Products (SMDP-APHA); United State Environment Protection Agency (USEPA/EPA); European Pharmacopoeia (EP); United States Pharmacopoeia (USP)
20
CODEX CAC/GL 21 menyebutkan bahwa untuk menentukan kelayakan
konsumsi suatu pangan yang sangat mudah rusak atau pangan dengan umur
simpan yang pendek, harus dipilih (apabila memungkinkan) metode uji yang
dapat memberikan hasil sebelum pangan itu dikonsumsi atau melewati masa umur
simpannya. Selain itu juga disebutkan bahwa metode mikrobiologi yang dipilih
harus dapat dipertanggung-jawabkan dalam hal kompleksitas, ketersediaan media,
peralatan, mudah di-interpretasikan hasilnya, waktu pengujian dan biaya yang
diperlukan (Codex, 1997).
Pemilihan suatu metode analisa, selain acuan ke suatu metode standar
nasional atau internasional, yang juga menjadi faktor sangat penting adalah
kemudahan dalam melakukan pengujian, ketelitian hasil, dan kecepatan
diperolehnya hasil pemeriksaan. Dalam aplikasi untuk industri pangan, seringkali
harga media yang mahal untuk suatu metode uji yang baru bukan menjadi faktor
utama. Yang lebih penting dari harga adalah metode yang dapat memberikan
hasil yang cepat dan pengerjaannya yang praktis sehingga tidak diperlukan jam
kerja dan jumlah pegawai yang banyak untuk mengerjakannya. Selain itu, hasil
yang cepat diperoleh akan memberikan banyak implikasi ke penghematan biaya
gudang dan kecepatan waktu suatu barang bisa dilepas ke pasar, terutama untuk
produk pangan yang berumur pendek.
Kebutuhan akan metode uji cepat, khususnya untuk uji E.coli di sampel air
minum yang digunakan di industri pengolahan pangan mendorong dilakukannya
penelitian ini. Walaupun Kepmenkes 907/2002 sebagai acuan tertinggi kualitas
air minum di Indonesia tidak menyebutkan suatu metode uji yang harus
digunakan, tetapi beberapa Standar Nasional Indonesia (SNI) masih menyebutkan
penggunaan metode Angka Paling Mungkin (APM) untuk uji Koliform dan
E.coli. SNI tersebut diantaranya adalah SNI 01–2897–1992 (Cara uji cemaran
Mikroba), SNI 01–3553–2006 (Air Minuman Dalam Kemasan), SNI 01–2332-1-
2006 (Cara uji mikrobiologi – Bagian 1: Penentuan Coliform dan Escherichia coli
pada produk perikanan).
Pengujian APM SNI menggunakan media Lauryl Sulfate Broth untuk uji
penduga Koliform, Brilliant Green Bile Broth untuk uji penguat Koliform, EC
Broth untuk uji penduga E.coli, Levine EMB untuk uji penguat E.coli. Dari
21
koloni terduga di media Levine EMB Agar harus dilakukan konfirmasi
menggunakan pengecatan gram, pembentukan gas dan uji IMViC untuk yang
membutuhkan total waktu pengujian 5-7 hari. Uji SNI untuk E.coli dan Koliform
adalah adopsi dari metode FDA-BAM untuk uji yang sama (FDA, 2006). Metode
APM adalah metode yang kurang diminati di kebanyakan industri di Indonesia
karena membutuhkan waktu pengerjaan, tenaga kerja dan peralatan yang banyak.
Beberapa penelitian membuktikan bahwa metode baru yang berbasis
kromogenik dan fluorogenik mampu memberikan hasil yang setara atau lebih baik
dengan media konvensional, bahkan dengan keuntungan waktu yang lebih cepat
dan cara pengerjaan yang lebih mudah (Manafi & Rosmann. 1998; Manafi &
Rosmann. 1998; Manafi, 2000, Geissler et al. 2000; Ogden et. al. 1998; WHO,
2002). Dalam deteksi, identifikasi dan perhitungan organisme target, pendekatan
konvensional umumnya hanya menggunakan teknik tunggal, sedangkan
pendekatan lain bisa menggunakan kombinasi beberapa metode yang berbeda.
Salah satu contohnya adalah dalam identifikasi E.coli bisa menggunakan media
kromogenik yang hanya membutuhkan waktu sehari, bisa dikombinasikan dengan
teknik-teknik lain yaitu fluorogenik, mikroskopis dan laser scanning (WHO,
2002).
Benoti, et.al (2002) membandingkan antara metode standar pemeriksaan
koliform dan E.coli untuk pemeriksaan susu di Kementerian Pertanian Brazil
(MARA - Ministério da Agricultura e Reforma Agrária) dan metode baru yang
lebih cepat. Dalam penelitian itu digunakan media Brilliant Green Bile Broth
untuk Koliform dan media EC Broth/Tryptone Water untuk E.coli. Kedua media
konvensional tersebut dibandingkan dengan media cepat Fluorocult® LMX Broth
(Merck) yang bisa digunakan sekaligus untuk koliform maupun E.coli. Dalam
penelitian tersebut terbukti bahwa kedua metode tersebut memberikan hasil yang
serupa. Fluorocult® LMX mempunyai keunggulan dibandingkan media
konvensional karena lebih cepat dan lebih mudah dilakukan, sehingga cocok
untuk pengujian produk susu dengan masa pakai yang sangat pendek.
Dari uraian diatas dapat disimpulkan adanya beberapa aspek yang dapat
dipelajari dalam membandingkan metode cepat dan metode konvensional
diantaranya :
22
1. Apakah metode cepat dapat memberikan hasil pertumbuhan (growth) yang
sama dibandingkan dengan dengan metode konvensional, untuk pemeriksaan
E.coli di sampel air proses.
2. Apakah ada perbedaan total hari pengujian antara metode cepat dan metode
konvensional untuk pemeriksaan E.coli di sampel air proses.
3. Apakah ada penghematan biaya pengujian laboratorium apabila menggunakan
metode cepat.
4. Apakah ada penghematan biaya gudang apabila menggunakan metode cepat.
5. Berapa persen penghematan biaya total pengujian E.coli pada sampel air
proses dengan media cepat dibandingkan dengan metode konvensional
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan (recovery rate, waktu
pengujian, dan analisis biaya) antara metode konvensional dan cepat untuk
analisis E.coli di sampel air. Perbandingan dilakukan pada kinerja keempat
metode yang diuji terhadap: (1) hasil pertumbuhan E.coli (recovery rate); (2)
total waktu pengujian yang diperlukan masing-masing metode; (3) Analisa biaya
yang meliputi biaya pembelian media, biaya laboratorium dan biaya gudang untuk
penyimpanan barang jadi selama pengujian belum selesai; (4) penghematan yang
bisa dilakukan dengan penerapan metode cepat.
1.3 Manfaat Penelitian
Dengan hasil penelitian ini diharapkan dapat diperoleh metode alternatif
pengujian E.coli yang optimum dari segi waktu pengujian, biaya pengujian
maupun biaya penyimpanan barang jadi untuk industri pangan yang mempunyai
karakteristik produk mudah rusak dan umur pakai pendek, sehingga memerlukan
waktu pengujian mikrobiologis yang cepat.
23
1.4 Hipotesis Penelitian
Berdasarkan teori yang ada maka dapat dibuat hipotesa bahwa metode cepat
pengujian E.coli pada sampel air proses yang menggunakan medium berbasis
kromogenik/fluorogenik dapat memberikan: (1) hasil pertumbuhan yang sama
dengan medium standar konvensional; (2) metode cepat memerlukan total waktu
pengujian yang lebih pendek; (3) penggunaan metode cepat dapat memberikan
mengurangi biaya media, biaya laboratorium dan biaya gudang dingin; (4) dapat
menghemat biaya secara total .
24
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Definisi Air dalam Proses Pengolahan Pangan
Dalam Pedoman Penerapan Cara Produksi Makanan Yang Baik (CPMB),
yang dikeluarkan oleh Badan Pengawasan Obat dan Makanan, fungsi air sebagai
bahan baku dalam proses produksi pangan dibagi menjadi dua jenis. Jenis
pertama adalah air yang digunakan dalam proses pengolahan dan mengalami
kontak langsung dengan makanan, misalnya untuk mencuci bahan mentah,
merebus makanan, membuat uap untuk mengukus makanan dan lain-lain. Jenis air
ini harus memenuhi persyaratan air bersih (BPOM, 1996). Jenis kedua adalah air
yang menjadi bagian dari makanan (ingredien) misalnya untuk membuat kaldu,
larutan gula, larutan garam dan lain-lain (BPOM, 1996). Jenis air ini harus
memenuhi persyaratan air minum atau air bersih (BPOM, 1996; Codex, 2003).
Selain fungsi air sebagai bahan baku, air dalam proses produksi pangan juga
digunakan untuk pembuatan es dan untuk fungsi pembersihan. Air untuk
pembuatan es yang akan mengalami kontak langsung dengan makanan dibuat dari
air yang memenuhi persyaratan sebagai air minum (BPOM, 1996; Codex, 2003).
Air untuk fungsi pembersihan, harus disediakan air dingin dan air panas dengan
kualitas air minum (Codex, 2003). Jouve (2000) menyebutkan bahwa air yang
digunakan dalam proses produksi harus memiliki kualitas air minum (potable
water) dengan kualitas mikrobiologis yang bagus. Dalam EC 98 (1998), yang
termasuk di dalam air yang ditujukan untuk konsumsi manusia adalah air untuk
minum, memasak, mempersiapkan makanan dan kebutuhan rumah tangga lainnya,
serta air untuk kebutuhan produksi makanan.
Definisi air bersih menurut CPMB adalah air yang dipergunakan untuk
keperluan sehari-hari, yang kualitasnya memenuhi syarat kesehatan sesuai dengan
Peraturan Menteri Kesehatan RI no. 416/Menkes/Per/IX/1990 (Permenkes RI No.
416/1990) dan dapat diminum apabila telah dimasak. Air minum menurut CPMB
adalah air yang kualitasnya memenuhi persyaratan Permenkes RI no. 416/1990
dan dapat langsung diminum (BPOM, 1996). Sejak tahun 2002, khusus untuk
persyaratan air minum, tidak lagi menggunakan Permenkes RI no. 416/1990
25
(Lampiran 16) tetapi diganti dengan Keputusan Menteri Kesehatan RI No.
907/MENKES/SK/VII/2002 tentang Syarat-syarat dan Pengawasan Kualitas Air
Minum seperti pada Tabel 2 (DEPKES, 2002). Definisi air minum menurut
Kepmenkes No. 907/2002 adalah air yang didistribusikan melalui pipa untuk
keperluan rumah tangga, air yang didistribusikan melalui tangki air, air kemasan,
dan air yang digunakan untuk bahan makanan dan minuman yang disajikan
kepada masyarakat (DEPKES, 2002).
Dalam Codex CAC/RCP 1-1969, Rev.4-2003 tentang pasokan air minum
disebutkan bahwa pasokan air minum yang cukup dengan fasilitas yang memadai
untuk penyimpanan, distribusi dan kontrol suhu, harus tersedia, apabila
diperlukan,untuk memastikan keamanan pangan. Standar air minum (potable
water) harus mengacu pada edisi terakhir dari WHO Guidelines for Drinking
Water Quality, atau standar lain yang lebih tinggi (Codex, 2003). Definisi air
minum menurut WHO (2004) adalah semua air yang akan digunakan untuk
minum maupun air yang masuk dan ada di sistem distribusi air. Kandungan E.coli
atau bakteri koliform tahan panas harus negatif per 100 ml sampel air minum.
Standar WHO tersebut juga menjadi acuan untuk pembuatan standar kualitas air
minum di European Community sesuai dengan Council Directive 98/83/EC
tanggal 3 November 1998 tentang Quality of Water Iintended for Human
Consumption (EC, 1998).
Pembuatan air proses di PT Yummy Food Utama yang digunakan sebagai
sampel dalam penelitian ini mengalami berbagai tahap perlakuan untuk memenuhi
kualitas air minum yang dipersyaratkan Kepmenkes 907. Dalam Lampiran 18
bagan alir untuk tanki 3 terlihat bahwa air baku dilewatkan ke penangkap besi
(Fe) dan mangan (Mn), kemudian dinetralkan dengan filter carosek yang juga
berfungsi untuk pengatur pH ke 6.5 – 7.5. Selanjutnya adalah penyaringan secara
bertahap dengan membran filter ukuran 5µ kemudian 3µ, dan terakhir sterilisasi
dengan lampu UV. Pengujian air rutin dilakukan setiap hari Senin dan Rabu pada
7 titik sampling. Selama ini dengan pengujian setiap sangat jarang diperoleh hasil
koliform dan E.coli positif dalam air proses tersebut. Pembersihan tanki secara
rutin dilakukan setiap dua minggu, kecuali apabila ada kasus koliform positif
maka pembersihan diajukan ke hari Sabtu terdekat. Pembersihan dilakukan
26
dengan mencuci dan menggosok tanki, kemudian mengisi air sampai penuh
kembali dan mengalirkan uap panas ke dalam tanki sampai mencapai suhu 95oC.
Air yang sudah panas tersebut selain memanaskan tanki kemudian dialirkan juga
ke semua sistem distribusi yang ada.
2.2 Bakteri Indikator dalam Air Minum
Pengujian mikrobiologi pada sampel air umumnya dilakukan untuk melihat
kemungkinan terjadinya transmisi penyakit-penyakit yang dapat disebarkan oleh
air (waterborne desease). Beberapa mikrooganisme patogen yang mungkin
disebarkan melalui air (waterborne pathogen) adalah bakteri, virus dan parasit
intestinal. Bakteri patogen tersebut antara lain Vibrio cholerae, Shigella
dysentriae, Salmonella spp., Salmonella Typhi, Campylobacter jejuni.
Escherichia coli patogen (enterohaemorhagik, enterotoksigenik, enteropatogenik,
enteroinvasif), Aeromonas hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia
enterocolitica, Burkholderia pseudomallei, non-tuberculous mycobacteria, dan
Legionella spp.. Virus yang mungkin ada di air minum antara lain Adenovirus,
Norovirus dan Sapovirus, Rotavirus, Enterovirus, Poliovirus, Coxsackievirus,
Echovirus, Reovirus Adenovirus, Hepatitis A virus Hepatitis E virus, Hepatitis A
virus, Norwalk like virus, Astrovirus, Calcivirus, Epidemic non A non B
hepatitus. Sementara itu parasit intestinal yang mungkin ada di dalam air minum
antara lain Cryptosporidium parvum, Giardia lablia, Entamoeba histolytica
(Harrigan, 1998; Merck, 2004; WHO, 2006). Bahaya mikrobiologis lain yang
disebabkan oleh toksin yang diproduksi cyanobacteria (blue-green algae) seperti
Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Nodularia, Microcystis, Nostoc, dan
Clyndrospermum (Harrigan, 1998).
Keamanan suatu air minum tidak hanya berhubungan dengan adanya bakteri
patogen akibat terjadinya kontaminasi fekal saja tetapi juga bisa berasal dari
organisme lain yang tumbuh di sistem perpipaan (dalam jalur distribusi dan
penyimpanan) atau yang berasal dari sumber air itu sendiri (WHO, 2006).
Idealnya, setiap sampel air minum diuji semua organisme patogen diatas sehingga
27
didapat air minum yang benar-benar sehat. Akan tetapi pengujian patogen pada
umumnya memerlukan waktu yang lama, sulit dikerjakan dan memerlukan biaya
yang besar sehingga dirasa tidak praktis untuk dilakukan dalam monitoring rutin.
Untuk itu diperlukan suatu organisme indikator yang memenuhi kriteria tertentu,
sehingga keberadaannya memberikan korelasi yang nyata dengan terjadinya
kontaminasi fekal di air tersebut (WHO, 2006).
Istilah organisme indikator sebenarnya dapat diaplikasikan ke setiap
kelompok organisme (baik secara taksonomik, fisiologis atau ekologis) yang
keberadaan ataupun ketidak beradaannya memberikan bukti tak langsung tentang
gambaran kondisi sample tersebut dimasa lalu atau gambaran kondisinya saat ini
dari suatu hal yang tidak di-investigasi secara langsung. Yang sering digunakan
sebagai indikator adalah kelompok koliform sebagai indikasi adanya kontaminasi
fekal, walaupun bisa juga digunakan sebagai indikator kurangnya pemanasan pada
pangan yang diproses panas (Harrigan, 1998). Istilah organisme indeks (index
organism) diusulkan oleh Ingram pada tahun 1977 (Harrigan, 1998) untuk
penanda dimana kehadirannya mengindikasikan kemungkinan keberadaan
patogen-patogen dari lingkungan yang sama. Istilah organisme penanda (marker
organism), yang awalnya digunakan dalam pengujian mikrobiologis air minum,
juga sering digunakan dalam pengujian kualitas dimana Escherichia coli telah
diketahui menjadi indikasi potensi bahaya dari kemungkinan adanya bakteri
patogen intestinal (Harrigan, 1998).
Organisme indikator/indeks/marker tersebut secara universal harus ada
dalam jumlah besar di feses manusia dan hewan berdarah panas lainnya, harus
dapat dideteksi dengan metode yang sederhana dan harus tidak tumbuh di air
alami (natural water) (WHO, 2006). Selain itu organisme tersebut juga harus ada
pada saat patogen yang dituju ada, jumlahnya harus jauh lebih banyak dari
patogen tersebut, dan harus lebih tahan terhadap kondisi lingkungan atau
manipulasi proses yang diterima (Harrigan, 1998).
Organisme indikator yang umum digunakan untuk indikasi kontaminasi
fekal adalah E.coli. Beberapa metode juga menggunakan koliform fekal sebagai
alternatif untuk test E.coli (WHO, 2006). Koliform yang pada awalnya digunakan
sebagai bakteri indikator tidak selalu mencerminkan telah terjadinya kontaminasi
28
fekal karena sebagian koliform berasal dari alam. Dilain pihak, hasil uji E.coli
dan koliform yang negatif bukan jaminan tidak ada patogen dalam sampel tersebut
karena protozoa dan virus umumnya lebih tahan terhadap perlakuan klorinasi dari
pada koliform. Selain itu, pemilihan jenis bakteri indikator dan metode analisa
juga akan berpengaruh terhadap interpretasi hasil, misalnya pemilihan E.coli
untuk indikator adalah khusus untuk strain biasa karena E.coli patogen tidak akan
terdeteksi dengan metode konvensional (Harrigan, 1998). Keterbatasan tersebut
menyebabkan Organisation for Economic Co-operation and Development
(OECD) bersama WHO dalam sidangnya di Geneva 24-25 April 2002
memutuskan bahwa ada kebutuhan akan parameter mikrobiologis dan metode
yang lebih baik untuk melakukan penilaian keamanan dan monitoring suatu air
minum (WHO, 2006).
Parameter uji mikrobiologis rutin yang dilakukan untuk sampel air adalah
total bakteri heterotrofik (Heterothropic Plate Count), koliform total, koliform
fekal (tahan panas), Escherichia coli, Streptococci fekal atau Enterococci faecalis,
Clostridia atau Clostridium perfringens (Merck, 2004).
Total bakteri heterotrofik
Bakteri yang terdapat di air sebagian besar dapat dikelompokkan dalam
tiga tipe yaitu: (a) bakteri akuatik (autochthonous); (b) organisme asli tanah; dan
(c) organisme yang biasanya hidup di pencernanaan manusia dan hewan.
Kebanyakan bakteri perairan adalah Gram negatif (seperti Pseudomonas,
Flavobacterium, Cytophaga, Acinetobacter, Chromobacterium), walaupun ada
beberapa bakteri Gram positif (seperti Corynebacteria, Micrococcus, Bacillus)
yang mungkin ditemukan (Harrigan, 1998).
Beberapa bakteri akuatik sangat sulit ditumbuhkan di media biasa kecuali
di CPS medium Apabila ditumbuhkan pada medium CPS maka hasilnya akan
sepuluh kali lipat daripada pertumbuhan di Nutrient Agar atau Plate Count Agar.
Bakteri seperti ini biasanya mempunyai temperature optimal di 25oC atau kurang,
dan plate harus diinkubasi sampai 14 hari (Harrigan, 1998).
Bakteri yang hidup di tanah bisa terbawa oleh air sehingga masuk ke
badan air. Yang termasuk ke golongan ini adalah spesies Bacillus, Sterptomyces,
29
dan anggota Enterobacteriaceae yang saprofitik seperti Enterobacter. Jenis
bakteri ini umumnya hidup di temperatur optimal sekitar 25oC dan dapat tumbuh
di Nutrient Agar atau Plate Count Agar (Harrigan, 1998).
Total bakteri heterotrofik atau Angka Lempeng Total (Total Plate Count)
memberikan indikasi keseluruhan dari sumber air tanah, efikasi dari proses
pengolahan air, kebersihan, dan kesempurnaan sistem distribusi air dengan
mengukur potensi pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah air minum
diproses (re-growth/after-growth). Mikroorganisme umumnya akan tumbuh di
dalam air dan juga sebagai biofilm pada permukaan-permukaan (pipa, tanki, dll)
Jumlah total bakteri yang tinggi pada air minum yang telah diproses
mengindikasikan adanya pertumbuhan kembali mikroorganisme setelah proses
dan sebagai indikator tak langsung akan keberhasilan penghilangan patogen
selama proses tersebut. Perubahan total bakteri dalam sampel air mengindikasikan
perubahan kualitas mikrobiologis air atau kalau terjadi secara tiba-tiba merupakan
peringatan dini adanya polusi di sistem proses pengolahan air tersebut, yang
memerlukan penyelidikan segera. (Merck, 2004). Harrigan (1998) menyebutkan
bahwa kebanyakan, kondisi total bakteri yang tinggi bukan berasal dari fekal atau
pencemaran limbah tetapi dari bakteri saprofitik tanah. Walaupun tidak selalu
berarti ada patogen akan tetapi total bakteri yang tinggi dapat menyebabkan
masalah pada proses pembusukan pangan (food spoilage).
Koliform
Pengujian koliform total sudah digunakan sejak lama sebagai indikator
kualitas sanitasi secara umum. Bakteri bersifat aerob dan fakultatif anaerob,
Gram negatif, berbentuk batang, tidak membentuk spora (Harrigan, 1998; Merck,
2004). Ada yang motil dengan flagella peritrikus, ada yang berfimbria, dan ada
yang membentuk kapsul (Supardi dan Sukamto, 1999). Kemampuan membentuk
enzim β-galaktosidase dimiliki oleh 94-96% dari bakteri koliform (Harrigan,
1998; Merck, 2004). Sebagian besar bisa tumbuh dan memfermentasi laktosa
menjadi asam dan gas dalam waktu 24 jam pada temperatur inkubasi 35-37oC,
dengan adanya garam bile atau reagen selektif lainnya (Harrigan, 1998; Merck,
2004). Pertumbuhan di media agar sederhana : koloni berbentuk sirkuler dengan
30
diameter 1-3 mm, sedikit cembung, permukaan halus, tidak berwarna atau abu-
abu, jernih. Pada media MacConkey Agar dan Eosin Methylen Blue Agar : koloni
yang mampu memfermentasi laktosa akan berwarna merah muda dengan kilap
logam. Klebsiella dan Enterobacter membentuk koloni yang lebih besar dan
berlendir, sedangkan Proteus membentuk koloni yang menjalar atau swarming
(Supardi dan Sukamto, 1999).
Koliform umumnya hidup di saluran pencernakan manusia dan hewan
berdarah panas, tetapi ada juga yang berasal dari tanah dan air permukaan.
Walaupun banyak yang berasal dari fekal tetapi beberapa diantaranya adalah
bakteri heterotrofik yang dapat berkembang biak di berbagai jenis lingkungan
perairan. Yang termasuk dalam kelompok bakteri koliform adalah Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella dan Citrobacter (Merck, 2004). Menurut Supardi dan
Sukamto (1999) yang termasuk koliform adalah Escherichia coli, Edwarsiella,
Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia, Proteus, Arizona,
Providentia, Pseudomonas dan basil parakolon. .
Keberadaan koliform tidak selalu berasal dari kontaminasi fekal di sumber air
akan tetapi mungkin dari pencemaran yang terjadi saat berada di sistem
pengolahan air atau distribusi dalam sistem yang tidak baik. Adanya koliform
mengindikasikan bahwa kemungkinan air tersebut telah terkontaminasi dengan
mikroorganisme yang bisa menyebabkan penyakit. Pada umumnya koliform
bersifat non-patogen, tetapi pada kondisi khusus juga bisa menyebabkan penyakit,
terutama pada orang-orang yang peka (Merck, 2004).
Koliform fekal
Koliform fekal atau dikenal juga sebagai bakteri koliform tahan panas
adalah bakteri yang dengan adanya garam bile atau reagen selektif lainnya, bisa
tumbuh dan memfermentasi laktosa menjadi asam dan gas apabila diinkubasi pada
temperatur 44 - 45,5oC. Temperatur inkubasi dalam kisaran tersebut adalah faktor
yang kritis dan penggunaan penangas air adalah wajib (Harrigan, 1998). Koliform
fekal mempunyai probailitas lebih besar berasal dari fekal daripada koliform
biasa yang bisa berasal dari fekal atau non fekal (Pierson & Smooth, 2001).
31
Kehadirannya di air minum adalah indikasi kuat bahwa belum lama
berselang telah terjadi kontaminasi limbah atau kotoran hewan. Kelompok bakteri
yang didominasi oleh Escherichia coli dan galur-galur Klebsiella yang tahan
panas ini lebih berkaitan dengan adanya kontaminasi fekal daripada total bakteri
koliform, sehingga keberadaannya dalam air minum umumnya tidak bisa diterima
(Merck, 2004).
Escherichia coli.
Escherichia coli adalah koliform fekal yang memfermentasi laktosa,
menghasilkan gas dan asam pada suhu 35-37oC dan 44 - 45.5 oC (meliputi 90%
dari E.coli). Sifat biokimia lainnya yang digunakan untuk identifikasi secara
konvensional adalah reaksi methyl red positif, reaksi Voges-Proskauer negatif,
tidak dapat menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, dan memiliki
reaksi indol positif. Pembentukan indol terjadi karena E.coli mempunyai enzim
tryptophanase yang dimiliki oleh 99% strain E.coli yang disebut strain E.coli tipe
1 (Harrigan, 1998; Merck, 2004). Sifat enzim lain yang diketahui adalah yaitu
96% dari strain E.coli mempunyai aktifitas enzim β-D-galaktosidase (GAL) dan
enzim β-D-glukuronidase (GUD). Seperti halnya koliform fekal, E.coli dapat
dideteksi dengan menumbuhkan pada media selektif cair atau agar pada suhu
lebih tinggi (44 atau 45,5oC) menggunakan penangas air (Merck, 2004).
Escherichia coli adalah spesies dari kelompok bakteri koliform yang
biasanya menghuni usus manusia atau hewan berdarah panas. Adanya E.coli di
air minum mengindikasikan bahwa belum lama berselang telah terjadi polusi yang
berasal dari fekal (air kotor atau kotoran hewan) karena E.coli jarang berkembang-
biak di lingkungan perairan (Merck, 2004). Patogen yang lebih tahan terhadap
kondisi lingkungan atau teknologi sanitasi mungkin masih ada di air yang telah
ditreatment walaupun hasil uji E.coli negatif (Harrigan, 1998; WHO, 2006).
Dengan demikian sampel yang terdeteksi positif E.coli belum tentu masih
mengandung patogen, sebaliknya apabila di sampel tersebut ada patogen yang
lebih tahan terhadap perlakuan selama pemrosesan air daripada E.coli maka
kemungkinan hasil test E.coli akan negatif.
32
Klasifikasi E.coli dilakukan berdasarkan reaksi biokimia dan serotipenya.
Berdasarkan serotipe, E.coli bisa dibedakan atas adanya antigen somatic (O) dan
antigen flagelar (H), yaitu enteropathogenic E.coli (EPEC), enterotoxigenic E.coli
(ETEC), enteroinvasive E.coli (EIEC), diffuse-adhering E.coli (DAEC),
enteroaggregative E.coli (EAEC), dan enterohemorrhargic E.coli (EHEC).
Diantara kelompok E.coli penyebab penyakit karena pangan (foodborne illness)
dan menyebabkan sakit yang parah adalah EHEC (Meng et.al. 2001).
Walaupun E.coli merupakan bakteri yang paling banyak digunakan
sebagai indikator kontaminasi fekal tetapi kegagalan dalam mendeteksi E.coli
tidak selalu berarti bahwa tidak ada patogen enterik di sana (Pierson & Smooth,
2001).
Enterococci.
Enterococci spp. adalah bakteri gram positif, katalase negatif, berbentuk
cocci, dan biasanya tumbuh pada temperatur 45oC dalam 6,5% NaCl dan pH 9,6
(Merck, 2004). Sumber dari Enterococci adalah material fekal manusia, hewan
(berdarah panas maupun dingin) dan tanaman. Enterococci berbeda dari koliform
dalam hal ketahanannya terhadap garam (6,5% NaCl) dan relatif tahan terhadap
pembekuan. Beberapa Enterococci (Enterococcus faecalis dan E.faecium) juga
relatif tahan panas dan mungkin bisa bertahan pada suhu pasteurisasi susu
(Pierson & Smooth, 2001).
Jumlah Enterococci dalam kotoran manusia lebih sedikit daripada
koliform fekal dan E.coli dan jarang ditemukan, sehingga membatasi
penggunaannya sebagai bakteri indikator dalam proses air minum. Selain itu
Enterococci jarang tumbuh di lingkungan, lebih tahan terhadap berbagai proses
perlakuan dan disinfeksi dibandingkan bakteri koliform, coliphage dan virus
(Merck, 2004).
Di Amerika Serikat Enterococci dapat digunakan sebagai indikator untuk
melakukan monitoring kualitas air di area rekreasi pantai karena Enterococci
lebih tahan terhadap kadar garam tinggi dibandingkan dengan E.coli. Enterococci
adalah indikator efisiensi dari suatu sistem pengolahan air. Enterococci seringkali
digunakan sebagai indikator kedua untuk sampling ulangan setelah ditemukan
33
koliform atau E.coli dalam suatu sistem distribusi air. Selain itu Enterococci juga
digunakan sebagai indikator dalam monitoring rutin untuk sumber utama air yang
baru dibuat atau setelah perbaikan sistem distribusi. Test Enterococci dilakukan
untuk mendapatkan data tambahan terhadap karakteristik suatu sistem air alam
karena mereka sangat jarang bekembang biak di alam (Merck, 2004). Karena bisa
bertahan di peralatan lingkungan proses produksi dalam jangka waktu yang
panjang, maka Enterococci bisa juga digunakan untuk mengidentifikasi buruknya
kualitas pelaksanaan proses produksi (Pierson & Smooth, 2001).
Clostridia
Indikator yang terakhir adalah Clostridia dan Clostridium perfringens yang
sesuai untuk indikator survival virus dan kista protozoa di air minum, atau ookista
di air minum yang diolah (apabila sampah diduga sebagai sumber kontaminasi).
Keduanya tidak direkomendasikan untuk digunakan sebagai parameter rutin
dalam pemeriksaan kualitas air karena spora Clostridia dapat terakumulasi dan
bertahan dalam waktu yang lama di alam (Merck, 2004).
Clostridium perfringens adalah bakteri anaerobik, Gram positif, bentuk
batang berspora, berkaspula, dan non motil. Ukuran sel bervariasi tergantung jenis
media pertumbuhan, misalnya pada medium yang mengandung glukosa selnya
pendek sedang pada media sporulasi yang mengandung pati ukurannya akan lebih
panjang. Selain bisa dijadikan indikator, bakteri ini sendiri bersifat patogen
terhadap manusia dan hewan karena mampu memproduksi enterotoksin yang bisa
menyebabkan diare dan gas gangrene (Labbe, 1992)
2.3 Standar Kualitas Mikrobiologis Air Minum
Walaupun ada beberapa macam bakteri indikator untuk kualitas
bakteriologis air minum, tetapi di Kepmenkes 907/2002 yang mengatur kualitas
bakteriologis air minum di Indonesia hanya menggunakan koliform total, E.coli
(atau koli fekal). Persyaratan kualitas bakteriologis air minum maupun yang
masuk ke sistem distribusi air minum seperti pada Tabel 2, adalah harus bebas
bakteri koliform total, E. coli atau koli fekal per 100 ml sampel.
34
Tabel 2 Persyaratan kualitas bakteriologis air minum menurut Keputusan Menteri Kesehatan Republik Indonesia No. 907/MENKES/SK/VII/2002
Parameter Satuan Kadar maksimum
yang diperbolehkan a. Air Minum E. coli atau fecal coli Jumlah per 100 ml sampel 0 b. Air yang masuk sistem distribusi E. coli atau fecal coli Jumlah per 100 ml sampel 0 Total Bakteri Koliform Jumlah per 100 ml sampel 0 c. Air pada sistem distribusi E.coli atau fecal coli Jumlah per 100 ml sampel 0 Total Bakteri Koliform Jumlah per 100 ml sampel 0
Sumber: Depkes (2002)
Dalam National Drinking Primary Water Standard yang dikeluarkan oleh
United States Environmental Protection Agency, USEPA 816-F-01-007 - Office of
Water (4606) disebutkan bahwa Maximum Contaminant Level Goal (MCLG)
koliform total (termasuk koliform fekal dan E.coli ) dalam sampel air harus nol
(zero). Jumlah sampel yang mungkin mengandung koliform total (positif) tidak
lebih dari 5% dari total sampel sebulan. Untuk sistem air yang jumlah sampel per
bulannya kurang dari 40, maka jumlah sampel yang mungkin positif tidak boleh
lebih dari satu dalam sebulan. Setiap sampel yang ada koliform totalnya harus
dianalisa untuk E.coli atau koliform fekal, untuk memastikan apakah tercemar
material fekal hewan. Dari hasil pemeriksaan lanjutan tersebut mungkin saja
ternyata dalam sampel tersebut tidak terkandung E.coli atau koliform fekal. E.coli
atau koliform fekal termasuk dalam kelompok koliform total (USEPA, 2001).
Dalam WHO Guidelines for Drinking–water Quality (WHO, 2004)
disebutkan bahwa adalah tidak mungkin melakukan monitoring air minum untuk
setiap mikroba pathogen yang mungkin ada. Yang paling umum digunakan
sebagai bakteri penanda (marker organism) adalah Escherichia coli dan koliform.
Koliform adalah satu kelompok bakteri yang terdiri dari Escherichia (termasuk E.
coli), Klebsiella, Citrobacter, dan Enterobacter. Koliform sebagai organisme
indikator mengindikasikan adanya sanitasi yang buruk dari air maupun suatu
proses produksi. E. coli sebagai organisme indek mengindikasikan adanya potensi
bakteri enterik lain penyebab penyakit karena adanya kontaminasi fekal (Merck,
35
2004). Koliform berasal dari lingkungan sedangkan koliform fekal dan E. coli
berasal dari kotoran fekal hewan maupun manusia (USEPA, 2001).
Standar untuk air minum menurut KEPMENKES 907, Council Directive
98/83/EC maupun WHO adalah kandungan bakteri koliform maupun E. coli harus
negatif dalam 100 ml sampel air minum (Depkes, 2002; EC, 1998; dan WHO,
2004). USEPA (2001) mensyaratkan bahwa dalam satu bulan jumlah sampel
yang positif koliform tidak boleh lebih dari 5% dari total sampel dan untuk system
yang jumlah sampelnya kurang dari 40 per bulan maka tidak boleh lebih dari satu
sampel yang positif koliform. Semua sampel yang positif koliform harus
dianalisa E. coli atau koliform fekal (cukup salah satu) untuk menentukan apakah
ada pencemaran dari fekal manusia atau hewan.
2.4 Metode Pengujian Bakteri Koliform dan E.coli
Salah satu alasan mengapa koliform total dan E.coli paling banyak
digunakan sebagai bakteri indikator adalah karena cara pengujiannya yang relatif
mudah dan cepat. Pengujian mikrobiologis mungkin memberikan akurasi hasil
yang bervariasi karena pemilihan medium pertumbuhan dan temperatur inkubasi.
Disamping itu, kondisi asal dan umur sampel air dapat mempengaruhi spesies
yang terisolasi serta jumlahnya (WHO, 2006). Media yang digunakan untuk
pengujian koliform dan E. coli bisa media konvensional yang berbasis fermentasi
karbohidrat atau media cepat yang berbasis fluorogenik dan/atau kromogenik.
Media konvensional pada umumnya berdasarkan pada kemampuan bakteri
koliform dalam memfermentasi laktosa oleh enzim ß-D-galactosidase,
menghasilkan asam dan gas. Asam yang terbentuk akan mengubah indikator yang
ada dalam media tersebut menjadi warna tertentu, baik pada media maupun pada
koloni bakteri. Gas yang terjadi karena fermentasi laktosa akan ditangkap dengan
tabung durham pada medium cair atau akan menimbulkan rekahan di media padat.
Beberapa reaksi lain yang mungkin timbul (sesuai komposisi medianya) adalah
terbentuknya kilap logam (Endo Agar dan EMB agar) atau terjadinya presipitat
disekitar koloni pada Violet Red Bile Agar (Manafi, 1996; Merck, 2005).
Beberapa media konvensional yang umum digunakan yaitu Lactose Broth
(LB), Brilliant Green Bile 2% Broth (BGLB), Lauryl Sulfate Tryptose
36
Broth/Lauryl Tryptose Broth (LST), MacConkey Broth (MCB), MacConkey Agar
(MCA), EC Broth/Medium, Violet Red Bile Agar (VRBA), Endo Agar, Eosin
Methylen Blue Agar (EMBA), Levine EMB Agar (LEMBA), m-Endo Agar LES,
A 1 Medium, dan P-A Broth (APHA, 2005; ISO, 2004; Merck, 2005; USEPA,
2007).
Secara umum, penggunaan media konvensional untuk pengujian bakteri
indikator masih belum bisa membedakan antara bakteri laktose positif, bakteri
kelompok koliform dan bakteri E. coli. Untuk membedakannya diperlukan
tahapan identifikasi atau konfirmasi dari koloni terduga yang tumbuh di media
agar untuk isolasi. Porses identifikasi tersebut selain memerlukan waktu yang
banyak, juga memerlukan beberapa tahapan pengerjaan (Manafi, 1996).
Kebutuhan untuk mendapatkan hasil pengujian mikrobiologis secepatnya,
terutama untuk produk pangan yang masa pakainya singkat, mendorong berbagai
penelitian tentang media yang lebih cepat, praktis dan akurat. Beberapa media
baru yang sesuai dengan kebutuhan tersebut sudah mulai diterima dan diakui oleh
beberapa Lembaga Internasional seperti APHA, WHO, USEPA, ISO, dan FDA.
Umumnya media yang digunakan adalah yang menggunakan enzim spesifik
sebagai target penanda suatu mikroorganisme tertentu (APHA, 2005; ISO, 2001;
USEPA, 2007, WHO, 2002).
Suatu mikroorganisme bisa mempunyai satu atau lebih enzim yang
spesifik dan esklusif, yang dapat menggunakan substrat tertentu yang sesuai
(misalnya substrat-enzim fluorogenik dan khromogenik). Substrat tersebut
dicampurkan kedalam media (cair atau padat) yang dipergunakan untuk
menumbuhkan organisme tersebut. Penemuan substrat tersebut telah memicu
pengembangan sejumlah besar metode untuk identifikasi mikroorganisme, bahkan
untuk media isolasi awal. Penambahan substrat-enzim ini ke medium selektif
dapat menghilangkan kebutuhan untuk subkultur dan test biokimia lanjutan untuk
meyakinkan identitas suatu mikroorganisme tertentu (Manafi, 1996; Manafi,
2000).
37
Enzim
Methyl-umbelliferon
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
Fluoresensi Sinar UV 366 nm
Enzim ß-D-Glucurondase
Media Fluorogenik
Media substrat-enzim fluorogenik umumnya mengandung substrat yang
spesifik terhadap enzim tertentu (seperti gula atau asam amino) dan fluorogen
(seperti 4-methylumbelliferone), yang interaksinya dapat mengubah sinar UV
menjadi sinar yang tampak. Sebagian besar enzim-substrat yang sering digunakan
adalah coumarin (Manafi, 1996). Substrat methylumbelliferyl bersifat larut air,
sangat sensitif dan sangat spesifik. Karena sifatnya yang terpengaruh oleh pH,
terdifusi secara kuat ke media padat, dan perlu lampu UV untuk mendeteksi, maka
penggunaan substrat in menjadi terbatas. Substrat fluorogenik yang paling umum
digunakan adalah MUG atau methylumbelliferyl glucuronidase (Manafi, 2000).
Secara umum reaksi yang terjadi pada media fluorogenik tampak pada
Gambar 1. Enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang tumbuh di media
fluorogenik akan memecah ikatan komplek substrat karbohidrat dengan
methylumbelliferron. Gugus karbohidrat akan dipecah oleh enzim dan gugus
methylumbelliferil akan dilepaskan ke media. Apabila disinari dengan lampu UV
panjang gelombang 365 nm atau 366 nm akan tampak sinar fluoresen biru pada
media cair atau pada koloni terduga yang tumbuh di media agar (Manafi, 1996;
Merck, 2004; APHA, 2005).
Media
Gambar 1 Skema umum reaksi enzim-substrat Methyl-umbelliferon pada media fluorogenik menghasilkan fluoresensi pada media cair dan koloni dibawah lampu UV 366 nm
38
Media cepat yang dikembangkan dari media konvensional dengan
penambahan substrat fluorogenik MUG dapat digunakan untuk menumbuhkan,
sekaligus membedakan E.coli dari bakteri lainnya. Contoh pengembangan media
konvensional menjadi media cepat fluorogenik dari adalah media VRBA with
MUG (APHA, 2005; FDA, 2002) dan media EC Broth with MUG (APHA, 2005).
Dalam Manafi (2000) disebutkan jumlah MUG yang ditambahkan ke media
konvensional adalah 50 µg/ml (BGLB, LB, ECB, LTB), 100 µg/ml (LTB), 150
µg/ml (MCB), dan 200 µg/ml (VRBA).
Beberapa contoh media cair yang menggunakan MUG, yang tersedia
secara komersial di pasar adalah Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform,
Colilert, Coliquick, dan Colisure (Tabel 3). Selain itu beberapa contoh media
konvensional yang sudah mengandung MUG didalamnya adalah Fluorocult®
LMX broth, Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, Fluorocult® BRILA Broth,
Readycult® Coliform, Fluorocult® VRBA, Fluorocult® MacConkey Agar,
Fluorocult® E.coli O157:H7 (Merck, 2005).
Media Kromogenik
Substrate-enzim kromogenik adalah senyawa-senyawa yang bertindak
sebagai substrat terhadap suatu enzim spesifik, dan berubah warna karena kerja
dari enzim tersebut. Secara umum, berdasarkan reaksi kimianya, empat kelompok
senyawa kromogenik dapat dikenali dan dideskripsikan oleh Manafi pada tahun
1998. Turunan indolil bersifat larut air dan tahan panas sehingga bisa digunakan
di media agar. Turunan indolil yang sering digunakan antara lain: 5-bromo-4-
chloro-3-indolyl (X), 5-bromo-6-chloro-3-indolyl (magenta), atau 6-chloro-3-
indolyl (salmon), dan semuanya terbukti tidak terdifusi di agar (Manafi, 2000).
Manafi (2000) menyebutkan bahwa substrat kromogenik yang sering
digunakan adalah ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside; Salmon-GAL (6-
bromo-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); XGAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-
D-galactopyranoside); XGLUC atau BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-
glucuronide); CPRG (chlorophenol red ß-galactopyranoside); dan TTC
(Tryphenyl Tetrazolium Chloride).
39
Pada Gambar 2 terlihat reaksi umum dari enzim-substrat pada media
kromogenik. Enzim spesifik yang dilepaskan oleh suatu mikroorganisme akan
menggunakan karbohidrat dari komplek karbohidrat-indolil yang ada di media
sebagai sumber karbon. Dua gugus indolil yang lepas akan saling berikatan, dan
dengan adanya oksigen akan membentuk warna tertentu, tergantung jenis indolil
dari kromogen yang digunakan. Karena pembentukan warna memerlukan oksigen
maka ketersediaan udara yang cukup di botol atau cawan petri menjadi sangat
penting (Manafi, 1996; Manafi, 2000).
Gambar 2 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik
menghasilkan warna tertentu pada koloni.
Contoh media kromogenik yang sudah tersedia di pasar adalah yang
menggunakan X-GAL sehingga memberikan warna biru (Tabel 3) adalah
Fluorocult LMX Broth, Readycult Coliform Medium, EMX Agar, C-EC-MF Agar,
Coli ID, Rapid E.coli 2, Coli Complete, ColiBag, Pathogel, dan E.colite. Media
kromogenik yang menggunakan ONPG sehingga memberikan warna kuning
(Tabel 3) adalah Colilert dan Coliquick. Substrat CRPG memberikan warna merah
digunakan pada media Colisure. Substrat lain yang juga memberikan warna
merah adalah Salmon GAL, dan digunakan pada media Chromocult Coliform
Agar, CHROM Agar ECC, E coli /Coliforms, Coliscan, HiChrom ECC.
Enzim Indolyl
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
ikatan indolyl + O 2 ���� warna
+
O2
Glucuronide dan Galactoside
Enzim ß-D-glucuronidase dan ß-D-galactosidase
40
Media Simultan untuk Koliform dan E.coli
Baik koliform maupun E.coli sampai saat ini masih sangat penting sebagai
indikator kualitas air dan produk pangan secara umum sehingga akan sangat
berguna apabila ada suatu media yang dapat mendeteksi keduanya sekaligus
dalam waktu yang bersamaan. Beberapa percobaan telah dilakukan dan metode
baru sudah diperkenalkan yaitu yang berdasar pada deteksi enzim ß-D-
galactosidase (ß-GAL) dan enzim ß-D-glucuronidase (GUD) menggunakan
substrat fluorogenik dan/atau khromogenik (Manafi & Rosmann, 1998b). Enzim
ß-D-galactosidase (ß-GAL) yang dimiliki oleh 98% koliform (Manafi, 1995).
Enzim ß-D-glucuronidase (GUD) yang dimiliki oleh 98% E.coli dan 99% E.coli
memberikan reaksi indol positif (Manafi, 1995 dan 1996). Akan tetapi ada 3-4%
E.coli ternyata memiliki sifat MUG negatif dan GAL positif, misalnya E.coli
O157 (Merck, 2005).
Gambar 3 Skema umum reaksi enzim-substrat indolyl dalam media kromogenik
dengan dua macam kromogen.
Enzim Indolyl
Karbohidrat
Enzim
Tak Berwarna
+
O2 Chloroindigo Bromochloroindigo
Coliforms dan E.coli
E.coli
X-Gluc dan Salmon GAL (+) E.coli
Glucuronidase dan Galactosidase
Glucuronide dan galactoside
41
Media yang digunakan untuk pengujian simultan koliform dan E. coli pada
Tabel 3 ada yang mengandung dua macam substrat kromogenik, ada pula yang
mengandung kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Untuk media yang
mengandung substrat kromogenik lebih dari satu maka akan tampak dua atau
lebih warna koloni yang berbeda untuk jenis bakteri yang berbeda. Contoh dari
media tersebut adalah Chromocult® Coliform Agar, CHROM Agar ECC,
E.coli/Coliforms, ColiScan, dan HiChrome ECC (Salmon GAL-merah dan
XGLUC-violet); Coli ID dan Rapid E.coli 2 (XGAL-biru dan Salmon Glu-rose
violet); dan m-Coliblue (TTC dan XGluc (Manafi, 2000).
Contoh reaksi yang terjadi apabila menggunakan dua macam kromogen
sekaligus ada pada Gambar 3, yaitu untuk media Chromocult® Coliform Agar.
Pada gambar tersebut terlihat dua macam reaksi warna yang terjadi dari peruraian
enzim-substrat yaitu merah salmon (dari enzim Galactosidase yang dimiliki oleh
koliform dan E.coli) dan hijau torquise (dari enzim Glucuronidase yang dimiliki
oleh E.coli). E.coli menghasilkan kedua macam enzim sehingga akan terjadi
warna purple yang merupakan campuran dari merah salmon dan hijau torquise
tersebut (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005).
Dalam suatu kultur bakteri campuran, warna yang tampak untuk akan ada
empat macam, yaitu merah salmon untuk koliform (GAL positif), purple (GAL
positif dan GUD positif) untuk E.coli, hijau torquise untuk bakteri dengan sifat
GUD positif dan GAL negatif, serta koloni tak berwarna untuk
Enterobacteriaceae lainnya (Manafi, 2000; Merck, 2004; Merck 2005).
Kemungkinan kedua adalah media simultan yang menggunakan kombinasi
kromogenik dan fluorogenik sekaligus. Pada media jenis ini maka selain timbul
warna spesifik juga muncul fluoresensi apabila dilihat dibawah lampu UV 366 nm.
Media simultan yang sudah ada di pasaran antara lain tampak pada Tabel 3,
yaitu yang berbentuk media cair, berbentuk media padat, atau juga sistem lain.
Yang berbentuk media cair adalah Fluororcult® LMX Broth, Readycult coliforms,
ColiLert, Coliquick, Colisure. Yang berbentuk media padat adalah EMX –agar,
C-EC-MF-Agar, Chromocult Coliform Agar, Coli ID, CHROMagar ECC,
Rapid’ E.coli 2, E.coli/Coliforms, ColiScan, MI-agar, dan HiCrome ECC.
42
Kelompok ketiga adalah yang menggunakan sistem lain yaitu, ColiComplete,
ColiBag/Water check, Pathogel, E. colite, m-Coliblue (Manafi, 2000).
Tabel 3 Penggunaan berbagai substrat kromogenik dan fluorogenik dalam media untuk deteksi E.coli dan koliform
Medium Substrat a / Warna Manufaktur Koliform E. coli Media cair Fluororcult® LMX Broth XGAL/biru-hijau MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) Readycult Coliform XGAL/MUG MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) ColiLert ONPG/kuning MUG/fluoresen biru IDEXX (USA) Coliquick ONPG/kuning MUG/fluoresen biru Hach (USA Colisure CPRG/merah MUG/fluoresen biru IDEXX (USA) Media Padat Fluorocult® Agars - MUG/fluoresen biru Merck (Jerman) TBX Agar - BCIG/biru OXOID (UK), Merck
(Jerman)) Uricult Trio - HOQ/hitam Orion (Finnland) EMX -agar XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biotest (Jerman) C-EC-MF-Agar XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biolife (Italy) Chromocult Coliform Agar
SalmonGal/merah XGLUC/biru-violet Merck (Jerman)
Coli ID XGAL/biru SalmonGlu/rose-violet bioMerieux (France) CHROMagar ECC SalmonGal/merah XGLUC/purple Chromagar (France) Rapid’ E.coli 2 XGAL/biru SalmonGlu/purple Sanofi (France) E.coli/Coliforms SalmonGal/merah XGLUC/purple OXOID (UK), ColiScan SalmonGal/merah XGLUC/purple MicrologyLab.(USA) MI-agar MUGal/fluoresen
biru Indoxyl/biru Brenner et al. (1993)
HiCrome ECC SalmonGal/merah XGLUC/biru Union Carbide (USA)
Sistem Lain ColiComplete XGAL/biru MUG/fluoresen biru Biocontrol (USA) ColiBag/Water check XGAL/biru-hijau MUG/fluoresen biru Oceta (Kanada) Pathogel XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) E. colite XGAL/biru MUG/fluoresen biru Charm Sci.(USA) m-Coliblue TTC/merah XGLUC/biru Hach (USA) a) Singkatan: ONPG (o-nitrophenyl-ß-D-galactopyranoside); Salmon-GAL (6-bromo-3-indolyl-
ß-D-galactopyranoside); XGAL (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside); CPRG (chlorophenol red ß-galactopyranoside); XGLUC atau BCIG (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide); MUG (4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide); TTC (Tryphenyl Tetrazolium Chloride); HOQ (Hydroxyquinoline-ß-D-glucuronide) Sumber : Manafi, 2000
Beberapa aplikasi media kromogenik dan fluorogenik untuk mikrobiologi
pangan dan air adalah untuk Enterobacteriaceae, Enterococci, Staphylococcus
aureus, Clostridium perfringens, Bifidobacteria dan Lactic acid bacteria, Listeria
monocytogenes, dan Bacillus cereus. Yang paling banyak berkembang saat ini
adalah media untuk pengujian Enterobacteriaceae yang meliputi media untuk
43
koliform, E.coli, E.coli O157:H7, koliform dan E.coli secara simultan, dan
Salmonella (Manafi, 2000).
2.5 Metode Pengujian Koliform dan E. coli.
Empat metode pengujian untuk bakteri koliform dan E.coli yang paling
umum dilakukan adalah metode Angka Paling Mungkin (Most Probable Number
atau Multiple-tube Fermentation Technique), metode Angka Koliform Total
(Total Coliform Count), metode Membrane Filtrasi (Membrane Filtration
Technique), atau metode Positif/Negatif (Presence Absence Procedure) melalui
fase pendugaan–penegasan (presuptive–confirmed phase) atau test lengkap
(APHA, 2005; Merck, 2004). Setiap teknik bisa diaplikasikan dalam keterbatasan
spesifikasinya dan dengan memperhatikan tujuan pemeriksaan. Agar dapat
memberikan hasil yang valid maka diperlukan penerapan prosedur Quality
Control yang ketat (APHA, 2005). Beberapa metode acuan baik nasional maupun
internasional menggunakan beberapa metode sekaligus (Tabel 4), sehingga
pemakai dapat memilih metode yang cocok dengan jenis sampel dan situasi yang
ada di laboratoriumnya.
Tabel 4 memberikan contoh beberapa metode pengujian koliform, E.coli
dan koli fekal beserta media yang digunakan, menurut referensi ISO, APHA, FDA,
SNI, dan USEPA. USEPA tampaknya lebih cepat mengadopsi teknologi
kromogenik fluorogenik dengan mengakui penggunaan EC-MUG, LMX,
Readycult Coliform, dan Chromocult Coliform Agar.
Angka Paling Mungkin
Angka Paling Mungkin (APM) atau Most Probable Number (MPN) atau
Multiple Tube Technique adalah modifikasi dari Presence Absence Test (P/A).
Sampel yang ditambahkan dibagi ke beberapa tabung yang berbeda dengan
volume larutan sampel yang sama (Merck, 2005). Seri pengenceran tersebut
menghitung perkiraan konsentrasi mikroba dalam sampel sehingga disebut angka
paling mungkin (FDA, 2006). APM terutama cocok untuk sampel dengan
konsentrasi organisme yang rendah (<100/g), terutama susu dan air, dan untuk
44
pangan yang bahan-bahan yang terkandung di dalamnya mungkin akan
mengacaukan akurasi perhitungan koloni (FDA, 2006).
Tabel 4 Metode dan media yang digunakan dalam dalam beberapa metode referensi untuk pengujian koliform, E.coli dan koli fekal
Metode / Media Metode Standar *) Koliform E.coli Koli Fekal Metode Angka Paling Mungkin LST => BGLB dan EC Broth USEPA, FDA, APHA, SNI √ √ √ LST - MUG USEPA, FDA, APHA √ √ Fluorocult LMX, Colilert USEPA √ √ √ Metode Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform Agar USEPA, AOAC TBX Agar ISO 16649-2:2001 √ VRBA ISO 4832, FDA, APHA √ VRBA - MUG FDA, APHA √ √ Metode Membran Filtrasi m-Endo, LES-Endo, mFC, M-1 USEPA, APHA √ Chromocult® Coliform Agar, USEPA √ √ Metode Presence Absence P-A Broth => BGLB USEPA, APHA √ LST => EC Broth USEPA √ √ A-1 Broth (direct media) APHA √ Readycult Coliform USEPA *) Keterangan dari singkatan nama : International Organization for Standardization (ISO, 2001); American Public Health Association (APHA, 2005); Food and Drug Association – Bacteriological Analytical Manual (FDA, 2002); United State Environment Protection Agency (USEPA, 2007); Standar Nasional Indonesia (SNI)
Hanya mikroorganisme hidup yang terhitung dengan metode APM.
Karena bakteri di dalam suatu sampel membentuk rantai yang tidak terpisahkan
selama persiapan sampel dan pengenceran, maka APM harus diputuskan sebagai
perkiraan growth units (GUs) atau colony-forming units (CFUs), bukan sebagai
individu bakteri (FDA, 2006). Esensi dari metode APM adalah untuk
mengencerkan sampel sampai ke suatu tingkat dimana inokula di dalam tabung
akan (kadang kala, tetapi tidak selalu) mengandung organisme hidup (FDA, 2006).
Dari jumlah tabung yang ada pertumbuhan pada setiap seri pengenceran
yang dihitung akan dibandingkan ke tabel tertentu sesuai dengan jenis seri
pengenceran yang dipakai misal 3, 5, 8, dan 10 tabung (FDA, 2006). Apabila
kemungkinan jumlah organisme dalam sampel sangat rendah maka jumlah sampel
45
a.Media Lauryl Sulfate Broth (positif = gas dan keruh)
b. Media Fluorocult LMX Broth
(positif = warna hijau)
diperbanyak (10 ml atau bahkan 100 ml) kemudian ditambahkan ke medium
double strength atau dengan volume yang setara (Harrigan, 1998)
Gambar 4 Pertumbuhan E.coli dalam media Lauryl Sulfate Broth dan Fluorocult® LMX Broth pada metode Angka Paling Mungkin
Media yang umum digunakan untuk APM adalah Lactose Broth (LB) atau
Lauryl Sulfate Broth (LSB) untuk uji pendugaan koliform (presumptive coliform).
Apabila terjadi gas dan media menjadi keruh di LB/LTB seperti di Gambar 4a,
maka dilakukan uji penegasan koliform (confirmed coliform) ke media Brilliant
Green Bile 2% Broth (BGLB) dan uji pendugaan E. coli ke media EC Broth. Uji
penegasan E. coli dilakukan dengan menginokulasikan tabung EC broth positif ke
media Levine EMB Agar. Dari hasil uji penegas yang positif kemudian dilakukan
inokulasi ke medium Nutrient Agar (NA) atau Plate Count Agar (PCA) untuk
keperluan uji konfirmasi IMVIC (APHA, 2005; FDA, 2006).
Beberapa media baru yang digunakan untuk APM adalah media yang
mengandung fluorogenik, kromogenik atau keduanya. Beberapa media yang
mengandung fluorogenik misalnya EC-MUG (APHA, 2005), Fluorocult® Lauryl
Sulfate Broth, Fluorocult® Brilliant Green Lactose Broth (Merck, 2005). Media
yang lain mengandung baik fluorogenik dan kromogenik misalnya Fluorocult®
LMX Broth. Hasil uji penduga positif apabila terjadi perubahan warna media
46
menjadi hijau kebiruan, yang biasanya mulai dari bagian atas tabung seperti
tampak di Gambar 4 b (Manafi, 2000; Merck, 2004).
Angka Lempeng Total.
Angka Lempeng Total (ALT) atau Total Plate Count (TPC) merupakan
metode perhitungan bakteri dengan menggunakan agar. Beberapa media yang
umum digunakan dalam ALT adalah Violet Red Bile Agar (VRBA) dan
Fluorocult® VRBA. Metode internasional yang menggunakan VRBA antara lain
American Public Health Association (APHA), SMDP, International Dairy
Federation (IDF), US Food and Drug Administration Bacteriology Analytical
Manual (FDA-BAM), International Standardisation Organisation (ISO), (BAM,
APHA). Beberapa media kromogenik yang bisa digunakan untuk ALT misalnya
Chromocult® Coliform Agar, Chromocult® TBX Agar (APHA, 2005; FDA, 2002;
ISO, Merck, 2004).
Pada Gambar 5 terlihat pertumbuhan koliform di empat macam media
yang berbeda, yaitu Chromocult® Coliform Agar / CCA (A), Violet Red Bile Agar
/ VRBA (B), ENDO Agar / EA (C), MacConkey Agar / MCA (D). Pada CCA
(Gambar 5 A) tampak koloni warna-warni yang membedakan antara koloni
koliform warna merah salmon dan E.coli warna purple, sehingga untuk
perhitungan total koliform kedua warna tersebut dijumlahkan. Untuk media
VRBA (Gambar 5 B) baik koliform dan E.coli semua warnanya sama yaitu koloni
merah dengan presipitat disekitar koloni yang berukuran 1-2 mm. Klebsiella yang
termasuk golongan koliform dan bakteri Enterococci kadang-kadang tumbuh di
VRBA dengan bentuk koloni pink-point. Pada media Endo Agar (Gambar 5 C)
koloni koliform dan E.coli juga berwarna sama yaitu merah, hanya untuk E.coli
ada kilap logamnya. Media ke empat yaitu MCA koliform dan E.coli yang bersifat
positif laktosa akan berwarna merah dikelilingi oleh zone keruh karena presipitasi
asam bile sebagai akibat ari penurunan pH (Merck, 2005). Dari keempat media
tersebut hanya CCA yang mampu menumbuhkan sekaligus membedakan antara
koloni koliform dan E.coli, sehingga bisa digunakan sekaligus sebagai media
untuk menumbuhkan, menghitung dan media seletif.
47
Gambar 5 Pertumbuhan E.coli dalam media Chromocult® Coliform Agar (A),
Violet Red Bile Agar (B), ENDO Agar (C), MacConkey Agar (D) pada metode Angka Lempeng Total
Membran Filtrasi
Metode membran filtrasi biasanya digunakan untuk kualitas air minum
atau air lain yang memiliki kandungan mikroorganisme sangat rendah.
Keuntungan penggunaan membran filtrasi adalah volume sampel yang ditest bisa
sangat besar sehingga akurasi data lebih besar dari pada metode lain yang
sampelnya sangat terbatas. Media yang direkomendasikan oleh USEPA dan
APHA untuk pengujian ini adalah M-Endo atau LES Endo kemudian di
konfirmasi ke LTB dan BGLB untuk Standar Methods SM 9222B,C; MI Medium
Standar Methods SM 9222, m-Coliblue, Chromocult Coliform Agar, dan Coliscan
(USEPA, 2007; APHA, 2005). Hasil pengujian dengan membran filtrasi tampak
pada Gambar 6.
A B
C D
48
Gambar 6 Pertumbuhan koloni pada metode pengujian Membran Filtrasi
Kelemahan metode membran filtrasi adalah apabila sampel banyak
mengandung partikulat yang nantinya akan tertahan di membran dan berpotensi
mengganggu perhitungan koloni. Selain itu metode ini memerlukan investasi
beberapa manifold dan pompa vakum untuk pelaksanaannya. Penggunaan jenis
membran yang tepat juga akan mempengaruhi hasil karena interaksi antara bahan
kimia dari media dengan membran sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan
bakteri (Ossmer et.al, 1999).
Presence Absence.
Metode Presence Absence (P/A) untuk koliform adalah modifikasi
sederhana dari metode APM. Penyederhanaan dilakukan dengan menggunakan
satu porsi besar (100 ml) dalam botol kultur tunggal untuk mendapatkan informasi
kualitatif, yaitu ada atau tidaknya koliform. Hal ini dijustifikasi oleh teori yang
ada bahwa dalam 100 ml sample air minum tidak boleh ada koliform sama sekali.
Metode ini juga memungkinkan untuk dilakukannya. Metode P/A membuka
kemungkinan untuk dilakukannya screening lanjutan untuk bakteri-bekteri
indikator lain (koliform fekal, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas,
Streptoccus fekal, dan Clostridium). Kelebihan lain adalah kemampuan dalam
menganalisa jumlah sample yang lebih besar per satuan waktu pengujian (APHA,
2005).
49
Inokulasi sampel
Koliform negatif
(being atau keruh
Koliform positif (warna hijau
kebiruan)
E.coli positif (warna hijau , Fluoresensi positif, indol positif)
Gambar 7. Metode Presence Absence menggunakan Readycult Coliform 100
Metode P/A umumnya digunakan untuk sampel dengan kualitas
mikrobiologis yang sangat bagus dimana keberadaan mikroorganisme mustahil
ada atau seharusnya tidak boleh ada, misalnya tidak boleh adanya (negatif)
koliform dan E.coli di sampel air minum. Kelemahan dari metode ini adalah
apabila hasilnya positif maka tidak ada informasi (kuantitatif) tentang tingkat
kontaminasi yang terjadi. Sensitifitas dari metode ini sangat tergantung pada
jumlah sampel yang dianalisa. Untuk air minum umumnya menggunakan sampel
100 ml, sedangkan untuk air minum yang dikemas maka sampel yang digunakan
adalah 250 ml (Codex, 2003; WHO, 2002).
Studi komparasi dengan metode membran filtrasi mengindikasikan bahwa
P/A bisa memaksimalkan deteksi koliform di sample yang mengandung macam-
macam organisme yang dapat menutupi (overgrow) koloni koliform dan
menyulitkan deteksi. Apabila hasilnya positif maka dianjurkan untuk diuji ulang
dengan metode kuantitatif untuk menghitung jumlah koliformnya yang akan
memberikan indikasi tingkat kontaminasi air (APHA, 2005). Gambar 7
memberikan contoh metode P/A menggunakan media Readycult Coliform dengan
pembacaan hasil yang sama dengan media LMX yaitu warna hijau kebiruan untuk
koliform positif, dan E.coli positif warna hijau fluoresensi dan indol (Merck,
2005; Manafi and Rossman, 1998).
50
III. BAHAN DAN METODE
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pusat Pengujian Obat
dan Makanan Nasional Badan Pengawasan Obat dan Makanan. Waktu penelitian
adalah tanggal 12 Mei 2008 sampai dengan 30 Juli 2008.
3.2 Bahan dan Alat
Dalam penelitian ini digunakan bahan penelitian berupa air proses yang
dari PT Yummy Food Utama. Pengambilan air proses sebanyak 1 liter dilakukan
pagi hari dengan 10 botol laboratorium steril ukuran satu liter. Sampel diambil
dari kran tanki air proses yang digunakan untuk proses pencucian dan bahan baku
produksi yogurt. Sampel air dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Pusat
Pengujian Obat dan Makanan Nasional (PPOMN) Badan Pengawasan Obat dan
Makanan di Jl. Percetakan Negara No. 23, Jakarta Pusat. Sampel dibawa dalam
keadaan dingin menggunakan coolbox dengan icepack.. Larutan Butterfield
Phophat Buffer steril digunakan untuk pembuatan kontrol positif. Sebagai baku
mutu bakteri digunakan biakan murni Escherichia coli ATCC 25922 yang
disimpan dalam cryobank dan disimpan dalam freezer -20oC.
Media dan reagen yang digunakan dibagi menjadi empat kelompok yaitu :
(1) media untuk metode pengujian Angka Paling Mungkin (APM) konvensional,
(2) media untuk metode pengujian Angka Paling Mungkin (APM) cepat, (3)
media untuk metode pengujian Presence Absence cepat, dan (4) media untuk
metode pengujian Angka Lempeng Total (ALT) cepat .
Kelompok pertama yaitu metode Angka Paling Mungkin (APM)
konvensional menggunakan media Lauryl Sulphate Tryptose Broth (LST) untuk
uji penduga Koliform, EC Broth (ECB) untuk uji penduga E.coli, LEVINE EMB
Agar (LEMBA) untuk uji penegas E.coli , Nutrient Agar (NA) untuk pembuatan
agar miring, MR-VP Broth Base (MRVP) untuk uji methyl red (MR) dan voges
preskauer (VP), SIMMONS Citrate Agar untuk uji sitrat, dan Tryptone Water
untuk uji indol. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi KOVAC’S indole
reagent untuk test indole, pereaksi Methyl Red untuk test MR, dan pereaksi Voges
Preskauer untuk test VP. Kelompok kedua yaitu metode APM cepat menggunakan
51
media Fluorocult® LMX Broth. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi
KOVAC’S indole reagent untuk test indole. Pengamatan fluoresensi
menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 366 nm.
Untuk metode ALT cepat yang merupakan kelompok ketiga digunakan
media Chromocult® Coliform Agar (CCA), dan pereaksi KOVAC'S indole
reagent untuk mengkonfirmasi pembentukan indol oleh koloni E.coli. Kelompok
keempat adalah metode Presence Absence cepat menggunakan media Readycult®
Coliforms 100, pereaksi KOVAC'S indole reagent dan lampu UV 366 nm untuk
pengujian fluoresensi. Semua media dan pereaksi menggunakan produk Merck
KGaA-Germany.
Peralatan yang digunakan adalah inkubator 35-37oC, tangas air, otoklaf,
kabinet keamanan biologis kelas II, laminar air flow, lemari pendingin, neraca,
lampu UV 366 nm, cawan petri, tabung reaksi, gelas beaker, botol laboratori,
erlenmeyer, tabung durham, pipet ukur, pipet tetes, jarum inokulasi, jarum ose,
dan lampu bunsen.
3.3 Metode Penelitian
Dalam penelitian ini dilakukan beberapa tahapan kerja yaitu: (1) persiapan
inokulum, (2) persiapan sampel yang di-inokulasi dengan E.coli ATCC 25922, (3)
Inkubasi dan pembacaan hasil pertumbuhan, (4) perhitungan hasil. melakukan
analisa pertumbuhan, menghitung recovery rate, menghitung waktu analisa, dan
menghitung biaya yang digunakan.
3.3.1 Persiapan inokulum bakteri dan sampel
Kultur bakteri yang akan dipergunakan diambil dari cryobank dan
diremajakan menggunakan media Brain Heart Infusion Broth (BHIB) sebelum
digunakan. Untuk perhitungan jumlah sel dalam stok suspensi, satu ml suspensi
kultur dari BHIB yang sudah berumur 24 jam dibuat seri pengenceran sampai 10-9
menggunakan Peptone Dilution Fluid (PDF). Dari masing-masing pengenceran
diambil satu ml dan ditanam di cawan petri yang berisi Plate Count Agar (PCA)
yang telah ditambahkan TTC (Triphenyl Tetrazolium Cloride) 1%, dengan
metode cawan tuang. Penambahan TTC dilakukan untuk memudahkan
52
perhitungan koloni karena warna koloni menjadi merah. Sambil menunggu hasil
perhitungan, stok suspensi bakteri tersebut disimpan dalam lemari pendingin.
Stok suspensi ini selanjutnya akan digunakan untuk melakukan cemaran ke
sample air proses maupun pembuatan kontrol positif dengan larutan PDF.
Sampel air proses diambil dari PT Yummy Food Utama pada pagi hari
dengan menggunakan botol laboratori steril ukuran 1000 ml. Sampel air disiapkan
sebanyak 8 botol untuk 4 macam perlakuan dengan masing-masing dua ulangan.
Semua sampel dibawa dalam cool box dengan ice pack untuk menjaga agar tetap
dingin selama perjalanan ke Laboratorium PPOMN. Pengambilan sampel dan
pengujian dilakukan dalam tiga periode yaitu tanggal 18 Mei (sampel 1), 3 Juni
(sampel 2), dan 26 Juni 2008 (sampel 3) sesuai dengan tanggal pengujian.
Dari 8 botol sampel air proses tersebut 6 botol sampel digunakan untuk
perlakuan sampel + cemaran dengan 3 konsentrasi cemaran, masing-masing dua
ulangan yaitu S1C dan S2C. Dua botol sampel air proses lainnya digunakan
untuk perlakuan sampel tanpa cemaran (dua ulangan S1 dan S2). Sebagai kontrol
positif yaitu perlakuan cemaran digunakan larutan PDF steril sebanyak 1 liter
dengan dua ulangan yaitu C1 dan C2. Masing-masing ulangan dibuat duplo.
Sampel air proses dan larutan PDF steril yang akan dicemari tersebut dituang
secara aseptis (di dalam Laminar Air Flow) kedalam tabung erlenmeyer steril
ukuran dua liter dan diinokulasi dengan suspensi bakteri standar yang sudah
disiapkan.
Dalam penelitian ini digunakan tiga konsentrasi bakteri E. coli pada setiap
sampel sedemikian rupa sehingga konsentrasi akhir pada sampel yang akan
diinokulasikan ke media adalah konsentrasi rendah (< 10 cfu/ml), konsentrasi
sedang (10-50 cfu/ml), dan konsentrasi tinggi (50-100 cfu/ml). Untuk membuat
sampel ber E.coli rendah (<10 cfu/ml) diambil satu ml dari pengenceran 10-6
dengan konsentrasi bakteri sebesar 4.103 kemudian diinokulasikan ke 1000 ml
larutan PDF steril dan 1000 ml sampel air proses, sehingga diperoleh sampel ber
E.coli 4 cfu/ml. Dengan cara yang sama dibuat sampel ber E.coli 10-50 cfu/ml
dari satu ml dari pengenceran 10-5 dengan konsentrasi sebesar 4.104 cfu/ml
sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 40 cfu/ml. Untuk
membuat sampel ber E.coli 50-100 cfu/ml diambil dua ml dari pengenceran 10-5
53
sehingga diperoleh konsentrasi sel pada sampel sebesar 80 sel/ml. Setelah di
gojog sampai homogen, semua jenis sampel diatas tersebut diambil masing-
masing 10 ml dan dimasukkan ke tabung steril 20 ml yang sudah disiapkan. Dari
perhitungan yang dilakukan saat pembuatan inokulum maka konsentrasi akhir dari
sample adalah 4 cfu/ml (rendah), 40 cfu/ml (sedang), dan 80 cfu/ml (tinggi).
3.3.2 Inokulasi sampel
Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium untuk membandingkan
empat macam metode pengujian bakteri E coli di sampel air. Keempat metode
pengujian tersebut adalah metode Angka Paling Mungkin konvensional, metode
APM cepat, metode Angka Lempeng Total cepat dan metode Presence Absence
cepat. Skema penelitian dan urutan kerja bisa dilihat dalam Gambar 8.
Yang pertama adalah analisa APM konvensional yang menjadi standar
pengujian Koliform dan E.coli di SNI dan FDA (FDA, 2006; SNI, 1992 dan
2006b). Yang kedua adalah metode APM cepat menggunakan media baru yang
mengandung substrat fluorogenik kromogenik yang sudah diakui oleh USEPA
(USEPA, 2001 dan 2007). Kedua metode APM ini menggunakan seri lima
tabung yaitu dengan jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0,1 ml dengan demikian total
sampel yang dianalisa tiap set seri pengenceran adalah 55,5 ml. Sesuai dengan
jumlah inokulum/sampel yang digunakan, maka volume media broth yang
digunakan untuk jumlah sampel 10 ml adalah 10 ml media broth LST atau LMX
double strength. Untuk jumlah sample 1 ml digunakan media 5 ml - single
strength dan jumlah sampel 0.1 ml digunakan media 5 ml - single strength
(APHA, 2005).
Pada metode APM konvensional, apabila didapat hasil positif gas pada
media LST setelah inkubasi 48 jam maka dilakukan inokulasi ke media EC Broth.
Setelah inkubasi 48 jam di media EC Broth, setiap tabung yang positif gas
(terduga E.coli) akan digores ke media Levine EMB Agar. Koloni terduga E.coli
adalah koloni warna pink dengan kilap logam. Beberapa koloni terduga
diperbanyak dengan Nutrient agar miring untuk dilakukan konfirmasi dengan uji
IMVIC’s. Pada metode APM cepat dengan media Fluorocult LMX Broth, tabung
54
yang diduga mengandung Koliform (termasuk E. coli) akan berubah warna
menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan dengan UV lamp 366 nm
untuk melihat fluoresensi dan penambahan KOVAC’s untuk melihat cincin merah
dari reaksinya dengan indol yang ada.
Gambar 8 Skema penelitian.
Metode ketiga adalah metode Presence Absence menggunakan media
kromogenik fluorogenik siap pakai, Readycult® Coliforms 100 (RC) dengan
sampel sebesar 100 ml. Botol yang diduga mengandung Koliform (termasuk E.
coli) akan berubah warna menjadi hijau kebiruan. Konfirmasi E.coli dilakukan
dengan UV lamp 366 nm untuk melihat fluoresensi dan penambahan pereaksi
KOVAC’s untuk melihat cincin merah dari reaksinya dengan indol yang ada.
Pada metode ini, karena sangat sensitif maka hanya dilakukan untuk sampel air
Sampel air + suspensi bakteri E. coli konsentrasi
0, 4, 40, 80 cfu/ml
metode cepat Angka Paling
Mungkin
Fluorocult LMX Broth
metode cepat Presence Absence
*)
Readycult
Coliform 100
Warna media hijau kebiruan, fluoresensi (+),
indol (+)
Warna koloni purple/ungu
Indol (+)
*) hanya untuk sampel ber E.coli rendah dan sampel air proses saja.
metode cepat Angka
Lempeng Total
Chromocult® Coliform Agar
Uji IMVIC’s
Nutrient Agar miring
Sampel air tanpa penambahan bakteri
E. coli
metode konvensional Angka Paling
Mungkin
Lauryl Sulphate Tryptose Broth (gas +)
EC Broth (gas +)
Levine EMBA (kilap logam pada koloni
merah muda)
Suspensi bakteri E. coli dalam Phosphat Buffer steril konsentrasi
0, 4, 40, 80 cfu/ml
55
yang tidak dicemari dan sampel yang dicemari E. coli dengan kadar bakteri
rendah (4 cfu/ml).
Metode keempat adalah metode Angka Lempeng Total menggunakan teknik
cawan tuang dengan sampel 1 ml. Media yang digunakan adalah media cepat
kromogenik Chromocult® Coliform Agar (CCA). Koloni E. coli pada media CCA
akan berwarna ungu. Konfirmasi dilakukan dengan meneteskan pereaksi
KOVAC’s pada koloni terduga hingga terbentuk warna merah disekitar koloni
3.4 Analisa Data.
Perbandingan antar metode pengujian dilakukan untuk : (1) evaluasi data
hasil pengujian; (2) ketepatan hasil perhitungan pertumbuhan (recovery); (3) total
waktu (hari kerja) yang diperlukan dihitung dari persiapan media sampai
pembacaan hasil; (4) biaya yang dikeluarkan untuk keperluan media pengujian,
biaya laboratorium, dan biaya gudang selama produk menunggu hasil uji selesai.
Perhitungan biaya menggunakan asumsi biaya yang dikeluarkan oleh PT Yummy
Food Utama untuk produk yogurt buah 250 mg.
Analisis pertama yaitu evaluasi data pengujian dengan membandingkan
hasil pengujian E.coli dari keempat metode yang diuji. Hasil diperbandingkan
antara sampel ber E. coli rendah, sedang, tinggi dan sampel yang tidak dicemari.
Analisa kedua adalah perhitungan recovery rate media dilakukan untuk melihat
seberapa bagus suatu media dalam menumbuhkan sejumlah tertentu bakteri yang
diinokulasikan. Jumlah bakteri yang terhitung di sampel positif dibagi dengan
jumlah bakteri yang terhitung di kontrol positif (larutan PDF). Rumus recovery
rate dapat dilihat dibawah, dimana kontrol positif harus hidup seluruhnya dan
sampel negatif bisa positif dan bisa negatif.
% Recovery (R) = (A/C) x 100%
A : jumlah bakteri terhitung di sampel positif
C : jumlah bakteri terhitung di kontrol positif
56
Analisa ketiga dilakukan untuk melihat total waktu maksimal yang
diperlukan untuk melakukan pengujian E.coli pada sampel air dengan asumsi
hasilnya positif E.coli. Waktu inkubasi yang digunakan sebagai perhitungan
adalah 48 jam setiap tahap karena dengan 24 jam beberapa sampel masih negatif.
Uji dianggap selesai setelah dilakukan uji konfirmasi pada setiap metodenya.
Analisa keempat adalah perhitungan biaya yang dikeluarkan untuk setiap
metode pengujian. Biaya yang dihitung adalah (a) biaya investasi pembelian awal
semua media yang dibutuhkan dan biaya media per sampel (cost per test) untuk
setiap metode sampai ke uji konfirmasi yang disarankan; (b) biaya operasional
laboratorium (personel dan peralatan) untuk pengujian E.coli dan (c) biaya gudang
yang dikeluarkan karena barang belum dapat dijual sebelum pengujian E.coli
selesai dilakukan. Dari semua perhitungan biaya tersebut dihitung penghematan
yang dapat dilakukan dengan penggunaan media cepat. Penghematan dihitung
dengan mengurangi total biaya yang dikeluarkan apabila menggunakan metode
konvensional dengan biaya yang dikeluarkan apabila menggunakan metode cepat.
57
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persiapan Inokulum Bakteri dan Sampel
Untuk persiapan inokulum, bakteri standar yang digunakan adalah E.coli
ATCC 25922 dari kultur stok yang disimpan dengan cryobank (MAST
Diagnostics) pada freezer -20oC, dengan demikian diharapkan sifat-sifat biokimia
bakteri tersebut tidak berubah. Pada tahap penghitungan konsentrasi suspensi
bakteri standar digunakan media PCA yang ditambahkan TTC 1% untuk
memudahkan pengamatan koloni. TTC memberi warna merah pada koloni yang
disebabkan oleh pembentukan zat warna (dye) formazan merah (Merck, 2005).
Dari hasil perhitungan matematis diperoleh data konsentrasi sampel yang di-
inokulasi bakteri E.coli dengan konsentrasi cemaran rendah 4 cfu/ml, cemaran
konsentrasi sedang 40 cfu/ml dan cemaran konsentrasi tinggi 80 cfu/ml. Hal ini
secara teori telah sesuai dengan standar persiapan cemaran untuk validasi media
yaitu rendah <10 cfu/ml, sedang 10-50 cfu/ml dan tinggi 50-100 cfu/ml.
4.2 Pengukuran Angka Paling Mungkin dengan Metode Konvensional
Metode APM yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu
metode APM konvensional dan metode APM cepat dengan media fluorogenik-
kromogenik. Metode APM bisa menggunakan seri 3 tabung, seri 5 tabung, seri 8
tabung atau seri 10 tabung (FDA, 2006). USEPA (2001) dan APHA (2005)
menggunakan total volume sample 100 ml untuk air minum, bisa dalam bentuk 10
ml x 10 tabung, 20 ml x 5 tabung atau 100 ml x 1 tabung. Untuk air yang bukan
air minum maka digunakan APM seri 5 tabung – 3 seri pengenceran dengan
jumlah sampel 10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml. Dalam penelitian ini digunakan seri 5
tabung karena walaupun sampelnya berkualitas air minum tetapi ada dicemari
dengan bakteri dalam jumlah yang banyak.
Volume media broth yang digunakan adalah 10 ml (double strength), 5 ml
(single strength) dan 5 ml (single strength). Penggunaaan double strength pada
media 10 ml karena tabung tersebut akan diinokulasi dengan sampel sejumlah 10
ml juga ( APHA, 2005, Merck 2005). Perbandingan antara volume sampel dan
58
volume media akan menentukan konsentrasi media cair yang harus dibuat
sehingga konsentrasi akhir diharapkan sesuai dengan kebutuhan bakteri (single
strength).
Metode APM konvensional dimulai dengan media Lauryl Sulfate Tryptose
Broth (LST) sebagai uji penduga (presumtive) Koliform. Media LST ini
mengandung laktosa yang akan difermentasi oleh bakteri Koliform sebagai
sumber karbon. Bakteri Koliform dikenal sebagai bakteri yang dapat
memfermentasi laktosa, menghasilkan gas dan asam (Merck, 2004; Merck, 2005;
Harrigan, 1998). Gas yang dihasilkan dari fermentasi tersebut ditampung dalam
tabung durham dan terlihat sebagai gelembung yang dapat mengangkat tabung ke
atas apabila jumlahnya cukup banyak seperti pada Gambar 9. Adanya gas dalam
tabung durham dan kekeruhan media menunjukkan bahwa tabung tersebut diduga
positif Koliform (Merck, 2005; Merck, 2004; Harrigan, 1998).
Gambar 9 Pertumbuhan bakteri E.coli dalam media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang ditunjukkan dari kekeruhan dan gas pada tabung durham
Dari tabung LST positif tersebut diambil 1 ml dan dikonfirmasikan dengan
menginokulasikan ke media kedua untuk uji penguat. Dalam tahap kedua ini
biasanya digunakan dua macam media yaitu media Brilliant Green Lactose Bile
59
2% Broth (BGLB) untuk uji Koliform dan media EC Broth untuk uji E.coli. Hasil
positif dari kedua media tersebut juga ditandai dengan terbentuknya gas di tabung
durham yang merupakan hasil fermentasi laktosa dan kekeruhan media (Harrigan,
1998; Merck, 2004; Merck 2005; SNI, 2006). Dalam penelitian ini karena hanya
menguji bakteri E.coli saja maka hanya digunakan media EC Broth sebagai media
kedua. Apabila hasil tabung EC Broth positif maka diambil satu ose dan
digoreskan ke Levine EMB Agar (LEMBA) untuk uji penegasan.
Koloni E.coli di LEMBA memberikan ciri yang khas (typical) yaitu hitam
pada bagian tengah dengan atau tanpa hijau metalik, seperti tampak pada Gambar
10 (SNI, 2006). Dalam Manual Microbiology Merck disebutkan bahwa koloni
E.coli di LEMBA berdiameter 2-3 mm, kilap logam yang kehijauan dalam cahaya
yang dipantulkan dan gelap atau bahkan hitam dibagian tengah dalam cahaya
yang diteruskan (Merck, 2005). Enterobacter dalam media LEMBA ini sangat
mirip dengan E.coli hanya ukuran koloninya yang lebih besar (4-6 mm), abu-abu
kecoklatan dibagian tengah, tanpa kilap logam (Merck, 2005).
Karena E.coli tidak selalu memunculkan kilap logam di LEMBA maka
apabila kilap logam itu tidak muncul akan susah untuk membedakannya dengan
Enterobacter (SNI, 2006). Adanya kemungkinan kesalahan ini menyebabkan
diperlukannya uji konfirmasi pada koloni terduga dengan uji biokimia (IMViC).
Lima koloni terduga digoreskan ke Plate Count Agar miring kemudian
diinkubasikan 18-24 jam untuk setiap tabung yang terbukti positif setelah diuji
IMViC akan dihitung sebagai tabung positif E.coli (Merck 2005; SNI, 2006).
Dalam SNI (2006), selain uji IMViC tersebut dilakukan juga uji pembentukan gas
di medium LST dan uji morfologi dengan pengecatan gram.
Uji IMViC adalah uji konfirmasi untuk E.coli yang terdiri dari uji Indol, uji
Methyl Red (MR), uji Voges Preskouer (VP), dan uji Citrat. Uji indol dilakukan
dengan menginokulasikan kultur murni ke media Tryptone Water yang
mengandung asam amino L-trypthopan. Trypthophan akan dipecah oleh enzim
trypthophanase yang dimiliki oleh 99% E.coli menjadi indol yang akan bereaksi
membentuk cincin merah pada bagian atas broth bila ditetesi reagen KOVAC’s.
60
Gambar 10 Koloni E.coli dengan kilap logam di Media LEMBA (Levine EMB Agar)
Uji MR dan VP dilakukan dengan menginokulasikan kultur murni ke dua
tabung kecil yang berisi 5 ml media MR-VP Broth Base. Pada uji MR setelah
inkubasi, ditambahkan lima tetes larutan indikator methyl red dan dilihat
pembentukan warna merah. Pada uji VP setelah inkubasi ditambahkan 0.6 ml
larutan alpha naphtol dan 0.2 ml reagen larutan KOH, warna merah yang
terbentuk menunjukkan hasil positif. Uji citrat untuk E.coli menunjukkan hasil
negatif yang ditunjukkan oleh warna media agar tetap hijau (Merck, 2005; SNI,
2006). Hasil reaksi IMViC pada bakteri E.coli tampak pada Gambar 11.
Pada penelitian ini, jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi
rendah adalah 40 sel (pada inokulum 10 ml), 4 sel (pada inokulum 1 ml), dan 0.4
sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi
sedang adalah 400 sel (pada inokulum 10 ml), 40 sel (pada inokulum 1 ml), dan 4
sel (pada inokulum 0.1 ml). Jumlah sel akhir per tabung APM untuk konsentrasi
tinggi adalah 800 sel (pada inokulum 10 ml), 80 sel (pada inokulum 1 ml), dan 8
sel (pada inokulum 0.1 ml). Dari hasil tersebut terlihat bahwa setelah inkubasi
semua tabung akan selalu positif kecuali pada inokulum 0.1 ml pada konsentrasi
pengenceran rendah.
61
Gambar 11 Hasil uji IMViC untuk bakteri E. coli
Dalam Tabel 5 (lebih lengkapnya bisa dilihat di Lampiran 7) terlihat bahwa
pada konsentrasi bakteri rendah dan sedang masih ada tabung yang negatif tetapi
untuk konsentrasi bakteri tinggi semua tabung adalah positif. Hasil AMP sesuai
namanya yaitu Angka Paling Mungkin atau Most Probable Number adalah
estimasi dari kisaran yang luas suatu kemungkinan konsentrasi menggunakan seri
pengenceran yang diinkubasi pada beberapa pengenceran. Tabel APM yang paling
mendekati jumlah sebenarnya dengan tingkat kepercayaan 95% diperbaiki oleh
De Man pada tahun 1983 (FDA, 2006).
Apabila dilihat dari konsentrasi bakteri rendah adalah 4 sel/ml tetapi setelah
dinokulasikan per tabung maka yang berkemungkinan negatif adalah tabung
dengan konsentrasi bakteri rendah pada inokulum 0.1 ml. Dalam tabung ini
perkiraan jumlah sel adalah 0.4 sel/tabung atau dari setiap 10 tabung yang di
inokulasi terdapat 4 tabung positif (minimal berisi satu sel) apabila sel
terdistribusi sempurna. Adanya tabung negatif pada pengenceran 0.1 terlihat pada
Lampiran 7, baik untuk tabung LST mapun LMX.
Indol (+)
MR (+)
VP (-)
Citrat (-)
62
Tabel 5 Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (Lauryl Sulphate Tryptose & LMX)
Sampel Kontrol positif
(cfu/100 ml) Sampel ber E. coli
(cfu/100 ml) Jenis Media Ulangan
Air Proses
Rendah*
Sedang*
Tinggi*
Rendah*
Sedang*
Tinggi*
1 <1.8 240 >1600 >1600 240 >1600 >1600 2 <1.8 245 >1600 >1600 390 920 >1600 3 <1.8 395 >1600 >1600 150 >1600 >1600
Lauryl Sulphate Tryptose
Broth Rerata <1.8 293 >1600 >1600 260 >1600 >1600 1 <1.8 240 >1600 >1600 390 >1600 >1600 2 <1.8 260 >1600 >1600 390 1600 >1600 3 <1.8 295 >1600 >1600 295 1600 >1600
Fluorocult LMX
Broth Rerata <1.8 265 >1600 >1600 358 >1600 >1600
Catatan : * Rendah : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi awal bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Dalam Tabel 5 dan Lampiran 7 terlihat juga bahwa hasil antara LST dan
LMX baik di cemaran maupun sampel ber E. coli adalah sebanding kecuali di
beberapa perlakuan, terutama di konsentrasi bakteri rendah dimana LMX
menunjukkan hasil yang lebih tinggi dari pada LST. Pada ulangan 1 (18 Mei
2008) untuk perlakuan sampel ber E. coli, keseluruhan hasil adalah sama tetapi
pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi didapat pada pengujian
dengan media LMX (konsentrasi bakteri rendah sampel 2 dan konsentrasi bakteri
sedang sampel 1). Pada pengujian kedua (3 Juni 2008) perlakuan cemaran
konsentrasi rendah sampel satu, hasil LMX juga menunjukkan angka lebih tinggi
dari LST, sedangkan pada perlakuan sampel ber E. coli hasil yang lebih tinggi
terjadi pada LMX dengan cemaran sedang baik untuk sampel satu dan dua.
Hal yang sama juga terjadi pada pengujian ketiga (26 Juni 2008). Pada
perlakuan cemaran sedang ada sampel satu, hasil yang lebih tinggi terjadi pada
media LMX. Pada perlakuan sampel ber E. coli hasil LMX yang lebih tinggi
terjadi pada perlakuan konsentrasi cemaran rendah baik pada sampel satu maupun
sampel dua. Di lain pihak, hasil LST yang lebih tinggi dari LMX hanya terjadi
pada pengujian ketiga (tanggal 26 Juni 2008) dengan perlakuan dengan
konsentrasi bakteri sedang sampel satu, dengan perbedaan hanya satu tabung
positif di volume inokulum 0.1 ml. Pada pengamatan 24 jam, secara umum
63
tabung LMX menunjukkan tanda-tanda positif lebih cepat dari pada LST sehingga
memungkinkan didapat hasil yang lebih cepat.
Pada Lampiran 7 terlihat bahwa hasil pembacaan untuk sampel air semua
adalah negatif (kombinasi tabung 000) sehingga didapat hasil <1.8 cfu/100 ml
yang merupakan nilai terendah untuk APM yang berarti masih mungkin ada
kandungan bakteri Koliform tetapi dibawah 1.8 cfu/100 ml. Hal ini agak
menyulitkan karena standar air bersih untuk Koliform maupun E.coli adalah 0/100
ml sampel (EC, 1998; Depkes, 2007; WHO, 2004). Hal inilah yang menyebabkan
metode standar untuk pengujian air minum yang saat ini banyak digunakan adalah
bukan metode APM tetapi metode Membran Filtrasi dan metode Presence
Absence (APHA, 2005; EC, 1998; FDA, 2006; Merck, 2004). Dengan
menggunakan metode P/A atau membran filtarsi bisa diperoleh hasil yang
menyatakan nilai negatif atau nol per 100 ml sampel sesuai standar yang
tercantum, karena jumlah sampel yang diuji bisa sampai 100 ml dan limit bawah
pembacaan hasil adalah nol cfu atau tidak ada pertumbuhan.
Pada perlakuan dengan konsentrasi bakteri tinggi semuanya menunjukkan
hasil yang sama yaitu >1600 atau semua tabung positif (kombinasi 555). Hal ini
menyulitkan karena tidak didapatkan suatu angka yang pasti yang bisa
dibandingkan dengan hasil dari metode lainnya. Untuk konsentrasi tinggi
sebenarnya bisa didapat hasil yang angka tertentu (bukan >1600) apabila
dilakukan penambahan seri pengenceran sampai diperoleh kombinasi angka
tabung positif yang ideal (FDA, 2006). Kesulitan dari penambahan seri
pengenceran sampai lebih dari tiga tingkat adalah implikasinya terhadap
penambahan waktu, peralatan, tenaga, dan media yang sangat berbeda nyata.
Apabila dibandingkan dengan jumlah inokulum awal yaitu konsentrasi bakteri
rendah (4 cfu/ml), konsentrasi bakteri sedang ( 40 cfu/ml) dan konsentrasi bakteri
tinggi (80 cfu/ml) maka hasil yang diperoleh di kedua media LST dan LMX
cukup mencerminkan kondisi tersebut.
Uji anova (Lampiran 8) yang dilakukan untuk APM LST menunjukkan
bahwa F hitung lebih kecil dari F tabel dan nilai P lebih besar dari 5% yang berarti
tidak ada perbedaan hasil yang nyata antar sampel yang diambil pada hari yang
berbeda dan juga antar perlakuan cemaran dan sampel + cemaran. Hasil untuk
64
APM LMX juga menunjukkan kondisi yang sama dengan APM LST (Lampiran
9). Dalam hal ini yang bisa dianalisa hanya yang cemaran rendah saja karena
cemaran sedang dan tinggi nilainya sebagian besar bukan berbentuk angka
(>1600).
Dalam SNI (2006) disebutkan bahwa hasil yang baik dalam APM adalah
jika pada pengenceran yang lebih rendah, contoh yang diduga lebih banyak
menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan di pengenceran
yang lebih tinggi, contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil yang
negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Dalam penelitian ini hanya dilakukan
pengujian untuk jumlah sampel yang diinokulasikan adalah 10 ml, 1 ml, dan 0.1
ml saja untuk semua perlakuan karena adanya keterbatasan waktu, tenaga,
ketersediaan peralatan dan biaya dalam pengerjaan.
Gambar 12 Pertumbuhan bakteri E. coli (warna hijau) dalam media Fluorocult® LMX Broth
Pada perhitungan anova dari pertumbuhan dengan metode APM
konvensional maupun cepat tersebut diatas (Lampiran 10), diperoleh hasil F
hitung lebih kecil dari F tabel dan P value lebih besar dari 5% baik pada variasi
sampel, metoda maupun interaksinya sehingga dapat disimpulkan bahwa hasil
dari metode APM LST adalah sebanding dengan APM LMX. Walaupun hasil
65
yang didapat dari kedua metode tersebut sebanding akan tetapi ada beberapa hal
lain yang patut menjadi pertimbangan yaitu kemudahan pengerjaan, kemudahan
dalam melakukan pengamatan hasil, kecepatan memperoleh hasil akhir test dan
kepekaan yang lebih tinggi. Kepekaan dan kemudahan pengamatan terutama
terlihat pada konsentrasi bakteri rendah dimana seringkali gelembung gas pada
tabung durham agak sulit diamati (pada inkubasi 24 jam). Pada penggunaan
media cepat Fluorocult® LMX untuk metode APM cepat, pertumbuhan E. coli
ditandai dengan perubahan warna hijau yang dimulai dari dari bagian atas tabung
terlihat jauh lebih nyata dan mudah diamati (Gambar 12).
Keuntungan lain dari media LMX menurut Manafi (1995), adalah hasil yang
dapat diketahui secara langsung dan sekaligus dalam waktu yang sama dan tabung
yang sama apakah ada bakteri Koliform maupun E.coli, tanpa perlu uji lanjutan
yaitu penegasan Koliform (BGLB), pendugaan E.coli (EC Broth) dan penegasan
E.coli (LEMBA). Adanya Koliform dalam LMX ditandai dengan terbentuknya
warna hijau kebiruan yang dimulai dari bagian atas media yang tidak hilang
apabila dikocok. Semakin lama waktu inkubasi, warna hijau kebiruan akan
semakin turun ke dasar tabung dan warna hijau kebiruan akan semakin pekat
(Gambar 12).
Gambar 13 Pembacaan fluoresensi pada media Fluorocult® LMX dengan lampu UV.
66
Konfirmasi untuk memastikan koloni tersebut Koliform biasa atau E.coli
bisa dilakukan dengan parameter tambahan yaitu fluoresensi dengan lampu UV
(Gambar 13) dan pembentukan cincin merah akibat reaksi indol yang dihasilkan
E.coli dengan reagen Kovac’s (Gambar 14). Fluoresensi dibawah lampu UV
tampak sebagai warna biru pendar yang terang, yang lebih tampak nyata dalam
kondisi gelap. Selain itu, dengan penambahan reagen Kovac’s akan terbentuk
cincin merah dibagian atas broth
Dari kedua media untuk APM yang dianalisa maka media LST memberikan
hasil recovery rate untuk sampel ber E.coli yang lebih rendah dari pada media
LMX, apabila dibandingkan dengan kontrol positif dengan media yang sama
(Tabel 6).
Tabel 6 Recovery rate E.coli pada tiga macam media pada konsentrasi awal bakteri 400 cfu/100 ml (rendah)
Hasil pengukuran (cfu/100ml) Recovery Rate sampel ber E.coli
Jenis Media Kontrol positif Sampel ber
E. coli dibandingkan kontrol positif
Lauryl Sulfate Tryptose Broth 293 260 89%
Fluorocult LMX Broth 358 122% Chromocult Coliform Agar 204 70%
Pada ISO 11133-2 maka recovery rate disebut sebagai productivity yaitu
jumlah cfu yang tumbuh di media uji dibagi dengan jumlah cfu yang tumbuh di
media general, misal Tryticase Soy Agar atau media general lainnya. Untuk media
selektif nilainya harus >50% (ISO, 2002). Pada Tabel 6 nilai recovery rate untuk
penelitian ini dihitung berdasarkan pertumbuhan di medium LST dengan
perlakuan kontrol positif. Dari hasil perhitungan diperoleh nilai recovery rate
pada perlakuan sampel ber E.coli rendah pada medium LST adalah 89%, LMX
122% dan CCA 70%.
Sebenarnya media LMX adalah generasi ketiga dari pengembangan media
Lauryl Sulfate Broth, dengan perbaikan komposisi media seiring dengan
perkembangan ilmu pengetahuan dan diketemukannya teknologi fluorogenik dan
kemudian kromogenik. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth sudah berkembang
67
menjadi Fluorocult® Lauryl Sulfate Broth, kemudian menjadi Fluorocult® LMX
Broth dan terakhir menjadi Readycult® Coliform (Tabel 7).
Gambar 14 Pembacaan Indol (cincin merah) pada media LMX dengan penambahan reagen KOVAC’s
Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth yang diperkenalkan oleh Mallmann
dan Darby pada tahun 1941 sebagai media kultur selektif untuk pendugaan bakteri
Koliform dan untuk untuk pengkayaan selektif untuk organisme Koliform dalam
analisa air. Media Lauryl Sulfate Tryptose Broth juga merupakan media yang
sangat umum digunakan dan sampai saat ini masih menjadi acuan dalam berbagai
standar Internasional seperti AOAC, BAM, COMPF, EPA, ISO, SMD, SMWW
(Merck, 2005). SNI yang mengadaptasi prosedur FDA / BAM dengan sendirinya
juga menggunakan media LST ini (SNI, 2006).
Pada tahun 1991 Schindler memberikan rekomendasi penggunaan media
Fluorocult® Lauryl Sulfate Tryptose Broth dalam Quality Control air mandi
(Merck, 2005). Selanjutnya media ini digunakan sebagai standar pengujian oleh
German-DIN-Norm 10183 untuk pemeriksaan susu, regulasi § 35 LMBG
(01.00/54) untuk pemeriksaan produk pangan, ISO/DIS 11886 - 2.2 (1994) untuk
68
susu dan produk susu, dan selanjutnya the German Badegewässerverordnung
(regulations for bathing water) 76/1604 EWG di tahun 1995 (Merck, 2005).
Perbaikan yang dilakukan dari media LST ke Fluorocult® LST adalah
dengan penambahan L-tryptophan yang memungkinkan dilakukannya pegujian
indol sekaligus dan MUG yang memungkinkan dilakukannya pengujian
fluoresensi sekaligus seperti pada Gambar 14. Dengan penambahan kedua zat
tersebut maka LST yang semula hanya dapat digunakan untuk pendugaan
Koliform sekarang bisa juga dilakukan untuk konfirmasi keberadaan E.coli dari
sifat fermentasi laktosa berupa pembentukan gas, enzim triptophanase berupa
pembentukan indol, dan enzim glucuronidase berupa pembentukan fluoresensi
(Manafi, 2000; Merck 2005).
Perkembangan selanjutnya adalah modifikasi dari media Fluorocult® Lauryl
Sulfate Tryptose Broth menjadi Fluorocult® LMX Broth dengan penambahan
substrat kromogenik, sorbitol dan IPTG kedalam media. LMX Broth pertama kali
diperkenalkan oleh Manafi dan Kneifel (1989) dan kemudian dimodifikasi oleh
Manafi dan Ossmer (1993) dengan memperbaiki penggunaan substrate yang dapat
meningkatkan sensitivitas media sekaligus mengurangi keseluruhan waktu
inkubasi menjadi hanya 24 jam.
Fluorocult® LMX Broth modified mengandung bufer fosfat untuk
menggaransi tingkat pertumbuhan yang tinggi bagi bakteri Koliform total.
Lauryl Sulfate yang ada sangat menghambat pertumbuhan bakteri gram positif.
Dengan substrat kromogenik X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-
galactopyranoside), yang akan dipecah oleh Koliform dan substrat fluorogenik 4-
methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (X-Gluc) yang sangat spesifik untuk E.coli.
Selain kedua substrat diatas, LMX juga mengandung tryptophan yang akan
dipecah oleh E.coli menjadi indol dengan adanya enzim tryptophanase (dimiliki
oleh 99% E.coli). Sintesa enzim tersebut diamplifikasi oleh 1-isopropyl-ß-D-1-
thio-galactopyranoside dengan meningkatkan aktifitas ß-D-galactosidase (Manafi,
1995; Merck, 2005). Dengan ketiga parameter tersebut maka dimungkinkan
untuk melakukan deteksi total Koliform dan E.coli secara simultan dengan satu
macam medium dalam satu tahapan kerja saja (Manafi, 2000; Merck, 2005).
69
Tabel 7 Perkembangan dari Lauryl Sulfate Tryptose Broth ke Fluorocult® LMX Broth dan Readycult® Coliform
Komposisi Media (g / l) Lauryl Sulfate
Tryptose Broth (LST)
Fluorocult ® Lauryl Sulfate
Broth
LMX Broth/ Readycult ®
Coliform Tryptose 20.0 20.0 5.0 Lactose 5.0 5.0 0 Sodium chloride 5.0 5.0 5.0
Dipotassium hydrogenphosphate 2.75 2.75 2.7
Potassium dihydrogen phosphate 2.75 2.75 2.0 Lauryl Sulfate Sodium Salt 0.1 0.1 0.1
L-tryptophan 1.0 1.0 Sorbitol 1.0
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside (X-GAL)
0.08
4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide (MUG)
0.1 0.05
1-isopropyl-ß-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG)
0.1
Sumber : Manual Microbiology Merck (2005)
Dalam penelitian Manafi (1995), dilakukan pengujian 771 strain bakteri
gram negatif dengan LMX broth dimana 98% E.coli yang di isolasi dari air
minum adalah positif ß-D-glucuronidase (X-Gluc). 98% dari strain E. coli
memperlihatkan aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal) dan 99% memberikan reaksi
indol positif. Augoustinos et al. (1993) dalam Manafi dan Rosmann (1998b) dan
Manafi (1991) mengisolasi 95,7% E.coli yang positif GUD (Glucuronidase) dari
satu medium MUG dan menemukan strain Shigella (44-58%) dan Salmonella (20-
29%) yang dapat memproduksi enzim GUD. Alonso et.al (1996) dalam Manafi
dan (1998b) menemukan beberapa strain Klebsiella oxytoca, Serratia fonticola
and Yersinia intermedia mampu memproduksi GUD. Selain itu juga beberapa
strain Flavobacteria, Staphylococci, Streptococci dan Clostridia juga dapat
memproduksi GUD. Akan tetapi pertumbuhan dari sebagian besar
mikroorganisme tersebut dapat dihambat dengan agensia selektif di dalam media
atau dengan pengaturan kondisi inkubasi (Manafi, 1995).
Rice et. al (1990) meneliti kemungkinan false positive dari penggunaan
GUD untuk deteksi E. coli oleh spesies Escherichia yang lain. Dari isolat klinis
(CDC) digunakan sebanyak 42 isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii,
E. vulneris, dan E. blattae. Dari isolat lingkungan digunakan juga sebanyak 25
70
isolat yang terdiri dari E. hermanni, E. fergusonnii, E. vulneris, dan E.
adecarboxylata. Kesemuannya ditumbuhkan di media EC-MUG, Colilert dan
juga di cek kemungkinan sebagai Koliform fekal dengan menumbuhkan di suhu
44.5oC. Dari hasil yang diperoleh ternyata hanya E. coli yang bersifat GUD
positif dan fekal Koliform positif, sedangkan spesies Escherichia yang lain
bersifat GUD negatif dan fekal Koliform negatif sehingga metode ini bisa
digunakan untuk mendeteksi E. coli tanpa adanya false positive.
Karena tryptophan sudah ada dalam komposisi media LMX broth, maka
reaksi indol dapat langsung dilakukan pada media tersebut hanya dengan
menambahkan pereaksi KOVAC’s secara langsung di tabung yang sama (Ossmer,
1993; Merck, 2005). Pereaksi KOVAC’s ditambahkan ke tabung sampai
membentuk lapisan reagen setebal 5 mm di permukaan broth. Apabila lapisan
pereaksi berubah menjadi warna merah cerry (cherry red) setelah 1-2 menit
(Gambar 14) maka keberadaan E. coli telah terkonfirmasikan (Merck, 2005).
Apabila hasil test fluoresensi masih negatif setelah inkubasi 24 jam, maka
penambahan pereaksi KOVAC’s untuk pengujian indol tidak boleh dilakukan
terlebih dahulu. Inkubasi diteruskan sampai 48 jam kemudian baru dilakukan
kembali uji fluoresensi dan indol.
Pereaksi KOVAC’s adalah larutan alkoholis yang akan merusak kondisi
pertumbuhan di broth tersebut. Pengujian indol secara simultan dalam satu
tabung yang sama akan sangat memotong hari kerja apabila dibandingkan dengan
prosedur konvensional, dimana dari LST positif ke medium EC broth, kemudian
ke LEMBA yang selanjutnya koloni terduga di perbanyak ke agar miring untuk
uji IMViC. Dalam uji IMViC yang salah satunya adalah uji Indol menggunakan
medium Tryptone Water yang kemudian diinkubasi selama 24 jam sebelum
ditambahkan pereaksi KOVAC’s.
Penggunaan ketiga parameter diatas, yaitu fluorogenik, kromogenik dan
indol diketahui dapat meningkatkan sensitifitas, selektifitas media sehingga
meminimalkan kemungkinan terjadinya kesalahan (baik kesalahan positif maupun
negatif) dalam pengujian Koliform dan E.coli.
71
4.3 Metode Angka Lempeng Total.
Di kalangan industri pangan, pengujian E.coli dan total Koliform selain
menggunakan metode APM juga banyak menggunakan metode ALT (Cawan
tuang) dan membran filtrasi. Berdasarkan pengalaman penulis selama menjadi
Product Manager untuk Mikrobiologi di Merck , di Indonesia, metode APM lebih
banyak digunakan oleh kalangan institusi pemerintahan atau beberapa industri
lokal yang mengacu kepada SNI. Di sebagian besar industri pangan skala
menengah ke atas umumnya lebih memilih menggunakan metode angka lempeng
total dengan cara cawan tuang (pour plate), karena metode APM dianggap lama
dan merepotkan.
Adapun media yang paling banyak digunakan di industri pangan di
Indonesia untuk uji Koliform adalah Violet Red Bile Agar (VRBA). Media ini
juga direkomendasikan oleh ISO, APHA, BAM, IDF-FIL, SMDP (Merck, 2005).
Karena banyaknya pertanyaan dari kalangan industri pangan ke penulis tentang
perbandingan antara hasil APM dan ALT untuk uji Koliform dan E.coli, maka
dalam penelitian ini juga dilakukan perbandingan keduanya. Medium VRBA
adalah medium yang diusulkan oleh Davis pada tahun 1951 untuk deteksi dan
perhitungan bakteri Koliform termasuk E.coli di air, susu, ice-cream, daging dan
bahan pangan lainnya (Merck, 2005). Medium ini sesuai dengan rekomendasi dari
American Public Health Association (1992), the International Dairy Federation
FIL-IDF (Internationaler Milchwirtschaftsverband 1985), the Institute for Food
Technology and Packaging (Institut für Leben-mitteltechnologie und Verpackung)
(1974).
Gambar 15 Pertumbuhan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media VRBA
72
Apabila dilihat dari komposisi media VRBA (Tabel 8) maka pertumbuhan
bakteri secara umum didukung oleh adanya peptone from meat, NaCl dan Yeast
extract. Sebagai sumber karbohidrat yang utama adalah laktosa yang sekaligus
juga menjadi pembeda antara Enterobacteriaceae yang laktosa positif dan negatif.
Degradasi laktosa menjadi asam oleh bakteri laktosa positif membuat indikator
pH neutral red memberi warna merah pada koloni bakteri tersebut dan
menyebabkan presipitasi bile acids membentuk halo kemerahan disekitar koloni.
Penghambatan terhadap bakteri gram positif dimungkinkan oleh adanya crystal
violet dan bile salts yang kadang justru juga menghambat pertumbuhan bakteri
Koliform dan E.coli apabila dalam keadaan sublethal injured / sakit (ISO, 2004;
Merck, 2004 & 2005).
Tabel 8. Perbandingan antara komposisi media VRBA, CCA dan TBX Agar
Komposisi Media (g / l) Deskripsi
VRBA CCA* TBX Agar** Peptone 7.00
(meat) 3.00 20.00
Yeast Extract 3.00 Sodium chloride 5.00 5.00 Lactose 10.00 Neutral Red 0.03 Bile salt 1.50
(mixture) 1.50
(No.3) Crystal violet 0.002 Sodium dihydrogen phospat 2.20 di-sodium hydrogen phospat 2.70 Sodium pyruvat 1.00 Tryptophane 1.00 Sorbitol 1.00 Tergitol 7 0.15 Chromogenic mixture 0.40 0.075 Agar-agar 13.00 10.00 15.00
Total penggunaan media (g/l) 39.53 26.50 36.60 Harga per botol 500g *** Rp. 920.000 Rp. 4.490.000 Rp. 7.555.000 Harga per petri (15 ml) Rp. 1.091 Rp. 3.563 Rp. 8.290 Pembacaan hasil Koliform saja Koliform, E. coli E. coli saja * CCA : Chromocult Coliform Agar ** TBX Agar : Chromocult TBX Agar ***Harga media berdasarkan pada Price List 2009 yang dikeluarkan PT Merck Tbk
Selain itu, media VRBA tidak bisa secara spesifik membedakan antara
E.coli, Koliform dengan Enterobacteriaceae lainnya, tetapi hanya membedakan
bakteri yang bersifat laktosa positif dan laktosa negatif saja yang semuanya
73
memunculkan warna merah dikelilingi zone presipistasi (Gambar 15). Beberapa
strain Klebsiella (yang juga merupakan anggota koliform) dan Enterococci
tumbuh sebagai koloni pink dengan ukuran sangat kecil (pin-point) sehingga
memungkinkan terjadinya kesalahan pembacaan hasil (Merck, 2005). Kesulitan
lain penggunaan media ini apabila mengikuti prosedur ISO 4832:2004 adalah
pemanasan media dalam air mendidih tidak boleh lebih dari 2 menit dan media
harus digunakan dalam waktu tiga jam setelah dibuat (ISO, 2004).
Di lain pihak, ada kebutuhan industri pangan akan media baru yang dapat
memberikan hasil yang lebih cepat dan akurat dengan pengerjaan yang mudah.
Seperti pada metode APM sebelumnya, penggunaan substrat kromogenik untuk
pengujian Koliform dan E.coli juga sudah banyak digunakan dalam media agar,
misal media TBX agar untuk ISO 16649:2001 dan Chromocult® Coliform Agar
(USEPA, 2007). Pada media TBX, kromogen yang digunakan hanya satu macam
dan hanya untuk mendeteksi sifat ß–glucuronidase yang ada di E. coli saja dengan
warna koloni hijau (ISO, 2001). Media TBX di Indonesia tidak populer karena
peraturan pemerintah maupun perusahaan yang ada di Indonesia pada umumnya
menghendaki uji Koliform dan E.coli sekaligus. Media Chromocult® Coliform
Agar (CCA) lebih sesuai dan lebih diterima untuk keperluan Indonesia karena bisa
mendeteksi keduanya yaitu Koliform berwarna merah salmon sedang E.coli biru
tua sampai violet.
Pada penelitian ini hanya dilakukan perhitungan Angka Lempeng Total
dengan Media CCA saja, tanpa membandingkan dengan VRBA dan TBX karena
tujuannya adalah untuk membandingkan metode ALT yang lebih sederhana cara
pengerjaannya dengan metode perhitungan APM konvensional. Dari hasil
perhitungan sampel terlihat bahwa semua sampel yang positif metode APM, baik
yang konvensional maupun yang cepat, juga memberikan hasil positif di CCA.
Sampel air proses yang tidak dicemari juga memberikan hasil negatif, sama
dengan kedua metode APM (Tabel 9). Data tersebut disajikan dalam nilai cfu/100
ml sesuai dengan perhitungan APM yang juga per 100 ml. Dari data Anova
untuk perhitungan antara cemaran saja dan sampel + cemaran dalam konsentrasi
rendah (Lampiran 11) diperoleh nilai F hitung lebih besar dari F tabel dan nilai P
lebih besar dari 5% yang menunjukkan hasil yang tidak beda nyata.
74
Tabel 9. Hasil pengujian dengan media Chromocult® Coliform Agar
Kontrol Positif (cfu/100 ml) Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Ulangan
Sampel air proses Rendah* Sedang** Tinggi*** Rendah* Sedang** Tinggi***
1 0 188 1963 4000 200 2275 4163 2 0 175 1188 2875 238 1613 3188 3 0 150 2000 4350 175 1838 3600
Rerata 0 171 1717 3742 204 1908 3650 Catatan : * Rendah : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 4 cfu/ml ** Sedang : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 40 cfu/ml *** Tinggi : konsentrasi bakteri E.coli dalam sampel 80 cfu/ml
Pada Tabel 10 tampak sifat pertumbuhan beberapa bakteri pada media CCA,
didasarkan pada sifat pemecahan substrat salmon-GAL, X-glucuronide dan asam
amino tryptophan untuk test indol. Pemecahan substrat Salmon-GAL oleh enzim
ß-D-galactosidase yang dimiliki oleh total Koliform (termasuk E.coli) ditandai
dengan munculnya warna merah salmon pada koloni. Pemecahan substrat X-
Glucuronide oleh enzim ß-D-glucuronidase yang dimiliki oleh E.coli dan
beberapa bakteri lainnya ditandai dengan warna biru terang sampai torquoise.
Khusus untuk E.coli yang memiliki kedua enzim tersebut akan memecah kedua
substrat tersebut menghasilkan gabungan antara warna merah salmon dan
torquoise menjadi warna biru gelap sampai violet (Gambar 16). Gram negatif lain
yang tidak memiliki kedua macam enzim tersebut tumbuh sebagai koloni tak
berwarna (Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b).
Tabel 10 Karakteristik beberapa bakteri di media Chromocult® Coliform Agar
Test strains Recovery rate %
Pertumbuhan Warna koloni
Salmon-GAL
X –Glucu ronide
Indole
Escherichia coli ATCC 11775
≥ 70% Bagus / sangat bagus
biru gelap - violet
+ + +
Citrobacter freundii ATCC 8090
> 70% Bagus / sangat bagus
merah salmon
+ - -
Escherichia coli DSMZ 502
> 70% Bagus / sangat bagus
biru-violet + - +
Salmonella enteritidis ATCC 13076
Tidak terbatas
Bagus / sangat bagus
tak berwarna
- - -
Enterococcus faecalis ATCC 19433
< 0.01 tidak tumbuh
Sumber : Microbiology Manual Merck (2005)
75
Warna yang timbul pada koloni oleh kromogen tersebut akan tetap stabil
untuk beberapa hari, tidak terpengaruh oleh nilai pH, temperatur, atau cahaya.
Karena pewarnaan tersebut tidak terdifusi ke agar maka pembedaan masing-
masing koloni dimungkinkan dalam media ini, bahkan apabila terjadi pada
perhitungan koloni yang tinggi (Merck, 2005)
Hasil false negatif pada media kromogenik dimungkinkan terjadi pada strain
Escherichia coli yang bersifat ß-glucuronidase negatif, seperti Escherichia coli
O157 (ISO, 2001). Dalam Manafi et.al (1991) disebutkan bahwa ada korelasi
kuat antara E.coli pembentuk verotoksin dengan sifat ß-glucuronidase negatif
sehingga memberikan hasil negatif pada media kromogenik (tidak membentuk
koloni hijau) dan fluorogenik (fluoresensi negatif) walaupun dapat tumbuh.
Dalam hal aktifitas ß-D-galactosidase (X-Gal), hanya beberapa strain Vibrio
metschnikovii, V. vulnificus, Aeromonas hydrophila dan A.sobria memberikan
reaksi “ false positive” X-Gal (Manafi, 1995; Geissler et al., 2000). Ley et al
(1993) menemukan bahwa semua strain Aeromonas, Citrobacter dan Enterobacter
yang diisolasi dari air baku (raw water) dalam medium yang mengandung X-Gal
bersifat ß-D-galactosidase positif. Sebaliknya, hanya 10-20% saja dari strain-
strain tersebut yang menghasilkan warna merah dengan kilap logam pada media
m-Endo agar LES.
Gambar 16. Pertumbuhan Citrobacter freundii ATCC 8090 dan Escherichia coli ATCC 11775 dalam media Chromocult® Coliform Agar
(sumber : Merck 2005)
76
Dari total 674 sampel air berklorinasi yang ditanam di m-Endo agar LES
dan medium yang mengandung X-Gal, 18 yang negatif di Endo memperlihatkan
hasil positif di Medium X-Gal. Dari 50% bakteri yang bersifat ß-D-galactosidase
positif, 76% diidentifikasi sebagai Aeromonas hydrophila (Ley et al, 1993).
Ossmer (1993) juga menyebutkan bahwa X-Gal memberikan hasil yang lebih
cepat dan lebih sensitif untuk Koliform total daripada produksi gas dari laktosa.
Untuk keperluan konfirmasi koloni E.coli, cukup dengan memberikan satu
tetes KOVACS' indole reagent kepada koloni yang berwarna biru gelap sampai
violet. Apabila pereaksi tersebut berubah menjadi warna merah cherry (Gambar
17) setelah beberapa detik maka dapat dikonfirmasikan bahwa terjadi
pembentukan indol yang memberi kepastian (99%) bahwa koloni tersebut
memang E.coli. Kemungkinan untuk melakukan test indol langsung di agar yang
sama membuat CCA menjadi unik dan sangat membantu memepercepat uji E.coli
(Merck, 2005; Manafi, 1995; Manafi dan Rosmann, 1998b).
Media CCA terbukti dalam beberapa penelitian, memang memiliki tingkat
akurasi yang tinggi yaitu 94-96% untuk sifat enzimatis GUD positif; 99% untuk
sifat indol positif (Manafi, 1991); dan 98% untuk sifat GAL positif (Geissler et al,
2000). Selain itu ada 3-4% strain E.coli yang mempunyai sifat ß-D-glucuronidase
negatif, yang akan membentuk koloni tak berwarna misal E.coli O157 atau juga
strain yang tidak dapat tumbuh pada temperatur 44 °C misal E. coli 0157:H7
(Merck, 2005). Pendekatan pengujian cepat dengan media kromogenik misal
identifikasi Escherichia coli menggunakan one-day cultivation bahkan juga sudah
diakui pentingnya oleh WHO sebagai metode alternatif, selain penggunaan probe
fluoresense secara mikroskopis dan teknik laser scanning (WHO, 2002).
Geissler et.al (2000) membandingkan kinerja dari Fluorocult® LMX Broth,
Chromocult® Coliform Agar (CCA) dan Chromocult® Coliform Agar ditambah
cefsulodin 10 µg/ml (CCA-CFS) dengan metode standar APM untuk perhitungan
Koliform dan E.coli di air pantai untuk rekreasi. Dalam penelitian Geissler ini
juga dibuktikan bahwa standar APM konvensional memberikan hasil yang kurang
sensitif untuk perhitungan E.coli., walaupun secara statistik tidak ada beda nyata
antara LMX, CCA, CCA-CFS dan APM untuk perhitungan E.coli.
77
Gambar 17. Pembentukan warna cherry red pada koloni Escherichia coli setelah ditetesi reagen KOVAC’s.
Di lain pihak penggunaan media CCA-CFS untuk angka lempeng total
memberikan hasil yang lebih akurat untuk total Koliform karena gangguan
background flora lebih terkurangi. Karena itu kontribusi bakteri ß-galactosidase
positif, non Koliform (terutama Aeromonas spp. dan Vibrio spp.) dalam
perhitungan angka lempeng total tidak bisa diabaikan begitu saja.
Penggunaan larutan PDF sebagai pengencer tanpa penambahan NaCl juga
berpotensi menyebabkan kerusakan sel karena bukan larutan yang bersifat isotonis.
Selain itu, tidak adanya kandungan peptone dalam cairan pengencer menyebabkan
tidak ada efek recovery sehingga sel bakteri yang sublethal injured kemungkinan
akan sulit tumbuh. ISO 6887 menganjurkan digunakannya larutan pengencer
Maximum Recovery Diluent yang per liternya mengandung 85 g NaCl dan 1 g
peptone yang mempunyai efek recovery dari peptone dan isotonik dari NaCl
fisiologis sehingga tidak terjadi kerusakan sel pada sampel (Merck, 2005).
Pengaruh tersebut juga diduga menjadi sebab dari rendahnya recovery rate media
CCA di penelitian ini (Tabel 11) yang seharusnya >70% (Merck, 2005).
78
Tabel 11 Recovery rate Escherichia coli di media Chromocult® Coliform Agar dibandingkan dengan konsentrasi awal bakteri sampel
Kontrol positif Sampel ber E. coli
Ulangan Rendah* Sedang* Tinggi* Rendah* Sedang* Tinggi*
1 47% 49% 50% 50% 57% 52% 2 44% 30% 36% 59% 40% 40% 3 38% 50% 54% 44% 46% 45%
Rerata 43% 43% 47% 51% 48% 46%
Catatan : * Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml)
Dari komunikasi pribadi dengan Rolf Ossmer (18 Maret 2009) yang
mengembangkan Chromocult® Coliform Agar di Laboratorium R&D Merck
KGaA di Jerman, seharusnya recovery rate dari media CCA untuk E.coli adalah
>70% (70-100%). Rendahnya recovery rate dalam penelitian ini kemungkinan
karena sampel tidak terdistribusi dengan baik di cawan petri, yang disebabkan
oleh teknik pencampuran sampel dengan media pada metode cawan tuang yang
salah. Area berwarna violet di agar (Gambar 18) merupakan indikasi tempat
terkumpulnya bakteri, sehingga jumlah koloni yang terpisah secara sempurna
menjadi berkurang.
Pada metode cawan tuang, koloni yang tumbuh di dekat permukaan agar-
agar dapat tumbuh dalam dua koloni dengan morfologi yang berbeda, yaitu koloni
kecil didalam agar dan koloni yang lebih besar di permukaan agar. Pertumbuhan
koloni dipermukaan agar-agar seringkali sangat kuat dengan warna dan ukuran
yang atypical. Penyebab dari terbentuknya koloni atypical seperti pada Gambar
18 belum diketahui tetapi mungkin telah terjadi penghambatan pada reaksi
enzimatis oleh kombinasi beberapa komponen dari material sampel dengan
pertumbuhan yang terjadi di permukaan. Hal ini bisa diatasi dengan melakukan
overlayer pada CCA seperti yang banyak direkomendasikan oleh banyak prosedur
standar. Pada medium CCA, apabila muncul koloni atypical, maka semua koloni
dengan warna violet di tengah koloni atau warna violet yang terdifusi kedalam
agar adalah koloni E.coli (Ossmer R 27 Maret 2009, komunikasi pribadi)
79
Gambar 18 Pertumbuhan koloni Escherichia coli atypical di media Chromocult Coliform Agar.
Dalam penelitian ini memang tidak dibandingkan antara metode ALT
menggunakan media VRBA dan CCA karena tujuan utama adalah membanding-
kan antara APM dengan ALT yang dalam hal ini diwakili oleh CCA. Pemilihan
CCA sendiri seperti diterangkan diatas adalah karena beberapa keunggulan yang
dimiliki CCA seperti ketelitian, kepraktisan dan kecepatan hasil. Penelitian yang
membandingkan VRBA dan CCA telah dilakukan oleh Gonzales et.al pada tahun
2003 pada sampel makanan siap saji (ready-to-eat foods). Dari hasil penelitian
tersebut disimpulkan bahwa CCA memiliki beberapa keuntungan dibandingkan
dengan VRBA yaitu hanya memerlukan satu medium untuk mendeteksi Koliform
dan E.coli, mengurangi biaya, mengurangi waktu secara nyata, dan mengurangi
kecenderungan terjadinya kontaminasi silang dibanding metode-metode lainnya.
4.4 Metode Presence Absence.
Untuk sampel air yang sangat bersih seperti air minum atau air proses, yang
jumlah bakterinya sangat kecil umumnya dianjurkan untuk menggunakan metode
membran filtrasi atau Presence/ Absence dengan jumlah sampel yang cukup besar,
misalnya 100 ml. Dengan jumlah sampel yang besar diharap tingkat ketelitian dan
sensitifitas uji juga meningkat. Sebenarnya standar mikrobiologis air proses dan
80
air minum menurut Kepmenkes, WHO, FDA, dan USEPA adalah negatif atau nol
cfu per 100 ml sampel. Karena itu, untuk pengujian air minum umumnya metode
yang disahkan adalah metode membran filtrasi atau P/A yang memiliki tingkat
ketelitian lebih tinggi dari pada metode APM dan ALT (Depkes, 2002; WHO,
2004; USEPA, 2007; FDA, 2002).
Dalam penelitian ini, metode APM yang sekarang digunakan dalam SNI
dan metode ALT yang banyak digunakan di industri dibandingkan dengan metode
P/A yang merupakan metode standar untuk pengujian air minum yang digunakan
oleh USEPA. Metode membran filtrasi tidak dipilih karena jarang digunakan di
Indonesia dan memerlukan pengerjaan yang lebih rumit daripada metode P/A.
Metode Presence Absence (P/A) pada penelitian ini menggunakan media
siap pakai Readycult® Coliform 100 (RC 100) seperti pada Gambar 20. Media
Readycult® Coliform 100 ini merupakan pengembangan dari media LMX Broth
(Tabel 7) menjadi bentuk siap pakai untuk metode Presence Absence dengan
sampel air sebanyak 100 ml (Manafi and Rosmann, 1998a; Merck, 2005). RC
100 dibuat dari media Fluorocult® LMX Broth sebanyak 1.7 g, dikemas dalam
sachet khusus dan disteril dengan cara radiasi (Merck, 2005; Manafi, 2000).
Karena media sudah dalam keadaan ditimbang dan steril maka media bisa
langsung dituang kedalam botol steril ukuran 250 ml yang sudah diisi dengan 100
ml sampel (Gambar 19). Karena basis medianya sama, maka prinsip kerja media
maupun cara pengamatan media RC adalah sama dengan LMX Broth.
Gambar 19 Cara penggunaan media cepat siap pakai Readycult® Coliform 100
81
Metode P/A menggunakan media Readycult® Coliform 100 ini telah
disahkan oleh USEPA untuk digunakan dalam pengujian bakteri Koliform
maupun E. coli dalam air minum (USEPA, 2007). Keunggulan metode ini
dibandingkan dengan APM maupun ALT adalah pengerjaannya yang jauh lebih
sederhana, cepat dan jumlah sampel yang dites jauh lebih besar daripada metode
APM maupun ALT sehingga apabila ada satu sel saja dalam 100 ml sample akan
terdeteksi sebagai positif.
Tabel 12 Hasil pengujian Escherichia coli dengan metode Presence Absence pada media Readycult® Coliform 100
Sampel Kontrol positif Sampel ber E. coli Jenis Media Ulangan Air
Proses
Rendah
Sedang
Tinggi
Rendah Sedang Tinggi
1 negatif positif TD TD positif TD TD
2 negatif positif TD TD positif TD TD RC 100
3 negatif positif TD TD positif TD TD Catatan :
- Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml) - Keterangan : TD = Tidak dilakukan
Dari hasil penelitian terlihat bahwa semua sampel air proses tanpa cemaran
adalah negatif dan semua sampel dengan cemaran maupun cemaran saja pada
konsentrasi rendah adalah positif (Tabel 12). Pada penelitian ini metode P/A
hanya dilakukan untuk konsentrasi rendah saja untuk melihat sensitifitas pada
jumlah sel terendah, sedangkan untuk konsentrasi sedang dan tinggi tidak
dilakukan karena sudah pasti akan positif hasilnya. Hasil ini sejalan dengan
kedua metode sebelumnya yaitu APM (dengan LST maupun LMX) dan ALT
(dengan CCA), dimana pada sampel air proses saja semua hasilnya negatif sedang
pada konsentrasi rendah semua positif dengan nilai cfu yang berbeda-beda.
Apabila memang hasil akhir yang diinginkan hanya negatif per 100 ml sampel
maka diantara ketiga metode tersebut, metode P/A lah yang paling sesuai karena
paling mudah dilakukan, cepat dan dengan hasil yang sebanding dengan metode
lain.
Manafi and Rosmann (1998a) dalam penelitiannya mendapatkan hasil
bahwa Readycult® mendeteksi Koliform dan E.coli secara signifikan pada lebih
82
banyak sampel dalam 24 jam dibandingkan dengan standard Methods.
Readycult® menunjukkan hasil false positive untuk Aeromonas spp., yang
merupakan waterborne bacteria yang umum. Deteksi Koliform dan E.coli
dikurangi menjadi total satu hari dibandingkan dengan metode EPA konvensional
yang memerlukan 4 hari dan metode DIN yang memerlukan 3 hari. Selain itu
juga dibuktikan bahwa sensitifitas Readycult® sama dengan Standard Methods
dan bahkan Readycult® dapat menghitung E.coli dan Koliform secara simultan
dalam analisis yang sama. Efisiensi dan kecepatan reaksi yang dapat dideteksi
membuat media ini sangat bermanfaat dalam test mikrobiologi air rutin (Manafi
and Rosmann, 1998a).
Pada Gambar 20 tampak berbagai hasil inkubasi media Readycult®. Paling
kiri yaitu yang berwarna bening kekuningan adalah pada saat awal inokulasi atau
apabila sampelnya steril. Botol yang tengah tampak keruh tetapi tidak berwarna
biru kehijauan, yang berarti ada pertumbuhan bakteri tetapi bukan termasuk
Koliform. Hasil ini didapat dari inkubasi sampel air proses tanpa cemaran pada
tanggal 3 Juni 2008, yang memang di media CCA juga tumbuh koloni tak
berwarna cukup banyak. Botol paling kanan keruh dan berwarna biru kehijauan,
yang menunjukkan ada pertumbuhan bakteri Koliform (dari perlakuan dengan
cemaran E.coli) . Uji konfirmasi lanjutan untuk membedakan E.coli dari bakteri
kelompok Koliform lainnya dilakukan dengan melihat fluoresensi dengan lampu
UV 366 nm dan pembentukan cincin merah dari reaksi indol dengan pereaksi
KOVAC’s (Gambar 21).
Keunggulan dan kelemahan media Readycult® dibandingkan dengan media
konvensional untuk uji Koliform dan E.coli pada dasarnya sama dengan media
Fluorocult® LMX Broth yang telah diterangkan di bagian metode APM LMX.
Keunggulan lainnya dari Readycult® adalah kemudahan dalam pengerjaan dan
ketelitian yang lebih untuk uji air minum dengan jumlah bakteri Koliform sangat
kecil bahkan negatif, karena sampel yang diuji adalah 100 ml dalam satu botol.
83
Gambar 20 Pertumbuhan bakteri Koliform di media Readycult® Coliform 100
Gambar 21 Fluoresensi (1) dan Reaksi Indol (2) dalam media Readycult®
Coliform 100.
Kemudahan pengerjaan seperti sudah disinggung di bagian inokulasi,
terutama karena media sudah dalam dalam bentuk snap siap yang steril (Gambar
19), dengan dua pilihan yaitu untuk keperluan sampel 50 ml atau 100 ml. Dengan
bentuk snap siap pakai tersebut proses preparasi media yang konvensionl seperti
penimbangan, pelarutan, sampai dengan sterilisasi dan penyimpanan menjadi
1. awal inokulasi
2. ada pertumbuhan
bukan Koliform
3. positif Koliform
1 2
84
hilang. Kebutuhan tenaga, peralatan, waktu pembuatan media dan ruang simpan
untuk media jadi juga menjadi sangat berkurang. Prosedur sederhana ini
memungkinkan suatu laboratorium sederhana dengan peralatan dan kompetensi
personal minimal, bahkan di lapangan, bisa juga melakukan test rutin monitoring
Koliform.
Bentuk snap dengan media steril juga memungkinkan dilakukannya
pengujian dengan sampel air sebesar 100 ml karena tidak lagi diperlukan air
sebagai pelarut dalam proses pembuatan media. Apabila menggunakan media
biasa maka untuk melakukan pengujian dengan sampel sebanyak 100 ml
diperlukan media sebanyak 50 ml dengan minimal 3 kali resep (3-fold) (Merck,
2005; APHA, 2005). Hal ini tentu akan sangat mengurangi biaya pengujian
dibandingkan dengan metode APM atau P/A biasa.
Karena metode ini sangat sensitif maka yang diuji hanya sampel tanpa
inokulasi dan cemaran yang konsentrasi rendah saja. Jumlah sel akhir per botol
adalah 400 sel untuk konsentrasi rendah (Tabel 12) karena jumlah inokulum 4 sel/
ml sedangkan jumlah suspensi cemaran yang digunakan adalah 100 ml. Cemaran
konsentrasi sedang dan konsentrasi tinggi tidak diuji karena sudah pasti hasilnya
akan positif karena menurut Manafi dan Rosmann (1998a) apabila ada satu sel
saja dalam 100 ml sampel yang akan memberikan hasil positif.
Selain untuk deteksi secara simultan Koliform dan E.coli, Readycult
Coliform dapat juga digunakan untuk pengkayaan dalam cara deteksi E.coli
O157:H7 secara cepat dan mudah di sampel air. E.coli O157:H7 yang diduga ada
di sampel yang diinokulasikan ke media RC yang berwarna hijau kebiruan tetapi
fluoresensi negatif dan indol positif dikonfirmasi dengan Singlepath E.coli O157
(Bubert et.al, poster)
4.5 Perbandingan antara APM, ALT, dan P/A
Apabila keempat metode tersebut kita bandingkan maka akan tampak bahwa
metode APM (baik LST maupun LMX) memberikan hasil yang lebih tinggi
dibandingkan dengan metode ALT CCA (Tabel 13). Pada perlakuan sampel
tanpa cemaran, metode APM memberikan hasil < 1,8 /100 ml, metode ALT
85
memberikan hasil 0 cfu/ml dan metode P/A memberikan hasil negatif/100 ml.
Hasil ALT terkecil adalah 0 cfu/ml karena tidak dilakukan pengenceran pada
sampel tetapi jumlah sampel yang dianalisa hanya 1 ml. Metode P/A memberikan
hasil negatif atau 0/100 ml sedangkan metode APM hanya bisa memberikan hasil
< 1.8/100 ml. Hal ini karena APM terkecil untuk seri 5 tabung dengan jumlah
total sampel 55.5 ml adalah 1.8 cfu/100 ml apabila hasil kombinasi tabung positif
0-0-1 dengan perhitungan sbb (APHA, 2005) :
MPN/100 ml = 100 x P / (N x T) 1/2
MPN/100 ml = 100 x 1/ (55.4 x 55.5)1/2
MPN/100 ml = 100/55.45 = 1.8
dimana :
P = jumlah tabung positif
N = total volume sampel dalam semua tabung negatif (dijumlahkan), ml
T = total volume sampel dalam seri pengenceran yang digunakan, ml
Pada sampel dengan penambahan cemaran dengan knsentrasi sedang dan
tinggi, maka hasil yang didapat pada metode APM kebanyakan >1600 cfu/100ml
sehingga sulit untuk dilakukan analisa pembandingan statistik dan tidak bisa
dibuat rerata apabila ada ulangan yang nilainya kurang dari 1600. Metode ALT
lebih memungkinkan untuk melakukan analisa statistik dan perhitungan rerata,
dengan pengerjaan yang lebih simpel.
Metode P/A walau lebih sederhana dalam pengerjaan tetapi hasil yang
diperoleh hanya bisa positif atau negatif saja sehingga hanya cocok untuk sampel
sangat bersih yang memang diharapkan hasilnya negatif. Dalam APHA (2005)
disebutkan bahwa apabila sampel yang diuji dengan metode P/A memberikan
hasil positif maka dianjurkan untuk melakukan pengujian ulang untuk menghitung
jumlah Koliform karena data kuantitatif dapat menunjukkan tingkat kontaminasi
yang terjadi.
Metode APM terutama sangat berguna untuk sampel yang konsentrasi
organismenya sangat rendah (<100 cfu/g) terutama air, susu dan sampel pangan
yang keberadaan partikulat materialnya kemungkinan mengganggu keakurasian
86
perhitungan koloni pada metode ALT (FDA, 2008). Asumsi yang sangat penting
untuk mendukung keakurasian metode APM adalah bahwa bakteri – bakteri yang
ada terdistribusi secara acak didalam sampel, saling terpisah, tidak membentuk
kelompok dan juga tidak saling menempel satu sama lain. Metode ALT biasanya
digunakan untuk sampel yang jumlah bakterinya banyak. (FDA, 2008).
Tabel 13 Perbandingan jumlah mikroba ter-recover pada metode Angka Paling Mungkin (LST & LMX), Angka Lempeng Total (CCA) dan Presence
Absence (RC)
Sampel Kontrol positif (cfu/100 ml) Sampel ber E. coli (cfu/100 ml) Jenis Media Ulangan Air
Proses
Rendah* Sedang* Tinggi*
Rendah* Sedang* Tinggi* 1 <1.8 240 >1600 >1600 240 >1600 >1600 2 <1.8 245 >1600 >1600 390 920 >1600 3 <1.8 395 >1600 >1600 150 >1600 >1600
LST**
Rerata <1.8 293 >1600 >1600 260 >1600 >1600 1 <1.8 240 >1600 >1600 390 >1600 >1600 2 <1.8 260 >1600 >1600 390 1600 >1600 3 <1.8 295 >1600 >1600 295 1600 >1600
LMX**
Rerata <1.8 265 >1600 >1600 358 >1600 >1600 1 0 188 1963 4000 200 2275 4163 2 0 175 1188 2875 238 1613 3188 3 0 150 2000 4350 175 1838 3600
CCA**
Rerata 0 171 1717 3742 204 1908 3650 1 negatif positif TD*** TD positif TD TD 2 negatif positif TD TD positif TD TD 3 negatif positif TD TD positif TD TD
RC**
Rerata negatif positif TD TD positif TD TD Catatan : * Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml) ** LST (Lauryl Sulfate Broth) LMX (Fluorocult LMX Broth) CCA (Chromocult Coliform Agar) RC (Readycult Coliform 100) *** TD : Tidak dilakukan pengujian
Selain itu apabila dilihat dari jumlah total sampel yang dianalisa maka
metode P/A adalah yang paling banyak dengan 100 ml, metode APM 5 tabung
dengan 55.5 ml dan metode ALT dengan hanya 1 ml. Dengan demikian ketelitian
hasil yang terbaik untuk pengujian air dengan kualitas air minum adalah pada
metode P/A dengan sampel 100 ml karena probabilitas keterambilan sel bakteri
dalam sampel menjadi jauh lebih besar dari pada metode APM dan ALT.
Misalnya, apabila ada 1 sel dalam 100 ml sampel maka dengan metode P/A akan
87
terdeteksi sebagai positif, pada metode APM probabilitas keterambilannya hanya
55.5 % (total sampel 55,5 ml) dan di metode ALT bahkan hanya 1% (total sampel
1 ml). Karena itu beberapa metode referensi pengujian air seperti APHA, FDA,
ISO, SNI menggunakan metode P/A atau Membran Filtrasi untuk sampel dengan
kelas air minum. Untuk sampel air bersih biasanya digunakan metode APM 5
tabung atau Membran Filtrasi (APHA, 2005; FDA, 2007; ISO, 2001; BSN, 2006).
Kelemahan ini juga dibahas oleh Odge et.al (1998) dan beliau menganjurkan
untuk menggunakan lebih dari 6 petri atau menggunakan perti dengan diameter 15
cm sehingga jumlah sampel yang diinokulasikan bisa lebih besar dari 1 ml.
Apabila dilihat dari kebutuhan inkubator maka keuntungan lain dari media
cepat LMX, RC dan CCA untuk pengujian Koliform dan E. coli adalah dalam
pengerjaannya hanya memerlukan satu suhu inkubasi yaitu 35oC dibandingkan
dengan metode konvensional yang perlu dua suhu inkubasi yaitu 35oC dan 44.5oC.
Jumlah tabung dan cawan petri yang lebih sedikit dan tahapan yang hanya satu
kali pengerjaan saja memerlukan ruang yang lebih sedikit di inkubator.
Salah satu parameter kualitas suatu media pertumbuhan adalah kemampuan
dalam menumbuhkan bakteri yang diinginkan. Dalam penelitian ini yang dihitung
pada Tabel 6 adalah nilai recovery ratenya untuk perlakuan dengan konsentrasi
bakteri rendah karena untuk perlakuan dengan APM pada konsentrasi sedang dan
tinggi memberikan hasil perhitungan > 1600 sehingga tidak bisa dihitung.
Perhitungan nilai recovery rate dilakukan dengan membandingkan hasil
pertumbuhan di sampel ber E.coli dengan kontrol positif (larutan PDF yang
dicemari dengan bakteri yang sama). Hasil recovery rate tertinggi adalah pada
media LMX (122%), kedua adalah media LST (89%) dan ketiga adalah media
CCA (70%).
Recovery rate CCA paling rendah dibandingkan dengan media broth lainnya
karena bentuknya yang padat berpengaruh terhadap tingkat recovery sel. Menurut
Ogden (1997) organisme yang sakit (rusak) lebih menyukai lingkungan yang cair
(broth) daripada permukaan padat yang kering (agar). Dari kedua broth yaitu LST
dan LMX maka hasil recovery rate LMX lebih tinggi dari LST hal ini karena
sumber karbohidrat yang digunakan dalam LMX selain laktosa juga sorbitol dan
dua macam substrat kromogenik (Merck, 2005) sehingga mampu memberikan
88
hasil pertumbuhan yang lebih bagus. Keuntungan lain dari CCA dan LMX adalah
waktu yang lebih cepat, yaitu 24 jam untuk sampai ke identifikasi / konfirmasi
E.coli.
Geissler et.al. (2000) melakukan penelitian pengujian secara kuantitatif
untuk koliform total dan E. coli di air laut dengan membandingkan metode APM
konvensional menggunakan Lauryl Sulfate Broth (LST) dengan metode APM
cepat menggunakan LMX Broth dan metode Membran Filtrasi menggunakan
Chromocult Coliform Agar (CC) dan CC plus Cefsulodin (CC-CFS). Dalam
penelitian tersebut dibuktikan bahwa metode APM konvensional memiliki
sensitifitas paling kecil untuk perhitungan E.coli. Keseluruhan hasil untuk E.coli
ter-recover menunjukkan bahwa pertumbuhan pada media LMX, CC-CFS, dan
CC adalah 1,60; 1,64; dan 1,39 kali lebih banyak dari APM konvensional. Akan
tetapi secara statistik, hasil antara LMX, CC, CC-CFS tidak berbeda nyata untuk
perhitungan E.coli. Pada media CC-CFS hasilnya lebih kecil daripada media CC
karena mengandung cefsulodin yang menyebabkan tingkat penghambatannya
lebih besar.
4.6 Analisa Ekonomis
Dalam penelitian ini, selain dilihat keunggulan teknis dari masing-masing
metode pengujian dan jenis medianya, dilakukan juga analisis ekonomis terhadap
keempat metode yang diperbandingkan, yaitu metode APM dengan media LST
(cara konvensional), APM dengan media LMX Broth (cara cepat), P/A dengan
media Readycult® (cara cepat) dan metode ALT dengan media CCA (cara cepat).
Parameter yang diperbandingkan adalah: (1) investasi biaya yang dikeluarkan
untuk pembelian pertama kali set media dan reagen yang dibutuhkan, (2) harga
per test (apabila dilakukan secara single maupun duplo), (3) perbandingan biaya
metode cepat terhadap metode konvensional, (4) total hari yang diperlukan untuk
pengujian (minimal dan maksimal), dan (5) jumlah petri dan tabung yang
diperlukan selama pengujian. Keseluruhan data tersebut tersaji pada Tabel 14.
Perhitungan tersebut dilakukan berdasar asumsi bahwa sampel positif
mengandung E.coli sehingga perlu dilakukan pengujian secara lengkap sampai ke
tahap konfirmasi untuk 2 koloni terduga. Khusus untuk metode APM LST, selain
89
perhitungan lengkap juga dilakukan perhitungan untuk sampel yang Koliform
negatif sehingga pengujian berhenti pada tahap tersebut.
Parameter ekonomis pertama adalah besarnya biaya yang dikeluarkan untuk
pembelian media pada saat awal pengujian yang dihitung berdasarkan harga price
list media Merck tahun 2009 yang dikeluarkan oleh PT. Merck Tbk. (Tabel 14).
Dari keempat metode tersebut tampak bahwa biaya investasi media terbesar
adalah untuk metode APM konvensional karena harus membeli enam macam
media yaitu LST, EC, LEMBA, Tryptone Water, MR-VP Base Broth, Simon
Citrate, dan tiga macam reagen yaitu KOVAC’s, MR dan VP.
Tabel 14 Perhitungan biaya dan lama pengujian lengkap E.coli pada
metode Angka Paling Mungkin, Angka Lempeng Total, dan Presence Absence.
Harga /test (Rp) Total hari Metode Analisa Investasi media (Rp) Single Duplo
% biaya min max
Jumlah alat gelas
APM LST 1) sampel E.coli positif
10.813.000 200.763 401.526 100% 5 7 195 tabung
APM LST 2) sampel Koliform negatif
10.813.000 9.676 19.352 5% 2 4 15 tabung
APM LMX 3) 8.119.000 57.218 114.436 29% 1 2 15 tabung
ALT CCA 4) 4.978.000 7.530 15.059 4% 1 2 2 petri
P/A Readycult 5) 1.309.000 60.570 121.140 30% 1 2 1 botol
Keterangan : 1. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST)
untuk sampel yang positif E.coli 2. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST
untuk sampel yang negatif Koliform 3. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth
(LMX) untuk sampel yang positif E.coli 4. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar untuk sampel
yang positif E.coli 5. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100 untuk sampel yang
positif E.coli
Total investasi untuk Metode APM konvensional untuk pemeriksaan
lengkap E.coli adalah Rp 10.813.000,-. Apabila uji Koliform juga dilakukan
maka ada tambahan biaya investasi sebesar Rp 1.086.000,- untuk pembelian
media Brilliant Green Bile 2% Broth sebagai uji penguat Koliform setelah positif
gas di LST. Dengan demikian, total investasi media dan reagen untuk uji
Koliform dan E.coli dengan metode APM konvensional adalah Rp 11.899.000,-.
Yang kedua adalah metode APM cepat LMX yaitu sebesar Rp 8.119.000,-. Yang
90
ketiga adalah metode ALT CCA yaitu sebesar Rp 4.978.000,- dan terakhir yang
paling murah investasinya adalah metode P/A yaitu sebesar Rp 1.309.000,-.
Metode P/A memang terlihat paling kecil biaya pembelian media awalnya karena
satu pak hanya untuk 20 test. Ketiga metode cepat tersebut sekaligus untuk
pengujian Kolifom dan E.coli.
Apabila dilihat dari jumlah investasi yang diperlukan untuk pembelian
media dan keterbatasan masa pakai suatu media maka untuk jumlah pengujian
sedikit dan tidak rutin, metode yang memerlukan jumlah media sedikit dan
investasi kecil akan lebih menguntungkan. Hal ini karena media dan reagen tidak
kadaluwarsa atau rusak sebelum habis digunakan. Perhitungan lengkap dari
masing-masing media ada di Lampiran 13, 14 dan 15.
Pada Tabel 14 juga bisa dilihat perhitungan harga per test untuk pengujian
single maupun duplo. Dari hasil perhitungan untuk pengujian single terlihat
bahwa metode APM konvensional (LST) yaitu Rp 200.763,- ternyata juga paling
mahal karena memerlukan banyak media dengan banyak tahapan. Harga per test
termahal kedua adalah Readycult® Coliform yaitu Rp 60.570,- atau hanya 30%
dari biaya APM konvensional LST. Selanjutnya (ketig-=a) adalah APM LMX
sebesar Rp 57.218,- atau 29% dari biaya APM konvensional LST. Metode ALT
dengan CCA ternyata paling murah yaitu hanya Rp 7.530,- per test nya atau hanya
4% dari harga per test APM konvensional LST. Apabila setiap sampel dilakukan
test duplo maka harga per test dikalikan dua seperti tampak pada Tabel 14, dan
selisih harga antar metode menjadi semakin besar yaitu Rp 401.526,- untuk APM
konvensional LST, Rp 121.140,- untuk Readycult, Rp 114.436,- untuk APM
LMX dan untuk ALT CCA hanya sebesar Rp 15.059,-.
Perhitungan total hari yang diperlukan untuk pengujian (lengkap sampai
tahap konfirmasi E.coli) didasarkan atas jumlah minimum dan maksimum hari
yang diperlukan. Perbedaan antara minimum dan maksimum total hari pengujian
in terjadi karena apabila pada inkubasi 24 jam hasil pembacaan masih negatif
maka harus diperpanjang menjadi 48 jam. Dari data di Tabel 15 tampak sekali
perbedaan antara metode APM LST (konvensional) yang memerlukan waktu
pengujian 5-7 hari dengan metode cepat (APM LMX, Readycult® dan ALT CCA)
yang hanya memerlukan waktu 1-2 hari saja. Total waktu pengujian sangat besar
91
pengaruhnya di industri karena berkaitan dengan waktu untuk melepas barang ke
pasar. Semakin lama waktu pengujian akan semakin lama pula waktu barang
tertahan di gudang. Lamanya barang tertahan di gudang akan berpengaruh
langsung ke kapasitas gudang yang diperlukan dan perputaran cash flow
perusahaan.
Dari sisi kebutuhan peralatan gelas yaitu tabung dan cawan petri, tampak
dalam Tabel 14 bahwa metode APM LST memerlukan jumlah peralatan gelas
sangat banyak. Jumlah 195 tabung dan cawan petri untuk APM LST sudah
dibatasi dengan melakukan hanya tiga seri pengenceran yaitu 100, 10-1, dan 10-2.
Sampel langsung dinokulasikan dengan jumlah ml yang berbeda untuk tiap tabung
(10 ml, 1 ml, dan 0.1 ml) sehingga menghemat tabung. Kelemahannya adalah
pada konsentrasi cemaran sedang dan tinggi hasilnya tidak bisa dihitung secara
statistik karena hanya menyebutkan nilai >1600. Uji konfirmasi E.coli hanya
dilakukan pada dua koloni terduga sehingga penggunaan tabung dan cawan petri
bisa dikurangi. Jumlah peralatan akan bertambah secara nyata lebih dari 195 buah
apabila jumlah pengenceran bertambah dan koloni yang dikonfirmasi juga
bertambah menjadi 5 koloni tiap tabung positif. Hal ini juga akan berimplikasi
langsung terhadap penambahan analis laboratorium, beban kerja di lab, jumlah
inkubator dan peralatan penunjang lainnya.
Penggunaan metode cepat sangat memotong jumlah tabung dan petri yang
diperlukan dengan sangat nyata dari 195 tabung menjadi hanya 16 tabung untuk
metode APM LMX dan bahkan hanya perlu dua cawan petri untuk metode ALT
CCA dan satu botol untuk metode P/A (Tabel 14). Hal ini juga akan berimplikasi
langsung terhadap pengurangan beban kerja di lab, jumlah inkubator dan
peralatan penunjang lainnya.
Penelitian yang dilakukan oleh Ogden et.al pada tahun 1998 telah
membandingkan metode APM konvensional dengan beberapa metode cepat untuk
sampel kerang. Dalam penelitian tersebut dibuktikan bahwa metode cepat dengan
Chromocult bisa memberikan hasil pengujian E.coli dalam waktu 48 jam (dalam
kenyataannya hasil biasanya diperoleh dalam 24 jam). Sebagai pembandingnya,
metode APM memberikan hasil dalam 3-4 hari.
92
Tabel 15 Analisa biaya pengujian dan gudang di PT Yummy Food Utama
A. Biaya Listrik Bulanan (Rp 27.000.000)Asumsi Nilai total Nilai Akhir/bulan
Bagian Produksi 27,000,000 14,850,000 Kantor 27,000,000 1,350,000 Bagian Laboratorium 27,000,000 2,700,000 Bagian Gudang (chiller) 27,000,000 8,100,000
B. Nilai Barang (4 batch = 16 trolley)
Asumsi/Trolley Nilai satuan Nilai Akhir/batch
Yogurt buah Blackberry 125 g 4,500 36,000,000 Yogurt buah Strawberry 125 g 4,500 36,000,000 Yogurt buah Manggo 125 g 4,300 34,400,000 Yogurt buah Guava 125 g 4,200 33,600,000 Total Nilai Barang per hari produksi 140,000,000
C. Biaya Gudang (Chiller)
Asumsi Biaya satuan Biaya harian
Gaji Karyawan/bulan 1,500,000 200,000 Investasi bangunan dan alat gudang 400,000,000 222,222 Biaya operasional lain-lain/bulan 2,000,000 66,667 Biaya listrik gudang-chiller (dari tabel biaya listrik) 8,100,000 270,000
758,889 Biaya gudang/trolley/hari (maksimum 65 trolley) 11,675
D.Biaya Laboratorium
DeskripsiHarian (7
parameter) Harian (E.coli
saja) Biaya TetapBelanja pegawai 383,333 54,762 Biaya Listrik 90,000 12,857 Penyusutan asset Lab 111,111 15,873 Biaya kalibrasi alat 5,721 817 Biaya operasional lain-lain/bulan 66,667 9,524 Total Biaya Tetap 590,166 84,309
30%
171,643 2,000,000
19,704,976
Total biaya gudang per hari
2,700,000 3,333,333
Per Bulan
% 55%5%
10%
8000
Satuan
4
Satuan
800080008000
11,500,000
11
1
Keterangan : 6. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST)
untuk sampel yang positif E.coli 7. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST
untuk sampel yang negatif Koliform 8. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth
(LMX) untuk sampel yang positif E.coli 9. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar untuk sampel
yang positif E.coli 10. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100 untuk sampel yang
positif E.coli
93
Biaya medium Chromocult yang digunakan di proyek tersebut kira-kira
seperempat dari biaya APM. Akan tetapi kepastian besarnya biaya metode APM
sangat tergantung kepada berapa banyaknya tabung yang tercatat positif dan
memerlukan analisis lebih lanjut. Ogden juga menyebutkan bahwa keuntungan
lain dari Chromocult adalah penggunaan inkubator yang hanya 37oC sedangkan
APM untuk E.coli juga perlu extra waterbath 44oC.
Selain biaya pembelian media pengujian, selanjutnya dihitung pula biaya
listrik bulanan (Tabel 15 A) dan nilai barang (Tabel 15 B). Perhitungan biaya
listrik dilakukan dengan asumsi bahwa dari total rata-rata biaya listrik per bulan
sebesar Rp 27.000.000,- dibagi menjadi 55% produksi, 5% untuk kantor, 10%
untuk Laboratorium dan 30% untuk gudang (chiller).
Walaupun PT. Yummy memiliki banyak varian keju dan yogurt,
perhitungan nilai barang dalam penelitian ini dilakukan hanya untuk produksi
yogurt buah empat rasa kemasan 125g. Harga satuan yogurt buah bervariasi
tergantung rasa, yaitu blackberry Rp 4500, strawberry Rp 4500, manggo Rp 4300,
dan yang termurah adalah guava Rp 4200. Apabila dalam satu hari dibuat setiap
rasa satu batch maka total nilai produk jadi per hari adalah Rp 140.000.000.-
(Tabel 15 B). Produksi per batch adalah 1000 kg dengan berat per kemasan
adalah 125g, dengan demikian dalam satu batch produksi diperoleh 8000 kemasan.
Kapasitas satu trolley adalah 2400 kemasan sehingga untuk satu batch diperlukan
4 buah trolley. Karena dalam satu hari diproduksi 4 batch maka kebutuhan trolley
per hari adalah 16 buah.
Kapasitas gudang chiller di PT Yummy adalah 65 trolley sehingga apabila
total biaya gudang per hari Rp 758.889,- maka biaya gudang per trolley per hari
adalah Rp 11.675,- (Tabel 15 C). Biaya per trolley tersebut dihitung dari jumlah
komponen biaya utama untuk gudang (gaji empat orang karyawan, penyusutan
investasi, operasional, listrik) dibagi kapasitas gudang chiller sebanyak 65 trolley.
Dengan kapasitas gudang chiller hanya 65 trolley maka dalam waktu 4 hari
produksi saja gudang chiller tersebut sudah penuh. Selain itu, karakteristik
produk yogurt yang mempunyai masa simpan pendek menyebabkan produk harus
secepat mungkin di release ke pasar. Pengujian yang cepat akan sangat membantu
efisiensi gudang sehingga kapasitas gudang tidak perlu ditambah.
94
Apabila di Tabel 14 biaya laboratorium dihitung untuk pemakaian media,
maka di Tabel 15 D biaya laboratorium dihitung sebagai biaya operasional yang
meliputi gaji pegawai sebanyak 3 orang, listrik, penyusutan peralatan lab,
kalibrasi alat dan biaya operasional lain-lain. Dalam sehari laboratorium PT
Yummy melakukan pengujian 7 parameter uji, salah satunya adalah E.coli dan
Koliform. Biaya harian untuk pengujian E.coli adalah Ro 84.309 yang diperoleh
dari total biaya bulanan operasional lab sebesar Rp 19.704.97 dibagi untuk 7
parameter pengujian. Hasil dari perhitungan di Tabel 15 akan digunakanuntuk
menghitung perbandingan biaya total masing-masing metode dan penghematan
yang bisa diperoleh dengan menerapkan metode cepat.
Perbandingan total biaya laboratorium dan gudang untuk tiap metode akan
dipengaruhi oleh biaya media yang digunakan, jumlah hari yang diperlukan suatu
metode yang mempengaruhi lama penyimpanan di gudang. Dalam perhitungan di
Tabel 16 digunakan asumsi produksi sehari 4 batch (nilai total Rp 140.000.000);
biaya gudang per hari Rp 186.803; bunga bank 15% dan kapasitas gudang adalah
untuk 4 hari produksi masing-masing 4 batch.
Dari Tabel 16, total biaya maksimal yang dikeluarkan untuk pengujian
dengan metode APM konvensional adalah Rp 3.906.632 dengan total waktu
pengujian 7 hari apabila pembacaan hasil setiap tahapan dilakukan dalam waktu
48 jam dan total biaya minimal adalah Rp 3.364.406 apabila tiap tahapan hanya
perlu 24 jam. Apabila Koliform negatif dalam waktu 48 jam maka hanya
diperlukan biaya Rp 734.703. Koliform negatif berarti hanya memerlukan
pengujian dengan media LST saja. Metode APM cepat dengan media LMX
hanya memerlukan 29% dari keseluruhan biaya APM LST untuk 48 jam inkubasi
di tiap tahapan dan 23% biaya apabila tiap tahapan dalam waktu 24 jam sudah
positif. Penghematan yang bisa dilakukan apabila menggunakan APM LMX
adalah Rp 2.578.014 - Rp 2.791.593 per produksi (4 batch). Apabila hasilnya
ternyata Koliform negatif (hanya tahap uji LST) maka APM LMX lebih mahal
Rp 380.336,- tetapi dengan ketelitian lebih tinggi dan kemungkinan kesalahan
lebih rendah.
95
Tabel 16. Perbandingan biaya total antara APM konvensional dan metode cepat
Metode APM Konvensional 1)Setiap tahap 48
jam (Rp) Setiap tahap 24 jam (Rp)
E .coli neg dalam 48 jam (Rp)
Biaya gudang total (E.coli positif) = 7 hari 1,307,624 934,017 373,607 Bunga bank - kredit modal kerja = 7 hari 402,740 402,740 115,068Biaya Media (duplo) = 4 batch 1,606,102 1,606,102 77,409Biaya Laboratorium = 7 hari 590,166 421,547 168,619 Total Biaya = 7 hari 3,906,632 3,364,406 734,703
Metode Cepat APM LMX 2)
Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari 373,607 186,803 373,607 Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari 115,068 57,534 115,068 Biaya Media (duplo) = 4 batch 457,745 457,745 457,745 Biaya Laboratorium = 2 hari 168,619 84,309 168,619 Total Biaya = 2 hari 1,115,039 786,392 1,115,039 % biaya dibanding APM Konvensional 29% 23%Penghematan dibanding APM Konvensional -2,791,593 -2,578,014 380,336
Metode Cepat ALT CCA 3)
Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari 373,607 186,803 373,607 Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari 115,068 57,534 115,068 Biaya Media (duplo) = 4 batch 60,236 60,236 60,236 Biaya Laboratorium = 2 hari 168,619 84,309 168,619 Total Biaya = 2 hari 717,530 388,883 717,530 % biaya dibanding APM Konvensional 18% 12%Penghematan dibanding APM Konvensional -3,189,102 -2,975,523 -17,173
Metode Cepat P/A Readycult 4)
Biaya gudang total (E.coli positif) = 2 hari 373,607 186,803 373,607 Bunga bank - kredit modal kerja = 2 hari 115,068 57,534 115,068 Biaya Media (duplo) = 4 batch 484,560 484,560 484,560 Biaya Laboratorium = 2 hari 168,619 84,309 168,619 Total Biaya = 2 hari 1,141,854 813,207 1,141,854 % biaya dibanding APM Konvensional 29% 24%Penghematan dibanding APM Konvensional -2,764,778 -2,551,199 407,151
Maksimal Hari
Asumsi :
1. Nilai jual produk/hari produksi (4 batch) : Rp 140.000.000 2. Biaya gudang/hari kerja (4 batch = 16 trolley) : Rp 186.803 3. Bunga bank kredit modal kerja : 15% / tahun 4. Kapasitas gudang 65 trolley setara dengan 4 hari kerja @ 4 batch.
Keterangan : 1. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Lauryl Sulphate Broth (LST) 2. Metode Angka Paling Mungkin seri 5 tabung dengan media Fluorocult LMX Broth 3. Metode Angka Lempeng Total dengan media Chromocult Coliform Agar 4. Metode Presence Absence dengan media readycult Coliform 100
Penggunaan CCA memerlukan biaya yang jauh lebih murah daripada APM
LST konvensional yaitu 18% (Rp 717.530) dari biaya untuk inkubasi tiap tahapan
48 jam dan 12% (Rp 388.883) untuk inkubasi 24 jam (Tabel 16). Penghematan
yang dilakukan dengan penggunaan CCA adalah Rp 3.189.102 untuk 48 jam dan
96
Rp 2.975.523 untuk 24 jam. Apabila sampelnya Koliform negatif maka masih
lebih hemat Rp 17.173 dibandingkan dengan APM konvensional dengan
keuntungan tambahan yaitu lebih spesifik terhadap Koliform dan E.coli dan lebih
sensitif terhadap sel yang sublethal injured.
Apabila dibandingkan dengan metode APM LST, maka metode cepat P/A
Readycult® selain hanya perlu waktu maksimal dua hari kerja, biaya yang
diperlukan hanya 29% (Rp 1.141.854) dari metode APM konvensional untuk
pembacaan hasil tiap tahapan 48 jam inkubasi dan 24% (Rp 813.207) untuk yang
24 jam inkubasi. Apabila ternyata sampel tersebut Koliform negatif maka biaya
total menjadi lebih mahal Rp 407.151, dibandingkan dengan metode konvensional
yang hanya perlu media LST saja dengan waktu yang sama dua hari. Walaupun
biaya (apabila Koliformnya negatif) lebih tinggi dibandingkan dengan APM
konvensional, akan tetapi keuntungan lain dari metode P/A dibandingkan dengan
APM konvensional adalah pengerjaannya yang cepat dan mudah serta
ketelitiannya yang lebih tinggi karena mengunakan 100 ml sampel.
Manfaat lain yang bisa diperoleh apabila menggunakan salah satu dari
metode cepat yang hanya memerlukan waktu maksimal dua hari pengerjaan untuk
analisa Koliform dan E.coli sekaligus, adalah release produk yang lebih cepat.
Apabila dengan metode APM konvensional tiap batch memerlukan alokasi tempat
di gudang selama tujuh hari maka dengan metode cepat hanya memerlukan
alokasi tempat selama dua hari saja. Apabila menggunakan pengujian APM
konvensional yang memerlukan waktu 7 hari kerja maka dalam seminggu (dengan
5 hari kerja) hanya bisa melakukan 4 hari produksi (18 batch per bulan) dengan
nilai total Rp 2.520.000.000. Apabila menggunakan metode cepat yang hanya
memerlukan 2 hari kerja maka dalam sebulan bisa diproduksi 22 batch dengan
nilai Rp 3.080.000.000 yang berarti peningkatan kapasitas produksi sebesar 22%.
97
V. SIMPULAN DAN SARAN
5.1 Simpulan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa recovery rate dari urutan yang paling
tinggi adalah media Fluorocult LMX broth (122% ), Lauryl Sulfate Tryptose
Broth (89%), dan Chromocult Coliform Agar (70%). Media Readycult tidak
dapat diperbandingkan karena bersifat kualitatif, akan tetapi formula media
Readycult sama dengan media Fluorocult LMX Broth. Hasil perhitungan anova
menunjukkan hasil yang sebanding antara metode APM konvensional dengan
metode cepat sehingga metode cepat dapat menggantikan metode konvensional.
Ketiga metode cepat memerlukan 1-2 hari (dengan kebutuhan 15 tabung
untuk LMX, 2 cawan petri untuk CCA dan 1 botol untuk Readycult), sedangkan
metode APM konvensional memerlukan waktu 5-7 hari (dengan kebutuhan
tabung dan cawan petri sampai 195 buah). Jumlah hari kerja dan peralatan yang
diperlukan mencerminkan kemudahan pengerjaan dan kecepatan mendapatkan
hasil, sehingga bisa disimpulkan bahwa urutan dari yang paling mudah, adalah (1)
metode Presence Absence menggunakan Readycult®, (2) metode Angka Lempeng
Total dengan Chromocult® Coliform Agar, (3) metode Angka Paling Mungkin
cepat dan (4) terakhir yang paling sulit adalah metode Angka Paling Mungkin
dengan metode konvensional.
Biaya investasi metode APM konvensional (Rp 10.813.000 untuk E.coli saja
dan Rp 11.899.000 untuk koliform dan E.coli), kemudian metode APM cepat (Rp
8.119.000), metode ALT cepat (Rp 4.978.000) dan investasi terkecil adalah
metode P/A cepat (Rp 1.309.000). Dari perhitungan biaya pengujian E.coli per
test (single dan duplo) maka dapat disimpulkan bahwa yang terbesar adalah untuk
metode APM konvensional (Rp 200.763 dan Rp 401.526), selanjutnya adalah
metode P/A cepat (Rp 60.570 dan Rp 121.140), kemudian metode APM cepat (Rp
57.218 dan Rp 114.436), dan biaya terkecil adalah metode ALT cepat (Rp 7.530
dan Rp 15.059). Apabila ternyata sampel tersebut negatif koliform maka harga
per test metode APM konvensional masih jauh lebih murah (Rp 9.676 dan Rp
19.352) daripada APM cepat dan metode P/A, dan sedikit lebih mahal daripada
metode ALT cepat. Apabila hasilnya selalu koliform negatif maka metode
98
konvensional masih lebih murah daripada metode cepat tetapi dengan recovery
rate yang lebih rendah.
Total biaya laboratorium ketiga metode cepat adalah Rp 84.309 (untuk
inkubasi 24 jam) dan Rp 168.619 (48 jam), sementara APM konvensional Rp
421.545 (5 hari) dan Rp 590.166 (7 hari). Dari data tersebut dapat disimpulkan
bahwa penggunaan metode cepat akan menghemat biaya laboratorium. Total
biaya gudang ketiga metode cepat adalah Rp 186.803 (24 jam) dan Rp 373.607
(48 jam), sementara APM konvensional Rp 934.015 (5 hari) dan Rp 1.307.624 (7
hari). Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa penggunaan metode cepat akan
menghemat biaya gudang karena produk bisa keluar untuk dipasarkan lebih cepat.
Penghematan total biaya yang diperoleh dengan mengganti metode APM
konvensional ke metode cepat dari urutan terendah adalah Rp 2.764.778 untuk
Readycult®, Rp 2.791.593 untuk Fluorocult® LMX Broth dan Rp 3.189.102 untuk
Chromocult® Coliform Agar. Kenaikan kapasitas produksi per bulan dengan
pemakaian metode cepat adalah 22% atau 22 batch dari 18 batch dengan lima hari
kerja seminggu.
Kesimpulan umum dari penelitian ini adalah metode cepat yang
menggunakan medium Fluorocult LMX broth, Chromocult Coliform Agar dan
Readycult Coliform 100 terbukti dapat memberikan hasil yang sebanding dengan
metode APM konvensional dalam pengujian E.coli di air proses PT. Yummy Food
Utama dengan waktu analisa yang lebih cepat dan prosedur kerja yang lebih
sederhana. Selain itu penggunaan metode cepat dapat digunakan untuk pengujian
koliform dan E.coli sekaligus. Penggunaan metode cepat (dengan model
pembiayaan di PT. Yummy Food Utama untuk jenis produk yogurt buah ukuran
125 g) terbukti dapat memberikan penghematan biaya investasi media, biaya
laboratorium, biaya gudang dan mampu memberikan penghematan biaya total
serta dapat meningkatkan kapasitas produksi.
99
5.2 Saran
1. Untuk penelitian lanjutan disarankan untuk menambah seri pengenceran pada
sampel dengan cemaran sedang dan tinggi terutama untuk metode Angka
Paling Mungkin sehingga diperoleh angka yang lebih kecil dari 1600
cfu/100ml.
2. Perlu dilakukan uji yang sama untuk jenis sampel air minum dan sampel
produk pangan lainnya yang kemungkinan kandungan E.coli dan koliform
dalam sampel positif, sehingga bisa lebih mencerminkan perbedaan
kemampuan media dalam menangkap strain liar bakteri.
3. Karena hasil dari metode APM konvensional untuk uji E.coli yang digunakan
oleh SNI ternyata tidak bisa memberikan hasil negatif per 100 ml seperti yang
dipersyaratkan oleh Kepmenkes No 907 maka perlu dilakukan pengkajian
ulang.
4. Perlu dilakukan kaji ulang untuk prosedur SNI pengujian E.coli dan koliform
untuk memberi peluang metode cepat yang lebih sesuai dengan keperluan
industri pangan.
100
DAFTAR PUSTAKA
[APHA] American Public Health Association. 2005. Standard Methods for The
Examination of Water & Wastewater. Centennial Edition. Washington. Beloti, Vanerli, M AF Barros, M.P. Nunes, E. H. Walter de Santana, L.A. Nero,
J.A. de Souza, 2002, Use of Readycult – LMX for Enumeration of Total Coliform and Escherichia Coli in Milk. Braz. J. Microbiol. 33:49-52
[BPOM] Badan Pengawasan Obat dan Makanan. 1996. Pedoman Penerapan
Produksi Makanan Yang Baik (CPMB). Direktorat Pengawasan Makanan dan Minuman. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, Departemen Kesehatan R.I.
[BSN], Badan Standardisasi Nasional . 2006. Air Minum Dalam Kemasan.
Dewan Standardisasi Nasional. Departemen Perindustrian. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–3553–2006. ICS 67.160.20.
Bubert, A, G. Paive, T. Smith, and M. Buelte, 2003. Rapid and simple detection of E.coli O157:H7 in water samples. Poster.
[Codex] Codex Alimentarius Comission. 1997. Principles for the Establishment
and Application of Microbiological Criteria for Foods. CAC/GL 21. [Codex] Codex Alimentarius Comission. 2003. Recommended International
Code of Practice General Principles of Food Hygiene. CAC/RCP 1-1969, Rev. 4-2003.
[DEPKES] Departemen Kesehatan. 2002. Keputusan Menteri Kesehatan Republik
Indonesia Nomor 907/MENKES/SK/VII/2002 Tentang Syarat-Syarat dan Pengawasan Kualitas Air. Menteri Kesehatan Republik Indonesia.
[EC] European Community. 1998. Council Directive 98/83/EC of 3 November
1998 on The Quality of Water Intended for Human Consumption. Official Journal of the european Communities. http://eur-lex-europa.eu/LexUri Serv/LexUriServ.do?uri=CELEX:31998L0083:EN:NOT. 8 Oktober 2007.
[FDA] United States Food and Drug Administration. 2002. Bacteriological
Analytical Manual Online September 2002, Chapter 4, Enumeration of Escherichia coli and the Coliform bacteria. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html [8 November 2007]
[FDA] United States Food and Drug Administration. 2006. Bacteriological
Analytical Manual Online February. 2006, Most Probable Number from Serial Dilution. USFDA/CFSAN-BAM-Appendix 2. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4.html [8 November 2007]
101
Feldsine, P, C. Abeyta, and W.H. Andrews. 2002. AOAC International Methods Committee. Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiology. Official Methods of Analysis. Journal of AOAC International 85:1187-1200.
Geissler, K, M. Manafi, I. Amoros, and J.L. Alonso, 2000, Quantitative
Determination of Total Coliform and Escherichia coli in Marine Waters with Chromogenic and Fluorogenic Media. Appl. Environ.Microbiol. 88:280-285.
Gonzales, R.D., L.M. Tamagnini, P.D. Olmos, G.B. de Sousa. 2003. Evaluation of
a Chromogenic Medium for Total Coliforms and Escherichia coli Determination in Ready-to-eat Foods. Journal of Food Microbiology 20:601-604.
Harrigan, W.F. 1998. Laboratory Methods in Food Microbiology. 3rd ed.
Academic Press. San Diego [ISO]. International Organization for Standardization. 2001. ISO 16649-
2:2001(E). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs — Horizontal Method for The Enumeration of ß-glucuronidase-positive Escherichia coli —Part 2: Colony-Count Technique at 44 °C using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide. ISO. Geneva.
[ISO]. International Organization for Standardization. 2002. ISO 11133-
2:2002(E). Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffsv-Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media. ISO. Geneva.
[ISO]. International Organization for Standardization. 2003. ISO 16140:2003.
Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs – Protocol for The Validation of Alternative Methods. ISO. Geneva
[ISO]. International Organization for Standardization. 2004. ISO 4832: 2004.
Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs - Horizontal Method for The Enumeration of Coliforms - Colony Count Technique. ISO. Geneva.
Jouve, Jean-Louis. 2000. Good Manufacturing Practice, HACCP, and Quality
System. Di dalam:. Lund, B.M., Baird-Parker, T.C., and Gould, G.W. Editor. The Microbiological Safety and Quality of Food Volume IV Chapter 58, pp 1627-1655. Aspen Publisher Inc. Maryland.
Labbe, R., 1992. Clostridium perfringens. Di dalam: Doyle, M.P. Editor.
Foodborne Bacterial Pathogens, Marcel Dekker, New York
102
Ley, A.N., Barr, S., Fredenburgh, D., Taylor, M. and Walker, N. (1993) Use of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galactopyranoside for Tthe Iisolation of ß-D-galactosidase-positive Bacteria from Municipal Water Supplies. Abstract. Can. J. Microbiol. 39, p. 821-825.
Manafi, M, W. Kneifel, S. Bascomb. 1991. Fluorogenic and Chromogenic
Substrates Used in Bacterial Diagnostics. Microbiological Reviews. American Society for Microbiology, Sept 1991. Vol 55. No. 3, p. 335-348
Manafi, M. (1995). New Medium for The Simultaneous Detection of Total
Coliforms and E. coli in Water. 95th Annual Meet. Am. Soc. Microbiol. 1995, American Society for Microbiology, Washington, DC. Abstr.P-43, P. 389.
Manafi, M. (1996). Fluorogenic and Chromogenic Enzyme Substrates in Culture
Media and Identification Tests. Int. J. Food Microbiol 31:45-58. Manafi. M. dan H. Rosmann. 1998a. An Evaluation of Readycult System for
Detection of Total Coliform and E. coli in Water. 98th American Society for Microbiology, Atlanta, 17-21 May 1998.
Manafi. M. dan H. Rosmann. 1998b. An Evaluation of a New Chromogenic /
Flourogenic Microbiology Media System for Detection of Total Coliforms and E.coli in Water. Hygiene Institute, University of Vienna, Kinderspitalgasse 15, A-1095, Vienna, Austria.
Manafi. M. 2000. New Development in Chromogenic and Fluorogenic Culture
Media. Int. J. Food Microbiol 60:205-218. [Merck] Merck KGaA. 2004. Water : Microbiological Examination. Germany [Merck] Merck KGaA. 2005. Merck Microbiology Manual. 12th Edition. Germany Ogden, I.D., G.C. Brown, S. Gallacher, P.H. Gartwaite, M. Gennari, M. P.
Gonzales, L.B. Jorgensen, B.T. Lunestad, M. MacRae, M.C. Nunes, A.C. Petersen, J.T.Rosnes, J. Vliegenthart. 1998. An interlaboratory study to find an alternative to the MPN technique for enumerating Escherichia coli in shellfish. Int. J. Food Microbiol 40:57-64.
Ossmer, R., 1993, Simultaneous Detection of Total Coliforms and E.coli -
Fluorocult LMX-Broth. - 15th International Symposium/FOOD MICRO 1993. The International Committee on Food Microbiology and Hygiene, Bingen/Rhine.
Ossmer, R., Schmidt, W., Mende, U., 1999. Chromocult Coliform Agar –
Influence of Membran Filter Quality on Performance. XVII Congresso de la Sociedad, Granada.
103
Pierson, M.D dan L. M. Smooth. 2001. Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. Di dalam: Doyle, M.P., L.R. Beuchat, T.J. Mont ville. Editor. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers, 2nd.Ed. Chapter 4. pp. 71-87. ASM Press, Washington DC.
Rice, E.W., Allen, M.J., Brenner, D.J. and Edberg, S.C. (1991) Assay for ß-
Glucuronidase in Species of The genus Escherichia and Its Application for Drinking Water Analysis. Appl. Environ.Microbiol. 57:592-593
Robinson, R.K, 2002, Dairy Microbiology Handbook, Third edition, John Wiley
and Sons, Inc., New York [SNI]. 1992. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–2897–1992. Cara Uji
Cemaran Mikroba. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
[SNI]. 2006a. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–3553–2006. Air Minuman
Dalam Kemasan. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
[SNI]. 2006b. Standard Nasional Indonesia. SNI 01–2332-1-2006. Cara Uji
Mikrobiologi – Bagian 1: Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada Produk Perikanan. Dewan Standardisasi Nasional. Badan Standardisasi Nasional. Jakarta.
Supardi, I., Sukamto. 1999. Mikrobiologi dalam Pengolahan dan Keamanan
Pangan. Penerbit Alumni. Bandung. [USEPA] United States Environmental Protection Agency. 2001. EPA 816-F-01-
007. National Primary Drinking Water. Office of Water (4604). http://www.epa.gov/safewater. [8 November 2007]
[USEPA] United States Environmental Protection Agency. 2007. Ground Water
& Drinking Water: Approved Methods for Microorganisms. http://www.epa.gov/safewater/methods/rules_micro.html. [24 September 2007]
[WHO] World Health Organization. 2002. Heterotrophic Plate Count
Measurement in Drinking Water Safety Management. Assessing Microbial Safety of Drinking Water: Improving Approach and Methods. World Health Organization Sustainable Development and Healthy Environments and Organization for Economic Co-operation and Development. IWA Publishing. Geneva.
[WHO] World Health Organization. 2006. Guidelines for Drinking-Water
Quality, 3rd Ed. Volume 1. Microbial Aspects. Chapter 7:121-144. Geneva. http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/gdwq3rev/en/ [7 Mei 2008].
104
[WSL] WSL Consultants Pty Ltd. 2004. Comparative Trials of Enzyme Substrate Technologies in Drinking Water Supplies. Draft report. Victoria. Australia.
105
LAMPIRAN
Lampiran 1 Rancangan percobaan perbandingan metode APM dengan metode cepat untuk pengujian E. coli di sampel air proses
No. Metode*) Media Test Rendah Sedang Tinggi Tanpa Rendah Sedang Tinggi
1 APM-LST Lauryl Sulfate Broth 1 1 1 1 1 1 12 APM-LST Lauryl Sulfate Broth 1 1 1 1 1 1 13 APM-LST Lauryl Sulfate Broth 1 1 1 1 1 1 14 APM-LST Lauryl Sulfate Broth 1 1 1 1 1 1 1
1 APM-LMX Fluorocult LMX Broth 1 1 1 1 1 1 12 APM-LMX Fluorocult LMX Broth 1 1 1 1 1 1 13 APM-LMX Fluorocult LMX Broth 1 1 1 1 1 1 14 APM-LMX Fluorocult LMX Broth 1 1 1 1 1 1 1
1 ALT C. Coliform Agar (CCA) 1 1 1 1 1 1 12 ALT C. Coliform Agar (CCA) 1 1 1 1 1 1 13 ALT C. Coliform Agar (CCA) 1 1 1 1 1 1 14 ALT C. Coliform Agar (CCA) 1 1 1 1 1 1 1
1 P/A Readycult Coliform 100 1 TD***) TD 1 1 TD TD2 P/A Readycult Coliform 100 1 TD TD 1 1 TD TD3 P/A Readycult Coliform 100 1 TD TD 1 1 TD TD4 P/A Readycult Coliform 100 1 TD TD 1 1 TD TD
Air Proses + cemaran**)Kontrol Positif**)
Keterangan : *) APM-LST (Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth), APM-LMX (Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth), ALT (Angka Paling Mungkin), P/A (Presence Absence) **) Cemaran Rendah (4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml), Tinggi (80 cfu/ml), Tanpa (sample tanpa cemaran. ***) TD (Tidak ditest)
106
Lampiran 2 Cara perhitungan konsentrasi awal suspensi bakteri standar dengan metode Angka Lempeng Total
Sampel yang dicemari
107
Lampiran 3 Skema Pengujian Angka Paling Mungkin Konvensional.
108
Lampiran 4 Skema Pengujian Angka Paling Mungkin cepat dengan media Fluorocult LMX Broth.
109
Lampiran 5 Skema Pengujian Angka Lempeng Total Chromocult® Coliform
Agar.
110
Lampiran 6 Skema Pengujian Presence Absence Readycult® Coliform 100
111
Lampiran 7 Jumlah mikroba ter-recover dalam air proses yang dicemari bakteri E.coli, pada media Lauryl Sulfate Broth dan LMX Broth
Tabung APM Tabung APM Tabung APM1 Cemaran LST C1-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >16002 Cemaran LST C2-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >16003 Cemaran LMX C1-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >16004 Cemaran LMX C2-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >1600
5 Cemaran LST C1-2 03-Jun 532 140 554 1600 555 >16006 Cemaran LST C2-2 03-Jun 551 350 555 >1600 555 >16007 Cemaran LMX C1-2 03-Jun 541 170 554 1600 555 >16008 Cemaran LMX C2-2 03-Jun 551 350 555 >1600 555 >1600
9 Cemaran LST C1-3 26-Jun 550 240 553 920 555 >160010 Cemaran LST C2-3 26-Jun 550 350 555 >1600 555 >160011 Cemaran LMX C1-3 26-Jun 550 240 555 >1600 555 >160012 Cemaran LMX C2-3 26-Jun 551 350 555 >1600 555 >1600
1 Sampel+Cemaran LST S1C-1 18 Mei 550 240 554 1600 555 >16002 Sampel+Cemaran LST S2C-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >16003 Sampel+Cemaran LMX S1C-1 18 Mei 550 240 555 >1600 555 >16004 Sampel+Cemaran LMX S2C-1 18 Mei 552 540 555 >1600 555 >1600
6 Sampel+Cemaran LST S1C-2 03-Jun 550 240 553 920 555 >16005 Sampel+Cemaran LST S2C-2 03-Jun 552 540 553 920 555 >16007 Sampel+Cemaran LMX S1C-2 03-Jun 552 540 555 >1600 555 >16008 Sampel+Cemaran LMX S2C-2 03-Jun 550 240 554 1600 555 >1600
9 Sampel+Cemaran LST S1C-3 26-Jun 541 170 554 1600 555 >160010 Sampel+Cemaran LST S2C-3 26-Jun 540 130 555 >1600 555 >160011 Sampel+Cemaran LMX S1C-3 26-Jun 551 350 554 1600 555 >160012 Sampel+Cemaran LMX S2C-3 26-Jun 550 240 554 1600 555 >1600
13 Sampel Air LST S1-1 18 Mei 000 <1.814 Sampel Air LST S2-1 18 Mei 000 <1.815 Sampel Air LMX S1-1 18 Mei 000 <1.816 Sampel Air LMX S2-1 18 Mei 000 <1.8
17 Sampel Air LST S1-1 03-Jun 000 <1.818 Sampel Air LST S2-1 03-Jun 000 <1.8 LST keruh gas (-)19 Sampel Air LMX S1-1 03-Jun 000 <1.820 Sampel Air LMX S2-1 03-Jun 000 <1.8 LMX keruh warna (-)
21 Sampel Air LST S1-1 26-Jun 000 <1.822 Sampel Air LST S2-1 26-Jun 000 <1.823 Sampel Air LMX S1-1 26-Jun 000 <1.824 Sampel Air LMX S2-1 26-Jun 000 <1.8
Rendah Sedang Tinggi
Pembacaan Tabung / Nilai APM akhirNo
Tanggal Inoku lasi
Kode Jenis Media
Deskripsi
Catatan : Rendah (konsentrasi cemaran 4 cfu/ml), Sedang (40 cfu/ml) dan Tinggi (80 cfu/ml)
112
Lampiran 8 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth (LST)
Cemaran Sampel + CemaranRendah Rendah
18 Mei 240 24003 Juni 245 39026 Juni 395 150
Anova: Two-Factor Without Replication (LST - 3 sampling - dua perlakuan)SUMMARY Count Sum Average Variance
Row 1 2 480 240 0Row 2 2 635 317.5 10512.5Row 3 2 545 272.5 30012.5
Column 1 3 880 293.3333333 7758.3333Column 2 3 780 260 14700
ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critRows 6,058.33 2.00 3,029.17 0.16 0.87 19.00 Columns 1,666.67 1.00 1,666.67 0.09 0.80 18.51 Error 38,858.33 2.00 19,429.17
Total 46,583.33 5.00
Jenis MediaTanggal Inokulasi
LST
Lampiran 9 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Fluorocult LMX Broth
Cemaran Sampel + CemaranRendah Rendah
18 Mei 240 39003 Juni 260 39026 Juni 295 295
Anova: Two-Factor Without Replication (LMX - 3 sampling - dua perlakuan)SUMMARY Count Sum Average Variance
Row 1 2 630 315 11250Row 2 2 650 325 8450Row 3 2 590 295 0
Column 1 3 795 265 775Column 2 3 1075 358.3333333 3008.333
ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critRows 933.33 2.00 466.67 0.14 0.88 19.00 Columns 13,066.67 1.00 13,066.67 3.94 0.19 18.51 Error 6,633.33 2.00 3,316.67
Total 20,633.33 5.00
Tanggal Inokulasi
Jenis Media
LMX
113
Lampiran 10 Perhitungan Anova Metode Angka Paling Mungkin dengan media Lauryl Sulfate Tryptose Broth dan Fluorocult LMX Broth
Jenis Media Cemaran Sampel + CemaranLST 240 240
245 390395 150
LMX 240 390260 390295 295
Anova: Two-Factor With Replication
SUMMARY Cemaran Sampel + Cemaran TotalLST
Count 3.00 3.00 6.00 Sum 880.00 780.00 1,660.00 Average 293.33 260.00 276.67 Variance 7,758.33 14,700.00 9,316.67
LMX
Count 3.00 3.00 6.00 Sum 795.00 1,075.00 1,870.00 Average 265.00 358.33 311.67 Variance 775.00 3,008.33 4,126.67
Total
Count 6.00 6.00 Sum 1,675.00 1,855.00 Average 279.17 309.17 Variance 3,654.17 9,984.17
ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critSample 3,675.00 1.00 3,675.00 0.56 0.48 5.32 Columns 2,700.00 1.00 2,700.00 0.41 0.54 5.32 Interaction 12,033.33 1.00 12,033.33 1.83 0.21 5.32 Within 52,483.33 8.00 6,560.42
Total 70,891.67 11.00
114
Lampiran 11 Perhitungan Anova Metode Angka Lempeng Total dengan
media Chromocult® Coliform Agar
Cemaran Sampel + CemaranRendah Rendah
18 Mei 188 20003 Juni 175 23826 Juni 150 175
Anova: Two-Factor Without Replication (CCA - 3 sampling - dua perlakuan)SUMMARY Count Sum Average Variance
Row 1 2 387.5 193.75 78.125Row 2 2 412.5 206.25 1953.125Row 3 2 325 162.5 312.5
Column 1 3 512.5 170.8333333 364.58333Column 2 3 612.5 204.1666667989.58333
ANOVASource of Variation SS df MS F P-value F critRows 2,031.25 2.00 1,015.63 3.00 0.25 19.00 Columns 1,666.67 1.00 1,666.67 4.92 0.16 18.51 Error 677.08 2.00 338.54
Total 4,375.00 5.00
CCA
Jenis MediaTanggal Inokulasi
115
Lampiran 12. Tabel Angka Paling Mungkin Bakteri 100 g (ml) Seri 5 Tabung dengan 10, 1 dan 0.1 g (ml) material uji
Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN Pos* MPN
10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1 10;1;0,1000 <1.8 100 2 200 4.5 300 7.8 400 13 500 23001 1.8 101 4 201 6.8 301 11 401 17 501 31002 3.6 102 6 202 9.1 302 13 402 21 502 43003 5.4 103 8 203 12 303 16 403 25 503 58004 7.2 104 10 204 14 304 20 404 30 504 76005 9 105 12 205 16 305 23 405 36 505 95010 1.8 110 4 210 6.8 310 11 410 17 510 33011 3.6 111 6.1 211 9.2 311 14 411 21 511 46012 5.5 112 8.1 212 12 312 17 412 26 512 64013 7.3 113 10 213 14 313 20 413 31 513 84014 9.1 114 12 214 17 314 23 414 36 514 110015 11 115 14 215 19 315 27 415 42 515 130020 3.7 120 6.1 220 9.3 320 14 420 22 520 49021 5.5 121 8.2 221 12 321 17 421 26 521 70022 7.4 122 10 222 14 322 20 422 32 522 95023 9.2 123 12 223 17 323 24 423 38 523 120024 11 124 15 224 19 324 27 424 44 524 150025 13 125 17 225 22 325 31 425 50 525 180030 5.6 130 8.3 230 12 330 17 430 27 530 79031 7.4 131 10 231 14 331 21 431 33 531 110032 9.3 132 13 232 17 332 24 432 39 532 140033 11 133 15 233 20 333 28 433 45 533 180034 13 134 17 234 22 334 31 434 52 534 210035 15 135 19 235 25 335 35 435 59 535 250040 7.5 140 11 240 15 340 21 440 34 540 130041 9.4 141 13 241 17 341 24 441 40 541 170042 11 142 15 242 20 342 28 442 47 542 220043 13 143 17 243 23 343 32 443 54 543 280044 15 144 19 244 25 344 36 444 62 544 350045 17 145 22 245 28 345 40 445 69 545 440050 9.4 150 13 250 17 350 25 450 41 550 240051 11 151 15 251 20 351 29 451 48 551 350052 13 152 17 252 17 352 32 452 56 552 540053 15 153 19 253 26 353 37 453 64 553 920054 17 154 22 254 29 354 41 454 72 554 1600055 19 155 24 255 32 355 45 455 81 555 >1600
* jumlah tabung positif dengan masing-masing menggunakan 3 volume.
116
117
Lampiranl 13 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Angka Paling Mungkin.
g/l
mediaRp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
min max
1 LST (Double Strength) 500 g 906,000 71.2 129 10 1,290 5 6,451 5 semua tabung positifLST (Single Strength) 500 g 35.6 65 5 323 10 3,225 10 semua tabung positif
2 EC Broth (single strength) 500 g 1,076,000 37.0 80 10 796 15 11,944 1 2 15 semua tabung positif3 LEVINE EMB Agar 500 g 1,686,000 36.0 121 15 1,821 15 27,313 1 1 15 2 koloni terduga/petri4 Nutrient Agar (agar miring) 500 g 1,221,000 20.0 49 8 391 30 11,722 1 1 30 gores ke NA miring5 MR-VP Broth Base (MR) 500 g 1,105,000 17.0 38 5 188 30 5,636 30 dikonfirmasi IMVIC
MR-VP Broth Base (VP) 500 g 17.0 38 5 188 30 5,636 30 dikonfirmasi IMVIC6 SIMMONS Citrate Agar 500 g 1,799,000 22.3 80 5 401 30 12,035 30 dikonfirmasi IMVIC7 Tryptone Water 500 g 1,556,000 15.0 47 5 233 30 7,002 30 dikonfirmasi IMVIC8 KOVAC'S indole reagent 100 ml 488,000 4,880 0.25 1,220 30 36,600 dikonfirmasi IMVIC9 Reagent MR 100 ml 488,000 4,880 0.25 1,220 30 36,600 dikonfirmasi IMVIC
10 Ragent VP 100 ml 488,000 4,880 0.25 1,220 30 36,600 dikonfirmasi IMVICTotal Biaya / test 10,813,000 285 200,763 5 7 195Total Biaya / test (duplo) 401,526 10 7 390
1 LMX (Double Strength) 500 g 7,631,000 34.0 519 10 5,189 5 25,945 5 tabung positifLMX (Single Strength) 500 g 17.0 259 5 1,297 10 12,973 10 tabung positif
2 KOVAC'S indole reagent 100 ml 488,000 4,880 0.25 1,220 15 18,300 tabung positifTotal Biaya / test 8,119,000 30 57,218 1 2 15Total Biaya / test (duplo) 114,436 2 2 30
Pack
1
Rp/test
Metode APM LMX (seri 5 tabung)
No
Metode APM LST (seri 5 tabung)
Jumlah Tabung
AsumsiMetode Pengujian
E.coliInvestasi
media
1
1 2
Total hari
1 2
117
117
Lampiran 14 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian Koliform negatif dengan Metode Angka Paling Mungkin
g/l
mediaRp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
min max
1 LST (Double Strength) 500 g 906,000 71.2 129 10 1,290 5 6,451 5 semua tabung negatifLST (Single Strength) 500 g 35.6 65 5 323 10 3,225 10 semua tabung negatifTotal Biaya / test 906,000 15 9,676 1 2 15Total Biaya / test (duplo) 19,352 2 2 30
Metode APM LST (seri 5 tabung) bila koliform negatif
1 2
NoMetode Pengujian
E.coliPack
Investasi media
Rp/testTotal hari Jumlah
TabungAsumsi
Lampiran 15 Perhitungan Biaya Investasi Media, Harga per Test, Jumlah Hari Pengujian, Jumlah Tabung yang digunakan dalam Pengujian E.coli dengan Metode Cepat Angka Lempeng Total, dan Presence Absence.
g/l
mediaRp/ml media
ml / tabung
Rp / tabung
Jumlah
min max
1 Readycult Coliforms 100 20 test 821,000 41,050 1 41,050 1 Botol positif 2 KOVAC'S indole reagent 100 ml 488,000 4,880 2 9,760 2 19,520 Botol positif
Total Biaya / test 1,309,000 3 60,570 1 2 1Total Biaya / test (duplo) 121,140 2 2 2
1 Chromocult Coliform Agar 500 g 4,490,000 26.5 238 15 3,570 2 7,139 2 duplo2 KOVAC'S indole reagent 100 ml 488,000 4,880 0.02 98 4 390 2 koloni terduga
Total Biaya / test 4,978,000 6 7,530 1 2 2Total Biaya / test (duplo) 15,059 2 2 4
1 2
2
Metode P/A - Readycult Coliform 100
Metode ALT Chromocult Coliform Agar
1
Investasi media
Rp/testTotal hari Jumlah
TabungNo
Metode Pengujian E.coli
Pack Asumsi
Lampiran 16 Persyaratan Mikrobiologis Kualitas Air Minum Menurut Peraturan Menteri Kesehatan 416:1990
No Parameter Satuan Kadar maksimum yang diperbolehkan
Keterangan
1 Koliform Tinja
Jumlah per 100 ml 0
2 Total Koliform
Jumlah per 100 ml 0 95% dari sampel yang diperiksa selama setahun. Kadang-kadang boleh ada 3 per 100 ml sampel air tetapi tidak berturut-turut
Sumber : Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor : 416/MENKES/SK
Lampiran 17 Nilai Pedoman untuk Verifikasi Kualitas Mikrobiologi Air Organisme Nilai Pedoman Semua air yang ditujukan untuk langsung diminum E.coli atau bakteri koliform tahan panas Air proses yang masuk ke sistim distribusi E.coli atau bakteri koliform tahan panas Bakteri koliform total Air proses didalam ke sistim distribusi E.coli atau bakteri koliform tahan panas Bakteri koliform total
Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Tidak boleh terdeteksi dalam setiap 100 ml sample Dalam hal suplai dalam jumlah besar dimana cukup sampel yang dianalisa, tidak boleh ada dalam 95% sample yang diambil selama tiap periode 12 bulan
Sumber : World Health Organization. 2006. Guidelines for Drinking-Water Quality, 3rd Ed Vol 1 Recommendations WHO, Geneva, 2004
117
Lampiran 18 Skema Pembuatan Air Proses di PT Yummy Food Utama
Sampel diambil dari tanki 3 yang digunakan untuk proses produksi dan pencucian areal produksi