PENGENDALIAN BIOLOGI DARI NEMATODA PURU AKAR (Meloidogyne

javanica) DENGAN Trichoderma harzianum

Adik Pipit Aprilianto (09/281766/PN/11589)

Sharon et al., 2001. Phytopathology (91) : 687-693.

LATAR BELAKANG

• Tomat (Lycopersicon esculentum) adalah komoditas hortikultura yang penting di Indonesia (Supriati et al., 2009).

• Nematoda parasitik dapat menimbulkan kerugian sebesar 20-25% pada sistem produksi pertanian di daerah tropis maupun sub tropis (Pranggeso, 2010).

• Nematoda puru akar (Meloidogyne spp) dapat menyebabkan kehilangan hasil sebanyak 25-50% (Rahayu et al., 1977).

• Telah dilaporkan ada sekitar 200 spesies fungi nematofagus (Trichoderma harzianum) (Nordbring – Hertz et al., 2006)

• Mekanisme jamur Trichoderma harzianum dilakukan dengan mekanisme mikoparasitik, antibiosis, kompetisi dan menghancurkan dinding sel (Harman, 2000).

TUJUAN

Untuk mengetahui efektivitas pengendalian biologi nematoda puru akar (Meloidogyne jacanica) dengan jamur nematofagus Trichoderma Harzianum

ANALISIS STATISTIK

Perbanyakan nematoda Penyiapan dan isolasi Trichoderma

Penyiapan tanah inokulasi nematoda

Penyiapan tanaman tomat

PERCOBAAN PADA KONDISI RUMAH KACA

• Pengaruh ekstrak tanah terhadap nematoda• Aktivitas pada tanah yang diberi perlakuan Trichoderma dan kontrol• Evaluasi aktivitas proteinase Prb1-transformed lines• Implementasi Trichoderma T-203 untuk penyakit puru akar• Aktivitas Trichoderma T-203, WT, and P-2 terhadap nematoda J2 tanah terinokulasi• Perkembangan Nematoda di dalam akar pada tanah yang terinokulasi Trichoderma • Evaluasi aktivitas Trichoderma pada tanah yang terinokulasi secara alami• Interaksi langsung antara Trichoderma T-203, WT, and P-2 dengan nematoda• Aktivitas protease pada ekstrak tanah

METODOLOGI

Penyiapan dan isolat Trichoderma

• Isolat Trichoderma harzianum Rifai yang berasal dari israel (T-203)• Isolat Trichoderma harzianum IMI 206040 yang mengekspresikan aktivitas

Proteinase Prb1 (P-1, P-2, P-5, Dan P-6 )• Isolat Trichoderma harzianum tipe liar (WT)

Ditumbuhkan pada media bekatul-sekam hingga 108 CFU/g (Sivan et al.,1984)

Penyiapan Tanah Dan Inokulasi Nematoda

• Biakan isolat Trichoderma dicampurkan ke tanah

• J2 nematoda ditambahkan pada 10 hari sebelum tanam

Tanah lempung pasiran (pH 7.8; 0.8% bahan organik) yang diambil dari lapisan dalam yang disimpan dalam keadaan kering

•Tanah terinokulasi secara alami merupakan tanah tempat tumbuh tanaman tomat terinfeksi Meloidogyne javanica selama 2 bulan dan dicabut.

• Tanah ini mengandung massa telur dan J2 (≈2,000 J2 per liter)

Tanah terinokulasi nematoda Tanah terinokulasi secara alami

Ekstraksi tanah

Ekstraksi Tanah

Perlakuan:• Biakan isolat T-203• Biakan isolat WT• Biakan isolat P-2• Media bekatul-sekam tanpa jamur• Biakan trichoderma yang

diautoclave dua kali• Kontrol

100 g sampel tanah dilarutkan ke dalam 100 ml air steril

Didiamkan hingga mengendap selama 30 menit dan supernatan diambil.

Centrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit dan supernatan diambil.

Disaring dengan 0.22-μm Durapore membrane steril lalu dikeringkan.

Setelah itu di larutkan ke dalam akuabidest dengan perbandingan 10:1

Ekstraksi dilakukan 1 bulan setelah inokulasi perlakuan.

Pengaruh Ekstrak Tanah Terhadap Nematoda

Perlakuan :• Air steril• Ekstrak tanah• Fraksi rendah ekstrak tanah (<3 kDa)• Fraksi tinggi ekstrak tanah (>3 kDa) • dipanaskan 100°C selama 10 menit

95 μl ekstrak tanah untuk setiap perlakuan.

Suspensi nematode 100 J2 atau kumpulan telur termasuk gall-nya dimasukkan

diinkubasi pada suhu 25 °C

persentase mobilitas J2 setelah 2 hari

Telur yang menetas diamati setelah 6 hari

multiwell flat-bottom plates

Aktivitas Pada Tanah Yang Diberi Perlakuan Trichoderma sp. Dan Kontrol

Perlakuan:• Biakan Trichoderma T-203 pada media

bekatul-sekam• Media bekatul-sekam tanpa jamur• Biakan trichoderma yang diautoclave dua kali• Kontrol

perlakuan yang sama dilakukan untuk tanah terinokulasi secara alami untuk isolat T-203 atau isolat WT

Perlakuan dicampurkan ke Tanah yang telah diinokulasi 2.000 J2 nematoda dalam pot

Setelah 10 hari setelah inokulasi Bibit tomat ditanam

Setelah 30 hari tanaman dibongkar dan ditentukan berat basah dan tingkat keparahan gall yang terbentuk dengan sekala 0-5

• 10 ulangan setiap perlakuannya

Evaluasi Aktivitas Proteinase Prb1-Transformed Lines.

Perlakuan:• Biakan isolat WT pada media bekatul-sekam• Biakan isolat P-1, P-2, P-5, and P-6 pada

media bekatul-sekam• Kontrol

Setelah 10 hari setelah inokulasi Bibit tomat ditanam

Setelah 30 hari tanaman dibongkar dan ditentukan berat basah dan tingkat keparahan gall yang terbentuk dengan sekala 0-5

• 10 ulangan setiap perlakuannya

Perlakuan dicampurkan ke Tanah yang telah diinokulasi 2.000 J2 nematoda dalam pot

Implementasi Trichoderma T-203 Untuk penyakit root-balls.

Setelah 10 hari setelah inokulasi Bibit tomat ditanam

Setelah 1 bulan tanaman dibongkar dan ditentukan berat basah dan tingkat keparahan gall yang terbentuk dengan sekala 0-5

• 10 ulangan setiap perlakuannya

Benih tomat yang dilengkapi dengan isolat T-203 selama pertumbuhan di kebun bibit ditanam pada pot yang berisi tanah terinokulasi secara alami

• Benih tomat yang tidak diberi perlakuan sebagai kontrol

Aktivitas Trichoderma T-203, Wt, And P-2 Terhadap Nematoda J2 Tanah Terinokulasi

Perlakuan:• Biakan isolat T-203 pada media bekatul-

sekam• Biakan isolat WT pada media bekatul-sekam• Biakan isolat P-2 pada media bekatul-sekam• Kontrol

Setelah 10 hari setelah inokulasi Bibit tomat ditanam

Setelah 6 minggu tanaman dibongkar dan ditentukan berat basah dan tingkat keparahan gall yang terbentuk dengan sekala 0-5

• 10 ulangan setiap perlakuannya

Perlakuan dicampurkan ke Tanah yang telah diinokulasi 8.000 J2 nematoda dalam pot

Perkembangan Nematoda Di Dalam Akar Pada Tanah Yang Terinokulasi Trichoderma sp.

Akar diberikan asam fuchsin untuk membedakan stadia siklus hidup (juvenil 2, 3, 4 dan dewasa) nematoda pada akar

Pot diisi dengan tanah tanpa perlakuan isolat jamur Inokulasi 100 J2 setiap pot

• Benih tomat yang tidak diberi perlakuan sebagai kontrol

10 hari dan 28 hari setelah tanam, tanaman diambil

Evaluasi Aktivitas Trichoderma Pada Tanah Yang Terinokulasi Secara Alami

Setelah 4 minggu setelah inokulasi Bibit tomat ditanam

Setelah 2 bulan tanaman dibongkar dan ditentukan berat basah dan tingkat keparahan gall yang terbentuk dengan sekala 0-5

• 4 ulangan setiap perlakuannya

Setengah pot diisi dengan tanah terinokulasi secara alami dan setengah bagian lainnya diisi dengan campuran antara tanah terinokulasi dengan biakan isolat WT

10 gram sampel tanah diambil untuk estimasi ketahanan jamur pada tanah yang diplating pada selective medium dan dihitung CFU per gram

• Tanah terinokulasi yang tidak diberi perlakuan sebagai kontrol

Interaksi Langsung Antara Trichoderma T-203, WT, And P-2 Dengan Nematoda

Interaksi diamati dengan mikroskop

Chamber diinkubasi pada suhu 27 °C selama 1 minggu

Yang dicobakan setiap fase hidup dengan setiap isolat jamur.

Two-well chamber slides diisi lapisan tipis 1% Phytagel

50 Embrio muda dari axenic, 50 J2 dari telur dan 50 masa telur muda

Diletakkan pada 4 tepi chamber.

Biakan Isolat jamur diletakkan pada tengah chamber.

Aktivitas Protease Pada Ekstrak Tanah

Ekstrak tanah dimasukkan ke dalam 250 μl campuran buffer

Inkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C

ditambahkan 250 μl of 10% trichloroacetic acid

Tabung dibiarkan diatas es selama 30 menit

Sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit

Dibandingkan dengan aktivitas protease dari Streptomyces griseus

Absorbansi supernatan diukur pada 400 nm

Pengaruh Ekstrak Tanah Terhadap Nematoda

Evaluasi aktivitas proteinase Prb1-transformed lines

Isolat Trichoderma

Isolat Trichoderma

Aktivitas Trichoderma T-203, WT, and P-2 Terhadap Nematoda J2 Tanah Terinokulasi

Evaluasi Aktivitas Trichoderma Pada Tanah Yang Terinokulasi Secara Alami

Kenampakan Akar

Perkembangan Nematoda Di Dalam Akar Pada Tanah Yang Terinokulasi Trichoderma sp.

Pengaruh Tanah, Aktivitas Protease, Daya Menetas Dan Mobilitas Nematoda

Pengaruh Tanah, Aktivitas Protease, Daya Menetas Dan Mobilitas Nematoda

Interaksi Langsung Antara Trichoderma T-203, WT, and P-2 Dengan Nematoda

KESIMPULAN

• Isolat Trichoderma T-203, P-2, WT dapat mengkoloni Meloidogyne javanica pada pengujian rumah kaca.

• Isolat P-2 mengeksresi nematisidal dan aktivitas proteolitik, sehingga dapat melalukan penetrasi ke dalam telur Meloidogyne javanica

• Isolat P-2 dan WT lebih baik menghambat perkembangan Meloidogyne javanica dibandingkan isolat T-203

TERIMAKASIH