pengenalan dasar teknik bio-molekuler

PENGENALAN DASAR

TEKNIK

BIO-MOLEKULER

UU No 28 tahun 2014 tentang Hak Cipta Fungsi dan sifat hak cipta Pasal 4 Hak Cipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 3 huruf a merupakan hak eksklusif yang terdiri atas hak moral dan hak ekonomi. Pembatasan Pelindungan Pasal 26 Ketentuan sebagaimana dimaksud dalam Pasal 23, Pasal 24, dan Pasal 25 tidak berlaku terhadap: i. Penggunaan kutipan singkat Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait untuk pelaporan

peristiwa aktual yang ditujukan hanya untuk keperluan penyediaan informasi aktual; ii. Penggandaan Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait hanya untuk kepentingan penelitian

ilmu pengetahuan; iii. Penggandaan Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait hanya untuk keperluan pengajaran,

kecuali pertunjukan dan Fonogram yang telah dilakukan Pengumuman sebagai bahan ajar; dan

iv. Penggunaan untuk kepentingan pendidikan dan pengembangan ilmu pengetahuan yang memungkinkan suatu Ciptaan dan/atau produk Hak Terkait dapat digunakan tanpa izin Pelaku Pertunjukan, Produser Fonogram, atau Lembaga Penyiaran.

Sanksi Pelanggaran Pasal 113 1. Setiap Orang yang dengan tanpa hak melakukan pelanggaran hak ekonomi sebagaimana

dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf i untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 1 (satu) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp100.000.000 (seratus juta rupiah).

2. Setiap Orang yang dengan tanpa hak dan/atau tanpa izin Pencipta atau pemegang Hak Cipta melakukan pelanggaran hak ekonomi Pencipta sebagaimana dimaksud dalam Pasal 9 ayat (1) huruf c, huruf d, huruf f, dan/atau huruf h untuk Penggunaan Secara Komersial dipidana dengan pidana penjara paling lama 3 (tiga) tahun dan/atau pidana denda paling banyak Rp500.000.000,00 (lima ratus juta rupiah).

PENGENALAN DASAR

TEKNIK

BIO-MOLEKULER

Chris Adhiyanto

Laifa Hendarmin

Rini Puspitaningrum

PENGENALAN DASAR TEKNIK BIO-MOLEKULER

Chris Adhiyanto

Laifa Hendarmin Rini Puspitaningrum

Editor:

dr. Hari Hendarto, SpPD-KEMD, Ph.D.

Desain cover Zahra Muthmainnah

Solihin, S.Pd.

Sumber freepik.com

Tata letak :

Amira Dzatin Nabila

Proofreader : Avinda Yuda Wati

Ukuran :

vi, 82 hlm, Uk: 15.5x23 cm

ISBN :

Cetakan Pertama:

Bulan 2020

Hak Cipta 2020, Pada Penulis

Isi diluar tanggung jawab percetakan

Copyright © 2020 by Deepublish Publisher

All Right Reserved

Hak cipta dilindungi undang-undang Dilarang keras menerjemahkan, memfotokopi, atau

memperbanyak sebagian atau seluruh isi buku ini tanpa izin tertulis dari Penerbit.

PENERBIT DEEPUBLISH

(Grup Penerbitan CV BUDI UTAMA) Anggota IKAPI (076/DIY/2012)

Jl.Rajawali, G. Elang 6, No 3, Drono, Sardonoharjo, Ngaglik, Sleman

Jl.Kaliurang Km.9,3 – Yogyakarta 55581 Telp/Faks: (0274) 4533427

Website: www.deepublish.co.id www.penerbitdeepublish.com

E-mail: [email protected]

v Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler

Kata Pengantar

Buku Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler ini merupakan

pengembangan dan perbaikan dari buku sebelumnya yang berjudul

Genetika Molekuler dan Aplikasinya. Dalam buku ini, kami

menambahkan beberapa metode teknik pembelajaran dalam

melakukan penelitian bio-molekuler khususnya yang berkaitan

dengan DNA, RNA dan Protein.

Buku ini kami tulis berdasarkan hasil pengalaman kerja dalam

membimbing mahasiswa S-1, S-2 dan S-3 dari Program Studi Ilmu

Kedokteran, Farmasi, Gizi dan Biologi, yang telah dilakukan di

Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah

Jakarta sejak 2013 hingga sekarang. Selain itu, isi buku ini juga

merupakan hasil pengalaman yang kami peroleh saat melakukan

penelitian kolaborasi dengan universitas di luar Indonesia.

Kami harapkan, buku ini dapat membantu dan menjadi dasar

pengetahuan melakukan penelitian bio-molekuler mahasiswa S-1, S-2

maupun S-3 dalam melakukan penelitian bio-molekuler.

Kami sebagai penulis merasa masih banyak kekurangan yang

ada dalam buku ini, karenanya kami akan berupaya menambah

informasi dan pengetahuan yang kami miliki agar ke depannya dapat

kami tambahkan teknik maupun informasi tambahan lainnya dalam

buku yang sama.

Semoga buku ini dapat membantu bagi para peneliti pemula

dalam bidang bio-molekuler.

Jakarta, Februari 2020

Tim Penulis

vi Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler

Daftar Isi

Kata Pengantar .................................................................................................................... v

Daftar Isi ................................................................................................................................ vi

BAB I. ISOLASI GENOM ......................................................................... 1

1.1. Pendahuluan ..................................................................................... 1

1.1.1. Persiapan Genom Manusia .......................................... 2

1.1.2. Menghancurkan Sel ......................................................... 2

1.1.3. Membuang Protein ........................................................... 3

1.1.4. Membuang RNA ................................................................. 4

1.1.5. Pemekatan DNA ................................................................. 4

BAB II. ELEKTROFORESIS DAN IDENTIFIKASI GENOM

DNA ............................................................................................ 13

BAB III. ISOLASI RNA ............................................................................ 16

BAB IV. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) .............................. 23

BAB V. REAL-TIME PCR/KUALITATIF PCR (RT-PCR/

QPCR) ........................................................................................ 34

BAB VI. MERANCANG PRIMER ........................................................... 60

BAB VII. ISOLASI PROTEIN ................................................................... 67

7.1. Pemurnian Protein ..................................................................... 69

7.2. SDS-Page .......................................................................................... 70

Daftar Pustaka .................................................................................................................. 78

Tentang Penulis ............................................................................................................... 81

1 Pengenalan Dasar Teknik Bio-Molekuler

BAB I. ISOLASI GENOM

1.1. Pendahuluan

Mendapatkan DNA berkualitas tinggi dan utuh seringkali

merupakan langkah pertama dan paling penting dalam banyak

aplikasi biologi molekuler, seperti kloning DNA, sekuensing, PCR, dan

elektroforesis. Mengisolasi keseluruhan DNA utuh dari berbagai

macam sampel jaringan memiliki kesulitan yang berbeda karena

tergantung dari sifat fisik dan biokimia jaringan yang dituju. Sebagai

contoh, banyak metode ekstraksi DNA akan bekerja dengan baik untuk

jaringan seperti hati, namun pada jaringan lain seperti jantung, lemak,

otak, dan limpa, isolasi DNA hingga saat ini masih merupakan hal yang

sulit untuk dilakukan. Isolasi yang paling umum dan mudah,

khususnya isolasi genom pada hewan adalah dengan menggunakan

sampel darah atau cairan tubuh dari organisme tersebut.

Beberapa metode telah banyak dikembangkan dengan tingkat

kesukaran, kemurnian hasil dan konsentrasi hasil yang berbeda-beda.

Namun demikian, teknik konvensional masih merupakan teknik yang

terbaik. Permasalahannya adalah teknik konvensional ini

menghasilkan produk buangan atau limbah yang berbahaya. Teknik

konvensional biasa menggunakan fenol-kloroform sebagai proses

menghilangkan materi lain selain nukleotida, misal protein.

Sebagaimana diketahui fenol merupakan bahan yang sangat korosif

sehingga pembuangan limbah yang tidak tepat, akan mencemari

lingkungan sekitarnya.

Pada teknik dasar bio-molekuler, kami akan memaparkan

beberapa teknik yang dapat digunakan untuk isolasi genom dari

bahan cairan tubuh. Pemilihan sumber cairan tubuh, bukan jaringan

hanya pada kemudahan dalam pengerjaan isolasi. Perbedaan isolasi

dari jaringan adalah pada langkah bagaimana teknik menghancurkan


jaringan tersebut. Dengan menguasai teknik dasar isolasi genom dari

bahan cairan tubuh, akan memudahkan kita dalam mempelajari teknik

isolasi genom dari sumber jaringan.

1.1.1. Persiapan Genom Manusia

Tujuan dari percobaan ini adalah mengisolasi dan

mempurifikasikan dalam jumlah banyak genom manusia. Sumber

yang paling mudah dan tidak korosif adalah saliva ataupun usapan

lapisan mukosa mulut pipi bagian dalam.

Telah kita ketahui bahwa konsentrasi jumlah DNA dalam sel

hanya sedikit, ditemukan sebagian besar di inti sel (90%). Karena

jumlah yang sangat sedikit, maka diperlukan keterampilan dalam

memisahkan DNA dengan komponen sel lainnya. Ada banyak metode

memurnikan atau purifikasi DNA dengan komponen lain, terutama

protein. Namun semua proses memiliki prinsip dasar yang sama,

yaitu:

1. Menghancurkan sel.

2. Membuang protein.

3. Membuang RNA.

4. Memekatkan DNA.

1.1.2. Menghancurkan Sel

Menghancurkan sel merupakan salah satu langkah penting

dalam pemurnian DNA. Sel dapat dihancurkan atau dipecah

menggunakan teknik sonikasi, grinding/giling, cacah atau dengan

tekanan tinggi agar sel hancur. Namun, langkah ini sering

mengakibatkan DNA terpotong-potong jika metode yang digunakan

kurang baik, sehingga kemurnian DNA akan turun.

Langkah yang terbaik adalah menggunakan bahan kimia

seperti pemberian detergen/sabun atau menggunakan teknik

enzimatik. Sabun akan melarutkan lipid membran sel. Sabun juga akan

memiliki peran sebagai inhibitor DNAse dan dapat mendenaturasi

protein, sehingga membantu dalam membuang protein dari larutan

uji. Detergen yang biasanya digunakan sebagai pelarut lisis sel hewan


adalah detergen yang bersifat anionic seperti SDS (sodium deodesil

sulfat) atau Sarkosil (sodium deodesil sarkosinat).

1.1.3. Membuang Protein

Langkah selanjutnya dalam proses isolasi dan pemurnian

genom adalah membuang semua materi atau komponen protein,

dikenal sebagai deproteinasi. Prinsip dasar pada proses ini adalah

membuang kemampuan kelarutan protein, sehingga protein akan

menjadi tidak larut (mengendap) sedangkan asam nukleat tetap larut.

Banyak pelarut organik yang dapat digunakan untuk

mengendapkan protein. Metode fenol dan kloroform, umumnya

digunakan dalam mengendapkan protein. Metode fenol mempunyai

prinsip sebagai berikut: Fenol adalah kristal pada suhu kamar, namun

dengan adanya 20 persen air, ia membentuk suspensi berair yang

mengandung misel fenol yang dikelilingi oleh molekul air. Molekul

protein banyak mengandung residu asam amino hidrofobik yang

terpusat di pusat molekul. Ketika larutan yang mengandung protein

terlarut dicampurkan dengan fenol yang bersifat lebih hidrofobik akan

menyebabkan fenol akan berdifusi ke dalam inti protein, sehingga

protein membengkak dan protein menjadi terbuka (unfold) dan ter-

denaturasi. Protein yang terdenaturasi dengan kelompok hidrofobik

yang terpapar dan dikelilingi oleh misel fenol, jauh lebih mudah larut

dalam fase fenol daripada fasa berair. Akibatnya, protein dipartisi ke

fasa fenol yang meninggalkan asam nukleat dalam fasa berair. Asam

nukleat tidak memiliki gugus hidrofobik sama sekali dan tidak dapat

larut dalam fase fenol. Selain itu, fenol juga berperan dalam

membuang fraksi lipid dalam larutan sampel DNA tersebut.

Metode kloroform digunakan karena kloroform tidak larut

dalam air sehingga mencegah hilangnya DNA ke fase organik.

Deproteinisasi oleh kloroform didasarkan atas ter-denaturasi rantai

polipeptida pada interfase air-kloroform. Konsentrasi protein yang

tinggi pada interfase akan menyebabkan protein mengendap. Namun

deproteinisasi ini sangat tergantung pada pembentukan daerah

interfase yang besar, sehingga bantuan mekanik yang besar yaitu


pengocokan/penggoyangan yang kuat. Selain itu, metode ini hanya

cocok untuk mendapatkan DNA dengan total ukuran 20 ribu-50 ribu

pasang basa (umumnya DNA virus). Metode fenol dan kloroform

memiliki keburukan dalam hal limbah. Sifat toksin yang tinggi,

memerlukan penangan limbah yang khusus.

Metode lain adalah menggunakan enzim. Protein dapat

dibuang dalam larutan sampel genom menggunakan enzim protease.

Enzim ini akan memecah atau mencerna semua protein. Ada dua

macam enzim yang sering digunakan yaitu proteinase K dan pronase.

Kedua enzim ini sangat stabil dan diperoleh dari jamur. Enzim ini akan

bekerja aktif pada larutan yang rendah seperti detergen anionik, tinggi

konsentrasi garam EDTA, pH 6-10 dan suhu antara 500-600C.

Perbedaan antar kedua enzim ini adalah pronase bersifat self-

digesting, sehingga harus selalu ditambahkan pada saat proses

berlangsung. Metode lain adalah dengan penggunaan asam. Prinsip

dasarnya adalah penambahan larutan asam seperti asam cuka akan

menyebabkan koagulasi protein, sehingga protein akan mudah

diendapkan. Proses ini terjadi akibat asam akan mengacaukan

jembatan garam dengan adanya muatan ionik.

1.1.4. Membuang RNA

Untuk membuang RNA saat isolasi DNA, maka digunakan

metode enzimatik. Namun, tidak semua RNA akan hilang, sejumlah

kecil RNA akan tetap ditemukan pada proses pemurnian DNA. Ada dua

enzim yang digunakan, yaitu RNase A dan RNase T1. Mekanisme

keduanya didasarkan pada posisi pemotongan basa nuklotida urasil,

sitosin dan guanine.

1.1.5. Pemekatan DNA

Pengendapan dan pemekatan DNA telah dimulai pada tahap

deproteinisasi menggunakan campuran fenol-kloroform-alkohol.

Prinsip pengendapan pada alkohol didasarkan pada kemampuan

penurunan kelarutan asam nukleat dalam air. Molekul air yang polar

yang mengelilingi molekul DNA akan mempengaruhi kelarutan DNA.


Etanol akan mengubah potensial ionik dari DNA sehingga akan

membuang molekul air yang berinteraksi dengan DNA, akibatnya DNA

akan mengendap. Penambahan etanol 95% dalam larutan sampel DNA

akan menarik molekul air-DNA sehingga DNA akan mengendap.

Penggunaan etanol 95% atau 100% murni, akan mempengaruhi

dalam hal pembiayaan. Untuk itu, digunakan etanol dengan

konsentrasi lebih rendah. Namun, proses ini memerlukan

penambahan larutan senyawa garam dalam larutan DNA agar

menetralkan muatan fosfat-DNA sehingga mengeliminasi interaksi air-

DNA. Senyawa larutan garam yang sering digunakan adalah natrium

atau amonium. Namun harap diingat, pengeliminasi materi garam dari

larutan DNA yang tidak sempurna akan mempengaruhi proses PCR

karena senyawa garam ini akan mengganggu proses enzimatik pada

proses PCR.

Penggunaan amonium asetat yang memiliki kelarutan tinggi

dalam etanol, sangat dianjurkan dalam memperoleh DNA yang murni.

Setelah larutan DNA diendapkan, garam amonium akan mudah

dilarutkan dengan penambahan etanol 70%. Sedangkan untuk

menghilangkan fraksi etanol pada DNA, dapat digunakan pemanasan.

Dalam temperatur 600C, etanol akan mudah dan cepat menguap.

Prinsip protokol isolasi genom ini dapat diterapkan baik

menggunakan darah, sel maupun jaringan. Perbedaan pada jaringan,

seperti jaringan tumbuhan, organ dan sebagainya hanya bagaimana

cara kita untuk memecah jaringan tersebut, seperti untuk isolasi

genom DNA dari jaringan hati, maka kita harus menggerus jaringan

tersebut menggunakan teknik penggerusan dengan lumping. Ekstrak

gerusan tersebut akan digunakan pada metode isolasi seperti di atas.

Saat ini, telah banyak dikembangkan teknik isolasi genom DNA

menggunakan KIT dari berbagai manufaktori. Masing-masing KIT

memiliki kelebihan dan kekurangan, sebagai contoh KIT isolasi DNA

genom menggunakan miniprep column memiliki kelebihan dalam

memangkas waktu kerja, tidak menggunakan bahan fenol yang

berbahaya dan mudah dalam pengerjaannya, namun kekurangannya

adalah dalam harga yang lebih mahal. Umumnya KIT isolasi genom


yang diproduksi di Eropa maupun Amerika, dijual lebih mahal

dibandingkan produk dari di luar negara tersebut.

Hal yang perlu diperhatikan dalam isolasi genom

Penanganan material sampel

Untuk isolasi DNA genom dari sel dan jaringan, sebaiknya

gunakan sampel baru fresh sample. Jika kita tidak dapat langsung

mengisolasi, sampel tersebut wajib dibekukan dalam cairan nitrogen

atau lemari beku -70C. Hal ini bertujuan mencegah degradasi DNA

akibat aktivitas enzim pendegradasi. Jika sampel yang kita koleksi

adalah darah atau cairan tubuh, penyimpanan pada suhu ruang hanya

bertahan selama 1-2 hari. Penyimpanan pada lemari beku suhu 4C,

hanya bertahan hingga 7 hari. Penyimpanan untuk 1 bulan, sampel

dapat dibekukan pada suhu -20C. Penyimpanan terbaik adalah pada

suhu -80C, sampel dapat bertahan lebih dari 5 tahun. Umumnya,

penyimpanan lama, akan menurunkan kemurnian dari DNA genom.

Perlu diingat, untuk sampel darah, antikoagulan yang diperbolehkan

adalah selain heparin. Pemakaian heparin sebagai antikoagulan, akan

mengganggu proses tahap PCR. Bahan sampel terutama dalam bentuk

cairan, harap disimpan dalam bentuk alikuot atau ditaruh di lebih dari

1 tabung. Hal ini bertujuan mencegah kerusakan bahan sampel akibat

proses cair-beku-cair (“thawing”) saat melakukan isolasi genom DNA.

Genom DNA hasil isolasi, sebaiknya disimpan pada suhu 2-8C.

Penyimpanan pada suhu beku akan merusak genom DNA atau genom

DNA akan terpotong-potong. Untuk genom DNA plasmid, dapat disim-

pan pada suhu -20C. Hindari pengeringan yang berlebih (pemanasan

yang lama) saat menguapkan etanol ditahap isolasi genom DNA.

Sebaiknya keringkan atau uapkan etanol dengan membuka tutup tube

dan taruh pada suhu ruangan (namun memerlukan waktu o.n atau

“over night”). Untuk melarutkan genom DNA, gunakan buffer Tris 10

mM pH 7-8. Hindari penggunaan air atau ddH2O. Agar memudahkan

genom DNA cepat larut, dapat diinkubasi suhu 65C selama 10 menit.

Pemanasan ini juga akan merusak DNase, sehingga genom DNA tidak

rusak. Hindari vorteks saat melarutkan genom DNA.


Cara menghitung konsentrasi dan kemurnian genom DNA

Genom DNA hasil isolasi dapat diukur konsentrasi dan

kemurniannya dengan cara mengetahui mengukur nilai OD dari

genom tersebut menggunakan teknik spektrofotometri. Genom DNA

diencerkan dan dibaca pada panjang gelombang 230 nm, 260 nm dan

280 nm. Saat ini, telah ada alat spektrofotometer yang dapat

digunakan untuk mengukur kemurnian dan konsentrasi genom DNA

dalam jumlah yang sangat sedikit, antara 0.5 – 2.0 uL. Alat ini akan

menghitung konsentrasi DNA secara otomatis dan tanpa perlu

pengenceran. Untuk mengetahui kemurnian DNA, diukur berdasarkan

perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 260/280 nm dan

260/230 nm. Kemurnian yang baik adalah jika nilai perbandingan

260/280 nm : 1.8 – 2.1 dan 260/230 nm 2-2.2. Jika nilai kurang atau

lebih dari kisaran tersebut, menunjukkan masih ada senyawa organik

atau garam dalam sampel DNA hasil isolasi. Untuk mengatasi

kemurnian yang tidak baik, dapat dilakukan pengulangan tahap

isolasi, atau dilakukan pengenceran dengan tujuan untuk memperkecil

senyawa bukan DNA dalam sampel. Namun, pengenceran akan

menurunkan konsentrasi dari sampel DNA hasil isolasi. Sampel DNA

dengan konsentrasi rendah (0.01 ng/uL) masih dapat digunakan

untuk tahapan RT PCR (qPCR) selama kemurniannya dalam kisaran

yang baik.

Isolasi genom dari liur

Isolasi genom dari liur atau saliva, merupakan salah satu

teknik yang sederhana, tidak melukai dan mudah pengerjaannya.

Bahan dan alat yang dibutuhkan adalah liur, tabung reaksi 30 mL,

etanol, buffer saline (PBS), larutan lisis, PCI dan amonium asetat serta

alat sentrifuse dan tabungnya. Kadang teknik dikombinasikan dengan

pemberian asam cuka encer.

Prosedur kerja:

1. Sepuluh milliliter larutan NaCl fisiologis (buffer saline)

digunakan untuk berkumur selama 60 detik.

2. Ludahkan dalam tabung sentrifuse 25 mL, ulangi hingga 2 kali.


3. Tabung kemudian disentrifuse pada kecepatan maksimum

(5000 rpm) selama 20 menit. Lebih baik jika menggunakan

sentrifuse dingin.

4. Hati-hati dalam membuang supernatant, jangan sampai pellet

sel terlepas dari dinding tabung.

5. Tambahkan 1 mL mL larutan lisis buffer yang terdiri dari

campuran 0.5% SDS, 0.1 M EDTA, 10 mM Tris-HCl.

6. Tambahkan 50 uL Proteinase K

7. Kocok perlahan, jangan berbuih (ingat kita menggunakan

sabun), sampai pellet terlepas dari dinding tabung. Kemudian

inkubasi 560C selama 3 jam atau biarkan dalam suhu kamar

selama 1 malam.

8. Setelah 3 jam atau dibiarkan satu malam, tambahkan larutan 1

mL PCI (fenol-8OH-TE) dengan perbandingan volume yang

sama. Kocok kuat-kuat selama 30 detik, lalu sentrifuse

kecepatan maksimum selama 10 menit. (gambar 1)

9. Ambil lapisan atas dan pindahkan ke tabung baru yang berisi

kloroform dengan volume yang sama. Hati-hati dalam

memindahkan DNA yang terlarut dalam fase cair (larutan

bening), jangan sampai tercampur dengan daerah interfase

yang berwarna putih, dan lapisan bawah yang merupakan fase

fenol (larutan kuning). Tabung baru yang telah berisi hasil

sentrifuse no 8 dan kloroform, kemudian dikocok dan

disentrifuse kecepatan maksimum selama 10 menit.

Pindahkan larutan atas ke tabung baru. Fungsi kloroform

dalam percobaan ini untuk membersihkan fenol dari sampel.

10. Tambahkan setengah volume (kira-kira 1 mL) 7.5 M amonium

asetat, tabung dibolak-balik 10 kali.

11. Tambahkan etanol 95% dingin sebanyak 2 x jumlah volume

larutan sebelumnya, misalkan jumlah volume total DNA dan

amonium asetat 3 ml, maka tambahkan etanol 6 mL. Bolak

balik dengan pelan, maka akan muncul helaian DNA seperti

kapas. Ambil helaian DNA secara hati-hati dengan


menggunakan batang kaca dan pindahkan ke tabung yang

sudah mengandung 3 etanol 70% dingin.

12. Sentrifuse pada kecepatan maksimum selama 5 menit. DNA

akan mengendap di bagian bawah tabung seperti lapisan atau

butiran putih.

13. Buang hati-hati etanol tersebut, buang sebanyak mungkin,

kemudian keringkan di oven dengan tutup tabung terbuka,

pada suhu 700C.

14. Setelah kering, pellet DNA dapat dilarutkan dengan 100 uL

buffer TE (Tris EDTA). Biarkan semalam dalam temperatur 40C

sehingga DNA larut.

15. Untuk memeriksa keberhasilan kita, dapat digunakan uji

elektroforesis dan nanodrop untuk menghitung kemurnian-

konsentrasi DNA.

Gambar 1. Isolasi DNA pada Pemisahan Fenol (www.genetargetsolutions.com.au/product/5prime-phase-lock-gel/)

Isolasi Genom dari darah dengan metode fenol-kloroform

Bahan :

- dH2O

- Larutan salin (NaCl 0.8%)

- Larutan lisis terdiri dari 14 g NH4Cl dan 0.144 g NH4HCO3

dibuat dalam 1 L air steril (dH2O)


- Proteinase K

- 10% SDS

- STE pH 7.4, yang terdiri dari 2.92 g NaCl; 3.03 g Trizma base;

0.19 g EDTA dibuat dalam 500 mL air steril

- TE yang terdiri dari 1.21 g Trizma base; 0.37 g Na-EDTA dibuat

dalam 900 mL. Larutan TE ini adalah stock, jika akan dibuat pH

8, maka larutan TE tersebut ditetesi 1 N HCl hingga pH 8,

kemudian ditambahkan air steril hingga 1 L. Hal yang sama

dilakukan jika untuk membuat pH 7.6

- TE-Saturated Phenol pH 8 dengan penambahan 0.1% 8-

hydroxyquinoline

- Kloroform

- 99.5% etanol

- 3 M Na-Asetat

- 70 % etanol

Prosedur:

Cell Lysis.

Darah (sekitar 2ml) disentrifus pada

kecepatan 5,000 rpm selama 5 menit

pada suhu ruang.

Tiga lapisan akan terbentuk (serum,

Buffy coat dan eritrosit/RBC).

Serum dibuang (jika dibutuhkan, simpan

di tabung lain).

Tambahkan salin untuk mencuci pellet, sentrifus pada

kecepatan 5,000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C (atau suhu

ruang).

Buang lapisan atas (supernatan) dan pindahkan buffy coat ke

tabung baru (tabung mikro1.5 mL).

Ulangi langkah 4 dan 5 sehingga akan diperoleh buffy coat (sel

darah putih) dalam jumlah yang banyak.

Tambahkan lysing solution (volume maksimum) ke dalam

tabung yang berisi buffy coat, kocok dan campur dengan baik

Serum

RBC

Buffy coat


selama 5 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan

15,000 rpm selama 5 menit pada 40C.

Ulangi langkah ke 7 tiga kali, dan harus yakin tidak ada

eritrosit yang tersisa (hanya buffy coat).

putih terlarut sempurna.

Tambahkan 20 L 10% SDS, campur dengan baik.

Tambahkan 4 L proteinase K, dan campur dengan baik (kocok

pelan-pelan, jangan berbuih).

Biarkan semalaman pada 370C atau simpan pada inkubator

suhu 600C untuk 1-2 jam.

Phenol-Chloroform Reaction

Tambahkan 400 L TE-saturated phenol, kocok perlahan-lahan

selama 5 menit.

Sentrifus pada 15,000 rpm selama 5 menit dalam suhu kamar.

Dapat terlihat 3 lapisan, bagian lapisan atas (DNA), tengah

(protein yang terdegradasi), bawah (phenol).

Pindahkan lapisan atas (DNA) ke dalam tabung mikro baru 1.5

mL menggunakan pipet tetes.

chloroform dingin dan campur dengan

baik (bolak-balik) untuk 5 menit dan sentrifus pada 15000

rpm selama 5 menit. (chloroform dapat berfungsi untuk

membuang atau menetralkan phenol, phenol harus

disingkirkan karena akan medetnaturasi protein enzim yang

akan digunakan pada step PCR atau analisis lain.)

mikro baru 1.5 mL menggunakan pipet bersih.

Ulangi dua langkah sebelumnya hingga seluruh phenol yang

ada hilang.

Tamba ethanol 99.9

%.

Campur dengan baik, dan DNA akan tampak.


Sentrifuse pada 15,000 rpm selama 5 menit. Buang supernatan

ethanol.

Tambahkan 1mL 70% ethanol, dan sentrifus pada 15,000 rpm

selama 5 menit.

Buang ethanol seluruhnya.

DNA dapat dikeringkan menggunakan sentrifus vakum selama

5 menit hingga tidak ada ethanol yang tersisa.

Jika tidak ada sentrifus vakum, cukup letakkan pada blok

inkubator suhu 600C dan biarkan hingga kering.

Larutkan DNA pellet menggunakan larutan 100

per 1ml darah).

Simpan pada 40C.

Selain metode konvensional, ada beberapa metode yang

memudahkan peneliti dalam isolasi DNA, yaitu menggunakan spin

kolom.


BAB II. ELEKTROFORESIS

DAN IDENTIFIKASI GENOM DNA

Gel elektroforesis adalah suatu teknik yang digunakan untuk

memisahkan fragmen DNA dari makromolekul lain (RNA dan protein)

berdasarkan ukuran dan muatannya. Molekul ini akan bergerak

melalui gel menuju arah yang berbeda muatan dan kecepatan. Untuk

molekul DNA, semua molekulnya memiliki muatan listrik yang sama

yaitu negatif, sehingga pergerakannya akan dipengaruhi oleh

ukurannya.

Gel elektroforesis untuk pemisahan DNA adalah agarose yang

merupakan polisakarida. Ketika agarose dilarutkan dalam buffer

garam kemudian dipanaskan dan setelah terlarut sempurna,

didinginkan, maka akan membentuk suatu bahan solid, namun tidak

keras dan permukaan yang licin. Pada prinsipnya agarose yang

mengeras menyerupai makanan agar-agar atau jello. Pada

pengamatan molekular, agarose gel merupakan matriks yang

molekulnya satu sama lain disatukan oleh ikatan hidrogen dan

membentuk semacam pori-pori atau lubang saringan kecil.

Untuk mengamati fragmen DNA, maka gel agarose tersebut

ditempatkan dalam suatu wadah berisi larutan buffer garam serta

dialirkan listrik melalui panel elektroda positif dan negatif. Saat

pembuatan gel agarose, dalam cetakan akan ditaruh sisir DNA,

sehingga saat gel agarose mengeras, akan ada sumur-sumur tempat

menuangkan cairan DNA. Adanya gugus fosfat pada DNA, maka DNA

akan bermuatan negatif. Oleh karena itu, posisi sumur untuk DNA

diletakkan dalam wadah elektroforesis di area kutub elektroda

negatif. Saat aliran listrik mengalir dalam gel agarose, DNA akan

bergerak ke arah kutub elektroda positif. Pergerakan kecepatan DNA

dalam gel agarose dipengaruhi oleh ukuran dari fragmen DNA


tersebut. Jika ukuran fragmen DNA adalah kecil, maka pergerakan

menuju kutub elektroda positif akan cepat, karena molekul DNA akan

mudah melewati pori-pori gel agarose. Jika ukuran fragmen DNA-nya

besar, maka kecepatan akan melambat akibat hambatan dari pori-pori

gel agarose yang kecil.

Gambar 2. Gel Elektroforesis Agarose (Drabik, 2016)

Pemeriksaan DNA genom dengan gel agarose

1. Siapkan agarose 1.5 % dan buffer elektroforesis (TBE atau

TAE)

2. Tuang larutan agarose cair yang sudah mengandung etidium

bromide dalam cetakan agarose.

3. Tunggu sampai kering.

4. Pindahkan agarose bersama cetakannya ke dalam bak

elektroforesis yang sudah berisi larutan elektroforesis.


5. Masukkan 1 uL genom DNA hasil isolasi kita.

6. Jalankan elektroforesis (ingat DNA berjalan dari kutub negatif

ke positif).

7. Setelah 30 menit, hasil elektroforesis dapat dilihat di lampu

UV. (gambar 2)

Gambar 3. Elektroforesis Genom DNA (dokumentasi pribadi)


BAB III. ISOLASI RNA

RNA (asam ribonukleat) adalah polimer yang ada dalam sel

hidup dan banyak virus, yang terdiri dari rantai panjang tunggal

untaian fosfat dan unit ribosa dengan basis nitrogen adenin, guanin,

sitosin, dan urasil, yang terikat pada gula ribosa. RNA digunakan

dalam semua langkah sintesis protein di semua sel hidup dan

membawa informasi genetik untuk banyak virus.

Isolasi RNA dengan kualitas tinggi adalah langkah penting yang

diperlukan untuk melakukan berbagai eksperimen biologi molekuler.

TRIzol Reagen adalah reagen siap pakai yang digunakan untuk isolasi

RNA dari sel dan jaringan. TRIzol bekerja dengan menjaga integritas

RNA selama homogenisasi jaringan, sementara pada saat yang sama

mengganggu dan memecah sel dan komponen sel. Penambahan

kloroform, setelah sentrifugasi, memisahkan larutan menjadi fase

berair dan organik. RNA hanya tersisa dalam fase air.

Setelah mentransfer fase berair, RNA dapat diperoleh kembali

dengan presipitasi dengan isopropil alkohol. Tetapi DNA dan protein

dapat pulih dengan pemisahan berurutan setelah penghilangan fase

berair. Pengendapan dengan etanol membutuhkan DNA dari interfase,

dan presipitasi tambahan dengan isopropil alkohol membutuhkan

protein dari fase organik. Total RNA yang diekstraksi oleh TRIzol

Reagent bebas dari kontaminasi protein dan DNA. RNA ini dapat

digunakan dalam analisis Northern blot dan lain-lain.

Pada umumnya, prosedur isolasi RNA tradisional diutamakan

terhadap agen penghambat kerja RNase (biasanya denaturants kuat

seperti garam guanidine, sodium dodecylsulfate (SDS), atau senyawa

berbasis fenol yang dirancang untuk menurunkan risiko degradasi

RNA dalam sampel). Namun pada kenyataannya, sebelum dan sesudah

isolasi, integritas RNA berada pada risiko tertinggi.


Teknik isolasi RNA atau total RNA hampir sama dengan teknik

isolasi DNA, namun harus diperhatikan sifat fisik dari RNA yang labil

dibanding DNA sehingga mudah mengalami kerusakan jika kerja kita

tidak baik. Hal yang wajib diperhatikan adalah proses pengambilan

dan pengantaran sampel, metode yang akan digunakan untuk isolasi

RNA, dan proses penyimpanan hasil isolasi RNA.

Berikut ini, akan dijelaskan proses isolasi RNA dari berbagai

sumber. Namun sebelumnya akan dijelaskan tahapan yang perlu

diperhatikan:

1. Koleksi sampel dan perlindungan terhadap sampel

Harus diingat, RNA sama seperti DNA, dapat diperoleh dari

jaringan atau sel yang berinti. Teknik isolasi untuk mendapatkan RNA

tergantung dari jenis sampel yang kita gunakan. Menemukan metode

koleksi dan perlindungan sampel RNA yang tepat akan

memaksimalkan hasil dan kualitas RNA yang diisolasi. Pada umumnya,

untuk memperoleh hasil RNA yang baik, sampel yang diisolasi harus

segera dibekukan baik dengan nitrogen cair atau es kering. Bagaimana

jika tidak mempunyai bejana nitrogen cair ataupun es kering. Itu kita

harus memikirkan cara mengontrol kondisi agar hasil yang diperoleh

tetap terjaga walaupun mungkin kualitasnya sedikit menurun. Hal

yang paling baik adalah, sampel yang diperoleh langsung digunakan

untuk diisolasi RNA-nya. Namun, jika kita tidak dapat segera

melakukannya, maka siapkan es balok atau es batu dalam termos.

Sampel dapat disimpan sementara dalam termos es selama maksimal

6 jam hingga kita memindahkan sampel tersebut dalam lemari

pendingin beku. Untuk sampel RNA yang bersumber dari jaringan atau

organ, dapat disimpan dalam formalin dingin (jika larutan tersebut

tersedia).

2. Preparasi RNA

Banyak teknologi yang sudah diproduksi massal untuk

mengisolasi RNA. Setiap metode ada kelebihan atau kekurangannya.

Umumnya pada kemudahan dalam kerja isolasi RNA. Sejumlah


teknologi persiapan RNA tersedia secara luas yang dapat

diklasifikasikan ke dalam empat teknik umum: metode ekstraksi

organik, format keranjang spin, metode partikel magnetik, dan metode

lisis langsung. Sementara semua dapat digunakan untuk menyiapkan

RNA berkualitas tinggi yang cocok untuk berbagai macam teknik

analisis, ada beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan dalam

memilih teknologi pemurnian yang tepat.

Metode Ekstraksi Organik

Metode ekstraksi organik dianggap sebagai standar emas

untuk persiapan RNA. Selama proses ini, sampel dihomogenisasi

dalam larutan yang mengandung fenol dan kemudian disentrifugasi.

Selama sentrifugasi, sampel dipisahkan menjadi tiga fase, yaitu fase

organik ada di area lebih rendah, fase tengah di area tengah yang

mengandung protein terdenaturasi dan gDNA, serta fase berair di area

atas yang mengandung RNA. Fase berair di atas dipindahkan dan RNA

diendapkan oleh pengendapan alkohol dan rehidrasi. Kelebihan

menggunakan metode ekstraksi organik adalah denaturasi nukleasi

yang cepat dan menstabilkan RNA.

Metode Filter-sentrifuse

Dasar metode ini adalah filter atau penyaringan menggunakan

membran berbahan serat kaca, silika atau penukar ion. Sampel

dilisiskan dalam buffer yang mengandung inhibitor RNase (biasanya

garam guanidin), dan asam nukleat terikat ke membran dengan

melewatkan lisat melalui membran menggunakan gaya sentrifugal.

Larutan pencucian kemudian dilewatkan melalui membran dan

dibuang. Pelarut elusi yang tepat diterapkan dan sampel dikumpulkan

ke dalam tabung dengan sentrifugasi. Beberapa teknik dapat

dilakukan dengan sentrifugasi atau vakum sentrifugasi.

3. Jumlah RNA

Untuk mencapai keberhasilkan dalam kerja dengan RNA, maka

perlu dilakukan identifikasi hasil isolasi RNA, yaitu dengan


menggunakan teknik agarose elektroforesis dan atau dengan

menggunakan teknik spektrofotometer.

Gambar 4. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian RNA dengan UV Spektrofotometer nano drop.

(Koleksi pribadi) Tampak konsentrasi 2912,071 ng/uL dengan kemurnian 2,05.

Prinsip dasar menggunakan agarose, serupa dengan

identifikasi hasil isolasi DNA. Molekul RNA juga memiliki muatan

negatif karena adanya gugus fosfat sebagai tulang punggungnya,

dengan demikian proses pergerakan elektroforesisnya adalah dari

kutub negatif ke kutub positif. Untuk mengetahui kemurnian dan

konsentrasi RNA, digunakan spektrofotometer. Saat ini telah ada

teknologi dalam mengukur kemurnian dan konsentrasi RNA

menggunakan alat UV spektrofotometer nano drop. Jika kita tidak

memiliki UV Spektrofotometer nano drop dapat menggunakan UV

Spektro biasa. Absorbansi sampel RNA yang diencerkan diukur pada

panjang gelombang 260 dan 280 nm. Konsentrasi RNA dihitung

dengan menggunakan hukum Beer-Lambert, memprediksi perubahan

linier dalam absorbansi dengan konsentrasi. Menggunakan persamaan

ini, maka pembacaan pada panjang gelombang 260 nm dari 1.0 setara

dengan ~ 40 ug/mL RNA untai tunggal. Rasio absorbansi pada 260

nm/280 nm digunakan untuk menilai kemurnian RNA. Nilai 1.8 – 2.1


menunjukkan RNA dengan kemurnian yang sangat baik. Jika kita

mempunyai alat UV Spektrofotometer nano drop, kita hanya

meneteskan 1 uL sampel larutan RNA hasil isolasi dan mesin akan

langsung menghitung konsentrasi serta kemurniannya.

Gambar 5. Hasil elektroforesis RNA. Hasil isolasi yang baik, akan memberikan gambaran 2 pita, yang menunjukkan RNA ukuran 28 S dan

18S (Dokumentasi pribadi)

Isolasi RNA menggunakan TRIzol merupakan teknik yang

umum dilakukan saat ini. Selain menggunakan TRIzol dengan teknik

konvesnional, ada juga teknik TRIzol yang dikombinasikan dengan

tabung kolom seperti pada isolasi DNA. Namun, secara prinsip dasar

kedua metode sama yaitu memisahkan RNA dari bahan biologis

lainnya.

Isolasi RNA dari darah menggunakan TRIzol-kloroform

Bahan:

- Darah

- 10x RBC lisis buffer steril (89.9 g NH4Cl, 10 g KHCO3, 2 mL 0.5

M EDTA dalam 1 L dengan pH 7.3), sebagai larutan stok.

- TRIzol

- PBS

- Isopropanol

28S

18S

Kontaminasi

DNA

28S RNA

18S RNA


- Etanol

- RNAse-free water

Prosedur:

1. 1 mL darah ditambahkan dalam 9 mL 1x RBC lisis buffer.

Bolak-balik pelan dan biarkan 10 menit pada suhu 40C.

2. Sentrifuse 1500 rpm selama 10 menit pada suhu ruang.

3. Buang supernatan dengan hati-hati, jangan sampai pellet

terbawa.

4. Tambahkan 1 x RBC lisis pada pellet, lakukan pemipetan “up

and down atau sedot sebul” hingga pellet larut dalam larutan

RBC lisis tersebut dan pindahkan ke tabung sentrifuse 2 mL.

5. Sentrifuse 3000 rpm selama 5 menit pada suhu 40C

(sebaiknya).

6. Buang supernatan, kemudian tambahkan 1 mL PBS, lakukan

pemipetan “sedot sebul”, kemudian ulangi lakukan sentrifuse

seperti pada tahap sebelumnya.

7. Tambahkan 1200 uL TRIzol dalam tabung berisi pellet, lalu

lakukan pemipetan “sedot sebul” sehingga pellet menjadi

terlarut dalam TRIzol.

8. Tambahkan 200 uL kloroform, vortex 10 detik, kemudian

sentrifuse pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada

suhu 40C.

9. Dalam tabung akan ada 3 lapisan larutan, lapisan bening atas;

lapisan tipis putih tengah dan lapisan merah muda bawah.

RNA berada di lapisan bening atas, DNA berada di lapisan

putih tengah (interface) dan protein berada di lapisan bawah,

larutan yang berwarna merah muda.

10. Ambil lapisan bening bagian atas dengan hati-hati tanpa

membawa lapisan putih dan merah muda, kemudian

pindahkan ke tabung baru yang bersih-steril.

11. Tambahkan 500 uL larutan isopropanol dingin dan lakukan

pemipeting “sedot-sebul” atau dikocok. Isopropanol akan

mengendapkan RNA. Biarkan 10 menit.


12. Taruh sampel di -200C jika tidak digunakan.

13. Sentrifuse 13000 rpm selama 10 menit pada suhu 40C. Buang

supernatan.

14. Buang supernatan dengan hati-hati, jangan sampai pellet putih

terbawa. Kemudian tambahkan 500 uL 75% etanol dingin.

15. Sentrifuse selama 10 menit pada kecepatan 13000 rpm dengan

temperatur 40C.

16. Buang supernatan, keringkan tabung jangan sampai ada etanol

sisa.

17. Tambahkan 30 uL air yang bebas RNA dalam tabung, biarkan

selama 2 jam agar larut.

18. RNA sudah diperoleh. Simpan pada suhu -200C.

Metode lain yang dapat digunakan adalah kombinasi TRIzol

dan kit isolasi PCR. Kami menggunakan Direct-zol RNA Miniprep Plus

dari Zymo Research. Metode kombinasi ini membantu mengurangi

waktu kerja dan mudah dalam pelaksanaannya.


BAB IV. PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Hibridiasasi atau aneling (penempelan) merupakan dasar dari

kemampuan untai tunggal asam nukleat untuk melakukan

pengikatnya spesifik dengan untai komplementernya (pasangannya).

Ketika untai ganda DNA mengalami denaturasi atau dipanaskan, maka

untai akan terpisah, jika pemanasan dihilangkan atau dilakukan

penurunan temperatur, maka untai terpisah akan bergabung kembali.

Prinsip dasar ini yang menjadi dasar pada proses PCR, di mana

saat terjadi penurunan suhu pada proses PCR, akan terjadi proses

penempelan untai oligonukleotida. Proses penempelan ini

dipengaruhi oleh faktor yang mempengaruhi proses pembentukan

ikatan hidrogen antara basa nukelotida pasangannya, yaitu

temperatur, pH, larutan garam dan sebagainya.

Telah diketahui bahwa basa nukleotida G akan berpasangan

dengan basa nukleotida C dengan bantuan tiga (3) jembatan hidrogen,

sedangkan basa nukleotida A akan berpasangan dengan T melalui dua

jembatan hidrogen. Untuk memutuskan jembatan yang

menghubungkan basa-basa tersebut diperlukan energi (untuk

laboratorium dalam hal ini adalah pemanasan yang tinggi).

PCR merupakan suatu metode in vitro dalam sintesis DNA.

Prinsip dasar metode ini adalah perbanyakan fragmen DNA

menggunakan enzim polymerase pada temperatur yang tinggi yang

dilakukan secara berulang. Pada proses PCR dibutuhkan

oligonukleotida pendek (primer DNA) yang berperan dalam

mengawali proses ini. Primer akan menempel atau hybrid pada untai

tunggal DNA saat temperatur diturunkan setelah terjadi pemisahan

untai ganda DNA. Produk hasil PCR dapat diamati menggunakan

teknik eletroforesis agarose.


PCR memiliki beragam aplikasi, tidak hanya dalam penelitian

dasar tetapi juga dalam bidang diagnosa medis, forensik, dan

pertanian. Seperti dijelaskan di halaman ini, beberapa contoh aplikasi

PCR meliputi:

1. Ekspresi gen

2. Deteksi genotipe

3. Kloning

4. Mutagenesis

5. Analisis metilasi

6. Sekuensing

7. Kesehatan, forensik dan aplikasi lainnya

Hingga saat ini, metode PCR telah berkembang dari metode

PCR yang umum hingga metode PCR yang dapat digunakan langsung

untuk melihat apakah sampel tersebut memiliki mutasi atau tidak,

tergantung aplikasi apa yang akan dipakai apakah untuk identifikasi

molekuler, sekuensing atau rekayasa genetika. Beberapa PCR yang

telah dikembangkan saat ini:

1. PCR standar, metode dasar PCR dan hasil produk PCR dapat

digunakan untuk tahap selanjutnya seperti kloning,

sekuensing, restriksi enzim.

2. ARMS PCR, atau Amplification Refractory Mutation System

(ARMS) PCR adalah aplikasi PCR di mana menggunakan

primer spesifik. Metode ini yang sangat berguna untuk

identifikasi mutasi titik atau polimorfisme.

3. GAP-PCR, mutasi delesi pada gen cluster seperti -globin, dapat

dideteksi oleh PCR standar menggunakan sepasang primer

yang komplemen dengan untai DNA yang di dalamnya ada area

delesi. Untuk delesi yang kecil, kurang dari 1 kb, maka akan

dihasilkan dua buah produk fragmen, satu fragmen besar dan

satu fragmen kecil (fragmen yang ada delesi kurang dari 1 kb).

Untuk delesi yang lebih besar (2 kb), jarak antara kedua

primer yang mengapit produk PCR (amplikon) terlalu besar,

sehingga sukar didapatkan dua fragmen produk (hanya yang

terbentuk fragmen yang delesi/fragmen kecil, sedang framen


normal tidak terbentuk), untuk itu diperlukan teknik khusus

untuk memperoleh kedua fragmen tersebut. Oleh karena itu,

teknik GAP-PCR digunakan. Teknik ini banyak digunakan

untuk deteksi alfa talasemia, di mana delesi yang terjadi sangat

besar (gambar 3).

4. RFLP PCR, metode ini digunakan jika ada area pemotongan

enzim restriksi. Pada alel homozigot/mutan yang memiliki

situs pemotongan, maka produk PCR akan dapat dipotong oleh

enzim restriksi tertentu (atau sebaliknya). Untuk alel hetero,

maka produk PCR yang diamati adalah kombinasi antara pita

yang terpotong dan yang tidak terpotong (gambar 4).

5. Kuantitatif-PCR, metode ini digunakan untuk menghitung

kuantitas atau jumlah produk spesifik hasil PCR, biasanya

dikenal dengan sebutan real-time PCR (“RT-PCR”). RT PCR di

sini, berbeda dengan Reverse Transcription (RT) PCR. Pada

Reverse Transcription PCR (RT-PCR), pcr didisain untuk

amplifikasi DNA dari RNA. Hasil jumlah amplifikasi DNA dari

RNA dapat diamati dengan menggunakan “RT-PCR”.

6. Multipleks tandem PCR, metode untuk mendeteksi banyak

target pada satu sampel. Pada metode ini, satu sampel akan

menggunakan banyak primer spesifik dan proses PCR dijalan

serentak. Karena menggunakan banyak primer, maka akan

dihasilkan banyak amplikon (produk PCR) dengan ukuran

yang beragam (gambar 5).

Masih banyak lagi jenis PCR, namun kami hanya menjelaskan

PCR yang sering digunakan untuk identifikasi penyakit. Semua metode

ini dikembangkan untuk memudahkan peneliti atau pekerja

laboratorium dalam mengidentifikasi sampel DNA seperti bidang

forensik, mikrobiologi dan sebagainya.


Gambar 6. Gap-PCR (http://www.ithanet.eu/ithapedia/index.php/Protocol:Gap-PCR)

Gambar 7. ARMS PCR (koleksi pribadi CYP1A1*2A)

Aplikasi PCR atau teknologi amplifikasi telah banyak

digunakan, biasanya di klinik/rumah sakit hingga membuat area

spesifik dari DNA dan diperbanyak untuk digunakan dalam kloning

teknologi. Di bawah ini merupakan ringkasan kelebihan dan

kekurangan teknologi amplifikasi:

Kelebihan teknologi amplifikasi:

1. Hasil cepat diperoleh (namun tergantung metode ataupun kit

PCR yang digunakan dan dikembangkan oleh pihak developer).


2. Lebih sensitif dan spesifik dibandingkan metode deteksi

konvensional.

3. Reprodusibilitinya sangat baik (kembali tergantung jenis kit

PCR dari berbagai developer).

4. Hasil amplifikasi dapat dihitung secara kuantitatif atau semi

kuantitatif, biasanya untuk teknik “RT-PCR”.

5. Mudah dikembangkan teknologi terbaru untuk dalam

pemeriksaan penanda kelainan genetik.

Kekurangan teknologi amplifikasi:

1. Memerlukan ruangan dengan alur proses kerja satu arah

(untuk mencegah kontaminasi).

2. Mudah terkontaminasi dalam melakukan pekerjaannya.

3. Target sekuensing DNA sasaran harus diketahui terlebih

dahulu, dan harus melakukan perancangan primer serta

kondisi alat yang sesuai dengan tujuan target yang diinginkan.

4. Biaya alat dan bahan untuk metode “RT PCR” yang mahal.

Prinsip dasar prosedur kerja PCR semua adalah sama, yaitu

harus ada primer, dNTP, Taq polimerase enzim, dH2O, buffer PCR

dengan atau tanpa MgCl, dan DNA template (sampel DNA genom).

Setiap teknik, pada dasarnya yang berbeda adalah:

1. Prosedur temperatur hibridisasi (penempelan) dan elongasi

(pemanjangan) produk PCR serta siklus dan waktu.

2. Desain primer (metode ARMS akan berbeda dengan metode

PCR standar).

3. Ada tidaknya area restriksi.

4. Perlu tidaknya menggunakan probe (primer yang berpendar).

Pemanfaatan PCR metode konvensional

1. PCR -globin

a. Bahan:

Primer:

Forward primer F5’-TAGCAATTTGTACTGATG GTATGG-3’

dan

Reverse primer R5’-TTTCCCAAGGTTTGAAC TAGCTCTT-3’.


10X PCR buffer

Tag Polimerase

dNTP

DNA template

b. Cara kerja

Siapkan semua bahan dalam tabung PCR

Untuk program PCR yang digunakan:

1. Denaturasi awal 950C selama 3 menit.

2. Denaturasi PCR 980C selama 20 detik.

3. Hibridisasi PCR 600C selama 15 detik.

4. Elongasi PCR 720C selama 60 detik.

5. Ulangi no 2 – 4 untuk 35 siklus.

6. Elongasi akhir 720C selama 60 detik.

7. Pendinginan 240C.

c. Hasil: akan didapatkan produk PCR atau amplikon dengan

ukuran 1200 bp.

Gambar 8. Hasil PCR gene b-globin (dokumentasi pribadi)

Hasil PCR b-globin ini dapat digunakan untuk identifikasi

hemoglobinopati menggunakan sekuensing DNA.


2. PCR ARMS gen ALAD

a. Bahan

ALAD F 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’

ALAD R 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’

ALAD C 5’-TTCTGTCCTGGGGGCTTGAG-3’

ALAD N 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGC-3’

ALAD M 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGG-3’

Bahan lain sama dengan PCR standar

b. Cara kerja

PCR tahap 1:

1. Campur semua bahan kecuali primer CNM.







8. Pendinginan 240C.

9. Produk PCR adalah 306 bp.

Gambar 9. Hasil PCR Tahap 1 (Dokumentasi pribadi)

PCR tahap 2

1. Campur semua bahan ditambah primer CN untuk

pengecekan sampel normal dan CM untuk sampel mutan.








8. Pendinginan 240.

Gambar 10. Hasil PCR Tahap 2. Lajur 1 dan 3 (sampel PCR A dan B) menggunakan primer mutan, sedangkan lajur 2 dan 4 (sampel PCR A dan B) menggunakan primer normal. Hasil menunjukkan sampel A

genotipe GG (ALAD – 1) dan sampel B genotipe GC (ALAD – ½) (Dokumentasi pribadi)

3. PCR RFLP CYP1A1*2A

a. Bahan

Primer A 5'-TAGGA GTCTT GTCTC ATGCC T-3'

Primer B 5'-CAGTG AAGAG GTGTA GCCGC T-3'

Enzim restriksi Msp I.

Bahan lain sama dengan bahan untuk PCR standar.

b. Cara kerja

Campur semua bahan kecuali enzim restriksi MspI, menjadi

satu.

Ambil 24 uL larutan campuran, masukkan ke dalam tabung

PCR, tambahkan 1 uL sampel DNA. Kemudian dimasukkan

ke dalam alat PCR.


Program PCR untuk CYP1A1*2A restriksi MspI, adalah

1. Denaturasi awal, 950C 3 menit.

2. Denaturasi PCR, 950C 3 menit.

3. Hibridisasi PCR, 600C 15 detik.

4. Elongasi PCR, 720C 2 detik.

5. Ulangi no 2 – 4 sebanyak 35 siklus.

6. Elongasi akhir 720C 5 detik.

Periksa hasil PCR menggunakan agarose elektroforesis. Jika

didapatkan hasil produk PCR 340 bp, proses PCR telah

sukses.

Ambil 5 uL produk PCR di atas, masukkan dalam tabung

PCR yang telah ada larutan campuran MspI dan buffernya

(masing-masing tergantung dari Kit perusahaan yang

menjual).

Inkubasi pada mesin PCR untuk suhu 370C selama 4 – 24

jam.

Hasil pemotongan diamati menggunakan 1.5 % agarosa

elektroforesis.

A: Band with 340 bp B: DNA Marker size 100 bp

C,D, F: Band with 340, 200 and 140 bp E: Band with 140 and 200 bp

(Dokumentasi pribadi)


4. Multiplex PCR deteksi 0-talassemia

Pada metode ini, kita dapat mendeteksi adanya mutasi

menggunakan lebih dari 1 primer dalam waktu yang bersamaan.

Primer-primer yang digunakan hanya mengenali atau

berkomplementasi dengan target. Metode ini dikenal juga sebagai

MARMS atau multiplex amplification refractory mutation system.

a. Bahan

- Kodon 17-M: 5’-CTC ACC ACC AAC TTC AGC CAC GTT CAG

CTA-3’

- Kodon 41/42-M: 5’-GAG TGA CAG ATG CCC AAA GGA CTC

AAC CT-3’

- Kodon 71/72-M: 5’-AGG TTG TCC AGG TGA GCC AGG CCA

TCA ATT-3’

- IVS1nt1-M: 5’-TTA AAC CTG TCT TGT AAC CTT GAT ACC

GAA-3’

- S-primer: 5’-ACC TCA CCC TGT GGA GGC AC-3’

- P1-primer: 5’-GCG ATC TGG GCT CTG TGT TCT-3’

- P2-primer: 5’-GTT CCC TGA GCC CCG ACA CG-3’

b. Prosedur Material uL

10x PCR buffer X 2.5 50 mM MgCl2 X 0.9 10 mM dNTPs X 0.75 5 uM S primer X 3.0 5 uM P1 X 0.5 5 uM P2 X 0.5 5 uM mutan primer @ 0.5 uL X 2 5U/uL HotStart Taq DNA X 0.13 dH2O X 7.72 DNA Sampel 7

c. Program

Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 95 00:15:00 1 x Denaturasi 94 00:01:00 Annealing 65 00:01:00 35 x Extensi 72 00:02:00 Extensi final 72 00:07:00 1 x Pendinginan 24 99:99 1 x


Gambar 12. Hasil PCR MARMS b-globin deteksi b-thalassemia. M: DNA Ladders/Markers; 1: kontrol b-thal CD71/72, 535 bp; 2: kontrol b-thal

CD41/42, 439 bp; 3: kontrol IVS1nt1, 281 bp; 4: kontrol b-thal CD17, 239 bp; 8: kontrol internal kontrol fragmen, 314; 5-7 dan 9-13 sampel

pasien (Dokumentasi pribadi, pelatihan di Chiang-Mai University)


BAB V. REAL-TIME PCR/

KUALITATIF PCR (RT-PCR/QPCR)

Telah dijelaskan sebelumnya secara singkat bahwa PCR adalah

teknik perbanyakan area DNA pada suatu gen, yang menjadi sasaran

oleh peneliti. Secara teoritis, PCR akan meningkatkan jumlah DNA

secara eksponensial atau dengan kata lain melipat gandakan jumlah

molekul target pada setiap amplifikasi siklus. Pada teknik PCR, pada

umumnya hanya untuk mengetahui bahwa DNA dari yang dituju telah

berhasil diamplifikasi. Sedangkan real-time PCR (RT-PCR) atau qPCR

bertujuan secara kuantitatif atau mengetahui jumlah DNA sasaran.

Harap dibedakan pengertian antara RT-PCR di sini dengan RT-PCR

yang reverse transcription PCR (RT-PCR) yang berfungsi dalam

mengubah RNA menjadi cDNA kemudian dilakukan qPCR.

Jika diaplikasikan dalam bidang kesehatan, teknik PCR

ditujukan untuk mengetahui ada tidaknya gen bakteri/virus dalam

tubuh pasien, dengan kata lain, jika ditemukan gen bakteri pada darah

pasien, maka pasien tersebut terinfeksi oleh bakteri tersebut.

Sedangkan qPCR bertujuan apakah dengan pengobatan akan

menurunkan atau tidak jumlah gen bakteri, dengan kata lain jika suatu

obat berhasil mengobati, maka jumlah gen mikroorganisme (bakteri)

akan turun.

Dalam RT-PCR, jumlah DNA diukur dalam setiap siklus melalui

pewarna berfluoresen (berpendar) yang akan meningkatkan sinyal

sejalan dengan bertambahnya jumlah produk amplikon. Senyawa

berfluoresen ini akan bergabung (hibridisasi) dalam untai DNA selama

proses PCR. Data sinyal akan dikumpulkan dalam fase eksponensial

dan diproses melalui perangkat lunak (software) dari alat PCR serta

diterjemahkan dalam plot amplifikasi yang mewakili akumulasi

produk selama durasi proses PCR.


Perbedaan yang mendasar dalam deteksi hasil PCR dan qPCR

dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

Gambar 13. PCR konvensional dan RT-PCR (qPCR) (Vilborg Matre, 2020)

Pada gambar di atas tampak bahwa pada siklus ke 45 dari PCR

konvensional, pita agarose akan menunjukkan hasil yang tajam

dibandingkan pada siklus sebelumnya. Kotak hijau merupakan area

amplifikasi PCR konvensional jika dipindahkan pada grafik fluoresensi

di RT-PCR. Ini berarti, gambaran pita siklus 45 pada elektroforesis

PCR konvensional merupakan produk akhir dari amplifikasi (gambar

pita tampak jelas dibandingkan siklus lain). Sedangkan pada teknik

RT-PCR, proses amplifikasi langsung terdeteksi oleh sistem di awal

peningkatan grafik (kotak merah). Jika pada PCR, hasil amplifikasi

tampak jelas pada siklus 45, di mana pada siklus ini dihasilkan jumlah

fragmen DNA sasaran (amplikon) sejumlah 6.9 x1019, maka pada RT-

PCR, hasil amplikon dapat terbaca oleh sensor alat berjumlah 9x106.

Hal ini menunjukkan RT-PCR lebih sensitif dan cepat dalam hasil

Akhir produk amplifikasi


amplifikasi DNA gen sasaran dibandingkan PCR konvensional. Atau

dengan kata lain, RT-PCR akan memonitor secara simultan proses

amplifikasi DNA target selama PCR berlangsung, sehingga akan lebih

cepat dalam memberikan hasil dibandingkan PCR konvensional. Selain

cepat, RT-PCR mempunyai kelebihan dalam konsentrasi jumlah DNA

sasaran, artinya jika konsentrasi sampel DNA target sangat banyak

(misalnya 100 ng/uL) maka siklus awal sensor membaca produk

amplifikasi akan lebih cepat atau pendek dibandingkan konsentrasi

sampel DNA target yang sangat sedikit (misalnya 1 ng/uL). Oleh

karena itu, metode RT-PCR dibidang medis digunakan untuk

mengetahui apakah dalam tubuh suatu obat berhasil digunakan untuk

membunuh bakteri/mikroba, di mana jika awal saat penderita sakit,

jumlah mikrobanya banyak yang berarti jumlah DNA sasaran sangat

tinggi (siklus PCR akan lebih cepat, maka saat pengobatan sukses,

jumlah mikroba (dalam hal ini DNA sasaran) turun, akan digambarkan

dengan siklus amplifikasi yang makin lama.

Gambar 14. Jumlah Siklus, Konsentrasi Sampel (Life Technology, 2010)

Pada gambar di atas, warna merah mewakili sampel dengan

konsentrasi 108 ng/uL, biru mewakili 107 ng/uL hingga warna kuning

mewakili 101 ng/uL. Pada konsentrasi total DNA sampel 108, amplikon


yang mencukupi jumlahnya, terbaca oleh alat pada siklus 14, begitu

juga pada konsentrasi yang lain hingga NTC (atau air), maka pola

kemunculan grafik fluorosensi makin lama (siklus makin tinggi). Pola

grafik seperti ini dapat digunakan dalam bidang medis untuk

mengetahui apakah suatu obat dapat menurunkan atau memusnahkan

mikroba, di mana jika jumlah mikroba masih tinggi, siklus amplifikasi

masih terdeteksi.

Dengan demikian, kita dapat melihat keuntungan RT-PCR

dibandingkan PCR konvensional sebagai berikut:

Dengan RT-PCR, kita dapat memantau kemajuan reaksi PCR

dari waktu ke waktu.

Dengan RT-PCR, kita dapat mengukur jumlah produk PCR

(amplikon) dengan tepat pada setiap siklus sehingga

memungkinkan kuantifikasi jumlah yang akurat dari bahan

sampel.

Proses amplifikasi dan deteksi terjadi dalam satu tube,

sehingga dapat menghilangkan manipulasi pasca-PCR

(manipulasi foto hasil elektroforesis PCR untuk menghasilkan

pita yang jelas).

RT-PCR selain dapat digunakan untuk mengetahui jumlah

amplifikasi, dapat juga digunakan untuk mengetahui adanya mutasi

dalam urutan DNA target suatu gen. Salah satu yang telah digunakan

dan dikembangkan adalah teknik hibrid-probe untuk mengetahui jenis

mutasi yang sering ditemukan pada penderita talasemia. Pada teknik

ini, digunakan probe yang akan menempel di salah satu nukleotida

DNA target dan hasilnya dianalisis berdasarkan kurva melting (kurva

leleh).

Analisis kurva leleh adalah suatu metode di mana saat suhu

DNA dinaikkan, untai DNA akan berdisosiasi yang akhirnya akan

meningkatkan intensitas absorbansi cahaya fluorosensi menuju

kondisi hiperkromisitas absorbansi (atau dengan kata lain

penyerapan sinar flourosen meningkat ketika dua untai DNA

terpisahkan). Kurva leleh atau kurva melting merupakan kondisi di

mana suhu meningkat dan 50% DNA mengalami denaturasi sehingga


akan berdisosiasi (berpisah). Adanya kurva melting ini, dapat

digunakan dalam mengetahui ada tidaknya mutasi atau perubahan

tunggal pada basa nukleotida DNA. Misalnya pada dua sampel, 30

urutan DNA target sampel A memiliki basa no 25 adalah A, namun

sedangkan sampel B adalah C, maka jika ditotal jumlah energi yang

dibutuhkan untuk memisahkan dua untai DNA pada sampel A dan B

dalam kondisi kurva melting, akan berbeda. Perbedaan ini menjadi

penanda adanya perubahan basa nukleotida pada 2 sampel yang

berbeda namun untuk target gen yang sama.

Gambar 15. Kurva melting pada 3 sampel dengan DNA gen target yang sama

Pada gambar di atas memperlihatkan 4 warna yang berbeda.

Setiap warna mewakili mutasi dan no sampel. Jika warna merah muda

(pink) adalah sampel no 1, maka kuning adalah sampel nomor 2, ungu

nomor 3 dan biru nomor 4 (atau air). Keempat sampel direaksikan

dengan bahan pereaksi yang sama, namun menghasilkan gambaran

puncak grafik yang berbeda. Jika kita perumpamakan jumlah target

DNA adalah 200 pasang basa (bp) dengan posisi mutasi A menjadi G

pada basa ke 70, maka warna merah muda dan biru mewakili salah

satu basa nukleotida tersebut (A atau G). Jika kita perumpamakan

warna merah muda adalah sampel 1 yang memiliki basa A pada posisi


70, maka ungu adalah sampel 2 yang memiliki basa G pada posisi 70.

Perubahan basa akan menyebabkan perubahan pada temperatur

melting untuk masing-masing sampel. Sehingga akan mengubah kurva

melting. Sampel 1 dapat dinyatakan homozigot untuk basa A (harap

ingat kembali pengertian konsep pasangan alel). Begitu juga dengan

sampel 2 yang dinyatakan homozigot untuk G. Sedangkan untuk garis

grafik kuning atau sampel 3, tampak ada dua puncak grafik yang

berada diposisi sampel 1 dan 2, maka sampel 3 dinyatakan sebagai

heterozigot karena mempunyai kedua basa di pasangan alel-nya.

RT-PCR atau qPCR juga dapat digunakan untuk pemeriksaan

SNP genotipe. SNP genotipe adalah pengukuran variasi genetik

polimorfisme nukleotida tunggal (SNPs) antara anggota suatu spesies.

Ini adalah bentuk genotipe, yang merupakan pengukuran variasi

genetik yang lebih umum. SNP adalah salah satu jenis variasi genetik

yang paling umum. SNP adalah mutasi pasangan basa tunggal pada

lokus tertentu, biasanya terdiri dari dua alel (di mana frekuensi alel

yang jarang adalah> 1%). SNP ditemukan terlibat dalam etiologi

banyak penyakit manusia dan menjadi minat khusus dalam

farmakogenetika. Karena SNP dilestarikan selama evolusi, mereka

telah diusulkan sebagai penanda untuk digunakan dalam analisis sifat

kuantitatif (QTL) dan dalam studi asosiasi di tempat mikrosatelit.

Penggunaan SNP sedang diperluas dalam proyek HapMap, yang

bertujuan untuk menyediakan set minimal SNP yang diperlukan untuk

genotipe genom manusia. SNP juga dapat memberikan sidik jari

genetik untuk digunakan dalam pengujian identitas. Meningkatnya

minat terhadap SNPs telah tercermin oleh perkembangan besar-

besaran beragam metode genotipe SNP. Prinsip teknik SNP genotipe

merupakan kombinasi teknik RFLP dan hampir sama dengan

hibidrisasi probe, hanya analisisnya tidak menggunakan kurva melting

namun “end point genotyping”. Berbedaan dengan RFLP adalah

menggunakan enzim restriksi pada yang dapat memotong area SNP

dan RFLP menggunakan teknik PCR konvensional kombinasi dengan

elektroforesis agarose (telah dijelaskan di pembahasan PCR

sebelumnya). Persamaannya adalah dianalisis pada akhir proses PCR.


Gambar 16. Hasil SNP genotipe menggunakan LC 480-Roche dan analisis “end point genotyping”, warna biru mewakili homo G, hijau adalah homo

A dan merah adalah hetero GA. Abu-abu adalah negatif sedangkan merah muda adalah alel yang tidak diketahui.

(Koleksi pribadi)

Gambar 17. Hasil RFLP pada target gen yang sama dengan gambar sebelumnya

(Dokumentasi pribadi, pelatihan pre conference IMMAN 2019)


Dijelaskan sebelumnya bahwa identifikasi SNP dapat

dilakukan dengan real time PCR. Pemanfaatan teknologi ini akan

memudahkan peneliti dalam hal waktu dalam bekerja dan analisis.

Berbedaan yang paling mendasar dalam SNP-RFLP dan SNP-RT PCR

adalah biaya. Jika dalam RFLP, enzim yang dipakai dapat digunakan

untuk identifikasi target gen lain selama enzim tersebut mengenali

area pemotongan. Sedangkan untuk SNP-RT PCR, karena menggu-

nakan probe khusus dan spesifik, maka probe tersebut hanya menge-

nai fragmen target pada daerah sarannya dan probe SNP tidak dapat

digunakan untuk fragmen target yang lain. Dengan demikian metode

SNP RFLP menjadi lebih murah. Namun dalam hal waktu pengerjaan,

SNP-RT PCR lebih cepat karena dalam 1 “plate tube PCR” yang berisi

96 sumur, kita dapat melakukan uji SNP untuk 96 sampel secara ber-

samaan. Dan dalam waktu kurang lebih 2 jam, kita dapat memperoleh

hasil serta analisis hasil secara bersamaan. Sedangkan untuk SNP

RFLP, memerlukan waktu lebih lama untuk memeriksa 96 sampel

(kurang lebih 1-2 hari). Berikut ini, beberapa contoh percobaan yang

dapat digunakan untuk uji menggunakan RT PCR (qPCR).

1. Identifikasi makanan mengandung produk non halal

(babi)

Metode ini kami kembangkan dari percobaan yang telah

dilakukan oleh Tanabe (2007).

Bahan:

- Sampel DNA dari produk makanan (seperti bakso), lihat

prosedur isolasi genom dari makanan siap saji.

- Primer sapi : Forward 5’- CCCGATTCTTCGCTTTCCAT -3’

Reverse 5’- CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG -3’

- Primer babi : Forward 5’ - CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG -3’

Reverse 5’ - CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC -

3’ (Tanabe, 2007)

- Kit Sybrgreen (harap membaca manual dari masing-masing

manufaktori produsen kit) untuk LC480 (LightCycler@480

SBYR Green).

- “plate well” untuk LC480


Prosedur:

- Encerkan masing-masing primer hingga konsentrasi 10 uM

- DNA sampel diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer.

Jika konsentrasi di atas 60 ng/uL dan kemurnian 1.8 – 2,

lakukan pengenceran 1:9. Jika konsentrasi kurang dari 60

ng/uL dan kemurnian 1.8 – 2, lakukan pengenceran 2:8. Pada

dasarnya, pengenceran dilakukan berdasarkan nilai

kemurniannya. Jika makin rendah kemurniannya, maka jumlah

pelarut untuk pengenceran lebih banyak dari jumlah sampel

DNA. Sebaiknya, lakukan pengenceran dengan menggunakan

pelarut elusi DNA.

- Buat larutan “mix PCR” yang terdiri dari:

- Masukkan 22 uL “mix PCR” ke dalam masing-masing sumur di

“well plate”, kemudian tambahkan 3 uL sampel DNA yang telah

diencerkan.

- Tutup “plate well” dengan plastik penutupnya.

- Masukkan ke dalam alat real time PCR

- Lakukan pengaktifan alat real time PCR sesuai masing-masing

prosedur alat PCR-nya.

- Untuk LC480, telah melakukan optimasi sebelumnya dengan

tahapan:

o Lakukan optimasi suhu annealing menggunakan teknik PCR

konvensional.

o Amati hasil PCR konvensional menggunakan teknik agarose

elektroforesis dan lihat pada lampu UV.

o Hasil optimasi suhu yang tepat, akan digunakan untuk real

time PCR identifikasi kandungan B2 (babi) pada bakso.

o Sebelum melakukan identifikasi kandungan B2 pada bakso,

lakukan pembuatan kontrol positif bakso yang

menggandung B2. Hal ini bertujuan untuk menguji

sensitivitas metode dalam melacak adanya B2 dalam bakso.

o Program real time PCR yang digunakan sebagai berikut


Target (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 95

00:10:00

1 x

PCR 95 60 72

00:00:10 00:00:20 00:00:30

30 x

Kurva Melting 95 60 97

00:00:05 00:01:00

1 x

Pendinginan 40

00:00:10

1 x

Hasil percobaan:

Mencari suhu optimun untuk “annealing”

Gambar 18. 1= 590C; 2= 59.50C; 3= 600C; 4= 60.50C; 5= 610C; 6= 61.50C; 7= 62.50C; 8= DNA Ladder 100 bp, besar amplikon sekitar 100 – 150 bp



Gambar 19. Garis hijau adalah NTC atau kontrol negatif, garis sigmoid merah adalah sampel DNA bakso sapi menggunakan primer DNA sapi


Pada gambar di atas, kami ingin mengidentifikasi apakah

primer DNA sapi yang kami kutip dari Tanabe akan menempel pada

target dan menghasilkan amplikon produk PCR dengan sampel bakso

sapi. Munculnya kurva garis sigmoid menunjukkan terjadi amplifikasi

bakso sapi dengan primer sapi.


Gambar 20. Garis grafik sigmoid warna merah adalah primer babi dengan sampel beberapa bakso babi, dengan konsentrasi terendah 6.67

ng/uL. Garis warna hijau adalah NTC atau dH2O (Dokumentasi pribadi).

Pada gambar di atas memperlihatkan bahwa primer babi dapat

mendeteksi bakso yang mengandung DNA babi dengan konsentrasi

DNA 6.67 ng/uL. Ini menunjukkan jika sampel mengandung produk

non halal (babi), maka akan dapat terdeteksi menggunakan metode

ini. Selanjutnya kita dapat gunakan primer tersebut untuk menguji

produk bakso, apakah mengandung babi atau tidak.


Gambar 21. Primer babi digunakan untuk identifikasi produk bakso yang ada babinya. Garis kurva sigmoid adalah kontrol bakso babi,

sedangkan garis hijau adalah bakso yang diuji (Dokumentasi pribadi).

Dengan melihat gambar di atas, maka kita dapat melakukan

percobaan untuk identifikasi makanan yang mengandung babi. Selain

melihat kurva kenaikan amplifikasi, ada cara lain untuk melihat

apakah makanan dalam hal ini bakso mengandung babi, dengan

melihat kurva leleh atau kurva melting.


Gambar 22. Kurva leleh atau kurva melting. Grafik garis biru adalah menggunakan primer sapi untuk bakso sapi, sedangkan garis merah

adalah menggunakan primer babi untuk bakso babi. Grafik garis hijau adalah primer sapi dengan bakso babi, sedangkan garis abu-abu adalah

primer babi dengan bakso sapi (Dokumentasi pribadi).

2. Identifikasi SNP RS9642880 menggunakan prosedur dan

pereaksi Tagman

Real time PCR juga dapat digunakan untuk identifikasi adanya

satu mutasi pada suatu fragmen target gen, yang biasanya disebut

dengan SNP (senip). Banyak mesin real time PCR yang dapat

digunakan untuk mendeteksi SNP dengan menggunakan sistem

pereaksi terbuka (open system) atau bahan pereaksi uji tidak berasal

dari satu pabrik dari mesin, sebagai contoh LC 480 dari Roche dapat

digunakan untuk identifikasi SNP menggunakan bahan pereaksi uji

bukan dari 1 perusahaan yang sama. Di sini kami akan memberikan

langkah prosedur dalam identifikasi SNP RS9642880 menggunakan

pereaksi Taqman dan mesin LC 480 dari Roche.


Bahan:

- Hasil isolasi DNA (dapat dari cairan tubuh)

- SNP Genotyping assay kit RS9642880, dengan probe

sekuensing VIC/FAM: GCAAAGGCTGGAGTTAGGAGAACCC[G/T]

TGGTTGATGGCTTTGTTAATTATTA

- dH2O bebas dari RNA dan DNA

Prosedur:

- Ukur konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi, kemudian

lakukan pengenceran sampel hingga konsentrasi berkisar 10

ng/uL, dan dilanjutkan lakukan dilusi pada sampel tersebut

dengan perbandingan 1:4 (1 sampel : 4 dH2O).

- Siapkan “master mix reagent” atau larutan pereaksi dalam satu

tabung PCR atau tabung 2.0 mL sesuai petunjuk dari kit

Taqman SNP Genotyping Assay.

- Masukkan dalam “plate well LC480” larutan pereaksi sebanyak

8 uL dan tambahkan 2 uL sampel uji.

- Masukkan “plate” tersebut pada mesin LC480, jalankan mesin

dengan program sebagai berikut:

o Format deteksi: dual color hydrolysis?UPL Probe

o Analysis: Endpoint Genotyping

o Prosedur eksperiment:

Name Cycles Analysis

Mode Target

(0C) Acquisition

Mode Hold Ramp

UNG 1 None 50 None 00:02:00 4.4 Poly ACt

1 None 95 None 00:00:20 4.4

PCR 50 Quantification 95 None 00:00:03 4.4 60 Single 00:00:20 2.2

Finish 1 None 40 None 00:00:30 2.2


Gambar 23. Hasil analisis “SNP Genotyping” Taqman Kit RS9642880. Warna mewakili alel, hijau untuk alel minor homozigot; merah untuk alel heterozigot, biru untuk alel mayor homozigot dan abu-abu untuk

NTC atau air (Dokumentasi pribadi)

3. Identifikasi gen AGTR1 RS5186 dengan metode rhAmp

SNP

Metode lain yang dapat digunakan untuk deteksi SNP dengan

real time PCR adalah “rhAmp SNP assay”. Secara ekonomis, metode ini

lebih murah namun sensitivitas sama dengan metode lain. Ayawey,

dkk. (2019) telah melakukan uji perbandingan antara beberapa

pereaksi deteksi SNP.

Bahan:

- Genom DNA hasil isolasi yang telah diukur konsentrasinya.


- Larutan campuran pereaksi rhAmp SNP (ikuti petunjuk dari

cara kerja) atau dapat mengikuti prosedur di bawah ini.

Cara kerja:

- Lakukan pengenceran 2:4 jika kemurnian di bawah 1.8 dan

konsentrasi kurang dari 20 ng/uL. Jika konsentrasi di atas 20

ng/uL namun kemurnian di bawah 1.8, lakukan pengenceran

1:4

- Masukkan 3 uL larutan campuran pereaksi rhAmp SNP dalam

masing-masing sumur di “plate well”, lalu tambahkan 2 uL

sampel.

- Adapun komponen campuran pereaksi rhAmp SNP sebagai

berikut:

Material uL Master Mix 0.95 x ((2n+1)x 2.65 )uL dH2O 2 x (2n+1) uL rhAmp@SNP 0.25 x (2n+1) uL Reporter Mix 0.05 x ((2n+1)x 2.65)uL n = jumlah sampel; 2 = duplikasi sampel (jika biasa menggunakan triplikasi, maka

angka 2 dapat diganti menjadi 3)

- Masukkan ke dalam mesin LC480 dan jalankan program

sebagai berikut:

Name Cycles Analysis

Mode Target

(0C) Acquisition

Mode Hold Ramp

Enz Act

1 None 95 None 00:10:00 4.4

PCR 50 Quantification 95 None 00:00:10 4.4

60 68

Single None

00:00:30 00:00:20

2.2 2.2

Finish 1 None 40 None 00:00:30 2.2


Gambar 24. Warna biru adalah alel mayor homozigot; warna merah adalah alel heterozigot sedangkan abu-abu adalah NTC atau dH2O. Pada

percobaan ini, alel minor homozigot tidak terdeteksi (Dokumentasi Pribadi).

4. Identifikasi hemoglobin varian HbE dengan Hibridisasi-

probe kurva melting

Metode Hybridization Probe Melting Curve Genotype (Hybrid

Probe) atau hibridisasi probe kurva melting merupakan metode

terbaru yang dikembangkan oleh Yamashiro dkk (2012) untuk

mendeteksi adanya mutasi pada urutan DNA secara cepat dan akurat.

Hybridization Probe Melting Curve Genotype terdiri atas kombinasi

antara teknik PCR menggunakan Probe dan teknik kurva melting Real

time PCR pereaksi formamide. Metode tersebut menggunakan DNA


probe yang telah dilabel dengan suatu penanda yang memiliki prinsip

kerja reaksi fluoresen. DNA probe yang telah dilabel akan

berkomplementasi dengan DNA target melalui hibridisasi sehingga

dapat mendeteksi keberadaan gen tertentu.

Bahan :

- Kit PCR Takara (bisa diganti Kit PCR lainnya)

- Genom DNA sampel

- DNA control positif

- Tube PCR

- Agarose dan buffer elektroforesis

- Hi-di Formamide

- Primer :

o Forward primer β7: 5’-CCAAGGACAGGTACGGCTGTCATCA-

3’

o Reverse Primer β8: 5’-CCTTCCTATGACATGAACTTAACCAT-

3’

- Probe[

o HbE : CD26 GAG→AAG

Sensor Probe:LCRed640-CCCAGGGCCTCACCACC-

Phosphate

Anchor Probe:CCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCA

ACC-Fluorescein

o Probe : CD41/42 TTCTT→TT

Sensor Probe:CTTAGGCTGCTGGTGGTCTACC-Fluorescein

Anchor Probe：LCRed640-TTGGACCCAGAGGTTCTTTGAG

TCCTTT-Phosphate

Cara kerja :

- Lakukan pembuatan larutan campuran PCR sesuai dengan

prosedur di bawah ini.

Bahan N x 1 (uL) dH2O 10.9 10x Buffer 2.0 2.5mM dNTP 1.6


Bahan N x 1 (uL) 5 pmol Primer Forward 2.0 5 pmol Primer Reverse 2.0 Taq Polimerase 0.1 Sampel genom 1.0

- Masukkan tube PCR yang telah berisi bahan uji dan sampel ke

alat PCR konvensional.

- Aktifkan mesin dengan program PCR sebagai berikut.

Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Denaturasi awal 94 00:03:00 1 x Denaturasi 94 00:00:40 Annealing 62 00:00:30 35 x Extensi 72 00:01:00 Pendinginan 24 00:03:00 1 x

- Periksa hasil amplifikasi PCR menggunakan agarose 1.5%

- Siapkan larutan campuran Hibri-Probe untuk uji HbE ataupun

talasemia CD41/42 sebagai berikut

(uL) dH2O 2 PCR Produk 10 Hi-di Formamide 4 Campuran Probe 4

- Masukkan larutan campuran dan amplikon PCR (hasil uji PCR

b-globin) dalam sumur di plate well.

- Taruh “plate” dalam mesin real time PCR dengan program

sebagai berikut

Nama Suhu (0C)

Waktu Siklus Analisis

Denaturasi 95 00:05:00 1 None annealing 28 00:02:00 1 Melting Curves

Melting 28-80 Continous-Acquistion

Mode 1 Melting Curve

Cooling 40 00:01:00 1 Melting Curves


Hasil

Gambar 25. Hasil elektroforesis PCR b-globin (Dokumentasi pribadi)

Gambar 26. Hasil Hibri-Probe kurva melting untuk deteksi talasemia tipe CD41/42



Gambar 27. Hasil Hibri-Probe kurva melting untuk deteksi HbE (Dokumentasi pribadi, Pelatihan Thalassemia 2013)

5. Deteksi -thalassemia-1 SEA menggunakan gap-Real time

PCR

Metode ini dikembangkan oleh Pornprasert (2008) dalam

deteksi -thalassemia menggunakan real-time PCR. Delesi yang besar

pada urutan DNA gen -globin menjadi salah satu kendala dalam

teknik deteksi -thalassemia. Metode deteksi gap-PCR dengan real

time PCR dan pereaksi Sybr green akan memudahkan dalam deteksi

dan analisis hasil percobaan.

Bahan:

- Sampel DNA

- Kit Sybr Green

Primer Sequence 5’3’:

NaI-Forward primer AGA AGC TGA GTG ATG GGT CCG

NaII-Reverse primer ACA AAC GCC CGT CCG ACT CAA

NaIII-Reverse primer TGG ACT TAA GTG ATC CTC CTG CCC

- dH2O


Prosedur :

Nama uL PCR Mix Sybr Green X 10 uL Primer NaI 10 uM X 0.5 uL Primer NaII 10 uM X 0.76 uL Primer NaIII 10 uM X 0.5 uL dH2O free Dnase/Rnase X 1.24 uL Sampel DNA 7 uL

Program real time PCR:

Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Analisis Denaturasi 95 00:15:00 1 None Denaturasi 94 00:00:20 Annealing 60 00:00:20 40 None Elongasi 72 00:00:20

Melting 80 – 95 Continous-Acquistion

Mode 1

Melting Curve

Cooling 40 00:01:00 1 None


Gambar 28. Hasil Real time PCR uji -thal-1 SEA (Dokumentasi pribadi, pelatihan Chiang Mai University 2016)

6. Estimasi semikuantitatif area delesi -thalassemia dengan

Junction- Real Time PCR

Percobaan ini bertujuan mencari area lokasi delesi dari suatu

gen dengan mengukur masing-masing dosis/konsentrasi gen hingga

mencapai lokasi pertemuan area di mana dosis gen kurang dari 75%.

Mencari lokasi pertemuan diperlukan karena area gen delesi yang

panjang sehingga harus dilakukan penyisiran urutan basa gen yang

dituju.


Gambar 29. Lokasi gen b-globin di kromosom 11 yang breakpoint? sulit ditentukan

Bahan:

- Sampel DNA

- Mastermix SybrGreen I Roche Diagnostic

- Set primer 5’bLCR dan LPL-9

- ddH2O

Prosedur:

1. Siapkan bahan master mix untuk 5’-LCR dan LPL-9. LPL-9

adalah internal kontrol.

2. Buat kurva standar dengan konsentrasi DNA kontrol: 3,75 ng;

1,875 ng; 0,9375 ng dan 0,46875 ng.

3. Sampel dilakukan pengenceran hingga konsentrasi DNA

adalah 1,875 ng. Konsentrasi ini yang digunakan untuk

menghitung “copy number”.

4. Masukkan masing-masing sampel ke dalam tabung 2 mL yang

berisi master mix, sesuai langkah dari FastStart DNA Master

SYBRGeen I Roche.

5. Pindahkan ke dalam plate tube 20 uL.

6. Masukkan ke dalam mesin dengan langkah sebagai berikut.


Nama Suhu (0C) Waktu Siklus Analisis Denaturasi 95 00:00:10 1 None Denaturasi 94 00:00:10 Annealing 60 00:00:30 40 None Elongasi 72 00:00:10

Melting 70 – 95 Continous-Acquistion

Mode 1 Melting Curve

Cooling 40 00:01:00 1 None

7. Dosis gen DNA sampel diekspresikan dengan “ratio copy

number dari gen -globin terhadap LPL-9. Jika tidak ada delesi

nilai ratio adalah 1 sedangkan 0,5 jika terdapat delesi.

8. Masukkan dalam tabel, jadi kita dapat mengamati lokasi delesi.

Kode Pasien

LCR-1-a

LCR-2

LCR-3

LCR-6

LCR-63-a

LCR-7-2

LCR-8

LCR-10

P6 1.30 1.25 0.59

0.63 0.64 0.52 X

P8 1.47 1.27 1.24 1.47 1.33 0.58

Y


BAB VI. MERANCANG PRIMER

Primer merupakan oligonukleotida pendek (terdiri dari 18-30

bp) yang akan menempel di untai tunggal DNA target serta akan

memulai proses perpanjangan untai tunggal membentuk untai ganda

DNA atau sintesis DNA. Dalam organisme hidup, proses sintesis DNA

akan melibatkan banyak faktor, tidak hanya primer DNA. Namun

dalam laboratorium, sintesis DNA hanya melibatkan DNA target,

primer, dNTP (A,T,C,G), buffer dan enzim polimerase.

Keberhasilan dalam memperbanyak fragmen DNA target,

sangatlah tergantung dari keberhasilan kita dalam melakukan desain/

perancangan primer yang tepat. Ketidakspesifikan dalam perancangan

primer akan menyebabkan primer tidak akan menempel di area gen

target, atau dapat menempel tidak hanya di area gen target namun di

area lain maupun penempelan sesama primer sehingga akan

menghasilkan produk PCR atau amplikon yang tidak spesifik.

Banyak aplikasi atau link website yang dapat kita gunakan

dalam merancang primer. Umumnya peneliti merancang primer

melalui NCBI, Primer3 atau melalui link berbayar seperti Oligo7 dan

sebagainya. Namun secara garis besar dalam merancang primer harus

memenuhi persyaratan sebagai berikut:

1. Primer harus bisa menempel hanya didaerah target. Primer ini

dirancang untuk memiliki urutan yang merupakan pelengkap

kebalikan dari wilayah template atau DNA target yang akan

diPCR.


2. Panjang primer antara 18-30 bp (biasanya 18-24 bp), primer

yang pendek akan mengakibatkan spesifisitas rendah sehingga

menghasilkan amplifikasi non-spesifik, sedangkan jika terlalu

panjang akan mengurangi efisiensi pengikatan atau

penempelan dengan DNA template pada suhu annealing

normal dan memungkinkan membentuk struktur sekunder

seperti “hairpins”.

3. Konten basa G + C sekitar 50-60% akan memberikan suhu

leleh (Tm) untuk penempelan (annealing) primer ke template

yang baik, dan akan memberikan stabilitas hibridisasi yang

sesuai.

4. Suhu leleh (Tm) merupakan faktor penting dalam menentukan

suhu annealing PCR berkisar 500 – 700C atau rata-rata terbaik

600C.

5. Karena primer bekerja berpasangan (“forward” primer dan

“reverse” primer) maka harus dipastikan suhu annealing PCR

cocok untuk kedua primer tersebut. Perbedaan maksimum

yang diizinkan adalah 30C. Semakin dekat Tanneal semakin baik.

Cara menghitung Tanneal adalah (Tm primer F + Tm primer R) :

2. Jadi jika suhu Tm F adalah 580C maka sebaiknya suhu Tm R

adalah berkisar 56 – 60. Jadi suhu Tanneal berkisar 590C.

5 CTGATCAAGTCGATGGCTTG 3 Fw 590 C

5 GATGGAGAGGCTTGACTGC 3 Rv 580 C


6. Dalam merancang primer, hindari terjadinya “hairpins” dan

“stemloop”.

7. Hindari juga komplementer di ujung 3’- dari primer antara

primer F dan primer R.

Jika kita merancang sendiri primer menggunakan software

yang bebas seperti di NCBI, software akan menghitung panjang

primer, persentase GC, suhu leleh. Namun, kita juga dapat menghitung

suhu leleh secara manual dengan rumus:

Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)

Dalam melakukan kerja PCR, ada baiknya kita lakukan

pemeriksaan optimasi primer menggunakan teknik PCR gradien.

Teknik ini dilakukan untuk mencari suhu annealing yang terbaik

untuk primer yang kita gunakan sebelum kita memakainya

menggunakan sampel sesungguhnya. Misalnya kita ingin menguji

primer A untuk digunakan pada DNA pasien, maka terlebih dahulu

kita lakukan uji optimasi primer A menggunakan sampel non pasien

atau sampel kontrol positif. Hal ini dilakukan mengingat untuk

mendapatkan sampel pasien lebih sulit dibandingkan sampel non

pasien atau kontrol positif.


Contoh membuat primer sendiri:

Merancang primer b-globin manusia

Prosedur:

1. Buka Wikipedia, pilih HBB (betaglobin). Wikipedia adalah

pilihan termudah jika kita ingin mencari informasi dari suatu

gen.

2. Lihat di box paling kanan, ada gambar 3D HBB, cari kolom

ortologi (Orthologs), tarik kursor mouse di pilih ensembl

human, enter.


3.

4. Akan dibawa ke link ensembl khusus untuk human b-globin.

Lihat kotak paling kirim tertulis Gene-based displays, pilih

sequence, maka anda akan dapat urutan DNA b-globin

manusia.


5. Pilih area yang akan anda teliti atau periksa dengan PCR,

misalkan huruf terblok kuning dengan tulisan merah yang blok

ke 3 dimulai dengan CGGC… tarik kursor hingga akhir blok ke

empat dengan urutan CTTTAC, copy/salin urutan tersebut

6. Pindah link ke NCBI/Primer-blast atau Primer3web jika

software NCBI sedang bermasalah.


7. Masukkan area urutan basa (daerah yang kita inginkan) dari

salinan no 5 ke dalam kotak PCR template.

8. Lalu lihat di kotak yang tertulis Pick Primer, taruh kursor di

tulisan tersebut dan tekan, maka anda akan mendapatkan

rancangan primer yang dilakukan oleh software.


BAB VII. ISOLASI PROTEIN

Studi tentang protein dalam suatu organisme hidup

merupakan bagian terintegrasi dari penelitian ilmu hayati atau biologi.

Protein adalah kelompok molekul biologis yang paling beragam dan

sangat penting untuk struktur dan fungsi seluler. Langkah pertama

dalam analisis protein adalah ekstraksi seluler. Karena protein begitu

heterogen, tidak ada satu metode atau reagen yang optimal untuk

isolasi protein secara umum. Selain itu, teknik ekstraksi protein

bervariasi tergantung pada sumber bahan awal, lokasi di dalam sel

protein yang diminati dan aplikasi di hilir. Banyak teknik telah

dikembangkan untuk mendapatkan hasil dan kemurnian protein

terbaik untuk berbagai jenis sel dan jaringan, dengan

mempertimbangkan di mana sesuai, lokasi subselular protein dan

kompatibilitas ekstrak protein dengan langkah selanjutnya dalam

percobaan.

Pada penelitian ilmu hayati, protein biasanya diekstraksi dari

sel mamalia yang dibudidayakan atau dikultur. Saat mengeluarkan

protein dari jaringan mamalia, gangguan mekanis diperlukan untuk

mengisolasi sel dari matriks jaringan mereka. Untuk sel mamalia dan

primer kultur, yang hanya memiliki membran plasma yang

memisahkan isi sel dari lingkungan, pelarut pereaksi yang

mengandung detergen dan komponen lainnya dapat dengan mudah

mengganggu lapisan bilayer membran protein-lipid, dengan demikian

ekstraksi protein relatif mudah. Organisme lain yang juga umum

digunakan dalam penelitian protein, termasuk bakteri (sebagai alat

untuk ekspresi protein), ragi (sebagai model untuk biologi sel) dan

tanaman (untuk bioteknologi pertanian) mengandung dinding sel,

yang secara tradisional memerlukan lisis mekanis. Namun, solusi

berbasis detergen telah dikembangkan untuk secara efisien melisiskan


sel-sel ini tanpa menggunakan gangguan fisik. Penggunaan lisis sel

dapat mengganggu selaput sel dan organel yang menghasilkan

aktivitas proteolitik dan dapat mengurangi hasil dan fungsi protein.

Untuk mencegah degradasi protein yang diekstraksi serta

mendapatkan hasil dan aktivitas protein terbaik diperlukan

penghambat lisis, protease dan fosfatase dapat ditambahkan ke

pereaksi lisis. Sejumlah senyawa telah diidentifikasi dan digunakan

untuk menghambat aktivitas protease dan fosfatase dengan mengikat

secara reversibel atau tidak. Karena beberapa detergen yang

digunakan dalam formulasi ekstraksi protein dapat menonaktifkan

fungsi enzim yang diminati atau mempengaruhi stabilitas jangka

panjangnya, maka sangat penting untuk menghilangkan detergen

setelah lisis sel. Selain itu, konsentrasi tinggi detergen atau garam

dapat mengganggu metode penelitian umum seperti tes protein,

pemurnian protein, imunopresipitasi, elektroforesis gel dan

spektrometri massa (MS). Dalam beberapa kasus, zat yang

mengganggu dapat dikurangi hanya dengan pengenceran atau dialisis.

Secara historis, pelisisan fisik merupakan metode terbaik

untuk ekstraksi protein. Namun dalam beberapa tahun terakhir,

metode lisis berbasis detergen telah menjadi standar. Telah banyak

vendor atau perusahaan yang telah mengembangkan kit yang baik dan

lengkap serta siap pakai untuk isolasi sel dan ekstraksi protein yang

efisien. Reagen ekstraksi protein dioptimalkan untuk jenis sel dan

jaringan tertentu, lokasi seluler dari protein yang diminati, dan pada

kebanyakan kasus, tidak memerlukan lisis fisik. Selain itu, produk ini

kompatibel dengan aplikasi biologi protein hilir yang paling umum

digunakan.

Protein membran memainkan peran kunci dalam proses

biologis mendasar, seperti pengangkutan molekul, pensinyalan,

pemanfaatan energi, dan pemeliharaan struktur sel dan jaringan.

Sekitar 30% gen ditentukan oleh protein membran, dan lebih dari 50

%-nya merupakan target obat saat ini. Meskipun penting,

pengetahuan kita tentang struktur dan fungsi protein membran pada

tingkat molekuler tertinggal jauh di belakang untuk protein terlarut.


Protein membran terintegral di lingkungan lipid membran biologis.

Untuk mendapatkan protein membran, maka diperlukan teknik

pemurnian, penanganan, dan analisis untuk protein larut di

lingkungan lipid tersebut. Hal ini biasanya dilakukan dengan

menambahkan detergen yang melarutkan biomembran dan

membentuk kompleks yang mudah larut dengan protein lipid dan

membran. Solubilisasi id sini harus dioptimalkan secara hati-hati

untuk menghindari kehilangan protein dan inaktivasi, di mana

denaturasi protein dan/atau agregasi sering dijumpai. Oleh karena itu

solubilisasi adalah salah satu aspek yang paling penting dalam

penanganan protein membran.

Pada isolasi protein, langkah pertama yang harus dipikirkan

adalah bagaimana membuang bagian dari sel yang bukan protein,

sehingga kita akan memperoleh protein murni. Secara umum, sel

hewan lebih mudah dalam isolasinya dibandingkan sel bakteri, jamur

maupun tumbuhan. Ada beberapa metode di bawah ini, namun bukan

menjadi metode mutlak:

1. Metode dengan pencacahan menggunakan “blender” teknik

homogenisasi pada sel hewan, akan memecah dan mencacah

jaringan sehingga dinding sel akan hancur.

2. Metode lisis, menggunakan larutan EDTA-Lisozim, dapat

digunakan untuk melarutkan dinding sel bakteri gram negatif,

sedangkan jika menggunakan pelarut organik seperti toluen

dapat melarutkankan bakteri dan yeast/jamur.

Semua metode yang paling umum untuk ekstraksi protein,

memiliki kelebihan dan kekurangan masing-masing metode.

7.1. Pemurnian Protein

Teknik isolasi dan pemurnian yang akan diterangkan dalam

buku ini adalah dalam bidang biologi molekular di mana akan

mengisolasi protein dari suatu mikroorganisme. Teknik ini tetap dapat

digunakan untuk isolasi protein pada organisme lain dengan

melakukan modifikasi.


7.2. SDS-Page

Elektroforesis gel poliakrilamid adalah salah satu teknik yang

paling sering digunakan untuk memisahkan makromolekul (DNA, RNA

dan protein). Banyak digunakan untuk menampilkan dan untuk

memisahkan protein maupun asam nukleat yang berbeda panjangnya.

Untuk memperoleh hasil pemisahan makromolekul, khususnya

polipeptida atau protein, diperlukan kondisi yang tepat meliputi

konsentrasi poliakrilamid, ketebalan gel dan sebagainya.

Elektroforesis secara umum merupakan proses pemisahan

makromolekul yang didasarkan pada muatan molekul tersebut dalam

suatu larutan dan resistansinya. Pada gel matriks poliakrilamid atau

agarose, resistansi yang diberikan oleh matriks berkaitan dengan

ukuran molekul dan bentuk molekul saat melewatinya. Untuk ukuran

pori tertentu, molekul yang besar akan mengalami hambatan yang

lebih besar sehingga bergerak lebih lambat saat melewati matriks

daripada molekul yang kecil.

Protokol Sederhana Protein Purifikasi dan Analisisnya

1. Homogenisasi jaringan mamalia

Untuk memurnikan atau mengkarakterisasi protein

intraselular, penting untuk memilih metode yang efisien untuk

mengganggu sel atau jaringan yang secara cepat melepaskan protein

dari kompartemen intraselnya ke dalam penyangga yang tidak

berbahaya bagi aktivitas biologis protein yang diminati. Salah satu

metode yang paling banyak digunakan untuk mengacaukan jaringan

lunak adalah homogenisasi. Dalam protokol ini, cara untuk

homogenisasi jaringan dengan menggunakan pencacah dan pemotong

mekanis seperti homogenizer kaca Potter-Elvhjem -Teflon,

homogenizer Dounce, atau Waring. Metode ini cepat dan berisiko kecil

terhadap protein dibandingkan metode lain untuk isolasi protein dari

kompartemen seluler. Pada metode ini, kadang digunakan bahan

penghambat aktivasi enzim protease untuk mencegah terjadinya

degardasi proteolitik.


Bahan:

Jaringan (jaringan mamalia)

Larutan stok DTT 0.5 M (Dithiothreitol) : harap diingat DTT

sangat berbahaya, gunakan pelindung diri saat membuatnya

seperti masker, sarung tangan dan dilakukan di lemari asam.

Buffer A homogenasi

1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)

2. 2 mM EDTA

3. 150 mM NaCl

4. 0.5 mM DTT

Buffer B homogenasi

1. 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)

2. 10 % (v/v) gliserol atau 0.25 M sukrosa

3. 5 mM Mg-asetat

4. 0.2 mM EDTA

5. 0.5 mM DTT

6. 1.0 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride). Bahan ini

berbahaya, gunakan pelindung diri.

Alat:

Sentrifuse

Corong berfilter

Pisau

Alat teflon homogenasi dan tabung Potter-Elvehjem

Cara:

Jaringan mamalia dibersihkan dari lemak dan jaringan

pembungkusnya, rendam dalam buffer A kondisi dingin.

Potong kecil-kecil, agar memudahkan dalam penggilingan.

Masukan 4 volume buffer B yang dingin ke dalam tabung kaca

Potter, letakkan tabung kaca tersebut dalam wadah berisi air

dingin atau es.

Masukkan jaringan yang dipotong kecil-kecil (jangan langsung

banyak).


Masukkan alat giling teflon, nyalakan mesin homogenasi,

dimulai dengan kecepatan 500 rpm, ditingkatkan hingga 1500

rpm. Gerakan tabung sehingga jaringan tergerus rata.

Tuangkan hasil gerusan ke tabung sentrifuse, sentrifuse pada

kecepatan 10.000 rpm suhu dingin selama 10 menit untuk

membuang sisa bahan potongan tak berguna.

Tuang supernatan ke corong berfilter, untuk membuang

lapisan lemak.

Supernatan yang telah disaring siap digunakan.

2. Isolasi protein penyusun sel darah merah (ghost red blood

cells)

Isolasi protein sel darah merah, merupakan salah satu teknik

isolasi protein yang sederhana. Kegunaan analisis protein di sini untuk

analisis ada tidaknya kerusakan membran protein dan sitoskeleton sel

darah merah. Adanya kelainan genetik pada komponen penyusun

membran sel darah merah, akan menyebabkan individu mengalami

anemia seperti pada kasus yang umum adalah pada ovalositosis,

eliptosisosi, sferositosis.

Bahan:

Darah

NaCl fisiologis

Buffer hipotonus lisis 15 mM

Buffer hipotonus lisis 10 mM

Alat:

Tabung darah EDTA

Tabung sentrifuse

Sentrifuse

Cara:

Ambil 5 mL darah, pisahkan sel darah merah dari plasma

dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan 3.000 rpm selama

10 menit suhu 40C.


Sel darah merah kemudian dicuci menggunakan larutan NaCl

fisiologis dan mensentrifugasinya selama 5 menit pada

kecepatan 3.000 rpm suhu 40C.

Pindahkan sel darah merah yang telah dicuci ke tabung

sentrifus yang berisi buffer lisis 15 mM dingin, dengan jumlah

volume perbandingan sel darah merah dan buffer 1:3. Sentrifus

pada kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 40C.

Buang supernatan.

Lakukan pelisisan buffer 15 mM sebanyak 3-4 X.

Pada hasil pelisisan dengan buffer 15 mM, akan didapatkan

endapan merah muda tua.

Tambahkan pada tabung sentrifuse yang berisi endapan pink

tersebut dengan buffer lisis 10 mM, diamkan 30 – 60 menit

pada lemari pendingin -200C, untuk mempercepat proses

pelisisan.

Sentrifuse pada kecepatan maksimal (13.000 rpm – 14.000

rpm) selama 20 menit. Ulangi proses ini 2 – 3 x, akan diperoleh

endapan merah muda samar – putih.

Endapan yang diperoleh dapat digunakan untuk tahap

selanjutnya.

3. Teknik SDS-PAGE protein penyusun sel darah merah

Bahan:

1.5 M tris (pH 8.8)

30 % akril/ 0.8 % bis-akrilamid

10 % SDS

10 % APS

TEMED

2x sampel buffer terdiri dari 100 mM tris-HCl ph 6.8; 20 %

gliserol; 4 % SDS; 0.2 % BPB (bromfenol biru); 20 mM DTT

atau 10 % BME

running buffer terdiri dari 25 mM Tris; 250 mM glisin dan 0.1

% SDS


Cara:

Pembuatan gel pemisah konsentrasi 12 % (resolving gels/ separating

gesl)

Bahan 5 mL 10 mL 15 mL 20 mL 25 mL Air steril 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 1.5 M Tris 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 Akril/bis-akril 2 4 6 8 10 SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 APS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01

Pembuatan gel penumpuk (stacking gels)

Bahan 1 mL 2 mL 3 mL 4 mL 5 mL Air steril 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 1.0 M Tris 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 Akril/bis-akril 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 APS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 TEMED 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005

1. Bersihkan lempeng kaca dan plastik pembatas dengan alkohol

untuk menghindari lemak. Gunakan sarung tangan agar bercak

lemak tangan tidak menempel di lempeng kaca.

2. Taruh lempeng kaca 1 (lempeng yang besar), kemudian

pembatas terakhir lempeng kaca 2.


3. Jepit kanan kiri dengan penjepit kertas atau penjepit lainnya.

4. Tuang campuran air isopropanol, kira-kira setengah dari luas

lempeng kaca, lihat ada kebocoran atau tidak.

5. Buang cairan tersebut, balik untuk mengeringkan.

6. Setelah kering, tuang gel pemisah sampai 3.4 luas lempeng

kaca 2.

7. Biarkan 15 – 20 menit sampai mengeras/membeku, posisi

harus tegak berdiri tidak miring. Untuk mengetahui sudah

mengeras, ambil sedikit gel pemisah, taruh dalam tabung 1.5

mL diamkan sampai mengeras. Jika gel dalam tabung

mengeras, ini berarti gel dalam lempeng juga sudah mengeras.

Tuang butanol di atasnya agar gel tidak kering saat kita

menyiapkan gel penumpuk. Setelah gel penumpuk siap

dituang, buang larutan butanol tersebut.

8. Tuang gel penumpuk hingga melewati bibir lempeng kaca,

taruh lempeng sisir untuk membuat sumur sampel.

9. Biarkan sampai mengeras/membeku. Buka jepitannya

10. Gel SDS-PAGE siap digunakan.

11. Letakkan gel dan lempengannya dalam kotak elektroforesis,

jepit agar buffer SDS tidak tumpah saat dituang, tuang buffer

SDS (running buffer) dalam bak buffer atas bawah. Buka

lempeng sisir.

12. Ambil 100 uL sampel isolat protein dalam 2x sampel buffer.


(https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/sds-page.html)

13. Masukkan ke dalam sumur (kira-kira 10 uL).

14. Nyalakan sumber listrik dengan arus yang diatur. Biarkan

proses pemisahan terjadi dengan bergeraknya sampel hingga

batas 1/3 lempengan (harap ditandai batas 1/3 dari bawah

lempengan).

(https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Information/4581/techniques/ge

l_elect/page_protein.html)


15. Gel siap diwarnai dan dicuci untuk tahap lanjutannya.

16. Cuci lempengan tersebut dalam air mengalir untuk

menghilangkan bekas buffer.

17. Lepaskan gel dari lempengannya (harap hati-hati), taruh dan

rendam gel tersebut dalam larutan biru Coomassie. Biarkan

selama 3 – 4 jam, gunakan mesin penggoyang (shaker) dalam

gerakan pelan.

18. Setelah selesai perendaman, pindahkan gel ke dalam wadah

yang berisi larutan pencuci. Cuci selama 1-2 jam, setiap 30

menit, ganti larutan pencuci yang sudah berubah warna.

19. Gel siap dianalisis.

(https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/sds-page.html)

20. Hasil pencucian :

Koleksi pribadi


Daftar Pustaka

1. Chris Adhiyanto, Rini Puspitaningrum. Genetika Molekuler dan

aplikasinya. UNJ Jakarta, 2018.

ISBN 978-623-7022-86-2

2. Chris Adhiyanto, Yasuhiro Yamashiro, Yukio Hattori, et al. A

New β0-Thalassemia Mutation (codon 102, AAC>ATCAC) in

Coexistence with a Heterozygous P4.2 Nippon Gene.

Hemoglobin, vol. 37, pp 227 -240, Apr 2013.

ISSN: 0363-0269 print/1532-432X online

DOI: 10.3109/03630269.2013.777847

3. Takenori Nitta, Fumio Kawano, Yasuhiro Yamashiro, Fumiya

Takagi, Tomoaki Murata, Tatehiko Tanaka, Mella Ferania, Chris

Adhiyanto, Yukio Hattori. A new Krüppel-like factor 1

mutation (c. 947G> A or p. C316Y) in humans causes β-

thalassemia minor. Hemoglobin, vol. 39, pp 121-126, March

2015.

ISSN: 0363-0269 (print), 1532-432X (electronic)

DOI: 10.3109/03630269.2015.1008702

4. Rini Puspitaningrum, Chris Adhiyanto, Annisa Firdausi,

Nurmasari Sartono, Ria Amelia, Mella Ferania, Yukio Hattori,

Yasuhiro Yamashiro, Riana Bagaskorowati, Saparuddin

Muktar. Identification Of The Levulinate Dehydratase (ALAD)

Gene Polymorphism And Whole Blood Hemoglobin In The

Students Of Elementary School In Kalideres. Asian Jr.of

Microbiol.Biotech.Env.Sc, vol 19, pp 897-904, Oct 2017.

5. Yasuhiro Yamashiro, Yukio Hattori, Takenori Nitta, Chris

Adhiyanto, Maryam M Matar, Mella Ferania, Fumiya Takagi.

Filipino-type β 0-thalassemia has 116 kb Deletion: Its Correct


Breakpoints and Five Cases Found in Japan. Bull Yamaguchi

Med Sch, vol 59, pp 53-59, 2012.

6. Dewi Shinta, Chris Adhiyanto, Min Kyaw Htet, Umi Fahmida.

The Association of TMPRSS6 Gene Polymorphism and Iron

Intake with Iron Status among Under-Two-Year-Old Children

in Lombok, Indonesia. Nutrient, vol 11, pp 878, Apr 2019.

DOI:10.3390/nu11040878

7. Rini Puspitaningrum, Chris Adhiyanto, Nurmasari Sartono,

Palgunadi Palgunadi, Solihin Solihin, Yasuhiro Yamashiro,

Yukio Hattori. δ aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) gene

polymorphism of marine taskforce personnel whit routine

exposure of lead suspended in air. MATEC Web. Conf, vol 197,

pp 06002, 2018.

8. Chris Adhiyanto, Witri Ardini, Hoirun Nisa, Zeti Harriyati, Dina

A Amu, Kemal AL Fajar, Taslim Poniman, Rofi Saunar, W

Aditomo. Genetic pattern of CYP1A1* 2A (T> C) gene in patients

with colorectal cancer in South Jakarta–Indonesia. Prociding.

Advances in Health Sciences Research, Dec 2017.

DOI: https://doi.org/10.2991/ichlas-17.2017.5

9. YR Dewahrani, C Adhiyanto, W Futy, R Puspitaningrum.

Screening of hemoglobin E in students of biology Universitas

Negeri Jakarta using Hybri-Probe genotype method. Asian Jr.of

Microbiol.Biotech.Env.Sc, vol 17, pp 379-385, 2015.

10. Chris Adhiyanto, Nouval Shahab, Flori R Sari, Hipni Solehudin,

Mukhtar Ikhsan, Nurlaely Mida, Witri Ardini, Zati Harriyati,

Narila Mutia Nasir, Hari Hendarto. Identification Rs9642880

Taqman Genotyping Using Lightcycler 480. Asian Jr. of

Microbiol. Biotech. Env. Sc. Vol. 21, pp 920-923, Apr 2019.

11. Chris Adhiyanto, Narila Mutia Nasir, Flori R Sari, Risfy Gusti

Pamungkas, Intan Azis, Zeti Harriyati, Witri Ardini, Hari

Hendarto, Nouval Shahab, Endah Wulandari, Fase Badriah.

Preliminary Study: Identification Of Dna Variation With SNP

Numbers Rs1137101 And Rs8050136 In Patient’s Type 2


Diabetes Mellitus At Salsabila Clinic Bogor Indonesia. Asian Jr.

of Microbiol. Biotech. Env. Sc. Vol. 21, pp 931-934, Apr 2019.

12. Richard J Simpson. Preparation of cellular and subcellular

extracts, in. Basic Methods in Protein Purification and Analysis,

Ed. RJ Simpson. Cold Spring Harbor Lab Press. 2008, pp 38.

13. Chris Adhiyanto. -

thalassemia complicated with P4.2Nippon may have developed

-thalassemia. Disertasi.

Yamaguchi University. 2013.

14. Stefan Surzycki. Laboratory Manual. Human molecular biology.

Blackwell Publishing. London-UK. 2003.

ISBN:0-63204-676-7

15. Siun Chee Tn, Beow Chin Yiap. Review article. DNA, RNA and

protein extraction: the past and the present. Journal of

Biomedicine and Biotechnology, vol 2009, pp 1-10, Nov 2009.

https://doi.org/10.1155/2009/574398

16. -. G-Biosciences, Protein Electrophoresis. www.GBiosciences.

com

17. -. Tools and reagents form optimal protein extraction. Thermo

Scientific. thermofisher.com/proteinbiology

18. Drabik A, Bodzon-Kulakowska A, Silberring J. Gel

Electhrophoresis in Proteomic Profiling and Analytical

Chemistry 2nd. The Crossroads. Elsevier. London-UK. 2016.

ISBN:978-0-444-63688-1

https://doi.org/10.1016/B978-0-444-63688-1.00007-0

19. http://www.ithanet.eu/ithapedia/index.php/Protocol:Gap-PCR

20. https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/

articles/biology/sds-page.html

21. https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Informatio

n/4581/techniques/gel_elect/page_protein.html


Tentang Penulis

Lahir di Semarang pada tahun 1969. Lulus S1 dari Fakultas Biologi

Unas pada tahun 1994. Dan langsung melanjutkan studi ke

pascasarjana bidang Biomedik FKUI. Setelah lulus, bekerja sebagai

staf dosen kontrak FKUI dari tahun 2000-2004. Kemudian pindah

ke FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta pada tahun 2004 hingga

sekarang. Tahun 2008, melanjutkan pendidikan S3 di Yamaguchi

University. Faculty of Medicine and Health Sciences. Program

Medical Technologies. Selesai pendidikan, kembali bekerja di UIN

Syarif Hidayatullah Jakarta sebagai dosen tetap FKIK dan Kepala

Laboratorium FKIK. Beberapa hasil penelitian telah dipublikasikan

di jurnal internasional.

Chris Adhiyanto, S.Si., M.Biomed, Ph.D

Adalah dokter gigi dan dosen tetap pada Fakultas Kedokteran,

Universitas Islam Negeri (FK UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta,

sejak 2008. Lahir di Jakarta pada tahun 1978. Ia mendapatkan

gelar sarjana bidang Kedokteran Gigi di Universitas Indonesia,

pada tahun 2001. Tahun 2003, ia mendapatkan beasiswa Monbu-

kagakusho untuk program S-3 pada Graduate School of Dental

School di Kyushu University, Jepang. Ia mendalami mengenai jaras

sinyal apoptosis dan survival pada sel tumor mulut. Beberapa

artikelnya telah diterbitkan dalam jurnal internasional dan

nasional.

drg. Laifa Annisa Hendarmin, Ph.D


Lahir pada tahun 1968 di Kota Jakarta. Lulus S1 dari

Fakultas Biologi UNAS pada tahun 1993. Kemudian melanjutkan ke

pascasarjana Bidang Biomedik & Biologi Molekuler di FKUI.

Setelah lulus bekerja mengajar di FMIPA Universitas Negeri Jakarta

(UNJ) mulai tahun 2011 hingga sekarang. Pada tahun 2005,

melanjutkan pendidikan S3 di bidang yang sama di Biomedik FKUI

dan Universitas Liverpool Inggris untuk Program Sandwich like

DIKTI tahun 2009. Menyelesaikan pendidikannya tersebut pada

tahun 2010. Karya ilmiah hasil risetnya di bidang Biokimia dan

Biologi Molekuler telah dipublikasikan dalam beberapa jurnal

sains nasional maupun internasional. Pada tahun 2011-2012

mengikuti program Research Postdoc bidang Proteomic di

Universitas JLU Gessen, Jerman menggunakan blaya pemerintah

Indonesia PAR C dan beasiswa DAAD dari pemerintah Jerman.

Selain bekerja sebagai staf pengajar di Fakultas MIPA UNJ Jakarta,

juga menjadi Koordinator Pusat SAINTEK dan Olahraga di

Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat (LPPM)

UNJ.

Dr. Rini Puspitaningrum. S.Si., M. Biomed.

pengenalan dasar teknik bio-molekuler

Documents