pengaruh pemberian mesenchymal stem cell ...repository.unissula.ac.id/13419/12/lampiran.pdftugas...

PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL

HYPOXIACONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP

SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan

CD105

(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesenchymal Stem Cell)

HALAMAN JUDUL

TESIS

Untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat Sarjana S2

Oleh :

Vivi Yustianingsih

MBK 15.6.01.0087

PROGRAM PENDIDIKAN MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG

SEMARANG

2018

ii

TESIS

PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL HYPOXIA

CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP

SELF-RENEWAL MSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan

CD105


Telah dipertahankan di depan Tim Penguji

pada tanggal 1 Oktober 2018

dan dinyatakan telah memenuhi syarat untuk diterima

Oleh

Vivi Yustianingsih

MBK 15.6.01.0087

Menyetujui,

Pembimbing

Pembimbing I Pembimbing II

Dr.dr.H. Agung Putra, M.Si.Med Dr.Ir.Hj. Titiek Sumarwati, M.Kes

NIK.210199050 NIK. 2230198045

Mengetahui,

Ketua Program Pendidikan Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung

Prof.Dr.dr.H. Taufiq R. Nasihun, M.Kes, Sp.And

NIK. 220186022

iii

SURAT PERNYATAAN

Yang bertandatangan di bawah ini:

Nama : Vivi Yustianingsih

NIM : MBK 15.6.01.0087

Dengan ini menyatakan bahwa tesis saya yang berjudul:

PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL HYPOXIA

CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP

SELF-RENEWAL MSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan

CD105


Adalah benar hasil karya saya sendiri dan didalamnya tidak terdapat karya

yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan

tinggi dan lembaga pendidikan lainnya. Pengetahuan yang diperoleh dari hasil

penerbitan maupun yang belum/tidak diterbitkan sumbernya dijelaskan didalam

tulisan dan daftar pustaka.

Semarang, 2 Oktober 2018

Penulis

(Vivi Yustianingsih)

iv

RIWAYAT HIDUP

A. Identitas Nama : dr. Vivi Yustianingsih

Tempat/Tanggal Lahir : Brebes, 30 Mei 1984

Agama : Islam

Jenis Kelamin : Perempuan

B. Riwayat Pendidikan SD Negeri Kalierang II : Lulus tahun 1996

SLTP Negeri I Bumiayu : Lulus tahun 1999

SMA Negeri I Bumiayu : Lulus tahun 2002

FK UNSOED Purwokerto : Lulus tahun 2011

Magister Ilmu Biomedik FK UNNISULA : (2016-Sekarang)

C. Riwayat Pekerjaan 1. Tahun 2010-2012 : Dokter RS. Alam Medika Bumiayu,

Kab. Brebes

2. Tahun 2012-2015 : - Site Manager PT. ESHRA Consultant, Kab. Tangerang

- Aesthetic Doctor Klinik Nayya, Kalibata, Jakarta Selatan

3. Tahun 2015-Sekarang : Dokter BLUD Bumiayu, Brebes 4. Tahun 2015-Sekarang : Dokter Klinik Ar-Rohmah Tonjong,

Kab. Brebes

5. Tahun 2015-Sekarang : Dokter Praktik Mandiri

D. Riwayat Keluarga 1. Nama Orang Tua

Ayah : Sudjito

Ibu : Alfiah

2. Nama Suami : IPTU. Susanto, SH 3. Nama Anak : Zahra Amalia Gardyna

Akmal Zikri

Qori Arvin Maulana

v

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum Wr. Wb.

Alhamdulillahirabbil’alamin, limpahan Puji dan Syukur ke hadirat Allah

Yang Maha Kuasa, atas Rahmat-Nya akhirnyapenulis berhasil menyelesaikan

tugas tesis dengan judul“PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL

STEM CELLHYPOXIA CONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM)

TERHADAP SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAIEKSPRESI CD73

CD90 Dan CD105” yang merupakan syarat yang wajib dipenuhi dalam mencapai

gelar Magister Biomedika di Fakultas Kedokteran Progam Pendidikan Magister

Ilmu Biomedik Universitas Islam Sultan Agung Semarang.

Saya mengerti sepenuhnya dengan segala kekurangan dan , sehingga tanpa

dorongan, bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, tidaklah mungkin bagi

saya untuk menyelesaikan tesis ini. Oleh karena itu, perkenankanlah saya

menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya

kepada:

1. Ir. Prabowo Setiawan, M.T, PhD selaku Rektor Universitas Islam Sultan

Agung beserta para Wakil Rektor yang telah memberikan kesempatan

pada saya untuk menempuh dan menyelesaikan pendidikan Magister

Biomedik.

2. Dr. dr. H. Setyo Trisnadi, SH, Sp.KF dan jajarannya selaku Dekan dan

Pimpinan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Sultan Agung yang telah

memberikan izin kepada saya untuk mengikuti program ini.

vi

3. Prof. Dr. dr. H. Taufiq R Nasihun, M.Kes, Sp.And selaku ketua Program

Studi Magister Ilmu Biomedik FK Unissula dan sekaligus sebagai penguji

I dalam penelitian, yang telah banyak memberikan saran yang membangun

untuk penelitian ini.

4. Dr. dr. H. Agung Putra, M.Si, Med dan Dr.Ir.Hj. Titiek Sumarwati,

M.Kes, sebagai dosen pembimbing I dan II yang telah dengan sabar

memberikan arahan dan bimbingan dalam menyusun tesis ini.

5. Dr. dr. Hj. Chodidjah, M.Kes dan Dr.dr.H. Joko Wahyu Wibowo, M.Kes

selaku penguji II dan IIIyang telah berkenan untuk menguji serta

memberikan segala masukan, saran dan kritik yang sangat membangun

untuk penyusunan tesis ini.

6. Seluruh dosen program Magister Biomedik dengan tanpa batasan telah

mencurahkan segala ilmu pengetahuan sepanjang masa pendidikan

sehingga dapat dijadikan modal utama dalam proses penyusunan tesis ini.

7. Seluruh staf program Magister Biomedik FK UNISSULA yang telah

banyak memberikan dukungan dan bantuan selama penyusunan tesis ini.

8. Semua staf Stem Cell & Cancer Research (SCCR) yang telah dengan

segala keikhlasan membantu selama proses penelitian berlangsung

didalam laboratorium.

9. Semua sejawat dan teman Program Studi Magister Biomedik FK

UNISSULA, yang tiada henti memberikan dorongan, serta semangat

selama menjalankan proses penelitian.

vii

10. Suamiku terkasih, IPTU Susanto, SH, dan anak-anakku tersayang, tidak

ada kata yang bisa terucapkan selain balasan kasih sayang atas semua yang

telah kalian berikan kepada Bunda.

11. Kedua orang tuaku, Bapak Sudjito dan Ibu Alfiah, doa restu kalian adalah

kunci keberhasilanku di dunia dan akhirat.

12. Seluruh pihak yang telah membantu dalam semua proses penyusunan tesis

yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu. Sehingga tesis ini berhasil saya

selesaikan.

Mohon maaf sebesar-besarnya kepada seluruh pihak yang terlibat dalam

seluruh tahapan penyusunan tesis ini, atas segala kata-kata dan perilaku saya yang

kurang berkenan di hati. Semoga tesis ini dapat memberikan manfaat untuk semua

pihak terutama untuk pengembangan ilmu pengetahuan.

Semarang, 2 Oktober 2018

Penulis

(Vivi Yustianingsih)

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................. ii

SURAT PERNYATAAN....................................................................................... iii

RIWAYAT HIDUP ................................................................................................ iv

KATA PENGANTAR ............................................................................................ v

DAFTAR ISI ........................................................................................................ viii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xii

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xiv

ABSTRAK ............................................................................................................ xv

BAB I PENDAHULUAN .................................................................................. 1

1.1. Latar Belakang ................................................................................. 1

1.2. Rumusan Masalah ........................................................................... 3

1.3. Tujuan Penelitian ............................................................................. 4

1.3.1. Tujuan Umum ........................................................................ 4

1.3.2. Tujuan Khusus ....................................................................... 4

1.4. Orisinalitas Penelitian ...................................................................... 4

1.5. Manfaat Penelitian ........................................................................... 7

1.5.1. Manfaat Teoritis ..................................................................... 7

1.5.2. Manfaat Praktis ...................................................................... 7

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ......................................................................... 8

2.1. Self-Renewal .................................................................................... 8

2.1.1. Proliferasi ............................................................................... 8

2.1.2. Self-renewal Mesenchymal Stem Cell (MSC) ........................ 8

2.1.3. Lingkungan yang Mempengaruhi Proliferasi ........................ 9

2.2. Stemness ........................................................................................ 11

2.2.1. Definisi ................................................................................. 11

2.2.2. Penanda Stemness MSC ....................................................... 12

2.2.3. Ekspresi Cluster Of Differentiation 73 (CD73) ................... 12

ix

2.2.4. Ekspresi Cluster Of Differentiation 90 (CD 90) .................. 14

2.2.5. Ekspresi Cluster Of Differentiation 105 (CD 105) .............. 15

2.3. Siklus Sel ....................................................................................... 17

2.3.1. Fase ...................................................................................... 17

2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC) ..................................................... 23

2.4.1. Definisi ................................................................................. 23

2.4.2. Sumber ................................................................................. 23

2.4.3. Morfologi Mesenchymal Stem Cell ...................................... 24

2.5. Hipoksia ......................................................................................... 25

2.5.1. Definisi ................................................................................. 25

2.5.2. Respon Fisiologi Sel terhadap Hipoksia .............................. 26

2.5.3. Hipoksia pada Tingkatan Seluler ......................................... 27

2.6. Mesenchymal Stem Cell – Hypoxia Conditioned Medium (MSC-

HCM) ............................................................................................. 28

2.6.1 Definisi ................................................................................. 28

2.6.2. Soluble Factor ...................................................................... 29

2.7. Regulasi Growth Factor pada Self-Renewal dan Multipotensi ..... 30

BAB III KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, DAN HIPOTESIS .. 34

3.1. Kerangka Teori .............................................................................. 34

3.2. Kerangka Konsep .......................................................................... 35

3.3. Hipotesis ........................................................................................ 35

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 36

4.1. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian .................................... 36

4.2. Populasi dan Sampel Penelitian ..................................................... 36

4.3. Variabel ......................................................................................... 37

4.3.1. Variabel Bebas ..................................................................... 37

4.3.2. Variabel Tergantung ............................................................ 37

4.4. Definisi Operasional ...................................................................... 37

4.5. Instrumen dan Bahan ..................................................................... 38

4.5.1. Instrumen ............................................................................. 38

4.5.2. Bahan ................................................................................... 39

4.6. Cara Penelitian dan Alur Kerja ...................................................... 40

x

4.6.1. Pengajuan Ethical Clearence Penelitian .............................. 40

4.6.2. Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical Cord

.............................................................................................. 40

4.6.3. Kultur Sel ............................................................................. 41

4.6.4. Proses Pemanenan Sel .......................................................... 42

4.6.5. Proses Penghitungan Sel ...................................................... 42

4.6.6. Prosedur Hipoksia ................................................................ 43

4.6.7. Penghitungan Self-Renewal Mesenchymal Stem Cell .......... 43

4.6.8. Pembacaan CD73, CD90 dan CD105 dengan Flowsitometri

.............................................................................................. 44

4.6.9. Alur Kerja ............................................................................ 46

4.7. Analisis Data ................................................................................. 48

4.8. Tempat Penelitian .......................................................................... 48

BAB V .................................................................................................. 49

HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................. 49

5.1. Hasil Penelitian .............................................................................. 49

5.1.1. Self-Renewal ........................................................................ 51

5.1.2. Ekspresi CD73, CD90, CD105 ............................................ 54

5.2. Pembahasan Penelitian ................................................................................... 61

BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................ 65

6.1. Kesimpulan .................................................................................... 65

6.2. Saran .............................................................................................. 66

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 67

LAMPIRAN .......................................................................................................... 73

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2. 1Ekpresi CD73 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal dari

MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (hijau) ;

Hasil sortasi CD73 pada populasi menunjukkan 99.1% positif

CD73. .............................................................................................. 13

Gambar 2. 2Ekpresi CD90 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal dari

MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah) ;

Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 98.9% positif

CD90 ............................................................................................... 15

Gambar 2. 3Ekpresi CD105 tumor desmoid pada pasase awal yang berasal

dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah);

Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 84,8% positif

CD105 ............................................................................................. 17

Gambar 2. 4 Skema Siklus Sel. Lingkaran luar: I = Interphase, M =Mitosis;

lingkaran dalam: M = Mitosis, G1 = Gap 1, G2 = Gap 2, S

=Synthesis; luar lingkaran: G0 = Gap 0/Resting ............................ 17

Gambar 2. 5 Sumber Mesenchymal StemCell ..................................................... 24

Gambar 2. 6 Morfologi MSC .............................................................................. 24

Gambar 2. 7 Regulasi HIF-1 pada normoksia dan hipoksia. ............................... 28

Gambar 2. 8 Jalur sinyal growth factor dalam memediasi self-renewalMSC ..... 32

Gambar 5. 1. Karakterisasi MSC menggunakan flowsitometri ............................ 50

Gambar 5. 2. Rerata jumlah self-renewal 72 jam paska induksi .......................... 51

Gambar 5. 3. Perkembangan MSC 0 jam, 24 jam, 48 jam, 72 jam (berurutan

dari kiri ke kanan) dengan pembesaran 10x, (a); Kontol, (b);

P1, (c); P2, (d); P3 .......................................................................... 53

Gambar 5. 4. Perbandingan jumlah sel awal dengan jumlah sel setelah

inkubasi 72 Jam .............................................................................. 53

Gambar 5. 5. Rerata ekspresi CD 73, setelah diinkubasi selama 24 jam ............. 54

Gambar 5. 6. Rerata ekspresi CD90, setelah diinkubasi selama 72 jam. ............. 56

Gambar 5. 7. Rerata ekspresi CD105 setelah diinkubasi 72 jam ......................... 58

Gambar 5. 8. Hasil flowsitometri kelompok P3 setelah inkubasi 72 jam ............ 61

xii

DAFTAR TABEL

Tabel 2.1. Tahapan Siklus Sel .............................................................................. 18

Tabel 2. 2 EkspresiGrowth factor dar berbagai sumber sel, waktu kultur,

jumlah sel dan proses dari conditioned medium.................................. 29

Tabel 2. 3. Barbagai growth factor beserta efeknya pada self-renewal MSC ....... 32

Tabel 5. 1. Hasil uji Post-Hoc jumlah self-renewal antara kelompok

perlakuan setelah inkubasi 72 jam ...................................................... 52

Tabel 5. 2. Hasil uji Post-Hoc ekspresi CD73 antara kelompok perlakuan

setelah inkubasi 72 jam ....................................................................... 55





Tabel 5. 5. Hubungan antara ekspresi CD73, CD90, CD105 ................................ 60

xiii

DAFTAR SINGKATAN

ALK = Anaplastic Limphoma Kinase

AMP = Adenosine Monophosphat

BM-MSC = Bone Marrow-Mesechymal Stem Cell

BMP = Bone Mophogenic Protein

CD 73 = Cluster of Differentiation 73



CM = Conditioned Medium

DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

EGF = Epidermal Growth Factor

EGFR = Epidermal Growth Factor Reseptor

FBS = Fetal Bofine Serum

FDA = Food and Drug Administration

FGF = Fibroblast Growth Factor

GH = Growth Factor

GPI = Glycosyl-Phospatidylinositol

HB-FGF = Heparin-Binding Epidermal Growth Factor

HGF = Hepatocyte Growth Factor

HIF-1 = Hypoxia Inducible Factors-1

HLA-DR = Human Leukocyte Antigen –DR Isotype

hMSC = human Mecenchymal Stem Cell

HSC = Haematopoietic Stem Cell

IL = Interleukin

MAPK = Mitogen Actifated Protein Kinase

MSC = Mesechymal Stem Cell

MSC-HCM = Mesechymal Stem Cell – Hypoxia Conditional Medium

MSC-NCM = Mesechymal Stem Cell- Normoxia Conditional Medium

OCT4 = Octamer-Binding Transcription Factor 4

PDGF = Platelet Derived Growth Factor

PDGFR = Platelet Derived Growth Factor Receptor

PI3K = Phosphoinositide-3 Kinase

ROS = Reactive Oxygen Species

SOX2 = Sex Determining Region Y-box2

TGF-α = Transforming Growth Factor Alpha

TGF-β = Trabsforming Growth Factor Beta

TGF-βR = Transforming Growth Factor Beta Reseptor

TNF-α = Tumor Necrosing Factor-Alpha

VEGF = Vascular Endothelial Growth Factor

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Uji Deskriptif jumlah proliferasi ....................................................... 73

Lampiran 2. Uji Normalitas Shapiro-Wilkjumlah proliferasi ................................ 73

Lampiran 3. Uji HomogenitasLevene jumlah proliferasi ....................................... 74

Lampiran 4. Hasil Uji ANOVA jumlah proliferasi ................................................. 74

Lampiran 5. Hasil Uji Post-Hoc Testjumlah proliferasi ........................................ 74

Lampiran 6. Uji Deskriptif Ekspresi CD73............................................................ 75

Lampiran 7. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD73 ................................... 75

Lampiran 8. Uji Homogentias Levenie TestEkspresi CD73 .................................. 75

Lampiran 9. Uji ANOVA Ekspresi CD73 ............................................................... 76

Lampiran 10. Uji Post-Hoc TestEkspresi CD 73 ................................................... 76

Lampiran 11. Uji Deskriptif Ekspresi CD90.......................................................... 77

Lampiran 12. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD90 ................................. 77

Lampiran 13. Uji Homogentias Levenie Test Ekspresi CD90 ............................... 77

Lampiran 14. Uji ANOVAEkspresi CD90 .............................................................. 78

Lampiran 15. Uji Post-HocTestEkspresi CD90 ..................................................... 78

Lampiran 16. Uji DeskriptifEkspresi CD105 ......................................................... 79

Lampiran 17. Uji Normalitas Shaphiro-Wilkekspresi CD105 ............................... 79

Lampiran 18. Uji Homogentias Levenie TestEkspresi CD105 .............................. 79

Lampiran 19. Uji ANOVAEkspresi CD105 ............................................................ 80

Lampiran 20. Uji Post-HocEkspresi CD105 .......................................................... 80

Lampiran 21. Uji Korelasi Pearson Antara Ekspresi CD73, CD90, CD105 ........ 81

Lampiran 22. Ethical Clearance ............................................................................ 82

Lampiran 23. Permohonan Ijin Penelitian ............................................................. 83

Lampiran 24. Surat Keterangan selesai melakukan Penelitian .............................. 84

Lampiran 25. Pembacaan Jumlah Stem Cell dan Pembacaan Flowcytometri ........ 85

Lampiran 26. Hasil Pembacaan Jumlah Stem Cell dan Pembacaan

Flowcytometri ................................................................................. 86

Lampiran 27. Dokumentasi Kegiatan .................................................................... 87

xv

PENGARUH PEMBERIAN MESENCHYMAL STEM CELL

HYPOXIACONDITIONED MEDIUM (MSC-HCM) TERHADAP

SELF-RENEWALMSC, YANG DITANDAI EKSPRESI CD73 CD90 Dan

CD105

(Studi Eksperimental in Vitro pada Human Mesechymal Stem Cell)

ABSTRAK

Metoda kultur mesechymal stem cell (MSC) dengan menggunakan

mesenchymal stem cell hypoxia coditional medium (MSC-HCM) yang diperoleh

dari modifikasi kultur MSC pada lingkungan hipoksia bertujuan untuk

mempercepat self-renewaldan melihat persentase ekspresi CD73, CD90, dan

CD105.

Desain penelitian yang digunakan, post test only control group, sampel

penelitian adalah MSC panen ke-4 dibagi menjadi 4 kelompok. P1 ditumbuhkan

pada medium mengandung 25% MSC-HCM, P2 ditumbuhkan pada medium

mengandung 50% MSC-HCM, P3 ditumbuhkan pada medium mengandung 75%

MSC-HCM, kontrol hanya diberikan DMEM. Tiap kelompok direplikasi

sebanyak 3 kali. Pengamatan dilakukan setelah diinkubasi selama 72 jam, sel

dipanen kemudian dihitung jumlahnya dengan menggunakan bilik hitung

sedangkan ekspresi CD73, CD90, dan CD105 diukur menggunakan flowsitometri.

Uji parametrik ANOVA terhadap self-renewal pada kelompok perlakuan

kontrol, P1, P2, dan P3 terdapat perbedaan yang bermakna (p

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Stem cell menjadi salah satu terapi baru dalam regenerasi sel dan

perbaikan jaringan yang tidak berhasil dengan pembedahan atau pengobatan.

Mesechymal stem cell (MSC) diketahui memperbaiki dengan berdiferensiasi

dan mengganti sel yang rusak.1 Efek farmokologi maksimal akan tercapai

apabila dosis, jalur pemberian dan kualitas stem cell yang digunakan telah

memenuhi syarat.2Sampai saat ini belum ada metode isolasi dan kultur MSC

yang dinilai efektif dan efisien.3Faktor yang umum sebagai pemicu

pembelahan sel dalam proses kultur adalah faktor pertumbuhan.Conditional

medium (CM)yang diperoleh dari modifikasi kultur hipoksia MSC

mengandung sitokin dan faktor pertumbuhan yang cukup tinggi.4 Sitokin dan

faktor pertumbuhan yang terdapat pada mesechymal stem cell-

hypoxiaconditional medium (MSC-HCM) seperti epidermal growth factor

(EGF), transforming growht factor α (TGF-α), hepatocite growth factor

(HGF), platelet derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth

factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF), menjadi salah satu faktor

pemicu self-renewal MSC dan tidak mempengaruhi kemampuan dari stem

cell. Stem cell memiliki kemampuan multipotensi apabila mengekspresikan

CD73, CD90, dan CD105.3,5

Keuntungan biologis kondisi hipoksia pada stem

cell menjadi subjek yang menarik untuk dipelajari, dengan harapan dapat

memberikan pemahaman yang lebih baik, serta meningkatkan peran dan

2

efektifitas penggunaan stem cell. Penelitian terkait dengan efek pemberian

mesenchymal stem cell – normoxia coditional medium (MSC-NCM) terhadap

self-renewal MSC serta multipotensinya masih sangat terbatas dan perlu

dikembangkan.

Perkembangan teknologi di bidang kedokteran memungkinkan upaya

penyembuhan penyakit melalui transplantasi jaringan dan sel diatur dalam

Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor 52 tahun 2013.6

Food and Drug Administration (FDA)dibeberapa negara telah menyetujui

peggunaan MSC sebagai pengobatan beberapa jenis penyakit yang telah

selesai uji klinis.7Stem cell dilaporkan telah diaplikasikan secara klinis untuk

lebih dari 70 penyakit. Di dunia, lebih dari 560 uji klinis telah dilakukan

dibelahan dunia seperti amerika timur (111/560), eropa (126/560) dan asia

timur (176/560).7Di Indonesia, terapistem cell telah berhasil diterapkan

terhadap 214 pasien di Rumah Sakit Cipto Mangun Kusumo.8 Melihat

perkembangan kebutuhan stem celldalam sekala besar, belum ada cara yang

mudah dan efisien untuk isolasi dan kultur MSC.3 Kultur haematopoietic

stem cell (HSC) membutuhkan waktu selama 5 minggu sampai pemanenan.9

Begitu pula MSC yang berasal dari jaringan tali pusat membutuhkan waktu

kultur antara 3 sampai 4 minggu.3 Panjang waktu isolasi dan kultur

disebabkan lamanya siklus sel dalam proliferasi.

Efek langsung keadaan hipoksia 2% pada MSC yang berasal dari tali

pusat adalah naiknya jumlah proliferasi, sedangkan apoptosis meningkat pada

ekspresi 1,5%.10

Penelitian berikutnya mengenai conditional

3

mediumhypoxia(HCM) daribone marrow-mesenchymal stem cell (BM-MCS)

yang dikultur dengan kadar oksigen 2%, menghasilkanekspresivascular

endothelial growth factor (VEGF), interleukin-6 (IL-6) dan interleukin-8

cukup tinggi, serta menunjukkan perbaikan luka tercepat pada tikus

dibandingkan dengan kontrol.11

Dilaporkan juga paparan hipoksia 5%

menimbulkan respon proliferasi sel arteri pulmonalis manusia dengan aktifasi

faktor mitogen diantaranya platelet derived growth factor (PDGF), fibroblast

growth factor -2 (FGF-2), dan epidermal growth factor (EGF) dibandingkan

dengan normoksia.12

Ekspresi oksigen terbaik untuk meningkatkan efek

parakrin VEGF dan angiogenesis adalah 5%. Berbagai penelitian tentang efek

mesenchymal stem cell – normoxia conditioned medium (MSC-NCM)

terhadap proliferasi beberapa jenis sel menunjukkan hasil memuaskan.

Namun, pengujian efek faktor pertumbuhan yang disekresi oleh stem cellyang

dikultur pada lingkungan hipoksia 5% terhadap stem cell masih belum banyak

penjelasan.

Melihat gambaran proses diatas, maka perlu dilakukan penelitian

tentang pengaruh pemberian MSC-HCM terhadap self-renewal MSC yang

ditandai ekspresi CD73, CD90 dan CD105.

1.2. Rumusan Masalah

Adakahpengaruh pemberian mesechymal stem cell-hipoxia

conditioned medium (MSC-HCM) pada MSC terhadapself-renewal yang

ditandai ekspresi CD73, CD90 dan CD105?

4

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum

Untuk membandingkan pengaruh pemberian MSC-HCM pada

MSC terhadap self-renewaldan ekspresi CD73, CD90, dan

CD105.

1.3.2. Tujuan Khusus

Untuk membandingkanantar kelompok pengaruh MSC-HCM

dengan modifikasi ekspresi 25%, 50%, 75% pada MSC

terhadapself-renewal, dibandingkan dengan kontrol.

Untuk membandingkan antar kelompok pengaruh MSC-HCM

dengan modifikasi ekspresi25%, 50%, 75%pada MSC terhadap

ekspresi CD73, CD90, CD105 dibandingkan dengan kontrol.

1.4. Orisinalitas Penelitian

Beberapa penelitian yang sudah dilakukan tentang efek pemberian

MSC-HCM terhadap proliferasi, tetapi belum ada yang menjelaskan secara

langsung jika MSC-HCM diberikan pada MSC. Pengukuran ekpresi stemness

dari stem cell hanya dilakukan berdasarkan perbedaan pada sumber isolasi.

Sedangkan, pada penelitian yang akan di lakukan menggunakan MSC-HCM

sebagai medium kultur MSC, untuk melihatself-renewalserta ekspresi CD73,

CD90, CD105 sebagai penanda kemampuan multipotensinya.

5

NO Penulis, tahun Judul Hasil Penelitian

1 Wahyu

Widowati,

Laura Wijaya,

et al. 2015

Conditioned

Medium from

normoxia

(WJMSCs-

norCM) and

hypoxia-treated

WJMSCs-

hypoCM in

inhibiting cancer

cell proliferation

Ekspresi marker CD73, CD90, CD105

WJMSCs-norCM dan WJMSCs-

hypoCM mencapai lebih dari 95%,

sedangkan ekpresi CD14, CD19, CD34,

CD45, HDLA-II kurang dari 2%.

WJMSCs-norCM dan WJMSCs-

hypoCM menghambat proliferasi

beberapa jenis sel kangker. Keduanya

tidak menunjukkan perbedaan yang

siginifikan pada ekspresi marker

diferensiasi pada permukaan MSC.13

2 Chang Youn

Lee et al.2016

Hypoxic

conditioned

medium from

mesechymal

stem cells

promotes

lymphangiogene

sis by regulation

of

mitochondrial-

related proteins

MSC mengekpresika faktor yang

berperan dalam limphangiogenesis

diantaranya EGF, FGF2, HGF, IGF1 dan

VEGF-A dan –C. human Lymphatic

Endothelial Cells (hLEC) dimanipulasi

dengan kedua medium. Proliferasi,

migrasi hLEC meningkat dibawah

hypoxia conditioned medium (HCM)

dibandingakan dengan normoxia

conditioned medium (NCM).14

3 Lei chen, et al.

2014

Cenditioned

medium from

hypoxic bone

marrow-derived

mesenchymal

stem cells

enhances wound

healing in mice

Ekspresifibroblast growth factor (FGF),

vascular endothelial growth factor

(VEGF), interleukin 6 (IL-6) dan

interleukin 8 (IL-8), meningkat secara

signifikan pada kultur hipoksia in vivo.

Sedangkan pada tikus Balb/c perbaikan

kulit lebih cepat ketika diberikan MSC-

HCM.11

4 Chika Koike,

Kaixuan zhou,

Yuji Takeda,

Moustafa

Fanthy,

Motonori

Okabe, Toshiko

Yoshida,

Yukiko

Nakamura,

Yukio Kato,

and Thosio

Nikaido. 2014

Characterization

of Amniotic

Stem Cells

Hasil pengamatan flowsitometri epitel

amnion mengeexpresikan CD133

, CD271,

SC271, dan TRA-1-60. Sedangkan pada

amniotic stem cell mengekspresikan

CD44, CD73, CD 90 dan CD 105.15

6

5 Hamad Ali,

Majda K, Al-

Yatama,

Mohammed

Abu-Farhan,

Kazem

Behbehani,

Ashraf Al

Madhoun. 2015

Multi-Lineage

Differetiation of

Human

Umbilical Cord

Whartons’s Jelly

Mesenchymal

Stromal Cells

Mediates

Changes in the

Expression

Profile of

Stemness

Markers

Hasil kultur dari WJ-MSC ternyata

mampu berdiferensiasi menajadi

beberapa tipe sel. Dibuktikan dengan

pengukuran marker stemness WJ-MSC

dengan Flow-Cytometry,

Immunofluororescence, dan qRT-PCR

analysis menunjukkan CD29, CD44,

CD73, CD90, CD90, CD105 dan CD166

yang merupakan penanda sel

hematopoietik, endothelial, dan

kondrogenik. Hal ini menjelaskan

kemampuan WJ-MSC untuk

berdifferensiasi menjadi berbagai macam

sell sesuai penanda stemness.16

6 Masound

Maleki, Farideh

Ghanbarvand,

Mohammad

Reza Behvarz,

Mehri Ejtemaei,

Elham

Ghardirkhom.

2014

Camparison of

Mesenchimal

Stem Cell

Markers in

Multiple Human

Adult Stem

Cells

Dari seluruh tipe sel MSC dari biopsi

testis, ovarium, folikel rambut, dan tali

pusat diamati dengan flow cytometry

menunjukkan ekspresi penanda surface

antigen, dengan karakterustik masing-

masing. Hal ini mendasari penggunaan

tujuan terapi stem sell dengan sumber

MSC yang digunakan.17

7 Theresa

L.Ramos, Luis

Ignatio

Sanches-

Abarca, et.al.

2016

MSC surface

markers (CD44,

CD73, dan

CD105) can

identify human

MSC-derived

etracellular

vesicles by

conventional

flow cytometry

EV dikeluarkan oleh BM-MSC, expresi

CD dari EV dapat diindentifikasi dengan

metode konvetional flow cytometry

ternyata positif untuk H-MSC (CD44,

CD90, CD73), dan tidak terdapat

Hematopoietic Marker (CD34, dan

CD45).18

8 Kelly Scultz, et

al. 2006.

Hypoxia and

hypoxia-

inducible factor-

1α promote

growht factor-

induced of

human vascular

smooth muscle

cells

Ekspresi HIF-1α menghambat growth

factor-meningkatkan ekspresi cyclin-A.

HIF-1α meningkatkan respon proliferasi

vascular smoth muscle cell (VSMC)

melalui sinyal FGF-2, PDGF dan EGF.

HIF tidak secara langsung

mempengaruhi proliferasi melainkan

dengan aktifasi jalur cyclin A.12

9 Antonina

Lavrentieva,

Ingrida Majore,

Cornelia casper,

Effect of

hypoxic culture

condition on

umbilical cord-

HIF-1α memiliki expresi tertinggi pada

ekspresi oksigen 2,5%, dan paling

rendah pada ekspresi 21%. Proliferasi

yang sama pada ekspresi 2,5% dan 21%.

7

and Ralf Hass.

2010

derived human

mesenchymal

stem cell. 2010

Apoptosis dan nekrosis meningkat pada

ekspresi 1,5% oksigen. Sedangkan

metabolisme glukosa, menggunakan

metoda PR-PCT analysis peningkatan

signifikan GLUT-1, LDHA dan PDK-1

pada ekspresi oksigen 1,5%, 2,5%, dan

5%.10

1.5. Manfaat Penelitian

1.5.1. Manfaat Teoritis

Memberikan sumbangan ilmu pengetahuan tentang pengaruh

pemberian MSC-HCM pada MSC terhadap self-renewal MSC,

yang ditandai ekspresi CD73, CD90, dan CD105.

1.5.2. Manfaat Praktis

Memberikan sumber informasi pada masyarakat mengenai

pengaruh pemberian MSC-HCM pada MSC terhadapself-renewal

MSC, yang ditandai ekspresi CD73, CD90, dan CD105.

8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Self-Renewal

2.1.1. Proliferasi

Proliferasi sel adalah proses fisiologis yang terjadi pada

hampir semua jaringan tubuh manusia pada berbagai keadaan sel

untuk berkembang biak. Homeostasis antara proliferasi sel dan

kematian sel terprogram (apoptosis) secara normal dipertahankan

untuk menyediakan integritas jaringan dan organ.19

Proliferasi sel

dapat dirangsang oleh faktor pertumbuhan intrinsik, jejas, kematian

sel, bahkan dapat pula oleh deformasi mekanis jaringan.20

Mediator

kimiawi yang terdapat pada lingkungan mikro setempat dapat

menghambat atau merangsang pertumbuahan sel. Kendali

pertumbuhan yang terpenting adalah penginduksian sel istirahat

(resting cell) pada fase G0 ke siklus sel. 20,21

2.1.2. Self-renewalMesenchymal Stem Cell (MSC)

Kemampuan utama stem cell dalam memperbaharui diri

adalah hal spesifik yang tidak akan dimiliki oleh sel lainnya dan

merupakan upaya sel tersebut untuk mempertahankan

multipotensinya bagi keberlangsungan hidup. Klon hasil dari

proses perbaharui diri akan tetap memiliki potensi yang serupa

dengan sel induk dan berupaya mempertahankan status non-

9

diferensiasi secara terus-menerus hingga suatu saat dibutuhkan

kembali memasuki siklus diferensiasi. Hal ini terlihat jelas ketika

jaringan mengalami kerusakan, maka stem cell segera melakukan

proliferasi untuk menghasilkan sel dewasa spesifik yang

dibutuhkan untuk reparasi kerusakan jaringan.22

Proses pada saat sel melakukan penggandaan sel tanpa terjadi

hambatan itu adalah waktu terjadinya ploriferasi sebuah sel. Ada 2

mekanisme membelahnya sel yaitu dengan cara simetris dan

asimetris. Pembelahan dengan cara simetris itu sendiri mempunyai

tujuan untuk memperbaiki diri dan itu dapat terjadi bila dikalukan

oleh sel yang mempunyai karakteristik seperti stem cell, dan

pembelahan secara asimetris disini bertujuan untuk menghasilkan

turunan sel yang terdeferensiasi dan dilakukan oleh sel yang

karakteristiknya tidak seperti stem cell.22

2.1.3. Lingkungan yang Mempengaruhi Proliferasi

2.1.3.1 Suhu

Suhu tubuh manusia merupakan suhu yang optimal untuk

tumbuhnya sel. Berdasarkan perbedaan kondisi suhu tumbuh sel,

tempat hidup sel digolongkan menjadi tiga, yaitu : hidup di udara

dingin pada suhu 15 – 200C, hidup di udara bersuhu sedang pada

suhu 25 – 400C, dan hidup di udara panas pada suhu 50 – 60

0C.

Untuk inkubasi sel optimal digunakan, suhu 370C atau sesuai

dengan suhu tubuh manusia.23

10

2.1.3.2 Konsentrasi ion hidrogen (pH)

Seringkali asam yang diproduksi oleh sel itu sendiri ketika

dibiakkan di laboratorium dapat menghambat pertumbuhan sel.

Kondisi tersebut akan menyebabkan pH optimal selmenyempit.

Untuk mengatasi hal tersebut, dapar kimia dapat ditambahkan ke

dalam media guna mempertahankan pH dan menetralkan asam.

Pepton dan Asam amino adalah salah satu contoh dapar kimia yang

dapat bekerja pada beberapa media pertumbuhan sel.23

2.1.3.3 Tekanan osmotik dan kekuatan ionik

Nutrisi dan air yang berada di lingkungan sekitar

dibutuhkan oleh sel untuk tumbuh dengan optimal. Tekanan

osmotik merupakan salah satu yang mempengaruhi. Peningkatan

tekanan osmoticdapat menyebabkan air keluar dari dalam sel.

Maka dari itu, pengendalian faktor-faktor tekanan osmotik dan

konsentrasi garam perlu dilakukan supaya tetap pada ekspresi

optimal bagi pertumbuhan sel.23

2.1.3.4 Karbon dioksida (CO2)

Lingkungan terbaik sebagai medium kultur pertumbuhan

sel adalah pada ekspresi 5% CO2.

2.1.3.5 Zat kimia

Adapun unsur lain yang dibutuhkan untuk pertumbuhan

sel selain air yaitu unsur kimia, diantaranya : karbon, sulfur, fosfor,

nitrogen dan unsur kelumit (misalnya : Cu, Zn dan Fe).23

11

2.2. Stemness

2.2.1. Definisi

Istilah stemness mengacu pada proses molekuler yang

umum terjadi dimana proses ini mendasari sifat inti dari stem cell

dalam hal kemampuan pembaharuan diri (self-renewal) dan

kemampuan berdiferensiasi menjadi keturunan yang

berbeda.24

Stem cell yang berbeda akan mengekspresikan penanda

(marker) yang berbeda pula, hal merupakan ciri khas dari sel-sel

tersebut.17

Terkadang, sel mengekspresikan marker atau fenotip

tetapi kemampuan secara fungsional berkurang oleh karena itu sel

tersebut tidak bisa dianggap sebagai stem cell.5Marker atau

penanda merupakan produk dari protein yang dikeluarkan oleh sel.

Stem cell dengan sumber yang berbeda akan menghasilkan marker

yang berbeda pula.17

Gen yang berperan dalam mempertahankan sifat

pluripotensi pada stem sell adalah SOX2, OCT4, dan NANOG.

Kemapuan untuk memperbanyak diri tanpa kehilangan sifat

induknya atau dikenal dengan self-renewaldipertahankan oleh gen

ini.25

Kontrol eksogenus berperan penting dalam mengaktifasi gen

ini untuk mengexpresikan penanda stemness. Ketika stem cell

tumbuh dalam fetal bofine serum(PBS) ESC dari tikus tidak

berdifensiasi, jalur LIF/STAT3 berperan penting dalam self-

renewal pada ESC. Basic-FGF dan IGF sebagai growth factor

12

merupakan sinyal pertama dalam membangun faktor transkripsi

OCT4, SOX2, NANOG.25

Mengenai regulasi pluripotensi, pada MSC hanya ekspresi

dari NANOG yang berperan. NANOG belum tampak pada saat

pertama isolasi MSC, namun mulai muncul dalam proses kultur

MSC, ekspresinya meningkat cukup tinggi. Pada sel yang telah

terdiferensiasi expresi NANOG sudah tidak terlihat lagi.26

2.2.2. Penanda Stemness MSC

Konsensus The International Society of Cellular Therapy, sel

yang tergolong dalam MSC harus mempunyai karakteristik antara

lain: MSC harus menempel pada permukaan plastik saat dilakukan

kultur di cawan palstik, MSC mempunyai molekul protein

permukaan (Cluster of Differentiation/CD): CD73, CD90, dan CD

105. Berbeda dengan Stem Cell Hematopoeitik (HSC), Mesenchymal

Stem Cell tidak mengekspresikan CD45, CD 34, CD14, dan Human

Leukocyte Antigen-DR (HLA-DR). Ketiga, dapat melakukan

diferensiasi sesuai 3 jalur utama diferensiasi mesenchymal, yaitu

jalur osteogenik (menjadi sel tulang/osteosit), jalur kondrogenik

(menjadi sel tulang rawan/kondrosit), dan jalur adipogenik (menjadi

sel lemak/adiposit) in vitro.27

2.2.3. Ekspresi Cluster Of Differentiation 73 (CD73)

CD73 (ecto-5’-nucleotidase) memiliki peran sebagai enzim

yang terletak pada ikatan glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)

13

dipermukaan membran dan berfungsi untuk hidrolisis adenosine

monophosphat (AMP) menjadi adenosin dan fosfat. Selanjutnya,

adenosin yang dihasilkan dari defosforilasi adenin oleh CD73 akan

disekresikan ke ekstraseluler.28

Ekspresi CD73 dapat ditemukan

dalam berbagai sel seperti sel epitel, sel endotel dan limfosit. Kolon

merupakan organ yang paling tinggi mengekspresikan CD73, organ

lain selain kolon adalah ginjal, otak, hati, jantung dan yang paling

rendah ekspresinya adalah otot.29

Ekspresi dari CD73 berfungsi

sebagai kontrol terhadap respon inflamasi yang terjadi.30

CD73 merupakan salah satu penanda atau marker positif dari

Mesenchymal Stem Cell (MSC).31

Selain menggunakan CD73,

CD105 dan CD90 juga digunakan sebagai marker positif dalam

mengidentifikasi MSC.28

Adenosin yang dihasilkan oleh CD73

memiliki potensi differensiasi osteoblastik terhadap MSC.

(a) (b)

Gambar 2. 1(a) Ekpresi CD73 tumor desmoid pada pasase awal

yang berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry

(hijau) (b) Hasil sortasi CD73 pada populasi menunjukkan 99.1%

positif CD73.32

14

2.2.4. Ekspresi Cluster Of Differentiation 90 (CD 90)

Cluster differentiation 90 (CD90) merupakan penanda

protein yang terdapat pada permukaan sel. Pada awalnya penanda

protein ini ditemukan pada timosit tikus.33

CD90 adalah glikoprotein

yang melekat ke permukaan sel melalui glikosilfosfatidlinositol

(GPI).Ekspresi CD90 berbeda antar spesies. Pada manusia, CD90

diekspresikan oleh stem cell termasuk Mesenchymal Stem cells

(MSC), Hematopoietik Stem Cell (HSC) dan Sel Batang

Keratinositik (KSC) dan berbagai variasi pada jaringan non-limfoid

seperti fibroblas, neuron dan sel endotel aktif.CD90 diekspresikan

oleh semua MSC, terlepas dari mana sumbernya.34

Ekspresi CD90

yang tinggi juga berkaitan dengan status MSC yang belum

berdiferensiasi, karena penurunan tingkat CD90 dapat dikaitkan

dengan proses diferensiasi menjadi sel yang lebih spesifik seperti

diferensiasi menjadi sel neuron.35

CD90 berfungsi dalam inflamasi dan penyembuhan luka

melalui proses sintesis dan mengeluarkan faktor pertumbuhan,

sitokin, dan komponen matrix ekstraseluler untuk membantu

perbaikan jaringan yang rusak.CD90 berperan diantara mediator

inflamasi untuk adhesi sel-matrix dan sel-sel dalam proses respon

imun. Contohnya adalah pada monosit terdapat ligan CD90 akan

berikatan dengan CD90 yang teraktivasi di endotel selama terjadi

inflamasi, terutama dalam migrasi sel imun ke bagian yang

15

inflamasi, jaringan yang rusak dan infeksi.36

CD90 juga menghambat

neurite outgrowth pada astrosit matur (non-neuronal cells) dan

mungkin berperan dalam pertumbuhan dan diferensiasi dari stem

cell.37

(a) (b)

Gambar 2. 2 (a) Ekpresi CD90 tumor desmoid pada pasase awal

yang berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry

(merah) (b) Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 98.9%

positif CD90.32

2.2.5. Ekspresi Cluster Of Differentiation 105 (CD 105)

CD105 dikenal sebagai endoglin merupakan membran

glikoprotein tipe 1 yang terletak pada permukaan sel dan merupakan

bagian dari kompleks reseptor transforming growth factor-β (TGF-

β). CD105 teridentifikasi sebagai marker MSC dan akan

memberikan hasil positif terhadap ekspresi CD105. Selain pada

MSC, CD105 juga mempunyai ekpresi yang tinggi terhadap aktivitas

angiogenesis pada pembuluh darah tumor, inflamasi jaringan, proses

penyembuhan luka dan saat embriogenesis.38

16

Ekspresi CD105 MSC terjadi karena proses dari pengikatan

kompleks TGF-β FBS oleh CD105. Dalam proses pengikatan

tersebut, dibutuhkan suatu sinyal yang membantu dalam proses

pengikatan tersebut, yaitu TGF-βRI dan TGF-βRII. Interaksi yang

terjadi antara CD105 dengan TGF-βRI dan TGF-βRII terjadi pada

domain ekstraseluler dan sitoplasma CD105, TGF-βRII akan

berinteraksi dengan asam amino region 437-558 pada domain

ekstraseluler CD105, sedangkan TGF-βRI tidak hanya berinteraksi

dengan asam amino region 437-558 tetapi juga dengan protein

region yang terletak diantara asam amino 437 dan N terminus.

Kedua signaling receptor (TGF-βRI dan TGF-βRII) juga akan

berinteraksi pada domain sitoplasma CD105. TGF-βRI hanya

berinteraksi ketika kinase pada domain sitoplasma inaktif, sedangkan

TGF-βRII dapat berinteraksi saat kinase dalam keadaan aktif

maupun inaktif.CD105 akan mengikat TGF- β1, TGF- β2, activin-A,

bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), dan bone morphogenetic

protein-7 (BMP-7) dan memodulasi respon seluler dependen TGF-

β1 dengan bantuan dari TGF-βRII dan TGF-βRII.39

17

(a) (b)

Gambar 2. 3(a) Ekpresi CD105 tumor desmoid pada pasase awal yang

berasal dari MSC melalui fluorescent immunohistochemistry (merah)

(b) Hasil sortasi CD90 pada populasi menunjukkan 84,8% positif CD105.32

2.3. Siklus Sel

Suatu proses di dalam sel yang akan mengawali terjadinya replikasi sel

disebut siklus sel.

2.3.1. Fase

Siklus sel terdiri dari 4 fase yang berbeda yaitu Fase G1, fase S

(Sintesis), fase G2 (Interfase), Fase M (Mitosis).40

Gambar 2.4. Skema Siklus Sel. Lingkaran luar: I = Interphase, M =Mitosis;

lingkaran dalam: M = Mitosis, G1 = Gap 1, G2 = Gap 2, S =Synthesis; luar

lingkaran: G0 = Gap 0/Resting.40

18

Tabel 2.1. Tahapan Siklus Sel

Tahap Deskripsi Singkatan

diam/

penuaan

Gap 0 G0 Sel telah berhenti membelah dan telah

meninggalkan siklus atau fase istirahat.

Interfase Gap 1 G1 Sel membesar pada Gap 1. Mekanisme

persiapan untuk sintesis DNA diatur oleh

cekpoin G1.

Sintesis S Terjadinya replikasi DNA.

Gap 2 G2 Cekpoin G2 mengatur mekanisme

persiapan untuk memasuki fase M

(mitosis) dan pembelahan.

Pembelahan

sel

Mitosis M Pertumbuhan sel berhenti. Energi seluler

terfokus pada urutan pembelahan menjadi

dua sel anakan. Sel telah siap untuk

melakukan pembelahan sel ditandai

dengan cekpoin di tengah-tengah mitosis

(cekpoin metafase).

1. Fase G0

Sel nonproliferatif pada eukariot multiseluler, pada

umumnya telah memasuki masa diam G0 dari G1 dan untuk

jangka waktu yang lama kemungkinan tetap pada masa diam,

Respon terhadap kerusakan DNA atau degradasi yaitu dengan

terjadinya penuaan sel yang akan membuat keturunan sel tidak

dapat terus hidup; seringkali adalah reaksi biokimia; pembelahan

sel dapat terjadi, seperti contohnya yang bersifat kanker.41

2. Interfase

Sebelum sel memasuki tahap pembelahan, sel

membutuhkan nutrisi. Seluruh persiapan diselesaikan ketika

interfase. Interfase terjadi dalam tiga tahap yaitu G1, S, dan G2.

19

Interfase juga diketahui sebagai fase persiapan untuk membelah.

Pembelahan nukleus dan sitosol tidak terjadi pada tahap ini.41

a. Fase G1

Fase pertama dalam interfase adalah G1 (G indicating

gap) atau fase pertumbuhan. Terjadi dari akhir fase M

sebelumnya sampai permulaan dari sintesis DNA. Aktivitas

biosintetik sel, yang telah melambat selama fase M, kembali

meningkat selama fase ini. Durasi dari G1 sangat bervariasi,

bahkan diantara sel-sel yang berbeda pada spesies yang sama.

Hal ini terjadi dibawah kontrol dari gen p53.41

b. Fase S

Fase S berawal ketika replikasi DNA dimulai. Saat

fase ini selesai, seluruh kromosom telah direplikasi. Setiap

kromosom memiliki dua kromatid. Selama fase ini, secara

efektif jumlah DNA pada sel menjadi ganda, walaupun

diploid sel masih tetap sama. Sintesis juga diselesaikan

secepat mungkin karena pairing basa yang terekspos menjadi

sensitif terhadap faktor eksternal seperti obat yang diminum

atau berbagai mutagen (seperti nikotin).41

c. Fase G2

Sel pada fase G2 bertahan sampai sel memasuki

mitosis. Biosintetik yang signifikan terjadi pada fase ini,

terutama melibatkan produksi mikrotubulus yang dibutuhkan

20

selama proses mitosis. Selama fase G2, inhibisi sintesis

protein mencegah sel untuk melakukan mitosis.41

3. Mitosis (Fase M/Fase Mitosis)

Mitosis adalah sebuah proses dimana terjadi pemisahan

kromosom pada inti sel menjadi dua sel identik dalam sitoplasma,

organel, dua nuklei, dan membran sel menjadi dua sel yang

mengandung pembagian komponen sel yang sama, yang

dilakukan oleh sel eukariotik.42

Kesalahan pada mitosis dapat menyebabkan apoptosis atau

mengakibatkan mutasi yang berujung pada kanker.

2.3.2. Interaksi Antara Protein Yang Terlibat Dalam Siklus Sel

1. Cyclin

Cyclin adalah kelompok protein yang mengatur suatu

progresi sel melalui siklus sel dengan cara mengaktivasi enzim

CyclinDependent Kinase (CDK).42

2. Peranan cyclin dan CDKs

Dua kelompok kunci dari molekul regulasi yang

menentukan perkembangan sel dalam siklus sel adalah cyclin dan

Cyclin-Dependent kinases (CDKs). Cyclin membentuk subunit

regulasi sedangkan CDKs adalah subunit katalistik dari

heterodimer yang telah teraktivasi; cyclin tidak mempunyai

aktivitas katalistik dan CDKs tidak akan teraktivasi tanpa adanya

sebuah cyclin pasangan. Ketika telah teraktivasi oleh adanya

21

ikatan cyclin, CDKs akan melakukan fosforilasi yaitu reaksi

biokimia biasa yang mengaktifkan atau menonaktifkan protein

target terhadap koordinat tempat masuk ke tahap selanjutnya dari

siklus sel. Kombinasi yang berbeda dari cyclin-CDK dapat

menentukan hilir dari protein yang telah ditargetkan. CDKs

diekspresikan dalam sel dimana terdapat sintesis cyclin pada

tahapan spesifik dari siklus sel sebagai respon terha

3. Mekanisme Utama Interaksi cyclin-CDKs

Kompleks-kompleks G1 cyclin-CDK menjadi aktif pada

penerimaan sinyal ekstraseluler pro-mitosis, untuk

mempersiapkan sel yang akan memasuki fase S, menaikkan

ekspresi faktor transkripsi yang akan meningkatkan ekspresi dari

cyclin S dan enzim-enzim yang dibutuhkan untuk replikasi DNA.

Kompleks-kompleks G1cyclin-CDK dapat juga berfungsi sebagai

inhibitor fase S dengan meningkatkan degradasi molekul-

molekul.43

Mitosis kompleks cyclin-CDK yang tersintesis namun

belum aktif selama fase S dan G2 dapat meningkatkan inisiasi dari

mitosis dengan cara merangsang hilir protein yang terlibat dalam

kondensasi kromosom dan kumparan mitosis terbentuk.

Kompleks penting yang teraktivasi selama proses ini adalah

sebuah ubiquisin ligase yang meningkatkan degradasi protein

struktural yang berhubungan dengan kromosom kinetokor, yang

http://en.wikipedia.org/wiki/Ubiquitin_ligase

22

dikenal sebagai anaphase-promoting complex (APC). APC juga

mentarget siklin mitosis untuk degradasi, serta menjamin agar

dapat dilaksanakan telofase dan sitokinesis.43

4. Spesifikasi Komplek Cyclin-CDKs

Cyclin-D adalah cyclin pertama sebagai respon dari sinyal

ekstraseluler yang diproduksi dalam siklus sel (misal: growth

factors). Cyclin-D terikat pada CDK4, dan membentuk sebuah

kompleks Cyclin-D-CDK4 yang aktif. Kompleks Cyclin-D-CDK4

pada fosorilasi protein Rb rentan terhadap retinoblastoma.Rb

yang hiperfosforilasi terpisah dari kompleks E2F/DP1/Rb (yang

sebelumnya terikat dengan gen responsif E2F, kemudian secara

efektif ―menghalangi‖ mereka dari transkripsi), mengaktifkan

E2F. Aktivasi E2F dapat menghasilkan transkripsi dari beberapa

protein seperti Cyclin-E, Cyclin-A, DNA polimerase, thymidine

kinase dan lain-lain. Cyclin-E yang menghasilkan ikatan dengan

CDK2, serta menghasilkan kompleks Cyclin-E-CDK2 yang dapat

mendorong sel dari fase G1 ke fase S (transisi G1/S). Cyclin-B

yang berhubungan dengan cdc2 (cdc2 – fission yeast (CDK1-

mamalia) akan membentuk sebuah kompleks Cyclin-B-cdc2 yang

dapat menginisiasi transisi G2/M. Aktivasi kompleks Cyclin-B-

cdc2 mengakibatkan pecahnya selubung nukleus dan inisiasi dari

profase, sedangkan inaktivasinya mengakibatkan sel keluar dari

mitosis.42

23

2.4. Mesenchymal Stem Cell (MSC)

2.4.1. Definisi

Mesenchymal stem cell (MSC) atau disebut juga stromal stem

cell merupakan sel yang mirip fibroblas yang mampu

mengoptimalkan lingkungan mikro dari sel hematopoietik. MSC

termasuk adult stem cell yang dapat berdiferensiasi menjadi

berbagai jaringan seperti jaringan lemak, kartilago, tulang dan

endotel, bergantung pada lingkungan mikronya (niche). MSC telah

terbukti dapat digandakan karena karakternya yang dapat

menempel pada permukaan kultur jaringan.44

MSC sangat sering

ditemukan pada sel stroma pada sumsum tulang belakang,

periosteum, kulit dan lemak. Meskipun keberadaanya sering

ditemukan pada sumsum tulang, akan tetapi jumlahnya hanya

mewakili 1 dari 10.000 keseluruhan sel berinti.35

2.4.2. Sumber

MSC dapat diisolasi dari jaringan dewasa, seperti sumsum

tulang, jaringan adiposa, polip endometrium, darah menstruasi dan

dan dari jaringan janin.45

Pada jaringan janin, sumber MSC yang

digunakan seperti plasenta, darah tali pusar dan matriks tali pusar

(Wharton’s jelly).46,47

Kemampuan MSC untuk berdiferensiasi

menjadi beberapa jaringan juga bervariasi sesuai dengan jaringan

asal mereka.48

24

Gambar 2. 5Sumber Mesenchymal StemCell.14

2.4.3. Morfologi Mesenchymal Stem Cell

Gambaran morphologi dibawah mikroskop fase kontras adalah

sebagai berikut:49

Fibroblast-like:

o Small cell body, namun panjang dan tipis

o Nukleus bundar dengan nukleolus menonjol, dikelilingi

kromatin halus tersebar—clear appearance nucleus

o Mengandung sejumlah kecil:

- Golgi apparatus,

- Rough endoplasmic reticulum,

- Mitochondria, dan

- Polyribosomes.

Gambar 2. 6Morfologi MSC.50

http://en.wikipedia.org/wiki/Golgi_apparatushttp://en.wikipedia.org/wiki/Rough_endoplasmic_reticulumhttp://en.wikipedia.org/wiki/Mitochondriahttp://en.wikipedia.org/wiki/Polyribosomes

25

2.5. Hipoksia

2.5.1. Definisi

Hipoksia adalah kondisi adaptasi sel dan jaringan terhadap

konsentrasi oksigen yang rendah. Oksigen merupakan syarat untuk

kehidupan semua organisme aerobik. Pengambilan oksigen

sementara dapat menyebabkan kerusakan protein dan DNA, yang

mengakibatkan stresscell.51

Hipoksia merupakan gambaran

penurunan dari suplai oksigen karena ketidakseimbangan dari

fungsi seluler seperti penurunan aliran darah yang dapat

menyebabkan dari suplai nutrien dan akumulasi metabolisme O2,

asam laktat, dan amonia.52

Kadar oksigen normal dalam medium invitro MSC ada pada

tingkat konsentrasi 20% yang biasa kita sebut sebagai normoksia.

Reaksi berbeda tergantung pada jenis stem cell, bone marrow stem

cell (BM-MSC) kadar oksigen hipoksia ada pada kadar 1%-7%,

dan pada jaringan lemak 10%-15%. Telah disepakati dalam

konsensus bersama Acta-Bionergetics Biokimia dan Biofisika

tahun 2008, hipoksia berada dalam kadar oksigen 3%-5% atau 30-

50 µM.10

Tetapi ternyata MSC yang ditumbuhkan pada kadar

oksigen 0,4% sampai 2.3% mengakibatkan jumlah sel apoptosis

meningkat. Ekspresi oksigen terbaik untuk meningkatkan produksi

efek parakrin VEGF dan angiogenesis adalah 5%.53

26

2.5.2. Respon Fisiologi Sel terhadap Hipoksia

Pada kondisi hipoksia metabolisme sel akan melewati proses

metabolisme anaerob yang menghasilkan energi yang lebih rendah

dari metabolisme aerob. ATP berfungsi sebagai energi sel dan

digunakan dalam metabolisme sel.52

Pada kondisi normoksia, 60%

produksi ATP digunakan sebagai motif ion ATPases, seperti Na/K+

ATPase dan CA2+

ATPase, dimana selama proses hipoksia dapat

menurunkan rasio intraseluler ATP/ADP yang dapat menyebabkan

peningkatan seluler efluks K+ dan influks Na

+, Ca

2+. Penurunan

aktivitas pada channel K+ dapat menyebabkan depolarisasi dan

aktivitas voltage-gate channel Ca2+

sehingga terjadi peningkatan

dari ion Ca2+

. Akibat dari peningkatan Ca2+

yaitu:52

1. Terjadi perubahan metabolism dari mitokondria.

2. Aktivasi lipase dan protease dapat menyebabkan kerusakan

membrane dan pelepasan dari protein dan asam lemak.

3. Aktivasi dari endonuclease.

4. Aktivasi dari ROS (Reactive Oxygen Species). Sel

menghasilkan energi dengan mereduksi O2 menjadi H20,

normalnya molekul oksigen reaktif (ROS) diproduksi dalam

jumlah sedikit, dan dapat dinetralisir dengan antioksidan.

Ekspresi ensim antioksidan menurun karena saat terjadi

hipoksia terjadi penurunan pH dan fungsi RNA. Akibatnya

27

terjadi penumpukan radikal bebas yang dikenal dengan stress

cell/oksidatif.

2.5.3. Hipoksia pada Tingkatan Seluler

Ekspresi oksigen yang rendah memiliki efek pada sel yang

berbeda pada berbagai jaringan. Hipoksia memiliki efek kuat

seperti pada metabolisme, angiogenesis, imunitas non spesifik dan

induksi sel untuk sifat stem cell. Pada proses hipoksia kronis

peningkatan intraseluler CA2+

yang berikatan dengan Calmodulin,

sehingga mengaktivasi dari CaM kinase II mengalami fosforilasi

(koaktivator p300) pada aktivitas transkipsi HIF-1 (Hypoxia-

Inducible Factors-1).52

Jalur sinyal respons hipoksia diaktifkan

HIF-1, dimulai dari sebuah rangkaian kejadian transkripsional yang

menghasilkan peningkatan ekspresi protein seperti VEGF dan

eritropoietin.51

Sel memiliki Factor Inhibiting HIF-1 (FIH-1) yang terdapat

pada asparagine residu di aktivasi transkripsi C-terminal untuk

mencegah interaksi antara transkipsi co-aktivator CBP/p300

sehingga menghambat ekspresi dari HIF-1. Pada kondisi hipoksia,

FIH-1 menjadi non aktif sehingga aktivasi dari transkripsi HIF-1.52

28

Gambar 2. 7Regulasi HIF-1 pada normoksia dan hipoksia.52

2.6. Mesenchymal Stem Cell – Hypoxia Conditioned Medium(MSC-HCM)

2.6.1 Definisi

Stem cell selama dalam tahap pengkulturan mensekresikan faktor-

faktor yang dapat ditemukan dalam medium kulturnya, yang

kemudian dinamakan Conditioned Medium (CM). Medium yang

diperoleh dari proses kultur MSC dengan modifikasi lingkungan

hipoksia dinamakan mesechymal stem cell-hypoxia conditined medium

(MSC-HCM). Faktor-faktor yang dikeluarkan pada medium kultur

dikenal dengan secretome, microvesicle, atau exosome.54

Terapi MSC

secara konvetional dapat digantikan dengan secretome dari MSC,

dengan kata lain Conditioned Medium (CM) memiliki peluang

sebagai pengobatan regeneratif.55,56

Stem cell mensekresikan berbagai

macam growth factor beserta agen regenaratif jaringan yang

merupakan kandungan dari CM. Faktanya bahwa stem cell mensekresi

29

berbagai growth factor juga ditunjukkan oleh studi proteomik, yang

mengungkapkan adanya berbagai faktor pertumbuhan dan sitokin

lainnya pada CM.57,58,59,60

2.6.2. Soluble Factor

Tabel 2. 2 EkspresiGrowth factor dar berbagai sumber sel, waktu kultur, jumlah

sel dan proses dari conditioned medium.56

No Sumber SC Kultur/

Durasi

Jumlah

Sel/Proses EkspresiGrowth Factor

1 Human-

BM-MSC

Monolayer-

24 jam

4 ×

106/Conc.

25x

VEGF

Normoxia : 230 pg/mL

Hypoxia : 450 pg/mL

HGF

Normoxia : 600 pg/mL

Hypoxia : 750 pg/Ml

2

Human-

Adipose-

SC

dalam

MEM-FBS

Spheroid- 2

hari 10

5/Centr

VEGF : 14.4 ± 0.4 ng/mL

Pawitan J.A., 2014, Prospect of Stem

Cell Conditioned Medium in

Regenerative Medicine,

BioMed Research

International (2014).

HGF : 13.3 ± 2.3 ng/mL

CXCL : 12 16.6 ± 2.9 ng/mL

3 Human-

MSC

Monolayer-

48 jam 70%/(—)

IGF-1 : 1515.6 ± 211.8 pg/mL

VEGF : 465.8 ± 108.8 pg/mL

TGF-b1 : 339.8 ± 14.4 pg/mL

HGF : 20.3 ± 7.9 pg/mL

Stimulasi inflamasi pada pengkondisian MSC menggunakan Tumor

Necrosing Factor-Alpha (TNF-α) dapat meningkatkan CM dari stem

cell.Begitu juga dengan pengkondisian kultur MSC pada lingkungan

hipoksia, berdasarkan data yang ada hipoksia CM memiliki ekspresi faktor

pertumbuhan dan sitokin yang lebih tinggi dibandingkan dengan CM yang

berasal dari kultur normoksia.

https://www.hindawi.com/73256389/

30

2.7. Regulasi Growth Factor pada Self-Renewal dan Multipotensi

Jalur growth factor dalam mempengaruhi proses proliferasi MSC

sedang banyak diteliti dalam beberapa tahun ini. Beberapa growth factor

menyebabkan tidak hanya satu efek biologis. Mereka membawa pengaruh

dalam perubahan motilitas, proliferasi, morfogenesis, dan pertahanan

hidup.10

Beberapa dari growth factor yang mempengaruhi proferasi adalah:

1. Transforming Growth Factor (TGF)

Transforming growth factor beta (TGFβ) beserta keluarganya bone

morphogenic protein (BMP-2) dan BMP-3 memberikan sinyal proliferasi

dengan mengaktifasi jalur mitogen aktifated protein kinase (MAPK) erk,

Rho GTPase, dan phosphoinositide-3 kinase (P13K). TFGβ tidak hanya

melalui jalur MAPK untuk mengatifkan sinyal proliferasi, jalur yang

kedua adalah aktifasi anaplastik limphoma kinase ALK-4, SMAD2,

SMAD3, namun padaa jalur ini akan dihambat oleh ekpresi Oct4 agar

proliferasi tetap terjadi namun tidak berdiferensiasi menjadi sel tulang.

2. Fibroblast Growth Factor (FGF)

Keluarga FGF yang berberan dalam proliferasi adalah FGF-2 dan FGF-4.

FGF-2 selain mempertahankan proliferasi MSC, juga diferensiasi

osteogenik, adipogenik dan kondrogenik. Sinyak proliferasi TGF melalui

jalur MAPK erk.

3. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

Beberapa penelitian menjelaskan bahwa MSC tidak mengekspresikan

reseptor VEGF. Tetapi ternyata VEGF mempengaruhi prolirefasi dengan

31

ikut bersamaan dapat berikatan dengan reseptor PDGF, kemudian

mengkatifkan jalur MAPK erk.

4. Platelet-derived Growth Factor (PDGF)

PDGF adalah agen mitogen yang ampuh pada MSC, dan terekspresi pada

seluruh jenis dari MSC. Sejak pertama ditemukan, PDGF berikatan

dengan PDGFR dan responsif terhadap proliferasi dengan mengaktifasi

jalur Erk. Fungsi PDGF adalah untuk memicu proliferasi fibroblast otot

polos dan monosit daerah radang dan luka.

5. Hepatocyte Growth Factor (HGF)

Reseptor HGF terdapat pada permukaan MSC adalah c-Met, expresinya

cukup rendah pada MSC tikus. C-Met seringkali bermutasi atau

mengalami oversekresi pada sel kanker, khususnya pada karsinoma

papiler ginjalll dan tiroid. Sistem sinyal HGF diperlukan dalam menjaga

kehidupan embrio yang terbukti dari temuan bahwa embrio yang reseptor

c-Met nya dihilangkan akan mengalami kelainan perkembangan otot,

ginjal, hati dan otak.

6. Epidermal Growth Factor (EGF) dan Heparin-Binding EFG

Berperan dalam proliferasi dan mobilitas fibroblast dan keratinosit.

Reseptor EGF (EGFR) yang paling banyak diketahui adalah EGFR1 dan

Erb1. Berpengaruh pada proliferasi MSC dengan aktifasi ERK1/2.

7. Wnt family.

Jalur sinyal Wnt dengan reseptor Frizzel pada permukaan sel yang

meneruskan signal biologisnya ke protein adaptor Dishevelled (Dsh)

32

didalam sel. Pertama kali ditemukan dalam proses karsinogenesis dan

embriogenesis. Jalur ini mengatur bentuk aksis tubuh, dan menentukan

proliferasi dan migrasi sel. Jalur ini sangat berperan dalam

embriogenesis, peran jalur ini ditemukan ketika komponennnya yang

mengalami mutasi genetik menyebabkan abnormalitas pada embrio lalat

buah.

Gambar 2. 8. Jalur sinyal growth factor dalam memediasi proliferasi MSC.61

Tabel 2. 3. Barbagai growth factor beserta efeknya pada proliferasi MSC18

Growth

factor

family

Growth factor Receptor/signaling modulalor Effect on proliferation/survival/morphogenesis

1.

2.

3.

4.

TGF-β

FGF

VEGF

PDGF

TGF-β1

BMP-2

BMP-3

FGF-2

FGF-4

VEGF-A

PDGF

ALK-1, ALK-2, ALK-3, ALK-6,

ALK-4, ALK-5, ALK-7

Erk

ALK-4/SMAD 2, SMAD 3

FGFR/Erk (Putative)

FGFR/Erk (Putative)

VEGF receptor/PDGF receptor

VEGF receptor/PDGF receptor

PDGF receptor/Erk

Increasses chondrogenensis

Increasses proliferation

Increasses osteogenesis, increasses proliferation


Bias towards chondrogenesis on prolonged exposure,

incereasses proliferation



Increasses survival


33

5.

6.

7.

EGF

HGF

Wnt

Soluble EGF

Tethered EFG

Heparin-binding EFG

HGF

Wnt3a

PDGF receptor/Erk

EGF receptor/transient Erk

EGF receptor/transient Erk

EGF receptor/Erk

C-Met/p38MAPK

C-Met/PI3K

β-catenin

Increasses survival

No effect in diffentiation, increasses proliferation

Increasses spreading and survival

No effect in differentiation, increasses proliferation

Enhances survival

Inhibit proliferation

Promotes proliferation

Jalur antara siklus sel dan multipotensi

Self-renewal dan multipotensi MSC dapat dipelihara dengan

mengunakan faktor pertumbuhan. MSC memiliki tiga jalur potensi yaitu

menjadi jaringan lemak, tulang dan tulang rawan. Self-renewal dan

multiponesi MSC terlihat cukup signifikan apabila dalam medium tumbuh

kaya akan FGF dan EGF, jika dibandingkan dengan medium tumbuh tanpa

FGF dan EGF.62

Regulasi OCT4, NANOG, dan SOX2 adalah hal yang

sangat beperana dalam reprograming embrionikstem cell(ESC). Kehilangan

ekpresi gen OCT4, SOX2, dan NANOG mengakibatkan ESC kehilangan

sifat pluripotensinya.

Sinyal ekstrinsik yang berperan dalam mempertahankan sifat

pluripotensi stem cell diantaranya, LIF/STAT3, PI3K, Wnt, TGFβ, MAPK.

Regulator pluripotensi hMSC hanya NANOG, sedangkan SOX2 dan OCT4

tidak terbukti terlibat. Ekspresi NANOG pada hMSC hanya terdeteksi saat

sel berproliferasi, dan tidak terdeteksi saat MSC diinduksi untuk

berdiferensiasi.63

34

BAB III

KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, DAN HIPOTESIS

3.1. Kerangka Teori

MEMBRAN SEL MSC

INTI SEL MSC

Aktifitas PI3K Aktifitas MAPK, ERK 1/2 Aktifitas Wnt/Β-

catenin

EGF, HB-EGF FGF TGF-β Wnt 3 a

Dosis Mesenchymal stem cell-

hypoxia conditioned medium (MSC-

HCM)

EGFR

HGF

FGFR C-Met TGFR

Aktifasi protein target C-fos, C-myc , p53 , Ets-1 (transkripsi), Pluripotency gen NANOG

Frizzled Reseptor

Aktifasi protein Siklin D1, Siklin A, Siklin E, p21, CDK 1

SELF-RENEWAL (EKSPRESI CD73, CD90, CD105)

Suhu

PH

CO2

Kelembapan

35

3.2. Kerangka Konsep

3.3. Hipotesis

Mesenchymal Stem Cell Hipoxia Conditioned Medium(MSC-NCM)

berpengaruh terhadapself-renewal MSC, yang ditandai ekspresi CD73,

CD90, dan CD105.

Dosis Mesechymal Stem

Cell-Hipoxia Conditional

Medium (MSC-HCM)

Self-renewal

(ekspresi CD73, CD90, CD105)

36

BAB IV

METODOLOGI PENELITIAN

4.1. JenisPenelitian dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan

menggunakan rancangan penelitian ―post test only control group design‖

4.2. Populasi dan Sampel Penelitian

Subjek populasi penelitian ini adalah Mesenchymal Stem Cell.

Sampel penelitian adalah MSC yang memenuhi kriteria inklusi.

Kriteria inklusi:

Mesenchymal Stem Cell (sesuai kriteria ISCT, 2006)

Bila dikultur dalam cawan kultur plastik, maka sel tersebut akan

menempel atau melekat pada permukaan ("plastic adherent") dengan

gambaran berupa fibroblast-like cell.

Mampu berdiferensiasi pada kultur in vitro menjadi sel tulang

(osteogenik), menjadi sel tulang rawan (kondrogenik) dan menjadi sel

lemak (adipogenik).

Kriteria ekslusi:

Terjadinya kontaminasi pada sel

Kriteria faktor perancu

Suhu 37°C

PH 7 (normal)

37

CO2 5% yang dikendalikan

Kelembapan

4.3. Variabel

4.3.1. Variabel Bebas

Mesenchymal Stem Cell Hipoxia Conditional Medium (MSC-HCM)

4.3.2. Variabel Tergantung

Self-renewal

Ekspresi CD73, CD90, dan CD105

4.4. Definisi Operasional

4.4.1. Conditioned Medium MSC Hipoksia adalahcairan medium kultur

MSC yang dimodifikasi pada kadar oksigen 5%, yang diinkubasi

selama 24 jam, kemudian disentrugasi untuk diambil cairan

supernatannya.

4.4.2. Mesechimal Stem Cell (MSC) adalah sel yang diisolasi dari jaringan

talipusat, memiliki sifat multipotent. Mengekspresikan CD73, CD90,

dan CD105.

4.4.3. Self-renewaladalahjumlah MSC setelah ditumbuhkan pada medium

yang mengandung MSC-HCM dengan ekspresi 25%, 50%, dan 75%,

kemudian diinkubasi 72 jam. Dihitung menggunakan bilik hitung

dengan rumus

∑ ∑ ∑ ∑

38

4.4.4. Ekspresi CD73, CD90, dan CD105 adalah persentase ekspresi CD73,

CD90, dan CD105 dalam bentuk grafik yang diekspresikan MSC

sebagai hasil kultur dengan medium mengandung MSC-HCM 25%,

50% dan 75%, setelah di inkubasi 72 jam, menggunakan alat

flowsitometri.

4.5. Instrumen dan Bahan

4.5.1. Instrumen

1. Micropipette with tip (blue tip, yellow tip, pink tip)

2. Pipette filler

3. Conical tube (15 ml, 50 ml)

4. Cryotube 1 ml

5. Inverted microscope

6. CO2 cylinder

7. Scissor

8. Pinset

9. Scalpel dan bisturi

10. Thermostirrer

11. Sentrifuge

12. Beaker glass

13. Aluminium foil

14. Dish

15. Flask

39

16. Chamber

17. Oxygen meter

18. Tabung CO2

19. Centrifuge

20. Imunocytochemistry

21. Biosafety Cabinet class 2

22. CO2 Incubator

23. Hotplate stirrer

24. Disposable pipet

25. Heparin tube

26. Cell counter

4.5.2. Bahan

1. Mesenchymal Stem Cell

2. NaCl 0.9%

3. FBS

4. Medium dMEM

5. Alkohol 70%

6. Fungizon 0.5%

7. Streptomisin-penicilin 1% (penstrep)

8. PBS

40

4.6. Cara Penelitian dan Alur Kerja

4.6.1. Pengajuan Ethical Clearence Penelitian

Pengajuan proposal penelitian

4.6.2. Teknik Isolasi Mesenchymal Stem Cell dari Umbilical Cord

Seluruh proses dilakukan di dalam biosafety cabinet class 2,

menggunakan peralatan yang steril dan dikerjakan dengan teknik

sterilitas yang tinggi.

1. Kumpulkan umbilical cord dan simpan dalam wadah steril yang

mengandung NaCl 0.9%.

Jika tidak diproses secara langsung, simpan pada suhu 4C

sampai proses isolasi (12-24 jam).

Jika dilakukan isolasi segera pada saat pengambilan

umbilical cord, tidak perlu disimpan pada suhu 4C.

2. Meletakkan umbilical cord ke petri dish dengan menggunakan

pinset, lalu cuci umb ilical cord sampai bersih dengan PBS.

3. Potong umbilical cord menjadi 3-5 cm dengan pisau steril.

4. Buang pembuluh darah yang ada pada potongan umbilical.

5. Tempatkan potongan umbilical 3-5 cm ke petri dish yang steril.

6. Tiap potongan umbilical dihancurkan dengan gunting mata.

tajam atau bisturi menjadi potongan-potongan kecil sebesar 1

mm.

41

7. Tempatkan hasil potongan kecil umbilical dengan menggunakan

pinset pada cawan kultur jaringan 60 mm , dengan susunan titik-

titik yang tersebar rata pada permukaan cawan kultur jaringan.

8. Bersihkan medium komplit (MEM yang ditambahkan dengan

fungizon, penstrep, dan FBS) sebanyak 2-3 ml.

9. Inkubasi dalam incubator dengan suhu 37C dan 5% CO2.

10. Amati tiap 24 jam, untuk melihat ada sel yang keluar dari spot

penanaman explan (kira-kira 14 hari akan muncul sel dari

explan).

11. Ganti medium tiap 2-3 hari sekali dengan cara membuang

separuh medium dengan menggunakan micropipette diganti

dengan fresh medium komplit sebanyak yang dibuang.

12. Setelah sel muncul dari explan, tambahkan medium komplit

menjadi 5 ml.

13. Setelah 24-72 jam dari munculnya sel explan, sel yang

mengapung dipindahkan ke cawan petri jaringan yang baru

dengan cara:

Ambil semua medium dan masukkan ke conical tube 15 ml

Sentrifugasi 2000 rpm selama 10 menit

Buang supernatant.

Resuspensi pellet dengan medium komplit.

4.6.3. Kultur Sel

1. Tanam ke cawan petri jaringan.

42

2. Inkubasi 37C dan 5% CO2.

3. Ganti setengah medium tiap 2-3 hari sekali sampai sel konfluens

80%.

4.6.4. Proses Pemanenan Sel

1. Panen sel dilakukan menggunakan panen sel ketiga yang

dipindahkan ke coverslip.

2. Bersihkan wadah medium dengan menggunakan PBS 1 ml dan

tripsin 1 ml untuk memisahkan medium dengan sel.

3. Inkubasi selama 3 menit pada suhu 37C.

4. Lihat di mikroskop untuk memastikan sel sudah lepas.

5. Jika sudah lepas, ambil tripsin dan PBS menggunakan

micropipette.

6. Kemudian ganti dengan medium komplit.

4.6.5. Proses Penghitungan Sel

1. Siapkan 10µl sel dan dimasukan ke cryotube.

2. Menambahkan triptofan blue 90µl ke dalam cryotube.

3. Pipetkan 10µL di bilik hitung yg sudah ditutup dengan deck

glass.

4. Lihat dengan menggunakan mikroskop inverted pada 4 bilik

hitung.

5. Hitung jumlah sel dengan menggunakan rumus:

∑

43

4.6.6. Prosedur Hipoksia

1. Siapkan chamber

2. Masukkan well yang berisi MSC kedalam chamber

3. Letakkan oxygen meter di dalam chamber

4. Pastikan chamber tersebut tertutup rapat

5. Alirkan CO2 melalui selang yang terhubung ke chamber

6. Amati pada oxygen meter sampai ekspresi5% O2

7. Inkubasi selama 24 jam dan amati kembali pada oxygen meter

tetap dalam ekspresi5%.

4.6.7. Penghitungan Self-Renewal Mesenchymal Stem Cell

Lakukan hitung sel dengan Rumus:

∑ ∑ ∑ ∑

Prosedur:

1. Siapkan 90 ul tripan blue 0,4 % dalam tabung mikro.

2. Ambil 10 ul suspensi sel, masukkan dalam tabung lalu isi tripan

blue kemudian resuspensi.

3. Pipetkan 10 ul ke dalam hemositometer.

4. Hitung sel dibawah mikroskop menggunakan counter.

Cara penghitungan:

1. Hitung sel pada 4 bilik hemositometer.

2. Sel yang hidup bening terang.

3. Sel yang mati biru gelap.

44

Gambar diatas menunjukan kotak pada haemocytometer yang

digunakan untuk menghitung jumlah sel. Yang digunakan adalah 4

kotak paling pojok (kiri, kanan, atas, dan bawah). Sedangkan kotak

tengah tidak digunakan.

Rumus perhitungan :

∑

4.6.8. Pembacaan CD73, CD90 dan CD105 denganFlowsitometri

Protokol Stemflow hMSC Analysis

1. Lepaskan sel dari flask dengan menggunakan BD™ Accutase™

Cell Detachment Solution (Cat. No 561527) atau larutan

detachment solution yg lain , cuci cells dan resuspensi dengan

konsentrasi 1x10^7 cells/ml in BD Pharmingen™ Stain Buffer

(Cat. No. 554656) atau PBS buffer. Sel dapat di resuspensi pada

konsentrasi 5x10^6 cells/ml jika jumlah cell terbatas.

45

2. Siapkan tabung falcon 5 ml dan label sbb:

Tabung Reagent Vol yg dimasukan

(1) FITC Mouse Anti-Human CD90 (5μl)

(2) PE Mouse Anti-Human CD44 (5μl)

(3) PerCP-Cy™5.5 Mouse Anti-Human CD105 (5μl)

(4) APC Mouse Anti-Human CD73 (5μl)

(5) Nothing

(6) hMSC Positive Isotype Control Cocktail (20μl)

hMSC Negative Isotype Control Cocktail (20μl)

(7) hMSC Positive Cocktail (20μl)

PE hMSC Negative Cocktail (20μl)

3. Ulangi tabung 5-7 untuk setiap penambahan sampel yang mau

dianalisis

4. Pipette 100 ul sample kedalam masing-masing tabung

5. Vortex atau tapping tabung

6. Inkubasi 30 menit suhu kamar, dalam ruang gelap

7. Cuci 2 kali dengan Stain Buffer (FBS) 2 kali dan resuspend

dengan 300-500 ul stain buffer (FBS) atau 1 x washing buffer

atau PBS

8. Baca di flow sitometri . Gunakan tabung 1-5 sebagai kontrol

untuk setup cytometer (yaitu kompensasi)

9. Baca tabung 5 di sitometri hingga sekitar . Adjust cytometer ,

cek plot FSC vs SSC hingga berada pada posisi yang kita

inginkan( di tengah-tengah) dan populasi sel berada pada hingga

posisi kiri bawah dari dot plot FL1 hingga FL4

46

10. Baca tabung 2-5 dan lakukan seting kompensasi hingga semua

populasi berada pada area yang sesuai

11. Baca tabung 6. Atur kuadran pada dot plot dan interval pada

histogram hingga semua populasi berada pada posisis negatif.

12. Baca tabung 7. Analisa persentase hasil.

4.6.9. Alur Kerja

a. Pembuatan MSC

Isolasi Umbilical Cord

Kultur Mesechimal Stem Cell

Plastic Adherent

Uji validasi

Marker CD Pengukuran Flowcytometri

Differensiasi

CD73+ CD90+ CD105+

Sel Tulang Sel Lemak

47

b. Kultur MSC dengan Conditioned Medium Hypoxia

Inkubasi 24 jam

Inkubasi 72 jam Inkubasi 72 Jam Inkubasi 72 Jam

Medium kultur

Mesenchimal Stem Cell –Hypoxia Condittioned Medium (MSC-HCM)

Terbagi tiga kelompok perlakuan

Jumlah

self-

renewal

Jumlah

self-

renewal

Ekspresi

CD73,

CD90,

CD105

Ekspresi

CD73,

CD90,

CD105

MSC 5 x106 (passage 4), hypoxia 5%

Pemanenan

MSC

Pemanenan

MSC

Kelompok P2

DMEM 50% +

MSC-HCM 50% +

MSC

Bilik

Hitung

flowcyto

metri

flowcyto

metri Bilik

Hitung

Kelompok kontrol

DMEM 100% +

MSC

Kelompok P1

DMEM 75% +

MSC-HCM 25% +

MSC

Pemanenan

MSC

Bilik

Hitung

flowcyto

metri

Kelompok

P3DMEM 25% +

MSC-HCM 75% +

MSC

Jumlah

self-

renewal

Pemanenan

MSC

Ekspresi

CD73,

CD90,

CD105

Bilik

Hitung

flowcyto

metri

Jumlah

self-

renewal

Ekspresi

CD73,

CD90,

CD105

Centrifuge 3000rpm, 4 menit,

suhu ruangan

Filter supernatan dengan

ukuran 0,22-µm

48

4.7. Analisis Data

Data yang sudah didapat, diproses, disunting, ditabulasi, dan

dibersihkan, kemudian dilakukan uji deskriptif menggunakan mean, modus,

median . Kemudian dilakukan uji normalitas data dengan Shapiro Wilk,

didapatkan data terdistribusi normal. Untuk melihat homogenitas data

dilakukan uji levenie, hasilnya data homogen.Karena terdistribusi normal

dan varian data homogen, maka dilanjutkan dengan uji ANOVA. Post Hoc

LSD menjadi tahap selanjutnya untuk melihat kelompok mana yang

memiliki perbedaan yang bermakna. Uji terakhir adalah melihat korelasi

antara variabel CD73, CD90, dan CD 105 menggunakan uji korelasi

Pearson.

4.8. Tempat Penelitian

Laboratorium Stem Cell and Cancer Reasearch Fakultas Kedokteran

Universitas Sultan Agung Semarang

49

BAB V

HASIL DAN PEMBAHASAN

5.1. Hasil Penelitian

Penelitian tentang pengaruh pemberianMSC-HCM untuk mengetahui

jumlah self-renewal dan ekspresi CD73, CD90, dan CD105 pada MSC,

dilakukan secara invitro dilaboratorium SCCR (Stem Cell and Cancer

Reasearch) Fakultas Kedokteran Unissula Semarang. Sampel yang digunakan

adalah human mesechymal stem cellhasil isolasi darah tali pusat bayi baru

lahir, dan dibiakkan selama 4-5 minggu sesuai dengan standar prosedur

pembuatan kultur stem cell. Karakteristik MSC diidentifikasi menggunakan

alat flowsitometri dengan melihat pesentase ekspresi CD73, CD90 dan

CD105. MSC-HCM merupakan supernatan MSC yang diinkubasi selama 24

jam pada kadar oksigen 5%. MSC dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan yang

direplikasi sebanyak 3 kali, yaitu kelompok kontrol DMEM, P1 MSC-HCM

25%, P2 MSC-HCM 50%, dan P3 MSC-HCM 75%.

Proses penelitian dimulai dengan mengambil darah tali pusat bayi

baru lahir sebanyak 40 cc. Darah segera diisolasi dan dibiakkan sesuai dengan

prosedur, setelah mencapai passage-4 sejumlah MSC diambil untuk

dilakukan validasi dengan alat flowsitometri. Sejumlah MSC diinkubasi

selama 24 jam dalam chamber dengan ekspresi oksigen 5% yang diukur

dengan alat oxygen meter kemudian dilakukan sentrifuge dengan kecepatan

3000 RPM untuk mendapatkan supernatan MSC-HCM. Sisa MSC dibagi

menjadi 4 kelom

pengaruh pemberian mesenchymal stem cell ...repository.unissula.ac.id/13419/12/lampiran.pdftugas...

Documents