pengaruh ekstrak ethanol propolis terhadap …...protein antiapoptosis. p21 merupakan suatu tumor...
TRANSCRIPT
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP
EKSPRESI p21,Bcl2, Bax DALAM MENEKAN
PROLIFERASI DAN MENGINDUKSI
APOPTOSIS PADA KULTUR SEL
KANKER HEPATOMA (Hep G2)
TESIS
Disusun Untuk Memenuhi Sebagian Persyaratan Mencapai Derajat Magister
Program Studi Magister Kedokteran Keluarga
Minat Utama Ilmu Biomedik
Oleh:
Kun Salimah
S501208023
PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2017
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
PENGARUH EKSTRAK ETHANOL PROPOLIS TERHADAP
EKSPRESI p21,Bcl2, Bax DALAM MENGINDUKSI
APOPTOSIS DAN MENEKAN PROLIFERASI
PADA KULTUR SEL KANKER
HEPATOMA(Hep G2)
TESIS
Kun Salimah
S501208023
Pembimbing
dr. Paulus Kusnanto SpPD-KGEH.FINASIM
Prof. Dr. dr. H. M. Bambang Purwanto, Sp.PD-KGH, FINASIM
Drs. Sumardi, MSi
PASCASARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA
SURAKARTA
2017
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
ix
Kun Salimah S501208023 Pengaruh Ekstrak Ethanol Propolis Terhadap
Ekspresi Protein Bcl2, P21 dalam Menekan Proliferasi dan Menginduksi
Apoptosis Pada Kultur Sel Hepatoma (Hep G2). TESIS. Pembimbing I : dr.
Paulus Kusnanto SpPD-KGEH.FINASIM, Pembimbing II : Prof. Dr. dr.
Bambang Purwanto, SpPD-KGH .FINASIM. Program PPDS I Ilmu Penyakit
Dalam. Universitas Sebelas Maret Surakarta.
ABSTRAK
Latar Belakang : Karsinoma Hepatoseluler (KHS) merupakan keganasan yang
paling sering ke 6 di seluruh dunia, dan merupakan penyebab kematian yang
semakin meningkat . Tumor primer di hati sebesar 90 % adalah karsinoma
hepatoseluler. Sorafenib telah banyak digunakan sebagai pengobatan kanker
hepatoseluler, bekerja dengan menghambat dua jenis kinase yakni profilerasi sel
dan angiogenesis (pembentukan pembuluh darah) di mana keduanya berperan
besar dalam proses pertumbuhan.Propolis diketahui memiliki aktivitas anti
kanker, melalui induksi apoptosis dan melalui penghambatan proliferasi dalam
siklus sel. Bax dan Bcl2 termasuk kelompok famili protein B-cell lymphoma
2 yang berperan sebagai apoptosis jalur intrinsic dimana BCl2 merupakan
protein antiapoptosis. P21 merupakan suatu tumor suppresor protein memiliki
fungsi utama dalam regulasi terhadap progresi siklus sel.
Tujuan Penelitian : Mengetahui efek anti kanker ekstrak ethanol propolis
(EEP) yang berasal dari Kerjo, Karanganyar pada kultur sel kanker
hepatoseluler (Hep G2) melalui potensinya sebagai antikanker dalam
meningkatkan ekspresi protein ekspresi P21, menurunkan ekspresi protein bcl2
dalam menekan apoptosis dan menurunkan proliferasi sel.
Metode Penelitian : Merupakan penelitian experimental laboratories, post
test with control group design. Dilakukan pada sel Hep G2 dengan
perlakuan pemberian konsentrasi EEP (½IC50, IC50, 2IC50), Sorafenib IC50,
kombinasi EEP IC50 + Sorafenib IC50, dan kontrol. Pengamatan ekspresi
protein Bax, Bcl2, P21 dengan metode imunositokimia ,pengamatan proliferasi
sel dengan doubling time, pengamatan apoptosis dengan flowcitometry.. Uji
statistik menggunakan ANOVA, dilanjutkan dengan uji post hoc Tuckey.
Dinyatakan bermakna bila p<0,05.
Hasil Penelitian : Konsentrasi penghambatan 50 % sel Hep G2 oleh EEP 65,2
μg/mL, dan Sorafenib ( 6,08 μg/mL ) . EEP konsentrasi 2IC50 ( p= 0,001 ) ,
Sorafenib 1 IC50 ( p=0,001 ), 1IC50 EEP + 1IC50 Sorafenib ( p =0,001) mampu
meningkatkan ekspresi protein p21.
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
x
Konsentrasi 2 EEP ( p=0,040),mampu menurunkan ekpresi protein Bcl2.Hasil uji
ANOVA menghasilkan p=0,001, menunjukkan masing-masing kelompok
berbeda secara menyakinkan. Kekuatan EEP 2IC50 menghasilkan dampak
lebih besar dibanding kelompok lain (p<0,05). Kekuatan EEP 1IC50 setara
dengan Sorafenib IC50 dalam menekan proliferasi 24jam (p>0,05). Kekuatan
EEP 0,5IC50 setara dengan Sorafenib IC50 dalam menekan proliferasi
48jam (p>0,05). Kekuatan EEP 1IC50 lebih baik dari Sorafenib IC50 dalam
menekan proliferasi 72jam (p>0,05).
Kesimpulan : Semua konsentrasi EEP meningkatkan ekspresi protein p21,
dengan kelompok EEP 2IC50 memberikan efek paling kuat. Semua
konsentrasi EEP mampu menurunkan proliferasi sel, dengan kelompok EEP
2IC50, memberikan efek paling kuat. Konsentrasi 2IC50 EEP berpengaruh
terhadap penurunan ekspresi protein bcl2 dan apoptosis sel hepatoma.
Kata kunci : Ekstrak ethanol propolis, bax,Bcl2, P21, apoptosis, proliferasi,
sel Hep G2
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xi
Kun Salimah. S501208023 .2017. Effect of ethanol extract of propolis on
Bcl2 protein expression, P21 induce apoptosis and decrease cell proliferation
in liver cell cancer culture ( Hep G2). TESIS. Pembimbing I : . Paulus Kusnanto
SpPD-KGEH.FINASIM Pembimbing II : Prof. Dr. dr. Bambang Purwanto,
SpPD-KGH FINASIM. Programe PPDS I Ilmu Penyakit Dalam. Universitas
Sebelas Maret Surakarta.
ABSTRACT
Background
Hepatocellular carcinoma (KHS) is the 6th most frequent malignancy worldwide,
and is a growing cause of death. The primary liver tumor of 90% is hepatocellular
carcinoma. Sorafenib has been widely used as a treatment for hepatocellular
cancer, acting by inhibiting two types of kinase ie cell profileration and
angiogenesis (blood vessel formation) in which both play a major role in the
growth process.Propolis is known to have anti-cancer activity, through apoptosis
induction and by inhibition of proliferation in cycles cell. Bax and Bcl2 belong to
the family group of B-cell lymphoma 2 protein that acts as an intrinsic path
apoptosis wherein BCl2 is an antiapoptosis protein. P21 is a protein suppressor
tumor has a major function in regulation of cell cycle progression.Propolis is
known to have anti-cancer activity by inducing apoptosis and inhibition
proliferation of the cell cycle.
Objectives
This study aims to determine the anti-cancer effects of ethanol extract of propolis
(EEP) derived from Kerjo, Karanganyar in cultured liver cancer cells (Hep G2)
through its potential as an anticancer in increasing protein expression
P21,decreasing protein expression bcl2 and decreasing cell proliferation and
induce cell apoptosis .
Methods
An experimental research laboratories post-test with control group of non cross-
over design. Performed on HepG2 cells treated with concentrations of EEP
(½IC50, IC50, 2IC50), Sorafenib IC50, combination IC50 EEP and
Sorafenib, and control. Observations p21, Bcl2, bax protein expression by
immunocytochemistry and observation method with a doubling time of cell
proliferation. Statistical test using ANOVA, followed by post hoc Tukey test.
Declared significant if p <0.05.
Results
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xii
This study shows inhibitory concentration 50% (IC50) of Hep G2 cells by EEP =
65,2 μg / mL, and by Sorafenib = 6,08 μg / mL. EEP concentration 2IC50 (p =
0.001), were able to increase the expression of p21 protein. ANOVA test results is
p = 0.001, respectively showed distinct groups convincingly. EEP
concentration 2IC50 can reduce the expression of Bcl2 and generate greater
impact than other groups (p <0.05). EEP concentration IC50 equivalent to
Sorafenib IC50 in reducing proliferation 24 hours (p> 0.05). EEP concentration
1/2IC50 equivalent to Sorafenib IC50 in suppressing the proliferation of 48
hours (p> 0.05). EEP concentration IC50 give better effect than Sorafenib IC50
suppressing the proliferation 72 hours (p> 0.05). Conclusions :All concentrations
of EEP, Sorafenib, and EEP + Sorafenib increase the expression of p21, with
EEP concentration 2IC50 group provide the strongest effect. All concentrations
of EEP, inhibit cell proliferation, with EEP concentration 2IC50 group provide
the strongest effect. Concentration 2 IC50 EEP generate impact on decreasing
expression of bcl2 and increasing apoptosis.
Keywords: Ethanol extract of propolis, bax, bcl2, apoptosis, proliferation,
HepG2 cells
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
DAFTAR ISI
Halaman
Pernyataan Keaslian dan Persyaratan Publikasi ........................................................v
Kata Pengantar ......................................................................................................vi
Abstrak .................................................................................................................ix
Abstract ................................................................................................................xi
Daftar Isi .............................................................................................................xiii
Daftar Gambar .....................................................................................................xviii
Daftar Tabel .......................................................................................................xix
Daftar Lampiran ..................................................................................................xx
Daftar Singkatan..................................................................................................xxi
BAB I. PENDAHULUAN ..................................................................................1
A. Latar Belakang ...........................................................................................1
B. Rumusan Masalah ......................................................................................4
C. Tujuan Penelitian .......................................................................................5
D. Manfaat Penelitian .....................................................................................5
1. Manfaat teoritis .....................................................................................5
2. Manfaat praktis .....................................................................................5
BAB II. LANDASAN TEORI ............................................................................6
A. Tinjauan Pustaka .....................................................................................7
1. Kanker………………………………………………………………..7
2. Kanker Hati…………………………………………………………..9
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xiv
a. Epidemiologi ...........................................................................9
b. Etiologi………………………………………………………..10
c. Diagnosis dan Staging .............................................................12
3. Sel kultur Hep G2. .............................................................................14
4. Siklus Sel ............................................................................................14
5. Apoptosis ............................................................................................17
6. Protein p21 ..........................................................................................22
7. Protein bcl2 /Bax ................................................................................22
8. Propolis ...............................................................................................25
a. Definisi ........................................................................................25
b. Kandungan Kimia Propolis……………………………………..27
c. Aktivitas biologis Propolis .............................................................31
1. Aktivitas antikanker ........................................................32
2. Aktivitas antiinflamasi………………………………….32
3. Antioksidan .....................................................................34
4. Imunomodulator………………………………………..34
d. Ekstrak dan ekstraksi propolis ........................................................35
1. Definisi……………………………………………………….35
2. Cairan Penyari………………………………………………..35
BAB III. KERANGKA KONSEPTUAL,KERANGKA PIKIR DAN HIPOTESIS
PENELITIAN .....................................................................................................37
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xv
A. Kerangka Konseptual Penelitian .........................................................37
B. Kerangka pikir .....................................................................................38
C. Hipotesis Penelitian .............................................................................40
BAB IV. METODE PENELITIAN ....................................................................42
A. Jenis penelitian…………………………………………………… ..42
B. Tempat Penelitian..............................................................................42
C. Waktu Penelitian ...............................................................................42
D. Besar Sampel .....................................................................................43
E. Variabel penelitian ............................................................................44
F. Definisi Operasional..........................................................................45
G. Bahan dan Alat Penelitian .................................................................48
H. Jalannya Penelitian .............................................................................51
I. Alur Penelitian ...................................................................................63
J. Analisis Hasil………………………………………………………..64
BAB V. ANALISIS HASIL PENELITIAN .....................................................66
A. Data Penelitian ......................................................................................66
1. Uji sitotoksisitas dengan MTT assay untuk menetapkan
nilai IC50 ekstrak etanol propolis dan Sorafenib ..............................66
a. Pengamatan ekspresi protein p21 ........................................70
b. Pengamatan ekspresi protein bcl2 ......................................73
c. Pengamatan ekspresi protein bax ........................................75
2. Uji induksi apoptosis EEP pada sel Hepatoma (Hep G2) dengan
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xvi
flowcytometry………………………………………………………...76
B. Proses Analisis Penelitian……………………………………………...80
1. Deskripsi variabel penelitian……………………………………….82
a. Variabel p21…………………………………………………...83
b. Variabel bcl2………………………………………………......85
c. Variabel bax…………………………………………………...87
d. Variabel proliferasi…………………………………………....89
e. Variabel apoptosis………………………………………….....95
2. Analisis Pengaruh Pemberian EEP terhadap Ekspresi Protein p21,
bcl2, bax, dan Apoptosis serta Proliferasi……………………….....97
a. Variabel ekspresi p21………………………………………....97
b. Variabel ekspresi bcl2………………………………………..104
c. Variabel Ekspresi bax………………………………………..111
d. Variabel proliferasi…………………………………………..116
e. Variabel apoptosis…………………………………………...140
BAB VI. PEMBAHASAN ................................................................................149
A. Berdasarkan pendekatan prinsip ontologi .........................................149
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xvii
B. Berdasarkan Pendekatan Prinsip Epistomologi .........................................150
C. Berdasarkan Prinsip Aksiologi ..................................................................153
D. Nilai Kebaruan penelitian ..........................................................................154
E. Keterbatasan Penelitian .............................................................................154
BAB VII. PENUTUP .........................................................................................155
A. Kesimpulan ....................................................................................................156
B. Saran ..........................................................................................................157
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................158
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xviii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Skema dasar molekuler kanker (Kumar,2005)……….................7
Gambar 2.2. 10 Besar Kanker Tersering di RSKD (Kasus Baru) Tahun 2010...10
Gambar 2.3. Algoritma BCLC staging………………………...................................13
Gambar 2.4. Siklus Sel………………………………………………………..16
Gambar 2.5. Apoptosis jalur ekstrinsik dan instrinsik ......................................19
Gambar 2.6. Struktur molekul flavones (flavonoid)…………………………..29
Gambar 2.7. Struktur molekul asam fenolat…....................................................32
Gambar 2.8. Struktur Molekul CAPE……………………………………………….........33
Gambar 3.1. Kerangka Konseptual Penelitian ..................................................37
Gambar 3.2. Kerangka Pikir ............................................................................ 38
Gambar 4.1. Skema pengisian plat mikrokultur uji sitotoksisitas ................... 53
Gambar 4.2. Skema pengisian plat mikrokultur untuk pengamatan
ekspresi protein p21,bcl2,bax ...................................................... 54
Gambar 4.3. Alur Penelitian ............................................................................ 59
Gambar 4.4 Uji sitotoksiksitas IC50 dengan metode MTT ............................ 60
Gambar 4.5. Uji Apoptosis dengan Flowcytometry ........................................ 61
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xix
Gambar 4.6. Uji proliferasi dengan doubling time .......................................... 62
Gambar 4.7 Uji ekspresi protein Cp21,bcl2,bax dengan metode
imunositokimia ........................................................................... 63
Gambar 5.1. Morfologi Sel Hep G2 ................................................................. 66
Gambar 5.2. Pembentukan Kristal formazan setelah pemberian reagen
yellow MTT.. .............................................................................. 68
Gambar 5.3. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk
ekspresi p21 pada sel HepG2 setelah perlakuan dan
inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP
konsentrasi ½ IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok
dengan Sorafenib (d) kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e)
dan kelompok kontrol (f) ............................................................ 72
Gambar 5.4. Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk
ekspresi bcl2 pada sel HepG2 setelah perlakuan dan
inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP
konsentrasi ½ IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok
dengan Sorafenib (d) kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e)
dan kelompok kontrol (f) ............................................................ 74
Gambar 5.5 Hasil pengecatan imunositokimia perbesaran 400 kali untuk
ekspresi bax pada sel HepG2 setelah perlakuan dan
inkubasi selama 24 jam pada kelompok dengan EEP
konsentrasi ½ IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok
dengan Sorafenib (d) kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e)
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xx
dan kelompok kontrol (f) .......................................................... 75
Gambar 5.6 Gambar sel HepG2 dengan perbesaran 400 kali, untuk uji
apoptosis setelah inkubasi 24 jam pada EEP konsentrasi ½
IC50 (a), IC50 (b), 2IC50 (c), kelompok dengan Sorafenib
(d), kelompok IC50 EEP + Sorafenib (e) dan kelompok
kontrol (f) .................................................................................. 77
Gambar 5.7. Hasil flowcytometry sel HepG2 setelah perlakuan dan
inkubasi selama 24 jam pada kelompok kontrol (a),
kelompok dengan pemberian EEP konsentrasi ½ IC50(b),
IC50(c) dan 2 IC50(d) serta kelompok dengan pemberian
Sorafenib konsentrasi IC50 (e) dan pemberian IC50 EEP +
Sorafenib (f) ..............................................................................79
Gambar 5.8. Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein p21 antar
Kelompok Sampel .....................................................................84
Gambar 5.9 Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein bcl21 antar
Kelompok Sampel ....................................................................87
Gambar 5.10 Perbandingan Nilai Rata-rata Ekspresi Protein bax antar
Kelompok Sampel .....................................................................88
Gambar 5.11 Perbandingan nilai rata – rata proliferasi 24 jam
antarkelompok sampel ........................................................... 91
Gambar 5.12 Perbandingan nilai rata –rata proliferasi 48 jam antarkelompok
sampel .................................................................................... 93
Gambar 5.13 Perbandingan nilai rata –rata proliferasi 72 jam antarkelompok
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xxi
sampel .......................................................................................94
Gambar 5.14 Perbandingan nilai rata-rata Apoptosis antar Kelompok
Sampel .......................................................................................96
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xxii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1. Senyawa utama propolis...................................................................30
Tabel 4.1 Jadwal Penelitian ..............................................................................43
Tabel 5.1. Nilai rata-rata persentase viabilitas sel HepG2 dan nilai IC50
bahan uji dengan metode MTT assay...............................................69
Tabel 5.2 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi Protein p21…….83
Tabel 5.3. Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi
Protein bcl2 ......................................................................................85
Tabel 5.4 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel Ekspresi
Protein bax .......................................................................................87
Tabel 5.5 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel proliferasi ...........................89
Tabel 5.6 Deskripsi dan Uji Normalitas Variabel apoptosis ............................95
Tabel 5.7 Hasil Pengujian ANOVA Variabel ekpresi protein p21 menurut
Kelompok Sampel...............................................................................98
Tabel 5.8 Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Ekspresi Protein p21 antar
Kelompok Sampel…………………………………………………..99
Tabel 5.9 Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Ekspresi Protein bcl2 menurut
Kelompok Sampel…….....................................................................104
Tabel 5.10 Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Ekspresi Protein Bcl2 antar
Kelompok
Sampel……………………………………………………………...106
Tabel 5.11Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Ekspresi Protein Bax menurut
Kelompok Sampel.............................................................................112
Tabel 5.12 Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-24 Menurut Kelompok
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xxiii
Sampel……………...........................................................................117
Tabel 5.13.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-24 antar Kelompok
Sampel ……………………………………………………………..118
Tabel 5.14.Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-48 menurut Kelompok
Sampel……………………………………………………………...125
Tabel 5.15.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-48 antar Kelompok
Sampel……………………………………………………………...128
Tabel 5.16. Hasil Pengujian ANOVA Variabel Proliferasi-72 menurut Kelompok
Sampel……………………………………………………………...133
Tabel 5.17. Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Proliferasi-72 antar Kelompok
Sampel……………………………………………………………...134
Tabel 5.18.Hasil Pengujian (ANOVA) Variabel Apoptosis menurut Kelompok
Sampel……………………………………………………………...141
Tabel 5.19.Penelusuran Beda Dua Mean Variabel Apoptosis antar Kelompok
Sampel……………………………………………………………...142
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
xxiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Ethical clearance ................................................................... 132
Lampiran 2. Sertifikat kursus kultur jaringan ........................................... 133
Lampiran 3. Absorbansi sel HepG2 setelah pemberian bahan uji ......... 134
Lampiran 4. Persentase viabilitas sel HepG2 setelah pemberian bahan uji .... 135
Lampiran 5. Analisis regresi linear untuk menentukan IC50 EEP .......... 135
Lampiran 6. Analisis statistik untuk memastikan kemaknaan
perbedaan ekspresi p21,bcl2, bax pada sel Hep G2
pada keenam kelompok ....................................................... 137
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
25
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
ix
DAFTAR SINGKATAN
WHO : World Health Organization
NFkB : Nuclear factor kappa B
Bcl :B-cell lymphoma
DNA : Deoksiribonukleat Acid
RB : Retinoblastoma
CDK : Cyclin dependent kinase
CIN : Cromosomal Instability
MIN : Microsatellite Instability
MMR : Missmatch repair
APC : Antigen Presenting Cell
VEGF : Vascular Endothel Growth Factor
EGFR : Endotheal Growth Factor Receptor
COX2 : Cyclooxygenase-2
pGP : P-glikoprotein
TNFR : Necrosis Factor Receptor
TRADD : TNF receptor-associated death domain
FADD : Fas-associated death domain
DISC : Death-inducing singnalling complex
PS : phosphatidyl serine
CAPE : Caffeic Acid Phenethyl Ester
EEP : Ekstrak etanol propolis
commit to user
library.uns.ac.id digilib.uns.ac.id
x
NFAT : Nuclear factor of activated cells
AP-1 : Activator protein-1
Klp : Kelompok