DR. YUNI KILAWATI,S.PI.,M.SI

Amerika Serikat mengijinkan digunakannya sel tubuh manusia untuk kegiatan penelitian mengenai terapi gen.

1990

Metode polymerase chain reaction (PCR) pertama kali dipublikasikan1988

Badan paten Amerika Serikat mengumkan bahwa tikus yang direkayasa secara genetis peka terhadap kanker

1988

Ti plasmid yang telah direkayasa digunakan untuk transformasi pada tanaman1983

Pertama kalinya vaksin hewan diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan di Eropa1982

Pertama kalinya kit diagnostik yang dibuat dari antibodi monoklonal digunakan secara luas di Amerika Serikat

1981

Pertama kalinya alat otomatis untuk sintesis DNA dijual secara komersial1981

Badan pengadilan Amerika Serikat menetapkan peraturan dalam kasus Diamond VS Chakrabarty yang melakukan manipulasi mikroorganisme yang dipatenkan.

1980

Perusahaan Genentech memproduksi insulin manusia pada sel bakteri Escherichia coli1978

Pengembangan teknik untuk mengetahui sekuen DNA1976

Pertama kali dikeluarkan pedoman untuk penelitian dalam bidang DNA rekombinan1976

Kohler dan Milstein mendeskripsikan produksi antibodi monoklonal1975

Boyer dan Cohen mengembangkan teknologi DNA rekombinan1973

Khorana dan rekan-rekannya dapat mensintesis keseluruhan gen yang mengkode tRNA1972

Isolasi pertama kali enzim endonuklease restriksi1970

Keseluruhan kode genetik dapat diketahui1961-1966

Watson dan Crick menemukan struktur DNA1953

Avery, MacLeod dan McCarty membuktikan bahwa DNA merupakan materi genetik.1944

Antibiotik penisilin diproduksi besar-besaran dalam skala industri1943

Karl Ereky pertama kali menyatakan istilah bioteknologi 1917

PeristiwaTahun

PETA KONSEPKelangsungan Hidup Manusia

Ditunjang Oleh

Teknologi

melalui

Bioteknologi

Bioteknologi Konvensional Bioteknologi Modern

Produksi Misalnya

Tempe Kecap Keju mikroprotein Kultur Jaringan

Rekayasa Genetik

19

Bioteknologi Kelautan dan Akuakultur

Bioteknologi dalam bidang kelautan/akuakultur dapatdimanfaatkan untuk memproduksi dan mengembangkan:

Farmasi

Enzim dan bahan-bahan biomolekul

Biopestisida

Peningkatan pertumbuhan, perkembangan,reproduksi dan nutrisi ikan

20

Bioteknologi Lingkungan

Bioteknologi dapat dimanfaatkan untuk mengatasi isulingkungan seperti:

Restorasi ekologi

Diagnosis dan monitoring penyakit menular

Kontrol hama,penyakit dan gulma pada pertanian

Deteksi, monitor dan remediasi polutan

Skreening toksisitas

Konversi limbah ke energi

Bioteknologi Perikanan› Pembuatan ikan Triploid dan Monosex› Diagnosa penyakit lebih akurat, cepat dan

murah lewat Biologi Molekular› Pembuatan Vaccine ikan› Penciptaan ikan yang resisten penyakit› Penciptaan ikan dengan pertumbuhan

cepat› Penciptaan ikan yang tahan pada suhu

dingin› dll

Aquaculture merupakan industri yang berkembang pesat

Pemenuhan kebutuhan pangan dunia dan pertimbangan kesehatan membuat permintaan akan produk perikanan meningkat

Permasalahan dalam budidaya : pertumbuhan lambat, penyakit, limbah budidaya merupakan hal yang harus diatasi

Bioteknologi mampu mengatasi berbagai problem BD dan meningkatkan produksi

Siklus pada Budidaya Perairan

Penyiapan induk udang berkualitas unggul usaha domestikasi & perbaikan mutu genetik udang ( terprogram & berkesinambungan)

Permasalahan pada induk introduksi adalah keterbatasan jumlah induk menurunkan keragaman genetik benih turunannya, apalagi dengan dilakukannya pemijahan berulang di hatchery (Haryanti et al., 2004).

Induk introduksi juga tidak diketahui turunan ke

berapa dalam proses seleksinyainduk introduksi merupakan hasil klon melalui rekayasa genetik homozigositas yang tinggi antar induk.

•Kondisi diperburuk dengan pembuatan induk lokal tanpa pemantauan mutu genetiknyamenyebabkan tereduksinya keragaman genetik & inbreeding. •Akibat perlahan namun pasti diperoleh induk-induk udang dg mutu yang rendah secara genetik.• Usaha menghasilkan induk dg kriteria resisten terhadap penyakit tertentu memerlukan waktu & biaya yang tinggidiperlukan usaha mendapatkan informasi mengenai marka genetik sebagai salah satu dasar seleksi individu agar bisa diperoleh induk & benih udang yang baik secara fenotip dan genotip.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) teknik yang digunakan untuk membedakan organisme yang mempunyai perbedaan sekuensi DNA homolog yang dapat dideteksi oleh adanya perbedaan panjang fragment setelah DNA dipotong oleh enzim restriction endonucleases tertentu.

Penggunaan PCR yang dikombinasikan dengan pengggunaan enzim restriksi dan RFLP untuk mengidentifikasi berbagai species udang telah dilakukan dengan cukup tepat dan efektif.

2. Ekstraksi DNA

Mengambil sample (kaki renang) Menyimpan pada suhu -8 oC atau langsung diekstraksi sample dihancurkan dalam tabung mikro yang berisi

200 ul 10 % chelex-100 dalam buffer TE pH 8 Menambahkan 5 ul proteinase K (200mg/l) Memanaskan dalam thermoblock 55 oC, 2,5 – 3 jam Kembali memanaskan dalam thermoblock 89oC, 8

menit Mendinginkan pada suhu kamar (hingga dingin) Menyentrifuge 13.000 rpm, 5’, 4oC Mentransfer supernatant ke tabung mikro baru Menyimpan pada suhu -20oC atau diproses lebih lanjut

2. Purifikasi

Suspensi (50 µl genom) ditambahkan 1,33 ul RNAase dan dicampur perlahan lalu diinkubasi dalam wadah waterbath pada suhu 37 o C 15 menit

Menambah 6,67 ul 1 % SDS kemudian diinkubasi dalam waterbath 70o c 10 ‘

Menambah 58,3 ul fenol kemudian disentrifuse pada 12.000 rpm, 4o C, 5 ‘

Supernatan diambil dengan hati-hati kemudian ditambahkan Sodium Asetat pH 5,5 ; 6,7 ul (dipipeting)

Menambahkan 133,3 ml etanol absolute, didiamkan selama 10 ‘ pada suhu kamar

Menyentrifuse pada 12.500 rpm 10 ‘ Supernatan dibuang, pellet diresuspensi ulang dengan

100 ul etanol 75 % etanol dibiarkan menguap 5 – 10 ‘ (di buang pelan-pelan, dibalik dan diserap mgnk tissue)

Pelet ditambah 133,3 ul TE disimpan pada suhu 4 o C utk selanjutnya diukur pada elektroforesis (OD 260 & OD 280) utk menghitung kemurnian DNA

1. P.monodon: 16S rRNA2. L.Vannamei : COI-COII

1. Genome 2,5 µl 2. H2O 11 µl 3. 10 x buffer 2,625 µl 4. dNTP 2,625 µl 5. COI 0,625 µl 6. COII 0,625 µl 7. MgCl2 5,25 µl 8. Taq 0,25 µl

Total 25 µl

dimasukkan ke dalam mesin PCR thermocycler ;

Initial denaturation - Denaturation 94oC, 1 min Annealing 55oC, 1 min Extension 72oC, 1 min Cycles 40x Final extension 72oC, 5 min Soak temperature 4 oC,

PCR produk diambil sebanyak 5 µl dan dicampur dengan loading dye 1 µl dimasukkan kedalam sumuran gel agarose 1 % dengan TBE buffer 1x untuk mengetahui pita tunggal amplifikasi dari template DNA mitokondria. Pengamatan menggunakan elektroforesis selama kurang lebih 20 menit, voltase 170 Watt. Marker yang digunakan adalah DNA ladder 100 bp.

Setelah itu baru dilakukan pemotongan band tunggal dengan menggunakan enzim restriksi, sebagai berikut :

P.monodon: Hinf I, Hae III, Hind III, Nde II, Bam HI

L.vannamei: Nla III, Hha I

Hae III H2O 1 µl NE2 0,5 µl RE 0,5 µl Jumlah 2 µlPCR product 4,0 µlIncubate 37 oC, 3.5 H 

Hha I H2O 0,48 µl NE4 1,2 µl BSA 0,12 µl RE 0,2 µl Jumlah 2 µl PCR product 3,0 µl Incubate 37 oC, 3.5 H 

Nla III H2O 0,48 µl NE4 1,2 µl BSA 0,12 µl RE 0,2 µl Jumlah 2 µl PCR product 3,0 µl Incubate 37 oC, 3.5 H

Untuk melarutkan primer pada umumnya dipergunakan buffer pH 8 atau dd H2O tergantung pada instruksi dari merk produk primer, cara pembuatan 10 mM primer :

COIH10 µl primer solution (100 mM) + 90 µl TE buffer (sentrifuse 5000 RPM, 5 min)

COIL10 µl primer solution (100 mM) + 90 µl TE buffer (sentrifuse 5000 RPM, 5 min)

 

Electrophoresis : 10 µl bhn DNA yg sdh diamplifikasi campur dg 6 x loading buffer 2 ul masukkan 10 ul ke sumur pada agarose

gel alirkan listrik 100 v (25 menit) staining

dlm buffer yg mgd ethidium bromide 0,05 %

Staining dan pengamatan hasil : 100 ml buffer staining + 5 ul Ethidium

bromide (0,05 % v/w) masukkan gel yang telah dielektroforesis

kedalamnya rendam selama 15 menit amati pada transilluminator Penentuan karakteristik mt-DNA

TERIMAKASIH