PowerPoint Presentation

PENENTUAN KADAR PROTEIN SECARA SPEKTROFOTOMETRI2 NOVEMBER 2015Tujuan PercobaanMemahami penggunaan spektrofotometri sebagai alat untuk menganalisis kadar proteinMenjelaskan prinsip dasar penggunaan spektrofotometri dalam analisis kadar proteinTerampil menggunakan spektrofotometri untuk menentukan kadar proteinDasar TeoriPenentuan kadar protein secara biuret berdasarkan atas pengukuran serapan cahaya dengan spektrofotometer oleh ikatan kompleks yang berwarna ungu. Itu terjadi apabila protein bereaksi denga tembaga dengan lingkungan alkalis (Tim DoseN Biokimia 2015)Protein adalah senyawa organik yang bermolekul tinggi berkisar antara beberapa ribu sampai jutaan. Protein tersusun dari atom, C, H, O, dan N serta unsur-unsur lainnta seperti P dan S membentuk unit-unit asam amino. (Girindra 1990)Dasar TeoriAdapun prinsip kerja dari spektrofotometer UV ini adalah menggunakan teori yang dikemukakan oleh Lambert (1760) dan Beer (1852) yang dikenal dengan Hukum Lambert-Beer dimana Absorbansi akan berbanding lurus dengan konsentrasu, artinya konsentrasi semakin tinggi maka absrobansinya makin tinggi, begitu pula sebaliknya (Cahyanto 2008).Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi 2 kemungkinan (1) cahaya ditangkap, (2)cahaya discattering. Bila energi dari cahaya(foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. (Cahyanto 2008).Alat dan bahanAlatSpketronik 20KuvetPipet tetesPipet volumeTabung reaksi kecilBeker glassLabu takarErlenmeyer

BahanSampel protein : susu cairCuSO4.5H2ONatrium kalium tatratAquadesNaOH 10%Serum albumin murniKaseinNaOHCara kerjaPembuatan Kurva kalibrasi1. Menyiapkan 5 tabung reaksi yang akan diisi larutan standar protein dengan 5 konsentrasi yang berbeda dengan volume 1mL.2. Pada setiap tabung reaksi ditambahkan 4mL biuret43125mg/mLmg/mLmg/mLmg/mLmg/mLBiuret diambil43125mg/mLmg/mLmg/mLmg/mLmg/mL+4mLBiuret Cara kerja3. Digojog dan didiamkan 30 menit

4. Mengukur absorbsinya menggunakan spektronik 20, panjang gelombang 540nm

5. Menggunakan larutan blanko(yang sudah didiamkan 30 menit)

6. Membuat kurva kalibrasi

4312mg/mLmg/mLmg/mLmg/mL5mg/mL1mL aquades

mg/mL+4mLBiuret Cara kerjaPengukuran sampel protein1mL Susu cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi.1mLSusucairBiuret diambil+4mLBiuret 1mLSusucair2. Digojog dan didiamkan 30 menit

3. Mengukur absorbsi-nya menggunakan spektronik 20, panjang gelombang 540nm

4. Menggunakan larutan blanko(yang sudah didiamkan 30 menit)

5. Membuat kurva kalibrasi

1mL aquades

mg/mL+4mLBiuret 8DATA PENGAMATANLarutan StandarM (mg/mL)Volume (mL)GambarVolume biuret (mL)Absorbansi (A)Larutan Blanko-140Tabung 11140.02Tabung 22140.02Tabung 33140.02Tabung 44140.04Tabung 55140.082. Pengukuran sampel proteinDATA PENGAMATANLarutan StandarM (mg/mL)Volume (mL)GambarVolume biuret (mL)Absorbansi (A)Larutan Blanko-140Sampel protein: susu cair-141.852. Pengukuran sampel proteinAnalisis DataPengenceran Larutan Standar ProteinTabung 1(1ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=1.50 V1=50/10=5mlTabung 2(2ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=2.50 V1=100/10=10mlTabung 3(3ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=3.50 V1=150/10=15ml

Tabung 4(4ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=4.50 V1=200/10=20mlTabung 5(5ppm)=M1.V1=M2.V2 10.V1=5.50 V1=250/10=25ml

Kurva Kalibrasi Kadar ProteinAnalisis Datay=0.018x-0.004R2=0.8804

Data 1=0.018x-0.0040.02=0.018x-0.004x=0.02+0.004 0.018x= 1.3 mg/Ml

Data 2=0.018x-0.0040.02=0.018x-0.004x=0.02+0.004 0.018x= 1.3 mg/mL

Data 3=0.018x-0.0040.02=0.018x-0.004x=0.02+0.004 0.018x= 1.3 mg/mL

Data 4=0.018x-0.0040.04=0.018x-0.004x=0.04+0.004 0.018x= 2.4 mg/mL

Data 5=0.018x-0.0040.08=0.018x-0.004x=0.08+0.004 0.018x= 4.67 mg/mL

Sampel Protein: Susu CairY=0.018x-0.0041.85=0.018x-0.004X=1.85+0.0040.018x= 103mg/mL

PembahasanPada masing-masing larutan sampel ditambahkan 4ml reagen biuret kemudian dikocok dan didiamkan 30 menit. Didapatkan larutan berubah menjadi ungu. Ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam suasana basa/alkali.Persamaan reaksi yang terjadi:

[ ]+Cu2+OHHHHH+Cu2+KOMPLEKS UNGUPembahasanLarutan NaOH merupakan basa kuat memiliki ion H- yang tinggi dalam larutan sehingga mampu mengikat ion H+ pada larutan protein sampel. Ion H+ yang lebih reaktif mampu diikat dan tidak akan bereaksi dengan gugus amino, sehingga Cu2+ dapat bereaksi dengan 4 gugus amino dari ikatan peptida protein.Gugus Cu2+ akan berikatan dengan 4 gugus amino membentuk kompleks berwarna ungu.Semakin tinggi konsentrasi larutan protein sampel, semakin banyak ikatan peptida dalam larutan maka pembentukan kompleks semakin banyak, ini dapat dilihat dari warna ungu yang semakin pekat.Pendiaman 30 menit, bertujuan agar endapan dan filtrat campura dapat terpisahkan dan tidak mengganggu proses identifikasi menggunakan spektronik 20.Pada proses ini telah terjadi absorbsi radiasi sinar panjang gelombang yang lebih panjang karena transfer elektron memerlukan energi radiasi yang lebih kecil.Digunakan panjang gelombang 540nm yang gelombang elektromagnetiknya dapat melalui wadah sampel.Didapatkan hasil, nilai absrobsinya antara 0.02-0.08 yang setelah dibuat kurva kalibrasinya didapatkan nilai y=0.018x-0.004 dengan nilai kadar protein susu cair yaitu 103mg/mL

PembahasanAda beberapa tabung yang memiliki hasil absorbsi yang sama dengan konsentrasi yang berbeda. Hal ini dapat terjadi karena larutan didiamkan lebih dari 30menit sehingga kestabilan warnanya tidak cukup lama dan memudar.Ketidakstabilan dapat disebabkan oleh oksidasi oleh udara, suhu, dsbWarna larutan tidak memiliki intensitas yang tinggi sehingga nilai absorbtivitas molarnya menurun.

SimpulanDidapatkan campuran kompleks berwarna ungu dari pereaksian ion Cu2+ dalam larutan protein dalam lingkungan basa/alkalisSemakin tinggi konsentrasi larutan protein sampel, semakin banyak ikatan peptida dalam larutan maka pembentukan kompleks semakin banyakSemakin tinggi konsentrasi larutan akan semakin banyak molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV sehingga sinar yang diteruskan akan semakin sedikit.Perbedaan hasil pengukuran absorbsi dapat disebabkan ketidakstabilan warna, warna larutan tidak cukup tua, oksidasi udara, suhu, dan sebagainya.Kadar protein yang terdapat dalam sampel susu cair yaitu 103mg/mlPraktikan dituntut untuk lebih teliti dalam melakukan pengenceran larutan standar protein karena dapat mempengaruhi hasilSebaiknya pengukuran absorbsi dilakukan saat pendiaman tidak lebih dari 30 menitSaran