Pemotongan Molekul DNA Menggunakan Enzim Restriksi

Endonuklease dan Pengukuran Besarnya Pasangan Basa dari Fragmen

yang Terpotong

RATNA DWI HIRMA W (B1J006019)

HARIYATI (B1J006021)

AFRINA YUNIATI (B1J006023)

K04-TD-04

Teknik manipulasi DNA melibatkan beberapa enzim, diantaranya DNA

polimerase, ligase, enzim yang memodifikasi ujung akhir nukleotida dan nuklease.

Nuklease merupakan enzim yang memotong molekul DNA dengan memutuskan

ikatan fosfodiester antara nukleotida satu dengan nukleotida berikutnya. Jenis

nuklease ada dua yaitu eksonuklease dan endonuklease. Endonuklease merupakan

nuklease yang memotong bagian internal DNA tepat pada ikatan fosfodiester. Hasil

pemotongan molekul DNA oleh enzim restriksi endonuklease tepat pada urutan

tertentu dan menghasilkan sekuens yang double-stranded, dengan demikian sekuens

yang akan dipotong dapat diprediksi urutan basa nitrogennya.

Ada tiga tipe enzim restriksi endonuklease yaitu tipe I, II dan III. Enzim

restriksi endonuklease tipe I dan III jarang digunakan, karena hasil pemotongannya

tidak tepat pada sekuens yang diinginkan, sedangkan enzim restriksi endonuklease

tipe II dapat memotong tepat atau dekat dengan sekuens yang diinginkan (gambar 1).

Gambar 1. Pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi endonuklease

tipe I, II, dan III.

Contoh enzim restriksi endonuklease tipe II adalah EcoRI. Enzim EcoRI

diisolasi dari E. coli dan memotong molekul DNA pada urutan heksanukleotida 5’-

GAATTC-3’. Selain EcoRI, enzim restriksi endonuklease lainnya dapat dilihat pada

tabel di bawah ini.

Hasil pemotongan enzim restriksi endonuklease ada dua macam yaitu unjung

blunt atau flush dan ujung sticky atau cohesive (gambar 2).

Gambar 2. Hasil pemotongan molekul DNA dengan enzim restriksi

endonuklease berbeda. (A) ujung blunt dan ujung sticky. (B) Tipe ujung sticky

berbeda. (C) Tipe ujung sticky sama dihasilkan oleh dua enzim restriksi endonuklease

berbeda.

Ujung blunt atau flush menghasilkan fragmen yang double-stranded,

sedangkan ujung sticky atau cohesive menunjukkan enzim restriksi endonuklease pada

posisi yang berbeda dari dua untai DNA yang komplementer. Beberapa pemotong

ujung sticky menghasilkan ujung 5’ atau ujung 3’ yang menggantung.

Fragmen DNA yang dipotong dengan enzim restriksi endonuklease dapat

ditentukan berapa besar ukurannya dengan menggunakan teknik elektroforesis gel

agarosa. Teknik ini tergantung oleh konsentrasi agarosa dalam gel. Fragmen yang

berukuran kurang dari 150 pasang basa dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis

yang konsentrasi agarosanya 4% atau 5%.

Apabila ukuran dari sekuens DNA tidak diketahui maka fragmen yang

mengandung gen atau segmen DNA tersebut dapat diidentifikasi dengan Southern

hybridization. Adapun tahapannya yaitu:

1. Mentransfer fragmen restriksi dari gel agarosa ke nitroselulosa atau membran

nilon.

2. Menyediakan hybrization probe. Sekuens molekul DNA yang komplementer

dengan DNA target dilabeli. Pelabelan ini dapat menggunakan oligonukleotida

sintetik. Pelabelan kemudian dideteksi dengan menggunakan

autoradiography.

Daftar Pustaka

Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.figgrp.6026

diakses tanggal 16 Oktober 2008

Situs Terkait

http://regeni.wordpress.com/bahan-ajar/laporan-praktikum/fitri/

http://lib.atmajaya.ac.id/default.aspx?tabID=61&src=k&id=135557

diakses tanggal 22 Oktober

http://bima.ipb.ac.id/~tpb-ipb/materi/genetika/dnarekombinan/enzimrestriksipdf.pdf

diakses tanggal 28 Oktober

http://users.sch.gr/ppoulio/Flash_animation/animation_biology/anasindiasmeno_DNA

%20Gkatefthinsis.swf

http://users.sch.gr/ppoulio/Flash_animation/animation_biology/endonukleases%20per

iorismou%20Gkatefthinsis.swf

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/restriction.html

diakses tanggal 29 Oktober 2008