PEMERIKSAAN WIDAL

1.1 Tujuan

1. Mahasiswa dapat melakukan pemeriksaan widal untuk menegakkan

diagnosis demam typhoid

2. Mahasiswa mengetahui adanya antibodi spesifik terhadap

bakteri Salmonella

1.2 Metode

Metode yang digunakan dalam praktikum ini adalah Rapid Slide Test dan

tes aglutinasi tabung reaksi

1.3 Prinsip

Prinsip dari tes ini adalah reaksi imunologis antara antibodi yang

diproduksi oleh bakteri (agglutinin) dengan jenis lain dari antigen fibril.

1.4 Dasar Teori

Tes Widal merupakan tes aglutinasi tabung yang digunakan dalam

diagnosis serologis demam enterik. Tes ini dinamai oleh Fernand Georges

Isidore Widal, seorang dokter dan ahli bakteriologi Perancis, lahir 9

Maret1862, Aljazair, meninggal 14 Januari 1929, Paris (Anonim, 2013). Uji

Widal merupakan suatu metode serologi baku dan rutin digunakan sejak tahun

1896 (Mimin, 2013).

Pemeriksaan Widal adalah salah satu pemeriksaan yang bertujuan untuk

menegakkan diagnosa demam tipoid. Pemeriksaan ini masih banyak dipakai di

negara-negara berkembang dikarenakan biayanya yang relatif terjangkau dan

hasilnya pun dapat diketahui dengan segera. Pemeriksaan Widal bertujuan

untuk mendeteksi adanya antibodi (kekebalan tubuh) terhadap kuman

Salmonella dengan cara mengukur kadar aglutinasi antibodi terhadap antigen

O dan H dalam sampel darah. Tubuh kita akan membentuk antibodi jika

terpapar kuman Salmonela typhi, baik kuman yang masuk secara alamiah dan

1

menyebabkan sakit, kuman yang masuk namun tidak menunjukan gejala

(karier) ataupun melalui vaksinasi (Vian, 2012).

Beberapa keuntungan dari pemeriksaan Widal adalah tekniknya sederhana,

mudah dan murah. Sedangkan beberapa kerugian dari pemeriksaan Widal

adalah (Lia, 2011) :

1. Adanya reaksi silang

2. Nilai normal daerah endemis tidak sama dengan daerah non endemis

3. Bila terjadi gangguan proses immunitas, pembentukan antibodi terganggu

maka uji Widal dapat memberikan hasil negatif palsu. Selain itu

keterbatasan uji ini juga dapat memberikan hasil positif palsu.

a. Negatif palsu

Hasil negatif palsu dapat terjadi jika dalam pemberian antibiotika yang

dilakukan sebelumnya sehingga dapat menghalangi respon antibodi (ini

kejadian paling sering di negara kita). Misalnya, saat terdapat gejala demam

langsung diberi antibiotika dan tidak sembuh dalam 5 hari sudah dilakukan uji

Widal. Padahal sebenarnya bisa positif jika dilakukan kultur darah.

b. Positif palsu

Dapat terjadinya positif palsu misalnya pada beberapa jenis serotipe

Salmonella lainnya (misalnya S. paratyphi A, B, C) yang memiliki antigen O

dan juga antigen H, sehingga dapat menimbulkan reaksi silang dengan jenis

bakteri lainnya, dan bisa menimbulkan hasil positif palsu (false positive).

Padahal sebenarnya yang positif kuman non S. typhi (bukan tifoid).

4. Tidak digunakan untuk evaluasi terapi

5. Sebagai sarana penunjang diagnosis demam typhoid, uji Widal memiliki

spesifitas yang agak rendah dan kesukaran untuk menginterpretasikan

hasil tersebut, sebab banyak faktor yang mempengaruhi kenaikan titer.

Selain itu antibodi terhadap antigen H bahkan mungkin dijumpai dengan

titer yang lebih tinggi, yang disebabkan adanya reaktifitas silang yang luas

sehingga sukar untuk diinterpretasikan. Dengan alasan ini maka pada

daerah endemis tidak dianjurkan pemeriksaan antibodi H S.typhi, cukup

pemeriksaan titer terhadap antibodi O S.typhi.

2

Prinsip pemeriksaan Widal adalah reaksi aglutinasi yang terjadi bila serum

penderita dicampur dengan suspense antigen Salmonella typhosa.

Pemeriksaan yang positif ialah bila terjadi reaksi aglutinasi antara antigen dan

antibodi (aglutinin). Antigen yang digunakan pada tes Widal ini berasal dari

suspense Salmonella yang sudah dimatikan dan diolah dalam laboratorium.

Dengan jalan mengencerkan serum, maka kadar anti dapat ditentukan.

Pengenceran tertinggi yang masih menimbulkan reaksi aglutinasi

menunjukkan titer antibodi dalam serum (Wikipedia, 2012).

Teknik pemeriksaan uji Widal dapat dilakukan dengan dua metode yaitu

uji hapusan atau peluncuran (slide test) dan uji tabung (tube test).

Perbedaannya, uji tabung membutuhkan waktu inkubasi semalam karena

membutuhkan teknik yang lebih rumit dan uji Widal peluncuran hanya

membutuhkan waktu inkubasi 1 menit saja yang biasanya digunakan dalam

prosedur penapisan. Umumnya sekarang lebih banyak digunakan uji Widal

peluncuran. Sensitivitas dan spesifitas tes ini amat dipengaruhi oleh jenis

antigen yang digunakan. Menurut beberapa peneliti uji Widal yang

menggunakan antigen yang dibuat dari jenis strain kuman asal daerah endemis

(lokal) memberikan sensitivitas dan spesifitas yang lebih tinggi daripada bila

dipakai antigen yang berasal dari strain kuman asal luar daerah endemis

(import). Walaupun begitu, menurut suatu penelitian yang mengukur

kemampuan uji tabung Widal menggunakan antigen import dan antigen lokal,

terdapat korelasi yang bermakna antara antigen lokal dengan antigen S.typhi O

dan H import, sehingga bisa dipertimbangkan antigen import untuk dipakai di

laboratorium yang tidak dapat memproduksi antigen sendiri untuk membantu

menegakkan diagnosis demam typhoid (Mimin, 2013).

Pada pemeriksaan uji Widal dikenal beberapa antigen yang dipakai

sebagai parameter penilaian hasil uji Widal. Berikut ini penjelasan macam

antigen tersebut (Anonim, 2013) :

1. Antigen O

Antigen O merupakan somatik yang terletak di lapisan luar tubuh kuman.

Struktur kimianya terdiri dari lipopolisakarida. Antigen ini tahan terhadap

pemanasan 100°C selama 2–5 jam, alkohol dan asam yang encer.

3

2. Antigen H

Antigen H merupakan antigen yang terletak di flagela, fimbriae atau fili S.

typhi dan berstruktur kimia protein. S. typhi mempunyai antigen H phase-1

tunggal yang juga dimiliki beberapa Salmonella lain. Antigen ini tidak aktif

pada pemanasan di atas suhu 60°C dan pada pemberian alkohol atau asam.

3. Antigen Vi

Antigen Vi terletak di lapisan terluar S. typhi (kapsul) yang melindungi

kuman dari fagositosis dengan struktur kimia glikolipid, akan rusak bila

dipanaskan selama 1 jam pada suhu 60°C, dengan pemberian asam dan fenol.

Antigen ini digunakan untuk mengetahui adanya karier.

4. Outer Membrane Protein (OMP)

Antigen OMP S. typhi merupakan bagian dinding sel yang terletak di luar

membran sitoplasma dan lapisan peptidoglikan yang membatasi sel terhadap

lingkungan sekitarnya. OMP ini terdiri dari 2 bagian yaitu protein porin dan

protein nonporin. Porin merupakan komponen utama OMP, terdiri atas protein

OMP C, OMP D, OMP F dan merupakan saluran hidrofilik yang berfungsi

untuk difusi solut dengan BM < 6000. Sifatnya resisten terhadap proteolisis

dan denaturasi pada suhu 85–100°C. Protein nonporin terdiri atas protein

OMP A, protein a dan lipoprotein, bersifat sensitif terhadap protease, tetapi

fungsinya masih belum diketahui dengan jelas. Beberapa peneliti menemukan

antigen OMP S typhi yang sangat spesifik yaitu antigen protein 50 kDa/52

kDa.

Uji Widal positif artinya ada zat anti (antibodi) terhadap kuman

Salmonella, menunjukkan bahwa seseorang pernah kontak atau terinfeksi

dengan kuman Salmonella tipe tertentu. Namun, dalam hasil uji Widal, masih

ada beberapa hal yang sering disalahartikan yaitu (Vian, 2013) :

1.   Pemeriksaan Widal positif dianggap ada kuman dalam tubuh, hal ini

pengertian yang salah. Uji Widal hanya menunjukkan adanya antibodi

terhadap kuman Salmonella.

2.   Pemeriksaan Widal yang diulang setelah pengobatan dan menunjukkan

hasil positif dianggap masih menderita tifus, ini juga pengertian yang

salah.

4

Setelah seseorang menderita tifus dan mendapat pengobatan, hasil uji

Widal tetap positif untuk waktu yang lama sehingga uji Widal tidak dapat

digunakan sebagai acuan untuk menyatakan kesembuhan.

3. Hasil ulang pemeriksaan Widal positif setelah mendapat pengobatan tifus,

bukan indikasi untuk mengulang pengobatan bilamana tidak lagi

didapatkan gejala yang sesuai.

4. Hasil uji negatif dianggap tidak menderita tifus.

Uji Widal umumnya menunjukkan hasil positif 5 hari atau lebih setelah

infeksi. Karena itu bila infeksi baru berlangsung beberapa hari, sering kali

hasilnya masih negatif dan baru akan positif bilamana pemeriksaan diulang.

Dengan demikian, hasil uji Widal negatif, terutama pada beberapa hari

pertama demam belum dapat menyingkirkan kemungkinan tifus (Nurahmad,

2011).

Untuk menentukan seseorang menderita demam tifoid tetap harus

didasarkan adanya gejala yang sesuai dengan penyakit tifus karena uji Widal

hanya sebagai pemeriksaan yang menunjang diagnosis. Seorang tanpa gejala,

dengan uji Widal positif tidak dapat dikatakan menderita tifus. Pada daerah

endemik, terdapat kesulitan dalam interpretasi hasil uji Widal karena sebagian

besar populasi sehat juga pernah kontak atau terinfeksi, sehingga

menunjukkan hasil uji Widal positif. Hasil survei pada orang sehat di Jakarta

pada 2006 menunjukkan hasil uji Widal positif pada 78% populasi orang

dewasa. Untuk itu perlu kecermatan dan kehatihatian dalam interpretasi hasil

pemeriksaan Widal (Vian, 2013).

Interpretasi dari uji Widal ini harus memperhatikan beberapa faktor antara

lain sensitivitas, spesifitas, stadium penyakit; faktor penderita seperti status

imunitas dan status gizi yang dapat mempengaruhi pembentukan antibodi, saat

pengambilan specimen, gambaran imunologis dari masyarakat setempat

(daerah endemis atau non endemis), faktor antigen, teknik serta reagen yang

digunakan. Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi uji Widal dapat

dijelaskan sebagai berikut, antara lain (Anonim, 2011) :

1. Keadaan umum : gizi buruk dapat menghambat pembentukan antibodi.

5

2. Saat pengambilan spesimen : berdasarkan penelitian Senewiratne, dkk.

kenaikan titer antibodi ke level diagnostik pada uji Widal umumnya paling

baik pada minggu kedua atau ketiga, yaitu 95,7%, sedangkan kenaikan

titer pada minggu pertama adalah hanya 85,7%.

3. Pengobatan dini dengan antibiotika, pemberian antibiotika sebelumnya

dapat menghambat pembentukan antibodi.

4. Vaksinasi terhadap salmonella bisa memberikan reaksi positif palsu. Hal

ini dapat dijelaskan bahwa setelah divaksinasi titer agglutinin O dan H

meningkat dan menetap selama beberapa waktu. Jalan keluarnya adalah

dengan melakukan pemeriksaan ulang tes Widal seminggu kemudian.

Infeksi akan menunjukkan peningkatan titer, sementara pasien yang

divaksinasi tidak akan menunjukkan peningkatan titer.

5. Obat-obatan immunosupresif dapat menghambat pembentukan antibodi.

6. Reaksi anamnesa. Pada individu yang terkena infeksi typhoid di masa lalu,

kadang-kadang terjadi peningkatan antibodi salmonella saat ia menderita

infeksi yang bukan typhoid, sehingga diperlukan pemeriksaan Widal ulang

seminggu kemudian.

7. Reaksi silang : beberapa jenis serotipe Salmonella lainnya (misalnya S.

paratyphi A, B, C) memiliki antigen O dan H juga, sehingga menimbulkan

reaksi silang dengan jenis bakteri lainnya, dan bisa menimbulkan hasil

positif palsu (false positive). Padahal sebenarnya yang positif kuman non

S. typhi (bukan typhoid).

8. Penyakit-penyakit tertentu seperti malaria, tetanus, sirosis dapat

menyebabkan positif palsu.

9. Konsentrasi suspense antigen dan strain Salmonella yang digunakan akan

mempengaruhi hasil uji Widal.

Kegunaan uji Widal untuk diagnosis demam typhoid masih kontroversial

diantara para ahli. Namun hampir semua ahli sepakat bahwa kenaikan titer

agglutinin lebih atau sama dengan 4 kali terutama agglutinin O atau agglutinin

H bernilai diagnostic yang penting untuk demam typhoid. Kenaikan titer

agglutinin yang tinggi pada specimen tunggal, tidak dapat membedakan

apakah infeksi tersebut merupakan infeksi baru atau lama. Begitu juga

6

kenaikan titer agglutinin terutama agglutinin H tidak mempunyai arti

diagnostik yang penting untuk demam typhoid, namun masih dapat membantu

dan menegakkan diagnosis tersangka demam typhoid pada penderita dewasa

yang berasal dari daerah non endemik atau pada anak umur kurang dari 10

tahun di daerah endemik, sebab pada kelompok penderita ini kemungkinan

mendapat kontak dengan S. typhi dalam dosis subinfeksi masih amat kecil.

Pada orang dewasa atau anak di atas 10 tahun yang bertempat tinggal di

daerah endemik, kemungkinan untuk menelan S.typhi dalam dosis subinfeksi

masih lebih besar sehingga uji Widal dapat memberikan ambang atas titer

rujukan yang berbeda-beda antar daerah endemik yang satu dengan yang

lainnya, tergantung dari tingkat endemisitasnya dan berbeda pula antara anak

di bawah umur 10 tahun dan orang dewasa. Dengan demikian, bila uji Widal

masih diperlukan untuk menunjang diagnosis demam typhoid, maka ambang

atas titer rujukan, baik pada anak dan dewasa perlu ditentukan (Nurahmad,

2011).

1.5 Alat, Bahan, dan Reagen

A. Alat

1. Kaca objek berbentuk cincin

2. Pipet serum

3. Stik pengaduk

4. Tabung reaksi

5. Pengaduk mekanik (jika diperlukan)

B. Bahan

1. Larutan NaCl 0,9%

2. Antigen Fibril

3. Serum

C. Reagen

1. Brucella abortus

2. Brucella melitensis

3. Antigen Salmonella Grup A

4. Antigen Salmonella Grup B

7

5. Antigen Salmonella Grup C

6. Paratyphoid A (Antigen Salmonella Flagellar a )

7. Paratyphoid B (Antigen Salmonella Flagellar b )

8. Paratyphoid C (Antigen Salmonella Flagellar c )

9. Proteus OX2

10. Proteus OX19

11. Proteus OXK

12. Typhoid O (Salmonella Group D, somatik)

1.6 Langkah Kerja

A. Rapid Slide Test

1. 5 kaca objek disediakan dan masing-masing dibuat lingkaran dengan

diameter 1 ½ inci dengan pensil lilin atau sebuah pensil dengan ujung

bercahaya. Untuk tujuan ini bisa juga digunakan kaca jendela yang

kecil. Kaca objek berbentuk cincin juga dianjurkan untuk digunakan.

2. Sejumlah serum yang akan diuji ditambahkan dengan pipet yang

sesuai, ke dalam lingkaran kaca objek dari kiri ke kanan dengan

urutan: 0,08 mL, 0,04 mL, 0,02 mL, 0,01 mL, 0,05 mL. Serum harus

bersih dan tidak panas. Prosedur ini diulangi dengan serum kontrol

positif dan negatif.

3. Antigen dikocok dengan hati – hati untuk memastikan suspensi

tercampur merata.

4. Dengan memegang penetes secara vertikal, ditambahkan satu tetes

suspensi antigen setiap sejumlah serum.

5. Serum dan antigen dicampur menggunakan stik pengaduk. Stik

pengaduk yang berbeda digunakan untuk setiap jumlah serum atau

digunakan stick yang sama dan dikerjakan dari kanan ke kiri. Area

yang dibentuk setiap campuran harus berukuran ½ inci - 1 inch.

6. Slide digoyangkan dengan tangan atau pengocok mekanik pada

kecepatan 150 rpm selama 2-3 menit.

7. Aglutinasi diamati dengan pencahayaan tidak langsung berlatar

belakang gelap.

8

8. Serum positif oleh titer yang dikenali dan serum negatif serum harus

termasuk ke dalam control

B. Tes Aglutinasi Tabung Reaksi

1. Sepuluh tabung reaksi berukuran 12 x 75 mm disediakan dan

diletakkan di rak yang sesuai

2. 1,9 mL larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan ke tabung pertama

3. 1,0 mL larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan ke tabung yang

tersisa

4. 0,1 mL serum yang akan diuji ditambahkan ke tabung pertama. 1,0 ml

serum yang diencerkan diaduk rata dan dipindahkan dari tabung

pertama ke tabung kedua. Prosedur ini diulangi sampai kesepuluh

tabung mengandung seri pengenceran serum dua - kali lipat dari 1: 20

sampai 1: 10240. 1,0 mL pengencer serum diambil dari tabung 10 dan

dibuang. Tabung no. 1 dianggap sebagai pengenceran 1:20. Prosedur

ini diulangi dengan serum kontrol positif dan negatif.

5. Satu tabung ditempatkan di akhir seri tabung pengenceran dan 1,0 mL

larutan natrium klorida 0,9% ditambahkan untuk mengencerkan serum.

Tabung itu dilabeli dengan nama "Control Saline”

6. Suspensi antigen dihomogenkan dengan mengocok botol hati - hati.

Satu tetes antigen ditambahkan untuk setiap tabung.

7. Rak dikocok untuk mencampur antigen dengan serum dan ditempatkan di

waterbath. Waktu dan suhu inkubasi yang dianjurkan adalah sebagai

berikut:

Antigen Temperature Waktu Inkubasi

Salmonella “O” Group A 45 - 50 18 jam

Salmonella “O” Group B 45 - 50 18 jam

Salmonella “O” Group C 45 - 50 18 jam

9

Salmonella “O” Group D

(Typhoid O)45 - 50 18 jam

Salmonella “H” a 45 - 50 2 jam

Salmonella “H” b 45 - 50 2 jam

Salmonella “H” c 45 - 50 2 jam

Salmonella “H” d

(Typhoid H)45 - 50 2 jam

Brucella abortus dan

Brucella meltonois

37 48 jam

Proteus OX2, OX19 dan

OXK

37 18 jam

Catatan : Typhoid H dan antigen Salmonella flagellar harus diinkubasi

selama 2 jam pada suhu 45 - 50 dilanjutkan dengan inkubasi 10 jam

pada suhu 2 - 8 sebelum pembacaan terakhir.

8. Setelah diinkubasi, rak yang berisi tabung reaksi dipindahkan dengan

hati-hati dan diamati aglutinasinya. Menggunakan sumber cahaya tidak

langsung dengan latar belakang hitam akan memberikan kondisi

optimal untuk pembacaan tabung

9. Hasil tes dicatat sebagai berikut :

a. 4+ : Semua organisme berkumpul di dasar tabung dan cairan

supernatan bersih

b. 3+ : Sekitar 75% organisme berkumpul dan supernatant sedikit

keruh

c. 2+ : Sekitar 50% organisme berkumpul dan supernatant dengan

kekeruhan sedang

d. 1+ : Sekitar 25 % organisme berkumpul dan supernatant keruh

e. - : Tidak ada aglutinasi yang teramati dan muncul kekeruhan

pada suspensi

10

10. Titer dari serum reaktif dicatat sebagai pengenceran terakhir yang

memberikan reaksi 2 +

1.7 Interprestasi Hasil

A. Rapid Slide Test

Derajat aglutinasi sebagai berikut :

4+ : 100% organisme mengalami aglutinasi

3+ : 75% organisme mengalami aglutinasi

2+ : 50% organisme mengalami aglutinasi

1+ : 25% organisme mengalami aglutinasi

+ : kurang dari 25% organisme mengalami aglutinasi

Negatif : tidak ada aglutinasi

B. Tes Titrasi Tabung Reaksi

4+ : Semua organisme berkumpul di dasar tabung dan cairan supernatan

bersih

3+ : Sekitar 75% organisme berkumpul dan supernatan sedikit keruh

2+ : Sekitar 50% organisme berkumpul dan supernatan dengan

kekeruhan sedang

1+ : Sekitar 25 % organisme berkumpul dan supernatan keruh

Negatif : Tidak ada aglutinasi yang teramati dan muncul kekeruhan

pada suspensi

11