pembahasan sds page.docx

8/10/2019 pembahasan SDS PAGE.docx

1/7

VII. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan isolasi protein total sel bakteri dan

elektroforesis SDS PAGE (Sodium Dodecyl SulphatePolyacrilamide Gel

Electrophoresis) yang menggunakan gel poliakrilamida yang dikombinasikan dengan

SDS. Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel

lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan

sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan

protein secara sempurna, gel poliakrilamida ini mempunyai daya pemisahan yang cukup

tinggi (anam, 2009),memiliki kapasitas muat yang tinggi hingga 10 mikrogram DNA dan

dapat dimuat ke dalam sumur tunggal (1 cm x 1 mm) tanpa kehilangan resolusi. metode

SDS page ini lebih mudah digunakan dan dapat mengeluarkan hasil dengan cepat dan

hasilnya tidak perlu dilihat di bawah sinar UV. Sementara itu kerugian dari metode SDS

page ini adalah mobilitas fragmen dapat dipengaruhi oleh komposisi dasar sehingga dapat

mengganggu keakuratan pita/band yang terbentuk. Penggunaan SDS berfungsi untuk

mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat ikatan

dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga

mercaptoetanol.

Pada percobaan kali ini kita menggunakan protein kolagenase. Kolagenase ini

merupakan enzim yang umumnya dibentuk oleh bakteri Clostridium, Helicobacter pylori,

dan banyak bakteri anaerob yang merupakan enzim ekstraseluler, bersifat dapat

menghancurkan kolagen sehingga menyebabkan bakteri dapat menyebar ke jaringan.

Sebelum dielektroforesi, sampel harus disiapkan terlebih dahulu dengan

ditambahkan buffer sampel yang terdiri dari 0.6 mL trisHCl 1M pH 6,8; 5 mL gliserol 50

%; 2 mL SDS 10%; 0.5 mL 2-merkaptoetanol yang ditambahkan dengan perbandingan

sampel : buffer sampel = 1:1. Dilihat dari komposisinya buffer sampel diatas merupakan

buffer sampel reducing karena mengandung reducing agentyaitu 2-mercaptoetanol. 2-

Mercaptoetanol dapat memecah ikatan disulfida pada protein, baik pada struktur tertier

maupun kuarterner. Karena kemampuan untuk mengganggu struktur protein. 2-

Mercaptoetanol juga seringkali terlibat dalam reaksi enzimatis untuk menghambat

oksidasi sehingga dapat mempertahankan aktivitas protein. 2-Mercaptoetanol sangat

toksik, bila terhirup dapat menyebabkan iritasi saluran pernafasan, bila terkena kulit dapat

menimbulkan iritasi, bila tertelan dapat mengakibatkan muntah, luka lambung, dan


2/7

berpotensi menimbulkan kematian bila terjadi paparan hebat, sehingga pada

pengerjaannya harus memakai alat pelindung diri seperti masker dan sarung tangan

nitrile. pH yang digunakan pada pada buffer sampel yaitu 6,8. pH ini dibawah pH

isoelektrik protein yaitu pH 8, sehingga nantinya protein akan tersusun secara berjajar

pada bagian bawah dari stacking gel saat elektroforesis. Gliserol dalam buffer sampel ini

digunakan untuk menambah densitas. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein yang

mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam

gel. Sampel didenaturasi sesaat sebelum mengisi gel. Karena protein sampel dapat

kembali ke bentuk awal jika didenaturasi jauh sebelum loading dan dapat menghasilkan

fragmen yang tidak tentu.

Berdasarkan preparasi sampel, elektroforesis dibagi dua yaitu : (1) native atau

nondenaturing atau nondisosiasi PAGE, dan (2) denaturing atau disosiasi atau SDS-

PAGE. Pada sistem native atau nondenaturing PAGE (non-dissociation), protein

diseparasi pada bufer yang mempunyai pI tertentu. Ketika bergerak di dalam gel, protein

tetap berada dalam struktur tiga dimensi (native). Ukuran suatu protein ditentukan oleh

berat molekul, tingkat hidrasi dan bentuknya. Pada sistem ini, sulit memperkirakan pola

migrasi protein. Pada umumnya, sistem ini hanya dipakai untuk memisahkan sampel

dengan berat molekul yang sama berdasarkan muatannya. Sistem ini tidak cocok untuk

diterapkan pada praktikum ini, karena pada praktikum ini praktikan hanya menggunakan

satu protein dan ingin menentukan berat molekulnya sehingga lebih cocok menggunakan

sistem denaturing menggunakan SDS-PAGE. Pada sistem denaturing yaitu pada saat

preparasi sampel ditambahkan SDS seperti yang dilakukan pada praktikum ini, protein

dielektroforesis pada bufer yang juga mengandung detergen ionik SDS. SDS akan

mengikat pada bagian hidrofobik dan residu asam amino sehingga menyebabkan

perubahan struktur tiga dimensi protein (menjadi unfolding). Selain itu, SDS juga

menyebabkan seluruh rantai peptida bermuatan negatif.Dalam kondisi ini, ukuran protein

hanya tergantung pada berat molekulnya. Kompleks protein-SDS bergerak dalam gel

poliakrilamid dengan kecepatan yang tergantung pada berat molekulnya.Dengan

demikian maka, SDS-PAGE digunakan untuk menentukan berat molekul suatu crude

protein.

Pada praktikum ini dilakukan pembuatan dua jenis gel berbeda, yaitu separating gel

15 % dan stacking gel 5%. Separating gel terdiri dari bahan yang digunakan dalam

praktikum yaitu air deionisasi steril 1457,5 L digunakan sebagai pelarut polar dan


3/7

sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel. Air deionisasi adalah air yang tidak

mengandung garam dan mineral-mineral. Perbedannya dengan air suling adalah air suling

dibuat dengan cara mendestilasi air, sedangkan air deionisasi dibuat dengan cara menarik

garam-garam dengan resin bermuatan listrik. Air deionisasi dibuat dengan cara

mengambil air yang masih mengandung mineral dan garam-garam, lalu dimasukkan ke

sebuah resin bermuatan listrik yang dapatmenarik garam-garam dan mineral tersebut.

Sehingga nantinya pada air hanya mengandung molekul H2O, dengan hanya

terkandungnya molekul H2O menyebabkan air deionisasi bersifat lebih polar dibanding

dengan air suling., akrilamid 30% 2500 L sebagai bahan untuk membentuk pori-pori

dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, 1M Tris-HCl pH 8,8 937,5

L untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah, SDS 10%

50L digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding

dan menyelubungi protein dengan muatan negatif sehingga protein berbentuk linier dan

member muatan negatif pada protein, fungsi pembentukan muatan negatif ini untuk

memudahkan separasi menuju kutub positif saat dilewatkan arus (Janson, 1998) dan

untuk mengikat protein sehingga bagian nonpolar dari SDS tersembunyi ke dalam bagian

nonpolar (hidrofobik) dari protein dan gugus sulfat dari SDS yang bermuatan negatif

berhubungan langsung atau terekspos pada pelarut, Ammonium persulfate (APS) 10%50L digunakan sebagai mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul

akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang panjang (polimerasi gel

poliakrilamid), dan TEMED (N,N,N,N tetrametilendiamin) 50L digunakan sebagai

katalisator pembentukan radikal bebas dari ammonium persulfat, katalisator reaksi

polimerisasi akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam

pemisahan protein dan sebagai pemadat sehingga pencampurannya dilakukan terakhir

agar larutan tidak menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur.

Larutan gel yang telah dibuat dimasukkan dalam plate untuk mencetak gel, lalu

pemberian aquades diatas separating gel yang setengah padat bertujuan untuk meratakan

permukaan separating gel, menghambat polimerisasi dan mencegah difusi O2 yang dapat

menghambat proses migrasi (Boyer 1993: 12). Setelah padat aquades diserap agar dapat

dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan stacking gel diatas separating gel 5%.

Bahan yang digunakan dalam pembuatan stacking gel ini yaitu, air deionisasi steril 1380

L akrilamid-bis 30% 335 L sebagai matriks penyangga, Matriks poliakrilamid

berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH bufer agar

muatan protein tidak berubah. Penggunaan konsentrasi bis acrylamid sebesar 30% akan


4/7

menyaring molekul protein sebesar 2x102,Tris-HCl pH 6,8 250 L, SDS 10% 20L ,

Ammonium persulfate (APS) 10% 150L dan TEMED (N,N,N,N tetrametilendiamin)

2,5 L. pH yang digunakan dalam separating gel yaitu 8,8 Protein merupakan molekul

amphoter karena mempunyai gugus amino positif dan gugus karboksil negatif. Dengan

demikian maka protein dapat mengion baik pada pH basa maupun pH asam. Pada pH

rendah, protein bersifat sebagai kation (bermuatan positif) yang cenderung bergerak ke

arah katoda (bermuatan negatif). Pada pH tinggi, protein bersifat sebagai anion

(bermuatan negatif) yang cenderung bergerak ke arah anoda (bermuatan positif). Nilai

diantara kedua pH tersebut dinamakan titik isoelektrik (isoelectric point atau pI) yaitu

nilai pH dimana protein menjadi tidak bermuatan. Hal ini karena pada pH tersebut jumlah

muatan negatif yang dihasilkan dari proteolisis sebanding dengan jumlah muatan positif

yang diperoleh dari penangkapan proton. Protein yang tidak bermuatan tidak dapat

bergerak pada medan listrik. Hampir semua protein mempunyai pI kurang dari 8,0. Oleh

karena itu, pH bufer elektroforesis berkisar 89 yang akan menyebabkan sebagian besar

protein bermuatan negatif yang akan bergerak ke anoda dan untuk mendapatkan pori-pori

yang lebih kecil sehingga protein akan terseparasi dengan baik saat running. pH stacking

gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel berada di bawah isoelektrik

protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara berjajar pada bagian bawah daristacking gel (Janson, 1998).

Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai dengan

berat molekul protein yang dipisahkan. Semakin rendah berat molekul protein yang

dipisahkan, maka semakin tinggi konsentrasi akrilamida yang digunakan agar kisi kisi

yang terbentuk semakin rapat.perbedaan ph stacking gel dan separating gel ini

memungkinkan protein dalam sampel dimuat terkonsentrasi menjadi band yang ketat

selama beberapa menit pertama elektroforesis sebelum memasuki bagian pemecahan gel.

Setelah separating gel dibuat, dilanjutkan dengan membuat stacking gel,

pembuatannya hampir sama dengan separating gel, hanya saja berbeda pada konsentrasi

bahan-bahan. Hal ini dikarenakan fungsi dari stacking gel sebagai gel pengumpul,

sehingga tidak membutuhkan konsentrasi bahan yang terlalu besar dan untuk tempat

menata sampel protein sebelum proses running dimulai sementara seperating gel

berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya

(Boyer 1993: 118 & 119). Peletakan stacking gel berada diatas separating gel, kemudian

diatas stacking gel diletakkan sisir untuk membuat sumuran. Setelah semua gel


5/7

selesaidibuat, kemudian dilakukan injeksi sampel dan running. Sampel dan marker di

injeksikan kesumuran sebanyak 5 l, setelah semua sampel selesai di injeksikan, gel

dimasukkan kedalam alat elektroforesis yang diberi aquades.

Running yang dilakukan pada praktikum digunakan arus 400 mA,voltase 100V

selama 75 menit untuk mendapatkan hasil yang baik karena digunakan arus yang lebih

kecil sehingga protein dapat terseparasi dengan baik. Pada proses running ini terjadi

migrasi protein dari katoda menuju anoda. Karena protein yang digunakan bermuatan

negatif maka protein akan bergerak dari katoda menuju anoda. Running ini dilakukan

untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekul yang dimilikinya. Running buffer

terdiri dari 0.3% Trisma basa; 1.44% glisin; 0.1% SDS, dan air suling ad 100%, dengan

pH 8.3. Trisma basa (Tris-base) digunakan sebagai pendapar yang dapat menstabilkan

pH, sehingga pH dapat stabil di 8.3 sehingga dapat menjaga kondisi fisiologis dari protein

dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik, agar tetap

konstan serta menghubungkan antar elektroda sehingga proses migrasi dapat berlangsung

(Ausubel et al, 1978) dan mencegah gel agar tidak terlalu panas akibat adanya arus listrik.

Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer karena sistem yang digunakan

dalam elektroforesis yaitu wet sistemdan digunakan arus listrik, jika salah satu bagiannya

tidak terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir. Setelah running selesai, yang

selanjutnya digunakan untuk analisis hanya separating gelnya saja sedangkan stacking

gelnya dibuang karena band-band protein hanya terdapat pada separating gel saja.

Semakain tinggi konsentrasi acrylamide maka diameter pori-pori akan semakin kecil.

Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka

memerlukan gel dengan konsentrasi acrylamide yang kecil. Konsentrasi acrylamide

dalam gel 30% biasanya digunakan untuk protein dengan berat molekul 2 x 1022 x 103

dalton .

Langkah selanjutnya yaitu staining atau pewarnaan. Pewarnaan ini perlu untuk

dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang terseparasi. Perwarnaan

atau staining pada gel juga merupakan bagian dari teknik SDS-PAGE. Pewarnaan gel

pada teknik SDS-PAGE commasie blue staining adalah pewarna tekstil trifenilmetana,

dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS PAGE. Commasie blue straining banyak

beberapa kelebihan yaitu harga yang relatif murah, mengikat protein secara spesifik,

bekerja cepat ( Boyer 1993: 139). Coomasie blue dapat mewarnakan hingga 5-500 ng

protein yang terdapat pada matriks gel. Namun beberapa protein dengan berat molekul


6/7

rendah terkadang tidak dapat tampak hanya dengan pewarnaa coomasie blue. Larutan

staining yang digunakan dalam praktikum ini commasie blue 1 g, 450 ml metanol, 450

mL air, 100 ml asam asetat glasial dalam 1 L, tetapi yang diambil untuk staining hanya

beberapa ml. Commasie blue berfungsi sebagai staining agent. Staining biasanya

dilakukan semalam dengan agitasi. Agitasi akan membantu sirkulasi dye, fasilitas

penetrasi dan membantu uniformity staining, untuk megoptimalkan reaksi staining yang

dilakukan oleh Comassie blue. Metanol berfungsi untuk mengendapkan protein.

Pencucian dengan aquades berfungsi untuk membilas dan menghilangkan commasie blue

yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya dilakukan perendaman pada larutan

destaining untuk menghilangkan warga pada gel yang tidak mengandung pita protein,

larutan destaining terdiri dari 100 ml metanol, 800 ml air, 100 ml asam asetat glasial.

Pemberian kertas saring saat perendaman pada larutan destaining bertujuan untuk

memaksimalkan pembersihan larutan Commasie blue. Setelah itu dilakukan pencucian

lagi dengan aquades untuk menghilangkan sisa larutan destaining dan menghentikan

pewarnaan yang dilakukan oleh larutan destaining. Selanjutnya gel dapat discan untuk

mendapatkan visualisasi lebih baik untuk analisis selanjutnya.

Marker protein yang digunakan adalah MW (Molecular Weight) marker. MW

marker mengandung campuran dari delapan protein recombinan yang stabil berukuran

mulai dari 20150 kDa.


7/7

CARA PERHITUNGAN DAN ANALISIS HASIL.

Cara pembacaan hasil SDS-PAGE, menurut Rantam (2003) berat molekul antigen

dapat dicari dengan menghitung nilai Rf (Retardation Factor) dari masing-masing pita

dengan rumus:

Rf = Jarak pergerakan protein dari tempat awal

---------------------------------------------------------

Jarak pergerakan warna dari tempat awal

Kemudian Rf dimasukkan ke dalam persamaaan regresi linier dengan rumus sebagai

berikut:

y = a + b x

keterangan : y = berat molekul sampel, x = Rf sampel

pembahasan sds page.docx

Documents