modul bioteknologi tanaman

7/23/2019 Modul Bioteknologi Tanaman

1/79

LEMBAGA KAJIAN DAN PENGEMBANGAN PENDIDIKAN

(LKPP)

LAPORAN MODUL PEMBELAJARAN BERBASIS SCL

Judul :

Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan

pada Transfer Genetik Tanaman

Oleh :

Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD.

Dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Hasanuddinsesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan Pekerjaan

Nomor: 469/H4.23/PM.05/2008 Tanggal 04 Januari 2008

JURUSAN BUDIDAYA TANAMAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS HASANUDDIN

FEBRUARI 2008


2/79

ii

LEMBAGA KAJIAN DAN PENGEMBANGAN PENDIDIKAN

Lantai Dasar Gedung Perpustakaan Universitas Hasanuddin

HALAMAN PENGESAHAN

LAPORAN MODUL PEMBELAJARANPROGRAM TRANSFORMASI DARI TEACHING KELEARNING

UNIVERSITAS HASANUDDIN 2008

Judul : Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinanpada Transfer genetik Tanaman

Nama Lengkap : Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhDNIP : 132 126 029Pangkat/Golongan : Asisten Ahli / IIIbTelp. / HP Pengusul : (0411) 589900/ 08194140992Jadwal Waktu Kegiatan : 1 (satu) bulan

Mulai 04 Januari 2008 s/d 04 Februari 2008

Biaya yang diusulkan : Rp. 4.000.000,- ( Empat juta rupiah)Dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Hasanuddinsesuai dengan Surat Perjanjian Pelaksanaan PekerjaanNomor: 469/H4.23/PM.05/2008 Tanggal 04

Januari 2008

Makassar, 04 Februari 2008Mengetahui :Fakultas PertanianUniversitas HasanuddinDekan, Pembuat Modul

(Prof. Dr. Ir. Mursalim) (Ir. Rinaldi Sjahril, MAgr., PhD)NIP. 131 657 135 NIP. 132 126 029


3/79


4/79

iv

RINGKASAN

Bioteknologi secara sempit didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip

dasar biologi, biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai

tambah dari suatu organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan

agensia biologis. Bioteknologi modern ditandai dengan penggunaan teknik biologi

molekuler sehingga rekayasa yang dilakukan dapat jauh lebih terarah sehingga hasil

yang diperoleh dapat lebih atau sepenuhnya dikendalikan.

Sel merupakan bahan dasar penyusun utama makhluk hidup. Sel juga

mengandung materi informasi genetik serta dapat menggandakan diri. Yang

membedakan antara sel prokariotik dengan sel eukariotik adalah pada sel prokaritotik

tidak memiliki membran nukleus dan sistem endomembran (organel-organel

bermembran). Sel tersusun atas dinding sel, membran plasma, sitoplasma, serta

organel-organel sel yang memiliki fungsi masing-masing.

Dalam bioteknologi, rekayasa dapat dilakukan hingga pada aras DNA yang

merupakan bahan informasi genetik. Struktur primer dari DNA terdiri atas, Gula

berkarbon lima (Pentosa), Basa organik heterosiklik (Purin dan Pirimidin), dan Gugus

fosfat bermuatan negatif yang terikat dalam ikatan fosfodiester. RNA dan DNA

mempunyai struktur primer yang mirip. Keduanya terdiri atas suatu rantai lurus dari

nukleotida purin dan pirimidin yang terikat satu sama lain dengan ikatan fosfodiester

dari posisi 3 ke posisi 5. Pada keduanya ditemukan adenin, guanin dan sitosin.

Dalam RNA, urasil menggantikan timin. Gula yang terdapat pada RNA adalah

Ribosa. Molekul RNA berupa single-stranded.

Ekspresi genetik merupakan proses penerjemahan informasi genetik (dalam

bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Ada tiga proses

dasar yang tercakup dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNAmenjadi RNA, dan Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi

gen merupakan aspek fundamental dalam setiap organisme hidup.


5/79

v

Teknologi DNA rekombinaan merupakan kumpulan teknik atau metode yang

digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Tahapan

dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah Isolasi molekul

DNA, pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi, penyambungan

molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul

DNA vektor, transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel inang,

analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinaan dalam sel inang, dan

karakterisasi fungsional gen yang diklon.

Dalam rekombinasi DNA maka dibutuhkan berbagai enzim untuk memotong

dan menyambung DNA. Enzim endonuklease restriksi atau enzim restriksi

merupakan enzim yang diproduksi oleh mikroba yang dapat memotong DNA utas

ganda, sedangkan enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk

menyambung potongan-potongan fragmen DNA. Transfer DNA ke dalam bakteri

dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu, konjugasi, tarnsformasi, dan transduksi.

DNA yang masuk ke dalam sel bakteri kemudian dapat berintegrasi dengan DNA

atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinaan. Amplifikasi

(perbanyakan) sekuens DNA dapat dilakukan dengan metode PCR (Polymerase chain

reaction). Amplifikasi DNA ini dilakukan dengan menggunakan enzim DNA

polimerase, dNTP (dinukleotida triphosphat) oligonukleotida primer, dan DNA

template (DNA cetakan).

Transfer gen dapat dilakukan baik dengan teknik transformasi protoplas

maupun transformasi sel atau jaringan tanaman. Terdapat berbagai metode transfer

gen diantaranya yaitu: Penggunaan A. tumefaciens, biolistik gun, elektroporasi, dan

oenggunaan senyawa kimia. Analisis DNA rekombinaan di dalam sel yang

tertransformasi dapat dilakukan dengan:Analisis restriksi DNA, hibridisasi dengan

pelacak DNA, analisis ekspresi gen asing yang diklon, amplifikasi DNA denganPCR, dan penentuan urutan nukleotida.


6/79

vi

PETA KEDUDUKAN MODUL

Pendahuluan, definisi, sejarah, klasifikasi danruang lingkup bioteknologi

Struktur dan komponen biomolekuler sel, strukturdan organisasi bahan genetik: kromosom, DNA,RNA, Plasmid, Genom

Perubahan konstitusi genetik, replikasi DNA danEkspresi Genetik

Metode transfer gen

Uji Kompetensi dan Remedial

Teknik kultur in vitro, mutasi, rekombinasi, transposisi,metabolit sekunder

- Hibridisasi somatik (Bila waktu tidak

mencukupi maka dibahas padamatakuliah pembiakan in vitro)

Aplikasi Konsep Teknologi DNARekombinan pada TransfergenetikTanaman


7/79

vii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN .................................................................. ii

KATA PENGANTAR ............................................................................. iii

RINGKASAN .......................................................................................... iv

PETA KEDUDUKAN MODUL ............................................................. vi

DAFTAR ISI ............................................................................................ vii

MODUL I.................................................................................................. 1

MODUL II ................................................................................................ 6

MODUL III ............................................................................................... 23

MODUL IV............................................................................................... 48

MODUL V ................................................................................................ 63

LAMPIRAN : RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS SCL

Mata Kuliah : Bioteknologi Tanaman


8/79

viii

LAMPIRAN

RANCANGAN PEMBELAJARAN MATA KULIAH

RANCANGAN PEMBELAJARAN BERBASIS KBK

MATA KULIAH : BIOTEKNOLOGI TANAMAN (206 G113)

Kompetensi Utama : Mengerti dan memahami sains dasar genetika DNA danbioteknologi (Nomor 1) serta menjelaskan danmerekayasa teknik-teknik yang ada dalam bioteknologitanaman, ekstraksi dan isolasi DNA dan menguraikanlangkah-langkah teknik PCR, transformasi genetiktanaman serta Pro dan Kontra. (Nomor 4)

Kompensi Pendukung : Kemampuan dalam penguasaan bahasa Inggris (Nomor6); Kemampuan dalam penguasaan software dan internet(Nomor 7); Kemampuan bekerjasama, baik sebagaipimpinan maupun sebagai anggota dalam tim kerja(Nomor 8); serta Kemampuan mengevaluasipermasalahan lingkungan dari sudut pandangbioteknologi (Nomor 11).

Kompetensi lainnya : Kemampuan mengembangkan diri berdasarkanpengetahuan dan pengalaman yang diperoleh selama

menempuh studi

Minggu

ke:Materi Pembelajaran

Bentuk

Pembelajaran

(Metode SCL)

Kompetensi Akhir Se

Pembelajaran

1-2 Pendahuluan, sejarah singkatdan pengertian dasar

1.Penjelasan KontrakPembelajaran

2.Kuliah & Diskusi3.Kajian Pustaka

Mengetahui pengertian,perkembangan dan peranBioteknologi dalam pertaniaMenyusun poster tentang Prpembuatan pupuk atau pestialami serta mekanisme reak

3-5 Struktur dan komponenbiomolekuler sel, strukturdan organisasi bahan

Kuliah & TugasKajian Pustaka +Kerja Kelompok +

Menyusun poster yangmenjelaskan keanekaragamamolekul dalam sel melalui p


9/79

ix

genetik: kromosom, DNA,RNA, Plasmid, Genom

Presentasi(CollaborativeLearning)

pengenalan biomolekuler sestruktur, sifat kimia dan perDNA/RNA sebagai bahan gpada organisme Eukariotik d

Prokariotik

6 - 8 Perubahan konstitusi genetik,replikasi DNA dan EkspresiGenetik

Kuliah + Kerjakelompok & Tutorial

Menyusun portfolio tentangKonstitusi genetik tanaman

melalui pemahaman terhaddogma genetik, kode genetekspresi genetik

Dogma genetik dan kode gEkspresi genetik, Mutasi,

mutagenesis, RekombinasiTransposisi, Replikasi,

Transkripsi dan Translasi DSomaklonal vs GametokloInteraksi genetik tanaman

lingkungan

9-10 Teknik kultur in vitro,mutasi, rekombinasi,transposisi, metabolitsekunder, Hibridisasisomatik

Kuliah & Diskusi +Tugas KajianPustaka (CooperativeLearning)

Menemukan paling sedikit 1contoh aplikasi pada setiap pbahasan yang menjelaskan tteknik Bioteknologi Tanamarekayasa genetika untuktransformasi genetika tanam

prospek pengembangan tanamelalui bioteknologi

11 - 15 Konsep Teknologi DNARekombinan danAplikasinya pada Transfergenetik Tanaman

Kuliah & Diskusi +Kerja kelompok;Presentasi(CollaborativeLearning) danProject BasedLearning untukPraktikum.

Menyusun presentasi oral daposter yang memuat langkahlangkah proses:Identifikasi dan isolasi DN

hingga kloning gen. AmpliDNA dengan PCR, Pemotdan Penyambungan DNA dengan mekanisme kerja e

enzim nuklease dan endonrestriksi; Vektor dalam klogen pada tanaman; PemindDNA ke vektor (plasmid/bakteriophage/hibrid);Transformasi ke sel inang Analisis DNA rekombinan


10/79


11/79


12/79

xii

BAB II. PEMBAHASAN

A. Definisi

Bioteknologi secara sempit didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip

dasar biologi, biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai

tambah dari suatu organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan

agensia biologis. Sedangkan dalam arti luas bioteknologi dapat didefinisikan sebagai

teknologi untuk mendayagunakan organisme hidup atau bagian dari organisme untuk

menghasilkan atau memodifikasi produk-produk tertentu, serta untuk perbaikan dan

pemuliaan mikroorganisme, tanaman, atau hewan.

B. Klasifikasi, dan ruang lingkup Bioteknologi.

Bioteknologi dapat diklasifikasikan menjadi bioteknologi konvensional dan

bioteknologi modern. Bioteknologi modern ditandai dengan penggunaan teknik

biologi molekuler sehingga rekayasa yang dilakukan dapat jauh lebih terarah

sehingga hasil yang diperoleh dapat lebih atau sepenuhnya dikendalikan. Dalam

biologi konvensional, agensia biologis yang digunakan masih apa adanya sehingga

hasil yang diperoleh belum sepenuhnya dapat dikemdalikan.

Bioteknologi sebagai ilmu multidisiplin dalam kajian dan penerapannya

memiliki ruang lingkup yang luas. Banyak bidang ilmu yang terkait, di antaranya

adalah :

1. Biologi (Mikrobiologi dan Biologi Sel Molekuler)

2. Biokimia (Kimia)

3. Genetika (Genetika Molekuler)

4. Rekayasa Genetik

5. Rekayasa Bioproses6. Teknologi Enzim

7. Teknologi Pangan dan Fermentasi

8. Teknik Komputerisasi ( Teknik Bioinformatika)


13/79

xiii

C. Sejarah Perkembangan Bioteknologi

Bioteknologi secara umum telah dikenal sejak ribuan tahun yang lalu.

Penggunaan mikrobia untuk fermentasi dalam pembuatan minuman beralkohol

misalnya telah dilakukan sejak 30 abad sebelum masehi. Namun Sejarah

Bioteknologi modern dimulai ketika ditemukan kembali kemampuan bakteri

Streptococcus pneumoniae yang telah kehilangan virulensinya yaitu dengan

mencampurkannya dengan bakteri yang virulen, Avery dkk (1944) telah

membuktikan bahwa pada tingkat organogenesis yang paling rendah pun terjadi

transaksi genetik (Brown 1991).

Selanjutnya diketahui konstruksi plasmid, penyisipan gen antar organisme

yang menghasilkan DNA rekombinan. adanya bakteri tanah Agrobacterium

tumafaciens yang dapat mentransfer gen secara alami dan akhirnya didapat

mekanisme transfer gen antar tanaman maka muncullah tanaman transgenik (Maniatis

dkk, 1982) Tanaman transgenik, yaitu tanaman yang sudah disusupi oleh DNA asing

sebagai pembawa sifat yang diinginkan.

D.Aplikasi Penerapan Bioteknologi dalam Bidang Pertanian

Bioteknologi telah diterapkan secara luas dalam bidang pertanian, antara lain

yaitu:

a. Pupuk Hayati (biofertiliser) yaitu suatu bahan yang berasal dari jasad hidup,khususnya mikrobia yang digunakan untuk meningkatkan kuantitas dan

kualitas produksi tanaman.

b. Kultur in vitro, yaitu pembiakan tanaman dengan menggunakan bagiantanaman yang ditumbuhkan pada media bernutrisi dalam kondisi aseptik.

Kultur in vitro memungkinkan perbanyakan tanaman secara massal dalam

waktu yang singkat.c. Teknologi DNA Rekombinaan, pengembangan tanaman transgenik, misalnya

galur tanaman transgenik yang membawa gen cry dari Bacillus thuringiensis

untuk pengendalian hama.


14/79

xiv

Kelebihan dan kekurangan bioteknologi modern

Kelebihan dan kekurangn Bioteknologi modern antara lain:

- perbaikan sifat genetik dapat dilakukan secara sangat terarah- dapat mengatasi kendala ketidaksesuaian genetik- dapat memeperpendek jangka waktu pengembangan galur tanaman baru- relatif mahal dan memerlukan kecanggihan teknologi- pengaruh jangka panjang belum diketahui

E. Latihan dan Tugas

Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai definisi, sejarah, ,

klasifikasi, ruang lingkup, aplikasi, dan kelebihan maupun kekurangan Bioteknologi

maka anda perlu mengerjakan tugas di bawah ini:

1. Buatlah definisi mengenai Bioteknologi dengan menggunakan kata-kata andasendiri!

2. Jelaskan dengan contoh bagaimana kemajuan berbagai disiplin ilmu lain dapatmenunjang kemajuan di bidang Bioteknologi!

3. Jelaskan keuntungan dan kelemahan penerapan Bioteknologi Modern!4.

Susunlah poster tentang proses pembuatan pupuk atau pestisida alami sertamekanisme reaksinya.

F. Indikator Penilaian

Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh,

kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada poster dari

model yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP

Rangkuman

Bioteknologi didefinisikan sebagai penerapan prinsip-prinsip dasar biologi,

biokimia, serta rekayasa untuk mengubah dan mendapatkan nilai tambah dari suatu

organisme atau bagian dari organisme melalui pemanfaatan agensia biologis.


15/79

xv

Bioteknologi diklasifikasikan menjadi bioteknologi konvensional dan bioteknologi

modern. Bioteknologi konvensional telag dimulai berabad-abad yang lalu, namun

bioteknologi modern sendiri ditandai dengan penemuan Avery (1944) yang

menemukan terjadinya transaksi genetic pada tingkat oeganogenesis yang paling

rendah. Contoh aplikasi bioteknologi pertanian yaitu penggunaan biofertiliser, kultur

in vitro, dan tanaman transgenik.

DAFTAR PUSTAKA

1. George, E.F. dan P.D. Sherrington, 1984. Plant Propagation by Tissue Culture.Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Einstein Press, UK

2. Hari Hartiko, 1995. DNA Rekombinan. PAU Bioteknologi, Universitas GadjahMada. Yogayakarta3. Mantell, S.H., J.A. Mattheus dan R.A. McKee, 1985. Principles of Plant

Biotechnology. Blackwell Scientific Publication. Oxford, London4. Nasir, 2001. Bioteknologi Pertanian. PT. Grafindo Jakarta.5. Prentio, S., 1984. Biotechnology, A New Revolution. Gurge Brazller Inc. New

York.6. Soemartono, Nasrullah dan Hari Hartiko, 1992. Genetika Kuantitatif dan

Bioteknologi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.7. Wattimena, G.A1992. Bioteknologi Tanaman. Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan, Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. PAU Bioteknologi, IPB.

Bogor8. Yusuf, M., 1998. Genetika Molekular. Program Studi Bioteknologi, IPB. Bogor9. Yuwono TriWibowo, 2006. Bioteknologi Pertanian. Seri Pertanian. Gadjah

Mada University Press.


16/79

xvi

MODUL II

STRUKTUR DAN KOMPONEN BIOMOLEKULER

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar BelakangBioteknologi modern ditandai dengan manipulasi atau rekayasa jasad hidup pada

aras molekuler. Inti sel dengan DNA yang dikandungnya menjadi objek rekayasa

yang substansial. Pemahaman mengenai sel sebagai unit terkecil penyusun makhluk

hidup yang masih dapat berdiri sendiri serta komponen-komponennya merupakan

dasar penting bagi bioteknologi.

B. Ruang Lingkup Isi

Modul ini membahas mengenai pengertian dan komponen penyusun sel,

struktur DNA dan RNA, perbedaan antara DNA prokariotik dengan eukariotik serta

definisi DNA supercoil, topoisomerase, nukleosom, histon, eukromatin dan heterokromatin,

serta pengenalan secara garis besar DNA Virus dan RNA Virus.

C. Kaitan Modul

Modul ini merupakan modul pertama yang memberikan pemahaman bagi

mahasiswa mengenai sel, dan komponen penyusunnya, serta DNA dan RNA

organisme prokariotik dan eukariotik .

D. Sasaran Pembelajaran Modul

Mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan mengenai pengertian dan

komponen penyusun sel, struktur DNA dan RNA, mengetahui perbedaan antara DNAprokariotik dengan eukariotik serta definisi DNA supercoil, topoisomerase, nukleosom,

histon, eukromatin dan heterokromatin, serta mengenal secara garis besar DNA Virus dan

RNA Virus.


17/79

xvii

BAB II. PEMBAHASAN

A. SELPengertian Sel

Sel merupakan bahan dasar penyusun utama makhluk hidup. Sel membentuk

rangka atau struktur tubuh makhluk hidup, mengambil nutrisi dari makanan

kemudian mengkonversi nutrisi tersebut menjadi energi dan melaksanak spesifikasi

fungsi. Sel juga mengandung materi informasi genetik serta dapat menggandakan

diri. Yang membedakan antara sel prokariotik dengan sel eukariotik adalah pada sel

prokaritotik tidak memiliki membran nukleus dan sistem endomembran (organel-

organel bermembran).

Sel terdiri atas beberapa bagian, beberapa bagian ini disebut organel yang

mempunyai fungsi tertentu di dalam sel.

gambar 1. Sel tumbuhan

Fungsi berbagai komponen struktur sel

1. Dinding selDinding sel pada sel muda terbuat dari zat pektin sedang pada sel dewasa

terbentuk dari bahan selulosa. Dinding sel pada tumbuhan berfungsi untuk

memberi bentuk pada sel tumbuhan.


18/79


19/79


20/79


21/79

xxi

Gambar 2. Rumus bangun dari sepotong untaian DNA

Struktur Sekunder DNA

Bentuk B

DNA mempunyai struktur sekunder yang memanjang. Bila susunan basanyadiperiksa, konsentrasi adenin akan selalu sama dengan konsentrasi timin ; sedangkan

konsentrasi guanin akan selalu sama dengan konsentrasi sitosin. Jadi jumlah

keseluruhan Purin (A+G) sama dengan jumlah keseluruhan Pirimidin (C+T), ratio

Purin : Pirimidin = 1. Dengan menggunakan keterangan tentang kandungan dasar ini,

disertai data hasil penelitian dengan menggunakan difraksi sinar-X, Watson and

Crick mengajukan suatu model struktur sekunder DNA yang dilukiskan sebagai

berikut ;

Gambar 3. DNA dalam bentuk B Watson-Crick


22/79

xxii

Struktur tersebut dinamakan bentuk B dari DNA. Dalam bentuk ini, dua

untaian lurus DNA saling membelit bersama-sama, membentuk suatu heliks berganda

berputar ke kanan. Kedua untaian DNA tadi berjalan dalam arah yang berlawanan.

Struktur seperti ini disebut sebagai anti paralel. Ada perulangan jarak sebesar 34

dengan 10 pasang basa untuk tiap putaran heliks. Ikatan hidrogen merupakan salah

satu kekuatan utama yang mempertahankan bentuk Heliks DNA. Residu adenin

membentuk dua ikatan hidrogen dengan timin. Guanin membentuk tiga ikatan

hidrogen dengan sitosin. Bentuk B dari DNA juga mempunyai dua alur, yaitu alur

besar dan kecil. Protein-protein yang berhubungan dengan fungsi DNA yang khas ,

misalnya replikasi atau reparasi, dapat berada dalam alur-alur ini.

Bentuk A

Bentuk B adalah bentuk utama dari DNA di dalam sel. Bentuk A

terjadi bila bentuk B mengalami dehidrasi. Bentuk ini lebih padat, tiap

putaran terdiri atas 11 residu basa. Pada bentuk A ini, basa berada dalam

kedudukan 13o sampai 19o dari possisi tegak lurus. Selain itu alur yang

terbentuk pun berubah, Alur kecil menjadi sangat dangkal, sedangkan alur

besar menjadi sangat dalam. Perubahan ini mengakibatkan interaksi khas

antara protein dengan DNA menjadi tidak mungkin.

Bentuk ZBentuk DNA yang secara nisbi masih baru ialah bentuk Z (dari zig-

zag). Bentuk Z merupakan heliks berputar ke kiri. Dan tiap putaran terdiri

atas 12 residu basa. Pada mulanya bentuk ini ditemukan pada suatu polimer

sintetik yang tersusun dari perulangan residu G dan C. Kemudian ternyata

bahwa bentuk Z juga ditemukan pada sejumlah spesies. Bentuk Z ini

dimantapkan oleh metilasi basa-basa yang ada di daalm DNA tersebut, suatu

peristia yang terjadi pada gen inaktif.


23/79

xxiii

Gambar 4. Bentuk A dan Z dari suatu DNA

Denaturasi

Berbagai Keadaan yang menyebabkan denaturasiStruktur Primer tidaklah berubah pada denaturasi. Struktur sekunder

dari DNA akan mantap bila ikatan hidrogen tidak tergangu. Bila ikatan ikatan

ini terganggu maka kedua untaian DNA akan terpisah. Adapun keadaan yang

dapat menyebabkan terjadinya hal terebut adalah Kenaikan suhu, pH yang

berbeda dari pH alamiah, dan adanya senyawa-senyawa yang dapat

memutuskan ikatan hidrogen antar untaian tadi, atau yang dapat menyisipkan

dirinya diantara basa.Struktur DNA akan mantap pada rentangan pH 4-10, diluar dari itu

dapat terjadi protonisasi atau ionisasi atom-atom nitrogen atau atom oksigen

yang membentuk ikatan hidrogen sehingga menyebabkan denaturasi. Selain

itu senyawa-senyawa semisal urea dan formida dapat pula mengganggu ikatan

hidrogen sedangkan senyawa dengan cincin aromatik yang datar dan

besar,semisal senyawa etidium bromida dan berbagai zat warna golongan

akridin, dapat menyisipkan dirinya antara dua basa DNA sehingga

menimbulkan denaturasi.


24/79


25/79

xxv

C. PERBEDAAN ANTARA KROMOSOM PROARIOTIK DAN EUKARIOTIKKromosom Prokariotik

Kromosom prokariotik, atau nukleoid, adalah suatu bentuk B dari DNA

yang merupakan molekul dengan lingkaran tertutup (sirkular). Hampir semua spesiesbakteri mempunyai kromosom berbentuk sirkular. Bentuk sirkular memberikan

perlindungan bagi DNA dari aksi-aksi enzim endonuklease (yang memotong ujung-

ujung DNA). Struktur tersier dari DNA prokariotik akan terbentuk apabila DNA

terpuntir sebelum lingkaran itu tertutup. Gelung tambahan yang terbentuk dinamakan

supercoiling.

Gambar 5. Proses terbentuknya struktur supercoil

Supercoil adalah bentuk penggulungan DNA. Bentuk supercoil ditemukan

pada tahun 1963 oleh Jerome Vinegrad dengan mengisolasi virus Polyoma. Dimana

Bentuk supercoil merupakan isomer topologi dari bentuk relaks. Enzim yang

berperan dalam pembentukannya adalah enzim topoisomerase yang bekerja

mengatur perubahan topologi DNA dengan cara meningkatkan atau menurunkan

jumlah pilinan pada heliks ganda. Enzim ini, dengan bantuan energi yang diperoleh

dari hidrolisis ATP akan memecah ikatan fosfodiester yang membentuk tulang

punggung kedua DNA, menyisipkan suatu gelungan, dan kembali menyegel tulang

punggung tadi. Perbedaan bentuk molekul ini dapat dengan jelas terlihat dengan

menggunakan teknik elektroforesis.Kromosom Eukariotik

DNA inti sel eukariotik mempunyai struktur kromosom yang lebih rumit lagi.

Semua kromosom inti eukariot berbentuk linier. Bila dilihat dengan mikroskop

elektron, kromosom inti sel eukariotik yang diekastraksi dengan larutan garam


26/79


27/79

xxvii

mencolok serta perubahan densitas pengapungan dalam keadaan terdenaturasi. Oleh

karena RNA hanyalah suatu salinan belaka dari seuntai DNA, maka jumlah A dari

suatu RNA tidaklah sama dengan U, begitu pula jumlah G tidaklah sama dengan C.

Gambar 6. Rumus bangun dari sepotong untaian RNA

Tiga tipe RNA Utama Dalam Sel

Genetika molekular klasik mengajarkan adanya tiga tipe RNA yang terlibat

dalam proses sintesis protein:

1. RNA-kurir (messenger-RNA, mRNA),

2. RNA-ribosom(ribosomal-RNA, rRNA),

3. RNA-transfer (transfer-RNA, tRNA).

Pada akhir abad ke-20 dan awal abad ke-21 diketahui bahwa RNA hadir dalam

berbagai macam bentuk dan terlibat dalam proses pascatranslasi. Dalam pengaturan

ekspresi genetik orang sekarang mengenal RNA-mikro (miRNA) yang terlibat dalam

"peredaman gen" atau gene silencing dan small-interfering RNA (siRNA) yang

terlibat dalam proses pertahanan terhadap serangan virus. Messenger RNA

mRNA adalah RNA yang paling beragam diantara berbagai RNA utama.

mRNA merupakan RNA terpanjang. Selain, itu mRNA mempunyai konsentrasi yang

paling rendah dan yang paling tidak stabil. Biasanya mRNA mengandung 5% dari


28/79

xxviii

seluruh RNA yang terdapat di dalam sitoplasma sel eukariotik. Pada prokariot, suatu

mRNA tunggal dapat mengandung informasi untuk beberapa protein yang berbeda.

mRNA serupa itu disebut sebagai pesan polisistronik. Pada eukariot, tiap mRNA

matang menyandikan satu, dan hanya satu itu saja polipeptida dan karena itu pula

dikatakan bersifat monosistronik.

Ribosomal-RNASel mengandung rRNA lebih dari yang lain. rRNA adalah bentuk RNA yang

paling mantap. Ia membentuk kompleks dengan protein dan disebut ribosom. rRNA

berupa pita tunggal, tidak bercabang dan fleksibel. rRNA berfungsi sebagai mesin

perakit dalam sintesis protein.

Transfer-RNA

Kira-kira 15% RNA sitoplasma dari suatu sel eukariotik adalah tRNA. tRNA

merupaka RNA terkecil, hanya mengandung 75-100 nukleotida. Paling sedikit ada 20

macam tRNA yang berbeda di dalam semua sel, yang masing-masing berpautan

dengan satu asam amino yang secara alamiah ditemukan di dalam molekul protein.

Mekipun beraneka ragam, semua tRNA ini mempunyai ciri umum yang sama yaitu

mempunyai daerah yang menjadi akseptor asam amino. Daerah-daerah yang

bervariasi perlu untuk mengikat berbagai macam asam amino yang berbeda. Selain

itu juga untuk mengenali kodon yang tepat pada mRNA.

E. DNA dan RNA VIRUSBerlawanan dengan sel-sel eukariotik normal, virus hanya mengandung asam

nukleat dan sejumlah kecil enzim essential, yang dikelilingi oleh suatu mantel yang

terutama tersusun dari protein. Bahan genetik dari virus dapat berupa DNA dan RNA,

dalam bentuk untaian tunggal atau ganda, melingkar ataupun lurus. Masing-maing

bentuk ini memerlukan suatu cara penggandaan dan penyalinan sedikit berbeda.Meskipun begitu, untuk penerjemahan dan pengubahan protein yang telah dibentuk

menjadi bentuk lain yang berfungsi, virus sama sekali tergantung kepada enzim yang

tersedia dalam sel yang diinfeksinya.


29/79


30/79


31/79


32/79


33/79


34/79

xxxiv


Mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan konstitusi genetik tanaman

melalui pemahaman terhadap dogma genetik, kode genetik dan ekspresi genetik.

BAB II. PEMBAHASAN

A. Pengertian Eskpresi Genetik


bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Proses ekspresi

genetik mengikuti tahapan yang sama untuk semua bentuk kehidupan, dan disebut

dogma inti (central dogma) dalam genetika. Ada tiga proses dasar yang tercakup

dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNA menjadi RNA, dan

Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi gen merupakan

aspek fundamental dalam setiap organisme hidup. Proses ini diduga dikontrol oleh

suatu mekanisme yang ada pada aliran informasi genetik. Pada awalnya para ilmuwan

menduga bahwa protein merupakan satu-satunya molekul yang berperan dalam

meregulasi ekspresi gen pada manusia dan organisme kompleks lainnya (eukariot),

seperti halnya pada organisme tingkat rendah atau mikroorganisme (prokariot).

Gambar 1. Proses penerjemahan informasi genetik menjadi asam amino


35/79

xxxv

F. MODEL REPLIKASI DNAModel Konservatif

Sebelum mekanisme replikasi DNA dapat dibuktikan secara eksperimental

oleh Matthew Messelson dan Franklin Stahl pada tahun 1958, ada tiga hipotesis yang

berkembang mengenai mekanisme replikasi DNA. Salah satunya adalah model

replikasi secara konservatif. Menurut model konservatif, molekul DNA untai ganda

induk akan tetap bergabung sedangkan kedua untaian DNA anakan terdiri atas

molekul hasil sintesis baru. Dengan kata lain, molekul awal tetap terpelihara dan

molekul baru semua disusun dari bahan baru.

Model Dispersif

Pada model replikasi DNA secara dispersif dinyatakan bahwa molekul DNA

induk akan mengalami fragmentasi sehingga DNA anakan akan terdiri atas campuran

molekul lama (berasal dari DNA induk dan molekul hasil sintesis baru.

Model Semi konservatif

Pada model replikasi DNA secara semi konservatif, Watson dan Crick dalam

hipotesisnya mengemukakan bahwa setiap molekul untai ganda DNA anakan terdiri

atas satu untai tunggal DNA induk dan satu untai tunggal lainnya merupakan untai

tunggal DNA hasil sintesis baru. Dengan kata lain, bahwa dalam pembentukan DNA

baru, yang disintesis tidak kedua utas tetapi hanya satu, sedang utas yang lainnya

berasal dari molekul DNA terdahulu.

Replikasi DNA mengikuti pola semi konservatif terbukti secara empiris pada

tahun 1958 oleh eksperimen yang dilakukan oleh Matthew Messelson dan Franklin

Stahl dengan menggunakan bakteri Escherichia coli untuk mengetahui mekanisme

replikasi DNA. Hasil Eksperimen tersebut membuktikan bahwa replikasi DNA

mengikuti pola semi konservatif. Meskipun demikian, bukti-bukti baru menunjukkanadanya penyimpangan dari teori replikasi semacam ini. Diketahui bahwamekanisme

replikasi DNA pada virus tertentu, misalnya virus x 174, yang genomnya berupa

DNA untai tunggal, melibatkan tahapan proses repliasi DNA dengan mekanisme

yang berbeda yaitu model konservatif.


36/79

xxxvi

Gambar 2. Tiga Hipotesis mengenai replikasi DNA

G. TIGA PROSES DASAR DALAM CENTRAL DOGMA PADA EKSPRESIGENETIK

Materi genetik, DNA selalu dalam keadaan aktif. Aktivitas ini berhubungan

dengan ekspresi gen dan juga aktivitas tambahan seperti replikasi, perbaikan dan

rekombinasi. Ekspresi gen berkaitan dengan proses transkripsi dan translasi untuk

mensintesis protein. Sedangkan proses replikasi, perbaikan dan rekombinasi berkaitandengan perbanyakan terarah terhadap DNA yang ada pada makhluk hidup.

Proses penyimpanan dan pemindahan informasi genetik dinyatakan dalam dalil

disebut dogma sentral oleh Francis Crick dan George Gamov pada tahun 1957.

Prinsip dogma sentral adalah DNA menjadi penentu jenis RNA, kemudian jenis RNA

menentukan macam protein yang disintesis.


37/79

xxxvii

Dogma ini berlaku universal dan menyatakan bahwa sekali informasi telah

diteruskan menjadi protein, maka tidak dapat dikembalikan lagi menjadi bentuk

asalnya. Aliran informasi dari asam nukleat ke asam nukleat memang

memungkinkan, tetapi aliran informasi dari protein ke asam nukleat atau protein ke

protein tidak memungkinkan. Dimana tahap-tahap yang terjadi pada ekspresi genetik

dan faktor-faktor yang terlibat dapat digambarkan seperti berikut;

Gambar 3. Proses aliran informasi genetik menjadi protein beserta tahap-tahap dan

faktor-faktor yang terlibat

Replikasi DNA

Salah satu tahapan penting dalam proses pertumbuhan jasad hidup adalah

proses perbanyakan bahan genetik. Proses perbanyakan bahan genetik dikenal

sebagai proses replikasi. Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan

urutan nukleotida pada DNA yang digandakan. Replikasi merupakan proses

pelipatgandaan DNA. Replikasi DNA adalah proses penggandaan molekul DNA

untai ganda. Pada sel, replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel. Prokariota

terus-menerus melakukan replikasi DNA. Pada eukariota, waktu terjadinya replikasi

DNA sangatlah diatur, yaitu pada fase S daur sel, sebelum mitosis atau meiosis I.

Penggandaan tersebut memanfaatkan enzim DNA polimerase yang membantu

pembentukan ikatan antara nukleotida-nukleotida penyusun polimer DNA. Proses

replikasi DNA dapat pula dilakukan in vitro dalam proses yang disebut reaksi

berantai polimerase (PCR).


38/79

xxxviii

Tahapan-tahapan dalam proses replikasi

Inisiasi, DNA dalam sel-sel eukaryotik memiliki ARCs (autonomouslyreplicating sequence) yang berperan sebagai asal muasal replikasi dan mereka

saling berlawanan dari asal bakterial (ori). ARCs terdiri atas 11 pasangan

landasan rentetan tambah dua atau tiga rentetan nucleotida pendek tambahan

dengan 100 hingga 200 pasangan landasan sepanjang area DNA. Grup utama

dari enam protein, secara kolektif dikenal dikenal sebagai ORC (Origin

Recognition Complex), mengikat asal muasal replikasi, menandai replikasi

DNA dengan tepat pada saat waktu yang sesuai melalui siklus sel.Pengenalan

situs awal replikasi, oleh suatu protein komponen polymerase DnaA yang

dihasilkan oleg gen dnaA.

Terbentuknya Garpu replikasi. Garpu replikasi atau cabang replikasi(replication fork) ialah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi. Garpu

replikasi ini dibentuk akibat enzim helikase yang memutus ikatan-ikatan

hidrogen yang menyatukan kedua untaian DNA, membuat terbukanya untaian

ganda tersebut menjadi dua cabang yang masing-masing terdiri dari sebuah

untaian tunggal DNA. Masing-masing cabang tersebut menjadi "cetakan" untuk

pembentukan dua untaian DNA baru berdasarkan urutan nukleotidakomplementernya. DNA polimerase membentuk untaian DNA baru dengan

memperpanjang oligonukleotida (RNA) yang dibentuk oleh enzim primase dan

disebut primer.

Pemanjangan Untaian DNA. DNA polimerase membentuk untaian DNA barudengan menambahkan nukleotidadalam hal ini, deoksiribonukleotidake

ujung 3'-hidroksil bebas nukleotida rantai DNA yang sedang tumbuh. Dengan

kata lain, rantai DNA baru (DNA "anak") disintesis dari arah 5'3', sedangkanDNA polimerase bergerak pada DNA "induk" dengan arah 3'5'. Namun

demikian, salah satu untaian DNA induk pada garpu replikasi berorientasi


39/79

xxxix

3'5', sementara untaian lainnya berorientasi 5'3', dan helikase bergerak

membuka untaian rangkap DNA dengan arah 5'3'. Oleh karena itu, replikasi

harus berlangsung pada kedua arah berlawanan tersebut

Pembentukan Leading strand. Pada replikasi DNA, untaian pengawal(leading strand) ialah untaian DNA yang disintesis dengan arah 5'3' secara

berkesinambungan. Pada untaian ini, DNA polimerase mampu membentuk

DNA menggunakan ujung 3'-OH bebas dari sebuah primer RNA dan sintesis

DNA berlangsung secara berkesinambungan, searah dengan arah pergerakan

garpu replikasi.

Pembentukan Lagging strand. Lagging strand ialah untaian DNA yangterletak pada sisi yang berseberangan dengan leading strand pada garpu

replikasi. Untaian ini disintesis dalam segmen-segmen yang disebut fragmen

Okazaki. Panjang fragmen okazaki mencapai sekitar 2.000 nukleotides panjang

dalam sel-sel bakterial dan sekitar 200 panjang nukelotides dalam sel-sel

eukaryotic. Pada untaian ini, primase membentuk primer RNA. DNA

polimerase dengan demikian dapat menggunakan gugus OH 3' bebas pada

primer RNA tersebut untuk mensintesis DNA dengan arah 5'3'. Fragmen

primer RNA tersebut lalu disingkirkan (misalnya dengan RNase H dan DNA

Polimerase I) dan deoksiribonukleotida baru ditambahkan untuk mengisi celah

yang tadinya ditempati oleh RNA. DNA ligase lalu menyambungkan fragmen-

fragmen Okazaki tersebut sehingga sintesis lagging strand menjadi lengkap.

DNA polymerases tidak mampu mengisi ikatan covalent yang hilang. Celah

yang tersisa direkat oleh DNA ligase. Enzim ini mengkatalis pembentukan

ikatan phosphodiester antara 3 OH dari salah satu helaian dari 5-P dari

halaian yang lain.DNA ligase diaktifkan oleh AMP (adenosine monophosphate)sebagai cofactor (faktor pengendali). Dalam E.coli, AMP dibawa dari

nucleotide NAD+. Dalam sel-sel eukaryotik, AMP ditandai dari ATP. Ligase-

ligase tidak dilibatkan dalam pemanjangan rantai; melainkan, mereka berperan

pemasang enzim-enzim untuk perekatan celah melalui molekul DNA.


40/79

xl

Modifikasi Post-Replikasi DNA, Setelah DNA direplikasikan, dua helaiantersintesis terbaru dipasangkan ke modifikasi enzimatik. Perubahan-perubahan

ini biasanya melibatkan penambahan molekul-molekul tertentu untuk

mekhususkan titik-titk sepanjang helix ganda. Pada cara ini, tags sel, atau label-

label, DNA, sehingga ini bisa membedakan material genetiknya sendiri dari

berbagai DNA asing yang mungkin bisa masuk ke dalam sel. Modifikasi post-

replikasi DNA mungkin juga mempengaruhi cara molekul diikat.DNA

merupakan faktor utama modifikasi dengan penambahan kelompok methyl ke

beberapa adenine dan residu-residu cytosine. Grup methyl ditambahkan oleh

DNA methylasess setelah nucleotides telah digabungkan dengan DNA

polymerases. Penambahan methyl ke cytosine membentuk 5-methylcytosinedan methylasi dari adenine membentuk 6-methyladine. Methyladine lebih

umum daripada methylcytosine dalam sel-sel bakterial, di mana dalam sel-sel

eukaryotik, grup methyl paling banyak ditambahkan ke cytosine. Methylase

muncul hanya pada beberapa rentetan nucleotide khusus. Dalam sel-sel

eukaryotik, sebagai contoh, methylasi secara umum muncul pada saat cytosine

berdampingan ke guanine di sisi 3-OH (5 P-CG-3OH).Pola methylasi bersifat

spesifik untuk spesies yang diberikan, berperan seperti tanda tangan untuk DNA

spesies tersebut. Hal ini patut diperhatikan karena grup methy melindungi DNA

melawan perlawanan enzim-emzim tertentu disebut restriction endonucleases

Oleh karena itu DNA asing melalui sebuah sel dicerna dengan restriction

endonucleases. Dalam sel tertentu, restriction endonucleases bisa memotong

DNA di titik khusus tertentu di mana DNA methylase menambah sebuah grup

methyl. Pola methylasi melindungi DNA dari cernaan oleh sel yang memiliki

endonucleases tapi tidak melawan pembatasan enzim-enzim yang diproduksi

sel-sel spesies yang lain. Pembatasan ini menyederhanakan pertukaran DNAantar sel dari spesies yang diproduksi sel-sel spesies yang berbeda. Methylasi

DNA pada titik-titik tertentu mungkin akan berakhir pada konversi terdekat dari

B-DNA ke bentuk-bentuk Z-DNA. Dalam bentuk B-DNA, grup-grup

hydropholic methyl dari alur utama, menghasilkan pengaturan yang tepat..


41/79


42/79

xlii

Komponen-komponen Penting dalam Replikasi

1. DNA cetakan, yaitu molekul DNA yang akan direplikasi2. Molekul nukleotida ; dATP, dTTP, dCPT, Dgtp3. Enzim DNA Polimerase, enzim utama yang mengkatalis proses

polimemerisasi nukleotida menjadi untaian DNA. Lima tipe DNA

polymerases antara lain , , , , dan , yang diidentifikasi dalam

sel-sel eukaryotic. , , dan pada DNA polymerases berfungsi

dalam replikasi DNA melalui nucleus. DNA polymerases berfungsi

dalam replikasi mitochondrial DNA, dan bentuk muncul dilibatkan

dalam pemasangan DNA. DNA polymerases I, II dan III, merupakan

DNA polymerase pada Prokaryotik.

4. Enzim primase, enzim yang mengkatalisis sintesis primer untukmemulai replikasi DNA.

5. Enzim Helikase, enzim pembuka ikatanuntaian DNA induk. Enzimlain yang juga berperan dalam proses tersebut adalah enzim girase.

6. Protein SSB (Single Strand Binding protein). Molekul yangmenstabilkan molekul DNA yang terbuka.

7. Enzim DNA ligase, suatu enzim yang berfungsi untuk menyambungfragmen-fragmen DNA.

Transkripsi DNA Menjadi RNA

Proses trankripsi pada dasarnya adalah sintesis suatu molekul RNA. Molekul

RNA adalah suatu polimer yang terbentuk dari berbagai gugus ribonukleotid. RNA

polimerase adalah suatu enzim yang bertugas mengenali tempat tertentu pada rantai

DNA yang menentukan mulainya transkripsi. Transkripsi adalah proses penyimpanan

informasi dalam DNA digunakan untuk menandai sintesis RNA. Transkripsi sama

dalam beberapa cara ke replikasi DNA tapi ada beberapa perbedaan utama antara


43/79


44/79

xliv

mengekspresi informasi. Lalu RNA dilibatkan sebagai pembawa informasi genetik

bersama sel. Transkripsi DNA berakhir dalam produksi tiga kelas dari RNA:rRNA,

tRNA, dan mRNA.

Proses transkripsi dilakukan oleh enzim RNA polimerase. Pada organisme

prokaryot, hanya ada satu macam RNA polimerase yang melakukan transkripsi gen

rRNA, gen yang mengkode protein, dan gen yang mengkode tRNA. Pada organisme

eukaryot , ada 3 macam RNA polimerase yaitu RNA polimerase I (menyalin gen

yang mengkode rRNA), RNA polymerase II (menyalin semua gen pengkode protein),

RNA polymerase III (menyalin gen yang mengkode tRNA dan rRNA berukuran 5S).

Urutan DNA yang akan ditranskripsi adalah gen yang akan diekspresikan. Gen yang

lengkap terdiri atas tiga bagian utama, yaitu; (1) daerah pengendali (regulatory

region) yang secara umum disebut promoter, (2) bagian structural, (3) terminator.

Promoter adalah bagian yang berperanan dalam mengendalikan proses transkripsi

dan terletak pada ujung 5. Bagian structural adalah bagian gen yang terletak

sebelah hilir (downstream) dari promoter. Bagian inilah yang mengandung urutan

DNA spesifik (kode-kode genetic) yang akan ditranskripsi. Terminator adalah

bagian gen yang terletak di sebelah hilir dari bagian structural yang berperan dalam

pengakhiran (terminasi) proses transkripsi.

Adapun tahapan tahapan dari transkripsi (sintesis RNA) adalah sebagai

berikut :

Inisiasi Transkripsi, DNA mengandung rentetan khusus nucleotide, dikenalsebagai pomoter regions, yang berperan sebagai penanda untuk inisiasi

transkripsi. Area pendukung DNA adalah lokasi di mana RNA polymerase

mengikat untuk transkripsi. Keaktifan promoter region mengkhususkan [1]

lokasi inisiasi transkripsi, dan [2] di mana dari dua helaian DNA bakteria

berfungsi sebagai sense strand untuk transkripsi di area tersebut.

Pembentukan open promoter kompleks, Pada tahap ini RNA polymerase IIakan mengenali daerah regulator element dari gen yang akan ditranskripsi.

Kemudian RNA polymerase ini akan menempel (binding) di daerah promoter


45/79

xlv

spesifik dari gene yang akan disintesis proteinnya, daerah promoter ini

merupakan daerah consesus sequences, pada urutan -10 dan -35 dari titik

inisiasi (+1) yang mengandung urutan TATA-Box sebagai basal promoter.

Setelah itu, polimerase ini akan membuka titik inisiasi (kodon ATG) dari gene

tersebut dan mengkopi semua informasi secara utuh baik daerah exon maupun

intron, dalam bentuk molekul immature mRNA (messenger RNA). Kemudian

immature mRNA ini diolah pada proses splicing dengan menggunakan

smallnuclearRNA (snRNA) complex yang akan memotong hanya daerah

intron, dan semua exon akan disambungkan menjadi satu urutan gen utuh

tanpa non-coding area dan disebut sebagai mature mRNA.

Pemanjangan selama proses transkripsi, Ketiga kawasan penting promotersyang berdampak pada bagaimana berfungsi dan efisiensi dari transkripsi

adalah kawasan konsensus -35, rententan konsensus Pribnow -10, dan lokasi

inisiasi. Rentetan konsesus -35 merupakan lokasi pengenalan inisial antara

RNA polymerase dan DNA, dan rentetan konsensus Pribnow -10 merupakan

pusat dari kawasan DNA yang tidak diikat. Inisiasi transkripsi mungkin juga

mempengaruhi inisiasi dan betapa cepatnya RNA polymerase meninggalkan

lokasi promoter. Semua fitur-fitur ini memiliki sebuah pengaruh kepadatingkat efisiensi RNA polymerase untuk transkripsi.

Penambahan dari rentetan nucleotide pada tiga kawasan penting juga

dipengaruhi oleh kemampuan memisahkan helaian-helaian DNA. Pemisahan

helaian secara langsung dipengaruhi oleh komposisi nucleotide (kawasan AT-

rich lebih mudah dipisahkan daripada kawasan GC-rich) dan dengan tingkatan

supercoiling dari helix ganda.

Tingkat kecepatan polymerisasi RNA selama transkripsi mungkin tidak akanberjalan lancar, penambahan berkelanjutan atas ribonucleotides. Di dalam

operons yang mengandung sebuah area attenuator, terdapat lokasi khusus

sepanjang DNA yang menyebabkan RNA polymerase berhenti atau diam

sejenak sampai kondisi-kondisi tertentu dipertemukan. Jika kondisi terpenuhi,


46/79

xlvi

RNA polymerase bisa memproses dengan pemanjangan. Jika kondisi tidak

terpenuhi, RNA polymerase menghentikan transkripsi.

Terminasi, Setelah terjadi proses pemanjangan untaian RNA hasil sintesis,selanjutnya diikuti dengan pengakhiran (terminasi) transkripsi yang ditandai

dengan pelepasan RNA polymerase dari sense strand DNA yang

ditranskripsi. Ada beberapa lokasi terminasi khusus yang berperan sebagai

sebuah sinyal untuk menghentikan transkripsi.

gambar 6 . Grafik tahapan transkripsi

Tranlasi RNA menjadi protein atau polipeptida

Translasi adalah proses penerjemahan kode-kode genetic (kodon) yang ada

pada molekul mRNA urutan-urutan asam amino. Hanya molekul mRNA yang

ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi. Pembacaan dari sebuah

molekul mRNA mulai dari sebuah titik permulaan yang tepat. Codon pertama yang

dibaca adalah AUG, yang memberi tanda asam amino methionine. Dalam sel-sel

bakterial, codon AUG memberi tanda methionine (Met) ketika muncul di mana pun

dalam molekul mRNA. Pada beberapa bakteria, codon AUG bertindak sebagaiinisiator codon yang mengkhususkan f-Met untuk memulai rantai polypeptide,

meskipun ketika GUC muncul pada posis internal dalam molekul mRNA, memberi

kode untuk valine. Baik itu Met atau f-Met merupakan bagian pertama dari asam

amino dalam semua rantai peptide ketika mereka disintesiskan secara inisial, terminal


47/79

xlvii

asam amino bisa dimodifikasi secara enzimatis kemudian. Deformylase bisa

memindahkan grup formyl dari formylmethionine, dan methionine amino peptidase

bisa memindahkan methionine dari amino terminus dari peptide. Olehkarena itu,

tidak semua polypeptides dalam mikroorganisme memiliki f-Met pada ujung terminal

amino mereka.

Bagian pangkal codon menentukan reading frame (rentetan tiga-nucleotide)

untuk bagian selebihnya dari molekul mRNA , sebab, landasan-landasan nucleotide

dibaca tiga pada satu waktu sepanjang rentai berkelanjutan dari nucleotides,

mengubah posisi kerangka membaca dengan memasukan atau menghapus landasan

nucleotide tunggal dalam sebuah gen bisa mempengaruhi secara dramatis rentetan

asam amino dari protein yang bisa diproduksinya.

Karena terjemahan bisa dimulai secara teoritis dengan berbagai nucleotide

melalui triplet codons, terdapat tiga kerangka membaca potensial dalam berbagai

kawasan di DNA. Sebuah protein diterjemahkan dengan kerangka yang mulai dengan

codon inisiasi AUG, memperluas melalui satu seri codon-codon yang

mengkhususkan asam amino, dan berakhir ketika terminasi codon dicapai.

Sebuah kerangka membaca yang mengandung codon-codon yang secara

eksklusif mengkode asam amino disebut open reading frame (ORF). Kerangka

membaca yang terkunci tidak bisa dibaca menjadi protein karena kehadiran terminasi

codon-codon. Deteksi dari sebuah ORF, yang bisa dilakukan dengan menguji rentetan

nucleotide diterjemahkan menjadi sebuah protein. Melacak database dari rentetan

nucleotide yang telah ditunjuk untuk memberi kode protein-protein yang dikenali bisa

membantu mengidentifikasi fungsi dari kerangka membaca terbuka. Homologies

tinggi ditemukan sepanjang spesies-spesies untuk rentetan nucleotides yang telah

melibatkan dan mengode protein-protein dengan fungsi-fungsi identik.

Beberapa protein dibutuhkan sebagai faktor-faktor inisiasi untuk memulaiproses terjemahan. Dalam sel-sel bakterial, tiga faktor inisiasi, IF1, IF2 dan IF3

dibutuhkan. Sedikit informasi yang diketahui mengenai faktor-faktor inisiasi

eukaryotik 4D (eIF4D). Dalam sel-sel eukaryotik, paling tidak sembilan faktor-faktor

inisiasi eukaryotik (eIF1 ke eIF6) dibutuhkan untuk memulai sintesis protein.


48/79

xlviii

Translasi berlansung di dalam ribosom. Pada organisme prokaryot, translasi

sudah dimulai sebelum transkripsi (sintesis mRNA) selesai dilakukan. Dengan

demikian proses transkripsi dan translasi pada prokaryot berlangsung secara hampir

serentak. Sebaliknya pada eukaryot, proses translasi baru dapat berlangsung jika

proses transkripsi (sintesis mRNA yang matang) sudah selesai dilakukan. Dalam

proses translasi diperlukan molekul tRNA yang berfungsi membawa asam amino

spesifik. Terdapat 1 sampai 6 t-RNA untuk masing-masing asam amino dari 20 asam

amino yang dikenal pembentuk protein. Ribosom mengkatalisis pembentukan ikatan

peptida di antara dua asam amino yangberdekatan.Terdapat sekitar 20 macam tRNA

yang masing-masing membawa asam amino spesifik, karena di alam terdapat 20

asam amino yang menyusun protein alami.

Gambar 7. Struktur molekul 20 asam amino

Sintesis protein terdiri atas 3 tahap, inisiasi, elongasi, dan terminasi. Pada

tahap inisiasi, dibentuklah kompleks inisiasi untuk kemudian memulai sintesis dan

berikatan dengan start kodon pada mRNA . Suatu bagian dari rantai mRNA yang

menjadi tempat mulainya translasi adalah Ribosome Binding Sites (RBS) atau sekuen

Shine Dalgarno. Proses translasi dimulai dari menempelnya ribosom pada RBS.

Setelah subunit 30S dari ribosom menempel pada RBS. Subunit itu bergerak


49/79

xlix

sepanjang mRNA hingga mencapai kodon awal (kodon AUG). Selama elongasi asam

amino membentuk ikatan kovalen secara berurutan mengikuti gerakan ribosom

sepanjang mRNA. Terminasi sintesis potein terjadi jika ribosom sampai kepada

kodon nonsens (UAA, UGA, UAG). Peptida selanjutnya terlepas dari ikatan tRNA

dan ribosom berdisosiasi menjadi sub unitnya. Translasi adalah penerjemahan kodon

pada mRNA menjadi suatu polipetida.

Kode genetika adalah triplet, karena masing-masing kode terbentuk dari tiga

nukleotida yang disebut kodon. Kodon terdiri dari tiga dari empat kemungkinan

nukleotida (A, U, C dan G). Ini berarti akan terdapat 43 = 64 kodon. Keenam puluh

empat kodon ini dikenal oleh t RNA kecuali tiga yang disebut kodon nonsens.

Gambar 8. Kode genetic

Marshall Nirenberg dan Gobin Khorana berjasa dalam hal menemukan

kode genetika ini. Dan kode genetika ini berlalu universal untuk semua organisme

dari bakteri sampai manusia.


50/79

l

Ciri-ciri kode genetic adalah sebagai berikut ;

1) Kode genetic adalah triplet. Setiap kodon mRNA yang mengkode asam aminodalam rantai polipeptida mengandung tiga nukleotida.

2) Kode genetic adalah kode yang bebas koma, mRNA dibaca terus, tiganukleotida (satu kodon) pada satu waktu, tanpa melompati nukleotida yang

lain.

3) Kode genetic tidak tumpang tindih. mRNA dibaca dalam kelompok berurutantiga nukleotida (triplet). Artinya tiada satu basa tunggal pun yang dapat

mengambil bagian dalam pembentukan lebih dari satu kodon.

4) Kode genetic bersifat degenerasi pengecualian (AUG, metionin dan UGG,triptofan), lebih dari satu kodon mengkode untuk beberapa asam amino.

5) Kode genetic mempunyai signal mulai dan signal berhenti. Signal mulai dansignal berhenti untuk sintesis protein berada dalam kode genetic ini.

6) Kode genetic dapat mempunyai dua arti, yaitu kodon yang sama dapatmemperinci lebih dari satu asam amino. Ex: Kodon UUU kode untuk

phenylalanin tetapi bila ada streptomisin dapat pula merupakan kode untukisoleusin, leusin atau serin.

Perubahan Pasca Penerjemahan (Mutasi)

Telah diketahui betapa penambahan sebuah basa saja sudah cukup untuk

mengacaukan pembacaan pesan genetic. Penambahan dua basa ataupun penghapusan

satu atau dua basa mempunyai akibat yang sama. Perubahan seperti itu dinamakan

mutasi pergeseran bingkai (frameshift mutation). Hanya penambahan atau

penghapusan pergandaan dari tiga basa yang menyebabkan pembacaan bingkai secaranisbi tidak berubah.

Perubahan satu basa saja mungkin tidak menimbulkan perubahan pada protein

yang dihasilkan, mungkin terjadi protein yang aktif sebagian saja atau bahkan protein

yang tidak aktif sama sekali, atau bahkan tidak terbentuk protein sama sekali.


51/79

li

Penggantian satu poromidin dengan pirimidin yang lain (misalnya C dengan T) atau

satu purin dengan yang lain (G dengan A) disebut mutasi transisional. Penggantian

suatu purin dengan suatu pirimidin atau sebaliknya disebut mutasi transversional.

Karena terjadi degenerasi sandi, hasilnya mungkin tidak ada perubahan dalam

molekul protein yang terbentuk (mutasi diam). Mutasi jenis ini hanya dapat dilacak

dengan menyelidiki urutan basa mRNA atau gen.

Suatu missense mutation mengganti suatu asam amino dengan asam amino

yang lain. Bila asam amino pengganti mirip, mungkin terjadi suatu protein yang

masih berfungsi. Bila asam amino pengganti berbeda sekali, protein yang dihasilkan

mungkin tidak aktif sama sekali.

Kemungkinan ketiga ialah tidak terbentuk protein sama sekali. Hal ini dapat

terjadi misalnya bila mutasi mengganti kodon suatu asam amino dengan suatu kodon

yang mengisyaratkan penghentian sintesis. Peristiwa ini disebut mutasi nonsens

(nonsense mutation).

Beberapa prokariot dan eukariot mengandung tRNA yang telah berubah yang

dapat menyisipkan suatu asam amino pada suatu tempat yang telah menglami mutasi

nonsense ataupun pada tempat yang biasanya mengandung kodon untuk

menghentikan sintesis. Ini disebut mutasi supresor. Pada dasarnya, tRNA supresor

ini salah dalam membaca sandi. Lagi pula untuk menekan suatu mutasi nonsense,

beberapa tRNA membalikkan efek dari missense dan bahkan mutasi pergeseran

bingkai. Yang terakhir ini terjadi bila suatu tRNA membaca empat basa, bukannya

tiga basa, sebagai kodon.


52/79


53/79

liii

protein represor yang dikode oleh genlaktose yaitu suatu protein yang tersusun atas

empat polipeptida yang identik menempel pada daerah operator ( Lac O ), yang

terletak disebelah hilir dari promoter, yang menyebabkan RNA polimerase tidak

dapat melakukan transkripsi gen-gen struktural lac Z, lac Y dan lac A, sehingga

operon lactosa mengalami represi, dan terjadi terus menerus selama tidak ada laktosa,

sehingga energi seluler dapat dihemat. Induksi operon laktosa terjadi jika ada laktosa

di dalam sel laktosa yang berada dalam medim pertubuhan sel diangkut ke dalam sel

dengan meggunakan enzim permiase galaktosidase. Enzim tersebut mengangkut

laktosa ke dalam sel,juga adanya enzim -galaktosidase di dalam sel yang terbatas

jumlahnya, maka meskipun belum ada induksi sepeuhnya dapat mengubah laktosa

menjadi allolaktosa ( mempunyai ikatan

-1.6 Allolaktosa yang merupakan induser

untuk mengaktifkan operon laktosa. Sedang laktosa adalah disakarida glukosa-

gaktosa yang terikat melalui ikatan -1,4. Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan

menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam

polipeptida yang berbeda (oleh karena itu disebut mRNA polisistronik).

Gambar 9. Ekspresi gen pada prokaryotic

Regulasi Gen Pada Organisme Eukaryotik

Pada organisme eukaryot, satu gen struktural yang mengkode suatu protein

akan dikendalikan ekspresinya oleh satu promotor yang spesifik sehingga mRNA


54/79

liv

yang dihasilkan berupa mRNA yang monosistronik. Molekul mRNA semacam ini

hanya membawa rangkaian kode genetik untuk satu macam protein. Pada tahun 1941

George W. Beadle dan Edward L. Tatum mengemukakan konsep yang dikenal

sebagai teori satu gen - satu enzim. Akan tetapi penelitian penelitian menunjukkan

bahwa banyak protein atau enzim yang molekul lengkap semua polipeptidanya dapat

dikode oleh lebih dari satu gen struktural. Sebagai contoh, molekul hemoglobin yang

lengkap dikode oleh dua gen. Oleh karena itu sekarang dikenal teori satu gen- satu

polipeptida.

Perbedaan lain antara regulasi gen pada prokaryot dan eukaryot terletak pada

organisasi bagian struktural gen-gen yang mengkode protein. Pada prokaryot, semua

urutan nukleotida ditranskripsi menjadi mRNA. Selanjutnya, semua urutan nukleotida

mRNA mulai urutan kodon awal (ATG) sampai kodon sebelum urutan kodon

terminasi (TAA,TAG, atau TGA) ditranslasi menjadi urutan asam-asam amino.

Sebaliknya, pada banyak gen eukaryot seringkali terdapat urutan-urutan nukleotida

(kodon) yang tidak diketemukan terjemahannya dalam urutan asam amino. Pada

organisme eukaryotik dikenal adanya bagian gen struktural yang disebut intron

(intervening squences). Intron adalah bagian struktural yang pada awalnya

ditranskripsi tetapi selanjutnya mengalami pemotongan sehingga transkrip mRNA

yang sudah matang tidak lagi mengandung urutan tersebut. Oleh karena itu, bagian

yang hilang dari mRNA tersebut tidak akan ditranslasi menjadi urutan asam amino.

Sebaliknya, bagian gen struktural yang ditranskripsi menjadi mRNA disebut exon.

Gambar 10. Skema pemrosesan mRNA pada organisme Eukaryot.


55/79

lv

Dalam proses transkripsi gen eukaryotik, exon-exon akan ditranskripsi.

Setelah terjadi pmotongan intron, selanjutnyaexon-exon disambung (disebut sebagai

proses splicing) menjadi molekul mRNA yang matang. Molekul mRNA yang matang

inilah (tidak mengandung intron lagi) yang selanjutnya akan ditranslasi menjadi

urutan asam amino.

Gambar 11. Skema ekspresi genetic pada organisme Eukaryot.

D. Tugas dan LatihanUntuk memantapkan pemahaman anda mengenai topik ini maka anda

diharapkan mengerjakan tugas dan latihan di bawah ini

1. Jelaskan mengenai dogma sentral

2. Jelaskan secara singkat urutan hingga suatu informasi genetik dapat diekspresikan!

3. Jelaskan secara singkat perbedaan regulasi gen organisme prokariot dan eukariot!

4. Plihlah salah satu topik di bawah ini kemudian susunlan portofolia berkaitandengan topik tersebut!

Konstitusi genetik tanaman melalui pemahaman terhadap dogma genetik, kodegenetik & ekspresi genetik

Dogma genetik dan kode genetikEkspresi genetikMutasi, mutagenesis, Rekombinasi, Transposisi


56/79

lvi

Replikasi, Transkripsi dan Translasi DNASomaklonal vs GametoklonalInteraksi genetik tanaman dan lingkungan

F. Indikator Penilaian

Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dengan contoh,

kejelasan uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada portofolio

berdasarkan topik yang dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUPRangkuman


bentuk urutan basa) menjadi protein, dan lebih jauh lagi: karakter. Ada tiga proses

dasar yang tercakup dalam dogma inti yaitu replikasi DNA, Transkripsi DNA

menjadi RNA, dan Translasi RNA menjadi protein atau polipeptida. Proses ekspresi

gen merupakan aspek fundamental dalam setiap organisme hidup.

Proses perbanyakan bahan genetik dikenal sebagai proses replikasi. Pada

replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA

yang digandakan. Proses trankripsi pada dasarnya adalah sintesis suatu molekul

RNA, Transkripsi adalah proses penyimpanan informasi dalam DNA digunakan

untuk menandai sintesis RNA. Translasi adalah proses penerjemahan kode-kode

genetic (kodon) yang ada pada molekul mRNA urutan-urutan asam amino. Hanya

molekul mRNA yang ditranslasi, sedangkan rRNA dan tRNA tidak ditranslasi.

Pada umumnya, gen yang mengkode protein pada prokaryot berupa gen

dengan kopi tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNAberupa gen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Pada organisme eukaryot,

satu gen struktural yang mengkode suatu protein akan dikendalikan ekspresinya oleh


57/79

lvii

satu promotor yang spesifik sehingga mRNA yang dihasilkan berupa mRNA yang

monosistronik. Molekul mRNA semacam ini hanya membawa rangkaian kode

genetik untuk satu macam protein.

DAFTAR PUSTAKA

1. http: //id.Wikipedia.org/DNA/

2. Molecular biology of the cell, 4th edition, The Benyamin/Cummings Publishing

Co.inc)

3. PPT Bahan Ajar Gene Expression Protein Synthesis). www. Brawijaya.Ac.id

4. PPT Bahan Ajar Dna Sebagai Bahan Genetik, UGM. http//ghr.nlm.nih.gov/

5. Schumm E. Dorothy.1992. Essential ofBiochemistry. Department of Physiologica

Chemistry. F.A.Davis company. Ohio


58/79

lviii

MODUL IV

Aplikasi Konsep Teknologi DNA Rekombinan pada Transfer genetik

Tanaman

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bioteknologi telah memainkan peranan penting dalam peningkatan produksi

tanaman dalam beberapa dasawarsa terakhir. Paradigma pengembangan pertanian

saat ini terus berkembang ke arah penerapan bioteknologi modern yang

memungkinkan manipulasi genetik pada tanaman dapat dilakukan secara sangat

terarah. Salah satu teknik bioteknologi modern yang memungkinkan dilakukannya

manipulasi genetik secara terarah yaitu teknologi DNA rekombinan. Pada prinsipnya

teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknik untuk menggabungkan molekul-

molekul DNA secara in vitro, teknik ini memungkinkan terjadinya penggabungan

DNA antara organisme yang hubungan kekerabatannya sangat jauh.

Pengembangan dan penerapan teknologi DNA rekombinan memiliki dampak

yang sangat besar dalam bidang pertanian. Berbagai tanaman dengan sifat-sifat

fisiologis yang lebih baik maupun resistensi yang lebih tinggi terhadap hama dan

penyakit telah dihasilkan melalui pemanfaatan teknologi ini. Melihat besarnya

implikasi teknik ini dan prospek pengembangannya di masa depan maka pengetahuan

mengenai aplikasi konsep teknologi DNA rekombinan pada transfer genetik tanaman

sangat penting dipahami.

B. Ruang Lingkup Isi

Modul ini membahas mengenai Pengenalan teknik DNA rekombinan,

identifikasi, isolasi, dan amplifikasi DNA dengan PCR, DNA vektor, dan berbagai

metode transfer gen ke tanaman.


59/79

lix

C. Kaitan Modul

Modul ini merupakan modul keempat setelah mahasiswa memahami modul-

modul sebelumnya yang meliputi struktur dan komponen biomolekuler sel,

perubahan konstitusi genetik, replikasi DNA, dan ekspresi genetik.


Setelah mempelajari modul ini, mahasiswa diharapkan dapat menjelaskan

mengenai teknologi rekombinan dan berbagai dampak yang ditimbulkan. Mengetahui

tahapan identifikasi, isolasi, dan amplifikasi DNA beserta metode yang

digunakan.Mengetahui berbagai DNA vektor dan proses introduksi DNA asing ke

dalam tanaman target. Mengetahui berbagai metode transfer gen ke tanaman.

BAB II. PEMBAHASAN

A. Pengenalan teknologi DNA rekombinan


digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Teknologi

DNA rekombinaan ini juga dikenal sebagai rekayasa genetik atau genetic

engineering.

Konsep mengenai teknologi DNA rekombinaan didasarkan pada mekanisme

seksual yang terdapat pada bakteri. Mekanisme seksual pada bakteri ditemukan oleh

Ledersberg dan Tatum pada tahun 1946. Mekanisme seksual pada bakteri tidak

bersifat reproduktif atau menghasilkan anak. Mekanisme ini memungkinkan

terjadinya pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya, sehingga dapatterbentuk kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda.

Tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah

sebagai berikut:

1. Isolasi molekul DNA


60/79

lx

2. Pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi

3. Penyambungan molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase

ke dalam suatu molekul DNA vektor.

4. Transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel inang

5. Analisis dan konfirmasi keberadaan DNA rekombinaan dalam sel inang

6. Karakterisasi fungsional gen yang diklon.

B. Isolasi DNA

DNA merupakan material genetik yang terdapat dalam sel oleh karena itu

langkah pertama dalam mengisolasi DNA yaitu memecahkan dinding sel. Dinding sel

dapat dipecahkan dengan memberikan perlakuan baik fisik, kimia, ataupun gabungan

dari keduanya.

- Perlakuan FisikSel dapat dipecahkan secara fisik dengan menggunakan alat

sonikator(sonicator). Pada prinsipnya alat ini menghasilkan suara dengan

frekuensi ultra tinggi sehingga dapat memecahkan dinding sel.

- Perlakuan KimiawiSecara kimiawi pemecahan dinding sel dapat dilakukan dengan menggunakan

enzim. Enzim yang dapat digunakan untuk pemecahan dinding sel yaitu

enzim lisozim.

Enzim Restriksi

Enzim endonuklease restriksi atau enzim restriksi merupakan enzim yang

diproduksi oleh mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim ini pertama

kali ditemukan oleh Werner Arber dan Hamilton Smith pada tahun 1960. Bakteri

secara alami menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yangmenginfeksinya.

Enzim restriksi mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang

panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim restriksi memotong pada bagian

tertentu , bagian DNA yang dipotong oleh enzim ini disebut sebagai sekuens


61/79


62/79

lxii

Enzim Ligase

Enzim ligase merupakan enzim yang digunakan untuk menyambung

potongan-potongan fragmen DNA. Enzim yang sering digunakan untuk menyambung

DNA adalah enzim yang genomnya berasal dari genom virus (bakteriofag) T4

sehingga disebut T4 DNA ligase. Enzim ini mampu menyambung DNA yang

ujungnya kohesif maupun runcing. Hal ini berbeda dari enzim ligase yang genomnya

berasal dari genom bakteri Escheria coli. Enzim yang diperoleh dari bakteri Ecoli

hanya mampu menyambung DNA ujung kohesif. Selain itu, T4 DNA ligase juga

mampu menyambung molekul DNA dengan RNA sedangkan enzim dari Ecoli tidak

dapat melakukan hal tersebut. Hal inilah yang menyebabkan enzim T4 DNA Ligase

lebih sering digunakan untuk kloning DNA.

Penyambungan ujung-ujung DNA yang kohesif lebih mudah dilakukan

dibandingkan DNA berujung tumpul. Penyambungan DNA dilakukan dengan

mencampur dua macam molekul DNA yang akan disambung dengan emzim DNA

ligase. Campuran ini kemudian diinkubasikan pada suhu 12 C 15 C selama

semalam. Untuk menyambung DNA yang mempunyai ujung-ujung yang tidak sama

karena berasal dari hasil pemotongan oleh enzim restriksi yang berbeda dilakukan

beberapa modifikasi,antara lain (a) penambanhan adaptor atau penyambung (linker),

(b) pembentukan akar homopolimer pada ujung DNA, (c) pengisian ujung-ujung

DNA kohesif, (d) penghilangan ujung DNA kohesif.

Adaptor adalah suatu molekul oligonukleotida sintetik yang urutan

oligonukleotidanya dirancang sedemikian rupa sehingga masing-masing ujung

adaptor bersifat komplementer dengan masing-masing ujung DNA yang akan

disambung.

Linker adalah molekul oligonukleotida sintetik yang dapat mengalamipenyambungan sendiri (self ligation). Linker dapat membentuk molekul untai ganda

berujung tumpul tetapi mempunyai urutan nukleotida yang dikenali oleh enzim

restriksi tertentu. Linker digunakan untuk menyambung DNA berujung tumpul,


63/79

lxiii

sehingga DNA berujung tumpul dapat mempunyai sisi pengenalan oleh enzsim

reztriksi tertentu.

Ekor homopolimer merupakan molekul deoksiribonukleotida yang terdiri atas

satu macam nukleotida dan ditambahkan pada ujung 3 suatu molekul DNA untai

tunggal atau ganda sehingga DNA tersebut dapat membentuk rekombinaan dengan

DNA lain yang mempunyai ekor homopolimer yang komplementer. Penambahan

ekor homopolimer dilakukan dengan menggunakan enzim calf thymus terminal

deoxynucleotidyl transferase.

C. VEKTOR DNA

Vektor DNA atau DNA vektor adalah molekul DNA yang secara khusus

dirancang untuk membawa molekul DNA asing yang akan dimasukkan ke dalam

jasad target. DNA vektor memiliki komponen viatal ayng meliputi ori (origin of

replication, titik awla replikasi), sisi penyisipan fragmen DNA asing, penanda

genetik, sinyal transkripsi dan translasi.

1. Titik awal replikasiTitik awal replikasi (ori) adalah suatu urtan nukleotiada pada vektor yang

digunakan untuk mengawali proses replikasi DNA vektor tersebut. Replikasi

suatu DNA vektor untuk memperthankan keberadaan vektor tersebut di dalam

sel.

2. Sisi penyisipan fragmen DNA asingSisi penyisipan fragmen DNA asing adalah sekuens DNA pada vektor yang

dapat dipotong oleh suatu enzim restriksi tertentu sehingga dapat digunakan

untuk menyisipkan fragmen DNA asing yang diklon. Sisi penyisipan tersebut

sering disebut sebagai sisi kloning (clonning site) yang dapat terdiri atas

beberapa urutan nukleotida khusus yang dapat dipotong oleh beberapa macamenzim restriksi yang berbeda.

3. Penanda genetik (genetic marker)Penanda gnetik adalah suatu gen tertentu pada vektor yang dapat digunakan

untuk menentukan koloni sel yang memebawa DNA vektor atau DNA


64/79


65/79

lxv

jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar sel bahkan antar

sel dalam satu spesies bakteri.

Gambar 1. Vektor DNA plasmid

Vektor DNA plasmid merupakan vektor yang paling umum digunakan untuk

kloning DNA. Struktur dasar vektor ini berasal dari DNA plasmid yang secara alami

ditemukan di dalam beberapa jasad prokaryot dan eukaryot. Plasmid yang digunakan

sebagai vektor pada umumnya merupakan hasil modifikasi plasmid alami dengan

cara menambahkan komponen-komponen genetik dari berbagai sumber, misalnya sisi

kloning, ori tambahan, promoter,. Terminator transkripsi serta penanda genetik.

Vektor yang berupa plasmid umumnya berukuran kecil yaitu sekitar 2-8 kb meskipun

ada juga yang berukuran sekitar 12 kb. Hal inilah yang menyebabkan vektor plasmid

hanya dapat digunakan untuk membawa fragmen DNA asing yang berukuran kecil

maksimum sampai mencapai sekitar 3-5 kb. Vektor DNA plasmid secara umum dapat

dikelompokkan menjadi (a) vektor untuk amplifikasi fragmen DNA asing (b) vektor

ekspresi (c) vektor ulang-alik (shuttle vector).

Vektor untuk amplifikasi merupakan vektor plasmid yang biasanya digunakanhanya untuk memperbanyak fragmen DNA asing yang disisipkan ke dalam plasmid

tersebut. Vektor ekspresi adalah kelompok vektor yang selain dapat digunakan untuk

memperbanyak gen yang disisipkan juga dapat mengekspresikan gen yang disisipkan


66/79

lxvi

tersebut. Beberapa vektor ekspresi juga dapat dimasukkan ke dalam vektor ulang-

alik. Vektor ulang-alik (shuttle vector) adalah vektor yang dapat direplikasikan pada

sel prokaryot dan eukaryot. Vektor ini digunakan untuk mengekspresikan gen asing

di dalam sel eukaryot, namun sebelumnya gen asing yang diklon tersebut

diperbanyak terlebih dahulu di dalam sel prokaryot.

D. Transfer DNA

Transfer DNA ke dalam bakteri dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu,

konjugasi, tarnsformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri

kemudian dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk

kromosom rekombinaan.

Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel ke dalam sel bakteri lain

mnelalui kontak fisik antara kedua sel. Sela donor (jantan) memasukkan sebagian

DNA nya ke dalam sel resepien (sel betina). Transfer DNA berlangsung melalui pili

seks yang dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel

jantan berpindak ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu setelah

konjugasi, sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel akan

berpisah kembali dan jumlah sel tidak bertambah. Setelah konjugasi tidak dihasilkan

anak. Oleh karena itu proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses seksual yang

tidak reproduktif.

Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di

sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa

potongan DNA atau fragmen DNA ysng berasal dari bakteri lainnya atau dari

organiosme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri dapat

terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini diamati oleh Griffith (1928), dan

kelompok Averry (1944). Griffith (1928) telah menemukan bahwa strain bakteri yangtidak virulen (strain yang penampilan koloninya kasar) dapat berubah sifatnya

menjadi strain yang virulen (penampilan koloninya halus) . Perubahan sifat ini

disebabkan karena strain yang tidak virulen menjadi strain yang virulen. Perubahan


67/79

lxvii

sifat ini disebabkan karena strai yang tidak virulen dicampur dengan strain virulen

yang telah dimatikan.

Avery, McCleod, dan McCarty (1944) menemukan bahwa perubahan sifat

atau transformasi dari bakteri avirulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA

dari sel bakteri virulen yang masuk ke dalam sel bakteri avirulen . Berdasarkan

mekanisme transformasi alami ini maka dapat dilakukan mekanisme transformasi

buatan. Dengan perlakuan tertentu kita dapat memasukkan potongan DNA ke dalam

sel bakteri. Pada prinsipnya ahal ,ini sangat sederhana yaitu

mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam tabung

reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi sel-sel bakteri yang sudah

mengandung potongan DNA tertentu tersebut.

Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke sel lain melalui

perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-

virus yang inangnya adalah bakteri disebut bakteriofage atau fage. Pada waktu fage

menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA nya ke dalam bakteri. DNA fage ini

kemudian bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom

bakteri. Pada waktu DNA fage dikemas di dalam pembungkusnya untuk membentuk

partikel-partikel fage baru, DNA fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA

baktei yang menjadi inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri lainnya

maka fage akan memasukkan DNA nya yang mengandung sebagian dari DNA

bakteri inangnya sebelumnya. Dengan demikian fage tidak hanya memasukkan DNA

nya sendiri ke dalam sel bakteri yang diseranganya tetapi juga memasukkan DNA

dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage. Hal ini berarti secara

alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya.

E. Amplifikasi DNA Dengan Teknik PCR

Amplifikasi (perbanyakan) sekuens DNA dapat dilakukan dengan metode

PCR (Polymerase chain reaction). Amplifikasi DNA ini dilakukan dengan

menggunakan enzim DNA polimerase, dNTP (dinukleotida triphosphat)

oligonukleotida primer, dan DNA template (DNA cetakan).


68/79

lxviii

Enzim DNA polimeraseEnzim DNA polimerase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi polimerisasi

nukleotida menjadi untaian DNA. Dalam teknik PCR biasanya digunakan enzim

DNA polimerase yang berasal dari bakteri termotoleran yang berasal dari laut, yaitu

Thermus aquaticus, enzim tersebut disebut Taq DNA polymerase. Enzim ini memiliki

kelebihan yaitu dapt tahan terhadap suhu yang sangat tinggi, yaitu mencapai suhu 95-

100 C.

Suhu setinggi itu diperlukan sebab untuk menyalin urutan basa DNA cetakan

dalam metode PCR. Maka DNA cetakan harus didenaturasi (dipisahkan ikatan antarauntaiannya) dengan perlakuan panas. Saat ini telah dikembangkan banyak DNA

polimerase termotoleran lain yang dikembangkan untuk PCR, misalnya Tth DNA

polymerase, dan Pwo DNA polymerase.

dNTP (dinukleotida triphosphat)Molekul dNTP (yaitu dATP, dTTP, dCTP, dan dGTP) diperlukan dalm teknik

PCR sebagai bahan dasar untuk membuat untaian DNA karena molekul DNA disusun

oleh keempat nukleotida tersebut.

Oligonukleotida primerOligonukleotida primer adalah molekul nukleotida berukuran pendek (sekitar

10-30 basa nukleotida) yang diperlukan dalam mengawali proses sintesis DNA.

Proses sintesis DNA baik secara in vivo maupun in vitro memerlukan molekul

primer. Urutan basa nukleotida pada primer ditentukan agar dapat menempel

(komplementer) pada bagian molekul DNA cetakan yang akan disalin atau

diamplifikasi. Molekul primer dapat dibuat dengan cara sintesis kimiawi.

Molekul DNA cetakanMolekul DNA cetakan merupakan molekul DNA yang urutan nukleotidanya

akan disalin. DNA cetakan diisolasi dari sel dan selanjutnya digunakan sebagai

cetakan yang akan dibaca oleh enzim DNA polimerase untuk membuat salinan urutan

nukleotidanya.


69/79

lxix

PCR dilakukan dengan mencampurkan keempat komponen tersebut di dalam

tabung Eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam thermocycler. Volume total

campuran reaksi yang diperlukan biasanya berkisar antara 25-100 mikroliter.

Thermocycler adalah alat yang dapat diatur untuk membuat suatu siklus perubahan

suhu yang diperlukan dalam proses amplifikasi DNA. Tahap pertama suhu alat diatur

sehingga mencapai 95-100 C selama bebrapa menit (biasanya sekitar 5 menit). Pada

saat ini, molekul DNA cetakan mengalami denaturasi sehingga kedua untaiannya

terpisah. Pemisahan untaian ini diperlukan agar nukleotida primer dapat menempel,

karena primer tidak akan dapat menempel pada DNA cetakan yang masih dalam

bentuk untaian ganda (double stranded).

Setelah beberapa menit pada suhu denaturasi, suhu alat diturunkan sehingga

mencapai suhu yang sesuai untuk penempelan primer (primer annealing) pada DNA

cetakan. Biasanya suhu yang diperlukan adalah sekitar 50-60 C, tetapi suhu yang

tepat harus ditemukan secara empiris tergantung pada urutan basa nukleotida primer

yang digunakan. Pada suhu yang tepat, molekul primer akan menempel pada daerah

DNA yang komplementer. Sebagai contoh, jika urutan nukleotida primer adalah

GATCTTCG, maka primer tersebut akan menempel pada daerah DNA cetakan yang

mempunyai urutan CTAGAAGC. Molekul primer yang menempel tersebut berfungsi

sebagai molekul awal dalam proses polimerasi DNA. Nukleotida-nukleotida baru

akan ditempelkan di ujung primer tersebut sesuai dengan urutan nukleotida pada

DNA cetakan.

Proses penempelan primer biasanya memerlukan waktu beberapa menit

sekitar 2-3 menit, selanjutnya suhu alat dinaikkan ke suhu yang optimum untuk

aktivitas polimerisasi DNA oleh DNA polimerisasi. Jika digunakan Taq DNA

polymerase maka biasanya suhu dinaikkan menjadi 72 C. Pada suhu inilah terjadi

proses polimerisasi (sintesis) DNA baru dengan adanya aktivitas DNA polimerase,dNTP, primer, dan DNA cetakan. Proses polimerisasi biasanya berlangsung selam 2-

5 menit.

Setelah proses polimerisasi, kemudian dilakukan lagi siklus seperti semula,

yaitu dengan menaikkan suhu menjadi 95-100 c (denaturasi) kemudian diturunkan


70/79

lxx

menjadi 50-60 C (penempelan primer) , dan kemudian dinaikkan lagi menjadi 72 C

(polimerisasi). Siklus perubahan semacam ini dilakukan berulang-ulang sekitar 25-35

kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi sintesis DNA secara berulang-ulang

sekitar 25-35 kali. Dengan demikian dalam proses PCR terjadi sintesis DNA secara

berulang-ulang sehingga diperoleh molekul DNA baru dengan jumlah yang jauh

berlipat ganda dibanding denagn molekul DNA cetakannya. Inilah yang disebut

sebagai proses reaksi berantai polimerase atau PCR. Dengan teknik ini dimungkinkan

mengamplifikasi suatu fragmen DNA denagn cepat dalam jumlah yang banyak.

Selain itu amplifikasi juga dapat diarahkan hanya pada bagian-bagian tertentu suatu

gen sehingga dapat dikembangkan untuk tujuan rekayasa struktur suatu gen atau

protein.

F. TRANSFORMASI SEL INANG

Setelah menyisipkan DNA asing ke dalam DNA vektor, selanjutnya DNA

rekombinan tersebut dimasukkan ke dalam sel inang yang sesuai. Proses ini disebut

sebagai transfomasi. Berdasarkan tujuan transformasi tersebut, secara umum sel inang

dapat dibedakan menjadi 2 kelompok, yaitu:

1. Sel inang sementara ( temporer), sel yang digunakan hanya untukmemperbanyak jumlah sel DNA rekombinan, biasanya digunakan baktei E.

Coli karena mudah dac cepat pertumbuhannya.

2. Sel inang tetap, sel inang yang digunakan untuk mengekspresikan gen asingyang diklon tersebut

G. Latihan dan Tugas

Untuk memantapkan pemahaman anda mengenai materi dalam modul ini

maka anda perlu mengerjakan tugas di bawah ini1. Jelaskan secara singkat tahapan dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara

in vitro!

2. Jelaskan secara singkat berbagai mekanisme perpindahan material genetik pada

bakteri!


71/79

lxxi

3. Jelaskan secara singkat urutan siklus amplifikasi DNA dengan menggunakan PCR!

4. Susunlah sebuah poster mengenai salah satu materi pada modul ini kemudian

presentasikan secara oral!

H. Indikator Penilaian

Kemampuan menyelesaikan latihan, ketepatan konsep dgn contoh, kejelasan

uraian,kemutakhiran tugas pustaka, ketuntasan gagasan pada poster dari model yang

dipilih, kreativitas, kerja sama tim pada presentasi.

BAB III. PENUTUP

Rangkuman


digunakan untuk menggabungkan molekul-molekul DNA secara in vitro. Tahapan

dasar dalam melakukan rekombinasi DNA secara in vitro adalah Isolasi molekul

DNA, pemotongan DNA menggunakan enzim endonuklease restriksi, penyambungan

molekul-molekul DNA menggunakan enzim DNA ligase ke dalam suatu molekul

DNA vektor, transformasi sel inang dengan DNA rekombinaan dalam sel inang,

analisis dan

modul bioteknologi tanaman

Documents