MIKrobiologi klinik pada infeksi

MIKrobiologi klinik pada infeksiSiti MariamGejala klinis infeksiKecurigaan adanya infeksi ditandai dengan keluhan : demam, menggigil, nyeri kepala atau mialgiaBila secara berdasarkan anamnesis dan pemeriksaan fisik lokalisasi infeksi tidak dapat ditemukan pemeriksaan laboratorium untuk memastikan :Ada atau tidaknya infeksi: (hitung leukosit, LED, Protein C-Reaktif, Interleukin dan faktor nekrosis tumor)Mengidentifikasi penyebab yang spesifik (Visualisasi langsung agen infeksi, immunoassay atau probe asam nukleat agen infeksius)Pemeriksaan Adanya InfeksiPeningkatan hitung leukosit di darah perifer atau dalam cairan tubuh merupakan bukti adanya infeksi. Peningkatan berlebihan persentase neutrofil mengisyaratkan infeksi bakteri.Laju Endap Darah (LED) : peningkatan laju endap darah menunjukkan adanya peradangan akut atau terjadi infeksi kronis yang memerlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk menentukan agen infeksi penyebabnya. Pemeriksaan ini tidak terlalu spesifik karena LED dapat disebabkan oleh hal lainnya Protein C- reaktif adalah reaktan fase akut yang konsentrasinya dalam serum atau cairan tubuh meningkat pada saat terjadi infeksi lokal atau sistemik. Pemeriksaan ini tidak spesifik karena banyak keadaan lain selain infeksi juga meningkatkan kadar pritein c-reaktif 4. Interleukin dan faktor nekrosis tumorSitokin adalah sekelompok protein dengan berat molekul rendah yang mengatur kekuatan dan lama respons imun dan peradangan (limfokin, monokin, interleukin dan interferon) yang dihasilkan oleh berbagai sel dalam tubuh.Interleukin-6 (IL-6) merupakan mediator respon peradangan penting, yang dihasilkan sebagai respon terhadap pengeluaran interleukin-1 dan faktor nekrosis tumor dan berfungsi :Sebagai sinyal untuk mengaktifkan sel TMerangsang pembentukan antibodi oleh sel BMemicu diferensiasi sel T sitotoksik

IL-6 merupakan pemicu utama pembentukan protein C-reaktifAdanya IL-6 dalam serum dan CCS merupakan penanda yang lebih peka untuk infeksi akut dari pada protein C-reaktif

Identifikasi infeksiIdentifikasi mikroba penyebab infeksi dapat dilakukan dengan :Identifikasi morfologi penyebab infeksi pada spesimen atau pada biopsi jaringan dengan mikroskop cahaya atau mikroskop elektron.Isolasi dan identifikasi m.o. dengan biakan atau kultur.Antigen dideteksi secara imunologi (aglutinasi latex, EIA, dsb.) atau dengan pewarnaan antibodi dengan label flourescen atau label peroksidase.Hibridasi DNA-DNA atau DNA-RNA untuk mendeteksi gene spesifik pada spesimen pasien.

Faktor yang mempengaruhi Hasil Pemeriksaan MikrobiologiKondisi-kondisi yang harus diperhatikan pada spesimen.Valid atau tidaknya hasil pemeriksaan spesimen dari Hasil pemeriksaan laboratorium sangat dipengaruhi beberapa hal:1.Tempat pengambilan spesimen dan jumlah serta kualitas spesimen yang ternatung pada pengambilan spesimen yang dilakukan dengan meminimalkan terjadinya pencemaran. Spesimen dapat mewakili proses infeksi contoh: sputum bukan saliva,usapan dari luka dalam bukan dari permukaan lukaWaktu pengambilan, pengumpulan serta penyimpanannya.Tergantung juga pada kepakaran dan pengalaman teknisi laboran. Kuantitas sampel harus cukupTidak terjadi kontaminasi pada spesimen , bekerja dengan menggunakan alat-2 steril dan bekerja secara aseptis.5. Spesimen untuk pemeriksaan adanya bakteri maupun fungi, sebaiknya sebelum penderita diberikan antimikroba. Bila sebelum pemeriksaan sudah diberikan antimikroba maka pemakaian antimikroba harus dihentikan dahulu. Kemudian beberapa hari kemudian dilakukan pengambilan spesimen ulang.

1. Visualisasi langsungPemeriksaan dengan mikroskop cahaya masih berperan sentral dalam mendiagnosis dini penyakit infeksi, karena memberi bukti langsung tercepat adanya infeksiPemeriksaan dengan mikroskop diakukan dengan teknik pewarnaanTujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

Macam Macam PewarnaanPewarnaan sederhana : Pewarnaan positif dan Pewarnaan negatifPewarnaan diferensial : Pewarnaan gram, Pewarnaan acid fast (tahan asam) dll.Pewarnaan khusus : Pewarnaan endospora, Pewarnaan flagella, dllPewarnaan JamurPewarnaan SederhanaPewarnaan sederhana bertujuan untuk memgetahui bentuk bakteri. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana yang mengunakan satu macam zat warnaPewarnaan negatif suatu preparat yang diberi warna dan setelah di lihat dibawah mikroskop objeknya tidak berwarna (transparan) sedangkan lapangannya berwarna.Pewarnaan positif suatu preparat yang diberi warna dan setelah di lihat dibawah mikroskop objeknya berwarna sedangkan lapangannya tidak berwarna (transparan)

Pewarnaan DiferensialPewarnaan Gram suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Bakteri gram (+) berwarna ungu dan gram (-) berwarna merah muda

Pewarnaan DiferensialPewarnaan Acid Fast (Tahan Asam) Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, sehingga bakteri harus diberi pewarna khusus disertai dengan pemanasan.Pewarnaan tahan asam dapat digunakan untuk membantu menegakkan diagnosa tuberkulosis. Pewarnaan tahan asam menggunakan : Pewarnaan Ziehl-NelsenA (cat karbol fuchsin), dilakukan pemanasan, Ziehl-Neelsen B (alkohol asam :HCL 3% dalam metanol 95%) dan ziehl neelsen C (cat biru metilen) Hasil pewarnaan maka bakteri tahan asam akan berwarna merah dan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.Pewarnaan Kinyoun menggunakan pewarna Karbol-fuchhsin yang pekat sehingga zat warna menembus mikroba dan tidak perlu pemasan Pada waktu pencucian lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen Pewarnaan Fluorokrom Pewarna primer campuran warna auramin O dan rodamin B dalam karbol-gliserol, dekolorisasi dg HCl/etanol dan larutan kaliumpermanganat yang menghilangkan fluoresensi latar bakteri berfluoresensi, pemeriksaan ini lebih sensitif

Pewarnaan Zeil Neilson dan KinyounPewarnaan FluorokromPewarnaan KhususPewarnaan endospora Endospora dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), diperlukan teknik pewarnaan endospora dengan prosedur pewarnaan endospora metode Schaeffer-Fulton.

Pewarnaan flagella Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

Pewarnaan kapsulPewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

Fungi diperiksa di jaringan dengan metode-metode berikut: Kerokan kulit dilarutkan dalam KOH 10% untuk meningkatkan kemampuan kita melihat fugi di bawah mikroskop cahaya Calcofluor white mengikat dinding sel karbohidrat kompleks dan menyebabkan jamur berwarna biru putih terang, sel manusia tidak memperlihatkan fluoresensi. Pewarna fungi khusus mencakup pewarna perak ( fungi dan membrane basal berwarna perak), dan reaksi periodic acid Schiff (PAS) (fungi berwarna merah muda). Tinta India (digunakan pada sediaan basah untuk sedimen CSS) memperjelas kapsul Cryptococcus neoformans , tetapi memiliki sensitivitas hanya 50% sehingga tidak dapat menyingkirkan meningitis kriptokokkus. Metode imunologik, seperti aglutinasi partikel lateks (APL) untuk mengidentifikasi adanya antigen polisakarida kapsul dalam CSS, jauh lebih peka dari pada tinta india. Pewarna Imunoflouresen untuk mengidentifikasi beberapa fungi dalam jaringan.

Pewarnaan untuk Identifikasi Fungi

2. Metode KulturMetode Kultur dapat dilakukan dengan identifikasi :Morfologi KoloniSidik jari Biokimia Karakteristik Mikrobiologi1. Morfologi KoloniPengamatan morfologi koloni bakteri merupakan langkah pertama untuk mengidentifikasi bakteri

Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik, bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas koloni (halus atau tidak beraturan)

Mengamati pertumbuhan bakteri berdasarkan morfologi koloni padaPada media cawan Pada agar miringpada agar tegakpada media cair

a. Koloni Pada CawanCiri-ciri yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :Ukuran; Pinpoint/punctiform (titik)Small (kecil)Moderate (sedang)Large (besar)

Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media

3) Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.Opaque (tidak dapat ditembus cahaya), Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian), Transparant (bening)

4) Bentuk Circular Irregular Spindle FilamentousRhizoid

6) ElevasiFlatRaisedConvexUmbonate

5) Margins EntireLobateUndulateSerrateFelamentousCurled

7) PermukaanHalus mengkilapKasarBerkerutKering seperti bubuk

b. Koloni pada Agar Miring

c. Koloni pada Agar tegakPola pertumbuhan berdasarkan kebutuhan O2Pada Media Cair Pada Media Padat

d. Koloni pada Media Cair

2. Pewarnaan BakteriPewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan.Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo RedMacam Macam PewarnaanPewarnaan sederhanaPewarnaan positifPewarnaan negatifPewarnaan diferensialPewarnaan gramPewarnaan acid fast dll.Pewarnaan khususPewarnaan endosporaPewarnaan flagella2. Sidik Jari BiokimiaSemua mikroorganisme mempunyai ciri-ciri tersendiri dalam reaksi biokimia, sama halnya dengan sidik jari pada manusia yang berbeda-beda untuk setiap individunya, sehingga reaksi biokimia mikroorganisme ini disebut juga sidik jari biokimia yaitu sifat-sifat yang terkendali oleh sel-sel untuk menghasilkan enzim aktif yang mempunyai kemampuan untuk : bioenergi, biosintetis dan biodegradasi.

Hasil sampingan dari metabolisme tersebut dapat digunakan untuk identifikasi bakteri.

a. Uji Fermentasi KarbohidratHasil akhir fermentasi karbohidrat ditentukan oleh sifat bakteri, media biakan yang digunakan, serta faktor lingkungan antara lain suhu dan pH.Media fermentasi harus mengandung senyawa yang dapat dioksidasi dan difermentasikan oleh bakteri. Pembentukan asam hasil fermentasi dapat diketahui dengan cara pemberian indikator ke dalam media.Media : Kaldu karbohidrat (glukosa, laktosa, manitol, maltosa dan sukrosa).Media digunakan untuk uji pembentukan asam dan gas hasil fermentasi.Pembentukan gas dapat ditentukan dengan menggunakan tabung Smithatau Durham.Tabung Smith digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan harus ditentukan.Tabung Durham digunakan bila jumlah dan macam gas yang dihasilkan tidak perlu diketahui. Bila terbentuk gas, gas masuk ke dalam tabung Durham dan mendesak cairan dalam tabung ini; gas ini terlihat sebagai gelembung udara yang terperangkap dalam tabung Durham.Asam hasil fermentasi menyebabkan penurunan pH. Indikator yang digunakan : merah fenol dan bromcresol purple. Pembentukan asam ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning.2. Uji Metil MerahUji metil merah sangat berguna dalam identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.Pada uji fermentasi menggunakan tabung Durham, hasil produksi fermentasi tidak diketahui.Uji metil merah digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran dengan menggunakan media : MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer).Fermentasi asam campuran ditentukan dengan menumbuhkan bakteri dalam kaldu yang mengandung glukosa dan menambahkan indikator metil merah ke dalam kaldu setelah masa inkubasi. Indikator berwarna merah pada pH 4.4 dan berwarna kuning pada pH 6.2.Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap berwarna merah karena terjadi penurunan pH pada kaldu biakan. Bila tidak terjadifermentasi asam campuran maka kaldu biakan akan menjadi berwarna Kuning.

3. Uji Voges-ProskauerUji ini digunakan untuk identifikasi bakteri yang memfermentasikan karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol.Asetoin (asetilmetilkarbinol) adalah senyawa pendahulu dari 2,3- butanadiol.Penambahan KOH dan alphanaphtol dapat menentukan adanya asetoin.Pada penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas denganpenambahan larutan alphanaphtol.Media yang digunakan : MR-VP.

4. Respirasi KarbohidratBakteri menggunakan glukosa sebagai sumber energi denganmengoksidasikannya menjadi piruvat melalui glikolisis. Piruvat masuk ke dalam siklus Krebs. Dalam siklus Krebs, terjadi oksidasi menghasilkan proton dan elektron. Proton dan elektron masuk ke dalam sistem transport elektron untuk menghasilkan ATP. Proton dan elektron akan ditangkap oleh akseptor elektron, misalnya oksigen atau nitrat. Bila akseptor elektron terakhir berupa oksigen, prosesnya disebut respirasi aerobik. Bila akseptor elektron terakhir berupanitrat atau molekul inorganik lainnya, prosesnya disebut respirasi anaerobik.Uji OksidaseUji ini berguna untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang ditemukan pada bakteri tertentu.Uji ini berguna dalam identifikasi bakteri patogen seperti Neisseria gonorrhoea dan Pseudomonas aeruginosa.Bila koloni bakteri yang bersifat oksidase-positif diberi reagen oksidase (dimetil-p-fenillendiamin oksalat), maka warna koloni berubah menjadi hitam. Perubahan warna ini disebabkan oleh oksidase sitokrom yang mengoksidasi larutan reagen. Bila tidak terjadi proses oksidasi, misalnya terjadi reaksi reduksi, tidak akan terjadi perubahan warna pada koloni.

b. Uji Katalase Pada bakteri berbentuk coccus, uji katalase berguna untuk membedakan Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Staphylococcus bersifat katalase-positif, sedangkan kelompok Streptococcus bersifat katalase-negatif.Uji katalase menggunakan larutan H2O2. Pada bakteri bersifat katalasepositif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni. Reaksi :H2O2 H2O 1/ 2O2c. Uji Reduksi Nitrato Nitrat digunakan oleh beberapa bakteri sebagai akseptor elektron terakhir.O Nitrat (NO3direduksi menjadi nitrit (NO2kemudian menjadi N2.o Kemampuan mereduksikan nitrat digunakan sebagai ciri dalam identifikasi bakteri. E. coli mereduksi nitrat menjadi nitrit, sedangkan P. aeruginosa mereduksi mereduksi nitrat hingga menjadi N2.o Uji reduksi nitrat menggunakan kaldu nutrien yang mengandung KNO3 dan tabung Durham. Perhatikan apakah terbentuk gas pada tabung serta nitritpada media biakan.o Gas yang terperangkap dalam tabung Durham merupakan campuran gas N2 dan CO2.o Gas N2 berasal dari penguraian sempurna nitrat, sedangkan CO2 berasal dari siklus Krebs.o Penambahan asam sulfamat dalam media biakan yang mengandung nitrit akan menyebabkan pembentukan gelembung gas (N2) sebagai hasil reduksi(NO2-) menjadi N2.5. Uji IndolGugus indol merupakan bagian dari asam amino triptofan. Dalam media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lain dari molekul triptofan digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara bakteri.Penumpukan indol dalam media biakan dapat diketahui dengan penambahan reagens (Kovacs, Gore, Ehrlich dan Ehrlich-Bohme) yang mengandung para-dimetil-aminobenzaldehida. Reagens akan bereaksi dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan media biakan.Media yang digunakan bersifat semipadat, oleh karena itu dapat digunakan juga untuk melihat pergerakan bakteri. Jika bakteri bergerak akan terlihat pertumbuhan di sekitar tusukan dan juga pada permukaan media.

6. Uji IMViCUji untuk membedakan Enterobacter aerogenes dan E. coli.Uji IMViC terdiri dari Uji Indol-Metil Merah-Voges Proskauer-Citrat.

Uji Hidrogen SulfidaAsam amino sistein dan metionin dihasilkan saat protein dihidrolisis untuk memenuhi kebutuhan zat hara bakteri.Sistein dan metionin mengandung sulfur.Bakteri yang menghasilkan desulfurase sewaktu dibiakkan dalam media yang kaya dengan asam amino yang mengandung sulfur akan membentuk H2S. Fe++dalam biakan bereaksi dengan H2S dan menghasilkan senyawa FeS yang berwarna hitam dan tidak larut dalam air.8. Uji Dekarboksilase LisinDekarboksilasi merupakan proses penguraian gugus karboksil dari suatu molekul organik.Proses dekarboksilasi asam amino menghasilkan CO2.Proses dekarboksilasi lisin dapat diketahui dengan menumbuhkan bakteri dalam biakan yang mengandung lisin, karbohidrat yang dapat difermentasikan (glukosa) dan indikator pH untuk melihat perubahan pH. Indikator yang digunakan adalah brom cresol purple (BCP).Asam yang dihasilkan dalam proses fermentasi glukosa akan menurunkan pH media biakan dan menyebabkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning.Dalam suasana asam, proses dekarboksilasi lisin dapat berlangsung sehingga terjadi pembentukan amin yang menetralisasi suasana asam.Proses netralisasi asam ini terlihat sebagai perubahan warna dari kuningmenjadi ungu seperti sebelumnya.Perubahan warna ungu ini menunjukkan bahwa lisin mengalamidekarboksilasi.Uji dekarboksilasi lisin merupakan salah satu uji yang digunakan dalampencirian bakteri, terutama yang menempati saluran pencernaan.9. DeaminasiProses deaminasi fenilalanin menghasilkan asam fenilpiruvat. Reaksi asam fenilpiruvat dengan ferri klorida (FeCl3) menghasilkan senyawa berwarna hijau.Aktivitas enzim deaminase fenilalanin ditentukan dengan cara menumbuhkan bakteri dalam media biakan yang mengandung fenilalanin dan menambahkan beberapa tetes larutan FeCl3. Warna hijau setelah penambahan reagens menunjukkan bahwa fenilalanin telah dideaminasikan.10. Uji Sitrat Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.Digunakan media sitrat-Koser (cair) atau sitrat-Simmon (padat).Sitrat-Simmon mengandung Na sitrat (sumber karbon), NH4 + sebagai sumber N dan biru bromtimol sebagai indikator.Pada media sitrat-Koser, tidak terkandung indikator.Bila bakteri mampu menggunakan sitrat yang terkandung pada media sitrat- Simmon, maka asam akan dihilangkan dari media biakan, terjadi peningkatan pH dan mengubah warna media dari hijau menjadi biru.Pada media sitrat-Koser, kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan.

3. Karakteristik MikrobiologiUntuk mengetahui karakteristik mikrobiologi dari bakteri digunakan media selektif atau media diferensial.Media selektif : mengandung paling sedikit 1 bahan yg menghambat perkembangan bakteri yg tidak diinginkan dan membolehkan perkembangbiakkan bakteri tertentu yg ingin diisolasi. Contoh : antibiotika (streptomycin, penisilin), kristal violet dsb.Media diferensial : berbagai kelompok bakteri dapat tumbuh pada media ini.Kelompok bakteri dapat dibedakan berdasarkan perubahan pada media biakan atau penampilanMedia yang digunakan untuk uji identifikasi diantaranya : Endo Agar Brilliant Green Agar Mac Conkey Agar China-Blue Lactose Agar Manitol Salt Agar Agar Darah Litmus MilkENDO AGARMengandung : laktosa, Na-sulfitSifat pertumbuhan koloni : Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni yang tembus terang, tidak berwarna , dikelilingi oleh media berwarna merah muda.Bakteri yang memfermentasikan laktosa terlihat sebagai koloni berwarna merah metalik dan dikelilingi oleh media yang berwarna kemerahan.

Escherischia Coli

Enterobacter sakazakii

Klebsiella pneumoniaeBRILLIANT GREEN AGARMengandung gula laktosa dan sukrosa.Zat warna brilliant green menghambat pertumbuhan E. coli, Proteus dan Pseudomonas.Media digunakan untuk isolasi dan identifikasi Salmonella dari tinja dan bahan makanan. Indikator : merah fenol, merah (basa) , kuning (asam). Sifat pertumbuhan koloni :Salmonella : Koloni berwarna merah muda dikelilingi oleh media berwarna merah.Proteus : Akan terlihat sebagai koloni merah tanpa penyebaran koloni.Pseudomonas : Koloni kecil berwarna merah dengan permukaan yang menjorok ke dalam.Bakteri yang memfermentasikan laktosa atau sukrosa Pertumbuhan bakteri ini dihambat, tampak sebagai koloni hijau-kuning dikelilingi oleh media yang berwarna hijau-kuning.MAC CONKEY AGARMengandung laktosa, garam empedu.Media ini menghambat pertumbuhan bakteri Gram-positif.Koloni dari bakteri Gram-negatif yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu.Endapan garam empedu karena penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam empedu.Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen tidak memperlihatkan perubahan pada media. Warna koloni = warna media.

Koloni

BakteriSerupa mediaSalmonella, ShigellaMerah, dikelilingi olehzona keruhE. Coli

Kecil dan tidak terangt embus

Enterococcus,Staphylococcus

Merah mudaEnterobacter, Klebsiella

Escherischia coliSerratia marcescens

CHINA-BLUE LACTOSE AGARUntuk membedakan bakteri yang memfermentasikan dan tidak memfermentasikan laktosa.Tidak ada bahan yang menghambat pertumbuhan bakteri.Bakteri Gram-positif dan Gram-negatif dapat tumbuh pada media ini.Penguraian laktosa menjadi asam akan terlihat karena adanya indikator china blue, sehingga warna akan menjadi biru tua.Koloni

BakterBiru tua dikelilingi oleh zona biru

E. coliiPutih, kadang-kadang dikelilingizona beningLaktose-negatif

Biru hijau dan tidak terang tembus Staphylococcus

Biru muda dan tidak terang tembus Enterococcus

AGAR DARAHUntuk menumbuhkan bakteri yang sulit untuk dibiakkan dan untuk membedakan kelompok bakteri yang melisis atau tidak melisiskan butir darah merah.Mengandung 5% darah domba.Lisis butir darah merah terlihat sebagai wilayah jernih di sekitar koloni.Jenis-jenis hemolisis :o Beta-hemolisis : lisis sempurna, wilayah benar-benar jernih.o Alpha-hemolisis : proses lisis tidak sempurna, media berwarna kehijauan.o Gamma-hemolisis : bakteri tidak mampu melisiskan butir darah merah dan tidak menyebabkan perubahan nyata pada media.o Proses hemolisis disebabkan oleh enzim yang dilepaskan bakteri.Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Enterococcus faecalisMANITOL SALT AGARMengandung NaCl 7.5%, manitol.Digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang bersifat patogen dan yang tidak patogen.Indikator untuk melihat adanya pembentukan asam merah fenol. Zona warna merah disebabkan oleh manitol yang tidak terfermentasikan.Zona warna kuning disebabkan oleh fermentasi manitol disertai pembentukan asam. Misal : S. aureus membentuk zona kuning patogen. S. epidermidis membentuk zona merah tidak patogen.

LITMUS MILKMengandung skim milk dan indikator litmus.Reaksi yang terjadi :o Asam : Media berubah warna menjadi merah muda.o Basa : Media berubah warna menjadi biru atau ungu.o Reduksi : Media berubah warna menjadi putih.o Koagulasi : Media akan terlihat padat karena koagulasi protein pada keadaan asam.o Peptonisasi : Media berubah warna menjadi biru.o Pembentukan Gas : Terjadi penguraian laktosa menjadi asam dan gas.3. Immunoassay Deteksi Antigen MikrobaImmunoassay adalah deteksi dan uji zat dengan metode serologis (imunologi), pada sebagian besar aplikasi zat tersebut berfungsi sebagai antigen, baik dalam produksi antibodi dan dalam pengukuran antibodi oleh zat uji

Prinsip metode imunoassay yang sering digunakan adalah :1. Reaksi presipitasi2. Reaksi aglutinasi3. Reaksi netralisasi4. Reaksi fiksasi komplemen5. Reaksi imunofluoresensi6. Radioimmuno assay (RIA)7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)23

Metode Immunoassay1. Reaksi presipitasiAdalah jika complex antigen-antibodi yang terbentuk berukuran terlalu besar, sehingga tidak dapat bertahan untuk terus berada di larutan dan akhirnya mengendap. Presipitasi terjadi karena reaksi antara antigen yang larut dengan antibodi, membentuk komplek berupa anyaman.Reaksi dilakukan untuk mengetahui kadar antibodi dalam serum.

2. Reaksi aglutinasiAglutinasi adalah uji serologi dimana virus atau bakteri yang tersuspensi dalam larutan bersatu menjadi gumpalan apabila suspense tersebut diperlakukan dengan antiserum yang mengandung antibody spesifik terhadap virus atau bakteri tersebut. Berbeda dengan reaksi presipitasi, reaksi aglutinasi ini dilakukan untuk antigen yang tidak larut, berbentuk partikel atau antigen yang larut tapi terikat dengan partikel atau sel. Antigen tersebut bereaksi dengan antibodi membentuk suatu agregat yang dpat dilihat yang disebut aglutinasi.

3. Reaksi netralisasiReaksi antara antigen dan antibodi untuk mencegah adanya efek yang berbahaya antara lain adanya eksotoksin bakteri atau virus. Senyawa yang dapat menetralkan toksin disebut dengan antitoksin, merupakan antibodi spesifik yang diproduksi oleh sel hospes.Reaksi antara antitoksin yang dapat menetralkan toksin bakteri disebut dengan reaksi netralisasi.

Metode Immunoassay4. Reaksi fiksasi komplemenComplement Fixation Test (CFT) atau uji Fiksasi komplemen merupakan cara untuk menentukan antigen atau antibodi yang hanya bereaksi bila ada komplemen. Antibodi dicampur dengan antigen dan komplemen. Komplemen akan diikat kompleks antigen-antibodi. Bila tidak terjadi ikatan komplemen, maka komplemen akan ditemukan bebas dalam larutan. Adanya komplemen bebas tersebut dapat diperlihatkan dengan menambahkan sel darah merah dan hemolisin. Lisis sel darah merah akan terjadi atas pengaruh komplemen yang bebas tadi.Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.

Metode Immunoassay4. Reaksi fiksasi komplemenComplement Fixation Test (CFT) atau uji Fiksasi komplemen merupakan cara untuk menentukan antigen atau antibodi yang hanya bereaksi bila ada komplemen. Antibodi dicampur dengan antigen dan komplemen. Komplemen akan diikat kompleks antigen-antibodi. Bila tidak terjadi ikatan komplemen, maka komplemen akan ditemukan bebas dalam larutan. Adanya komplemen bebas tersebut dapat diperlihatkan dengan menambahkan sel darah merah dan hemolisin. Lisis sel darah merah akan terjadi atas pengaruh komplemen yang bebas tadi. Reaksi fiksasi komplemen dapat menentukan kadar antibodi yang rendah yang tidak dapat dideteksi dengan cara uji presipitasi ataupun aglutinasi.

5. Reaksi imunofluoresensiTeknik ini merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet. Uji ini merupakan cara yang cepat, sensitif dan sangat spesifik.6. Radioimmuno assay (RIA)Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini.Terdapat dua cara untuk melakukan pemeriksaan dengan teknik RIA ini, pertama dengan penentuan berdasarkan reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase radio immuno assay) dan yang kedua adalah berdasarkan reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase radio immuno assay).

Metode Immunoassay5. Reaksi imunofluoresensiTeknik ini merupakan kombinasi antara zat warna fluoresein dengan antibodi sehingga menimbulkan warna pendaran ketika dilihat pada mikroskop dengan sinar ultra violet. Uji ini merupakan cara yang cepat, sensitif dan sangat spesifik.

Metode Immunoassay6. Radioimmuno assay (RIA)Teknik RIA merupakan cara diagnostik yang mampu mengukur konsentrasi antigen maupun antibodi yang berkadar rendah, sehingga memungkinkan untuk mendeteksi adanya kelainan tubuh secara dini.Terdapat dua cara untuk melakukan pemeriksaan dengan teknik RIA ini, pertama dengan penentuan berdasarkan reaksi antigen antibodi dalam larutan (liquid phase radio immuno assay) dan yang kedua adalah berdasarkan reaksi pada zat padat atau partikel (solid phase radio immuno assay).

Metode Immunoassay7. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampelElisa terdri dari :Elisa metode Direct yaitu antigen berikatan dengan antibodi yang mengikat Enzim, di bantu dengan penambahan substrat membentuk kompleks warna.Elisa metode Indirect yaitu antigen berikatan dengan antibodi Primer,lalu antibodi primer berikatan dengan second/konjugat antibodi yang mengikat enzim, di bantu dengn penambahan substrat membentuk kompleks warna.Elisa metode competitif yaitu antigen-antibody yang telah diinkubasi berikatan dengan secondary antibodi,di bantu dengan penambahan substrat membentuk kompleks warna.Elisa metode Sandwich/Capture yaitu capture-Ab berikatan dengan antigen, lalu antigen berikatan dengan primary-Ab. Primary-Ab berikatan lagi dengan Second-Ab yang mengandung enzim, dan dengandengan penambahan substrat membentuk kompleks warna.

4. Identifikasi bakteri dengan 16S rRNA.Sekuens 16S rRNA bakteri memiliki daerah yang conserve (stabil), namun bagian tertentu yang variabel dapat menentukan keragaman bakteri.

Bagian yang variabel ini merupakan bagian yang spesifik untuk spesies (species-specifik marker).

Identifikasi dengan mengamplifikasi bagian ini dengan PCR (polymerase chain reaction), kemudian disekuens, data sekuens yang diperoleh dapat sebagai identifikasi.

Patogen yang sulit dikultur atau yang tidak dapat dikultur di laboratorium dapat diidentifikasi menggunakan teknik ini. Sebagai contoh, Tropheryma whippelii, penyebab Whipples disease.55

56TERIMAKASIH