Sterilisasi Alat dan Bahan

Teori Dasar

Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman untuk ditangani, tujuannya untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada beberapa metode dekontaminasi, yaitu:

1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.

2. Desinfeksi : metode untuk memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen.

3. Sanitasi : metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup.

Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti : konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik. Inaktivasi mikroorganisme dengan dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai berikut :

Koagulasi dan denaturasi protein

Lisis

Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim

Oksidasi

Hal penting yang harus diperhatikan dalam melakukan dekontaminasi :

1. Target mikroorganisme.

2. Dekontaminan yang digunakan (bentuk dan target yang diinginkan).

3. Tingkat inaktivasi yang diperlukan.

4. Adanya substrat organik seperti darah, agar, dsb.

5. Tipe permukaan dari target seperti : padat, berpori atau mudah diterbangkan udara.

6. Konsentrasi tertinggi dari sel yang dapat ditanggulangi dengan inaktivasi.

7. Kemampuan dekontaminan kontak dengan mikroorganisme.

8. Prosedur antisipasi yang diperlukan dalam dekontaminasi agar efisien dalam waktu dan konsentrasi yang digunakan.

9. Toksisitas dari dekontaminan yang dapat membahayakan praktikan di area tersebut.

Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu :

1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)

2. Sterilisasi Panas Kering

3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)

4. Sterilisasi Gas

5. Sterilisasi dengan Radiasi

Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering.

1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)

Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :

1. Penguraian gula.

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan jika tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut.

Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoclave adalah :

- Suhu 115,5 , waktu 30 menit

- Suhu 121,5 , waktu 20 menit

- Suhu 126,5 , waktu 15 menit

Metode sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap temperatur yang dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air, larutan dengan pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet dan plastik, dan media untuk pekerjaan mikrobiologi.

2. Sterilisasi Panas Kering

Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril, karena metode sterilisasi panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap. Metode ini memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperatur 160-170 dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak, minyak mineral, gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah.

Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas kering, maka metode ini dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup karet atau plastik. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering dengan menggunakan oven steril adalah :

Suhu 170C, waktu 1 jam

Suhu 160C, waktu 2 jam

Suhu 150C, waktu 2,5 jam

Suhu 140C, waktu 3 jam

Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.

3. Sterilisasi dengan Penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil, penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi, khususnya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik.

4. Sterilisasi Gas

Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.

5. Sterilisasi dengan Radiasi

Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan alat-alat medis yang peka terhadap panas (termolabil) dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar ) dan arus partikel kecil (sinar dan ).

pembahasan

Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasi alat-alat yang berada di laboratorium mikrobiologi. Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alat- alat yang disterilisasi yaitu tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume, dan cawan petri. Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoclave merupakan alat-alat gelas yang presisi. Dalam sterilisasi uap (panas lembab) menggunakan autoclave dengan membutuhkan waktu yang sangat singkat untuk mensterilkan alat dan pada suhu 121, karena alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Sedangkan jika menggunakan oven dalam sterilisasi uap membutuhkan waktu yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170 . Karena pada suhu 160-170 , alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum alat-alat gelas disterilisasikan menggunakan autoclave, semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil. Tujuannya yaitu semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba agar tidak ada lagi spora mikroba yang masuk.

Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Nutrien Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.

Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 3,9150 gram Nutrien Broth dan 300 ml aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Broth dipanaskan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Sedangkan untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 10,05 gram Nutrien Agar dan 500 ml aquades. Nutrien agar dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning tua keruh. Warna kuning tua keruh ini berarti larutan masih belum steril, setelah itu Nutrien Agar dipanaskan juga menggunakan hot plate . Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning tua jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil agar proses sterilisasi media Nutrien Broth berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121 selama 15 menit. Setelah 15 menit, labu dikeluarkan dari autoclave dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna kuning jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum dimasukkan kedalam autoclave. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat dalam waktu 24 jam.

Tujuan dilakukan membuat media dari Nutrien Agar dan Nutrien Broth adalah untuk biakan jamur pada Nutrien Agar, dan sebagai media pertumbuhan bakteri pada Nutrien Broth. Dari percobaan yang telah dilakukan ternyata hasil yang diperoleh dari media Nutrien Agar tidak terdapat bakteri yang berupa lendir pada bagian atas media dan pada Nutrien Broth tidak terdapat jamur yang tumbuh di sekitar mulut tabung. Hal ini di sebabkan karena alat-alat yang dipakai masih steril, sedangkan jika terdapat bakteri dan jamur pada media alat-alat yang dipakai sudah dalam kondisi tidak steril lagi.

mikroorganisme yang dijumpai di laboratorium dan pada permukaan tubuh

pembahasan

Mikroorganisme adalah sebuah organisme kehidupan yang terlalu kecil untuk dilihat dengan mata telanjang. Ukuran yang digunakan untuk mikroorganisme adalah mikrometer (m) ; 1m = 0,001 milimeter, 1 nanometer = 0,001 m. Mikroorganisme dapat ditemukan dimana-mana dan sangat berperan dalam semua kehidupan di muka bumi. sebagai contoh pada praktikum kali ini yaitu dilakukan pengamatan mengenai contoh contoh mikroorganisme yang sering dijumpai di laboratorium dan juga pada tubuh manusia .

mikroorganisme atau mikroba dapat dibiakkan melalui medium pertumbuhan mikroba. Medium pertumbuhan mikroba adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran nutrien yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan menggunakan bahan medium pertumbuhan, aktivitas mikrobia dapat dipelajari dan dengan menggunakan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikrobia menjadi biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk pertumbuhan medium dapat dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang meliputi air, agar yang bersifat tidak diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein yang dapat diuraikan oleh mikrobia, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat khusus untuk menumbuhkan mikrobia yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-asam organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam kimia (K, Na, Fedan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium dengan tujuan tertentu seperti indikator maupun anti biotik. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh media yang digunakan disterilkan terlebih dahulu.

Dalam praktikum kali ini percobaan yang dilakukan adalah pembuatan media dari nutrient agar dan nutrient browth.

Sama seperti pembuatan media bakteri pada umumnya, bahan-bahan yang diperlukan ditimbang terlebih dahulu kemudian dicampur dan dipanaskan. Pada saat dipanaskan media harus diaduk supaya larutan yang ada di dalam media tersebut dapat homogen dengan baik.

Untuk media pada cawan petri, yang disterilisasikan dalam autoklaf yaitu erlenmeyernya, baru sesudah itu media dipindahkan ke dalam cawan petri sesuai prosedur cara kerja yang aseptis, sedangkan untuk media pada tabung reaksi yang dipanaskan dalam autoklaf adalah tabung reaksinya. Sesudah media dibuat pada erlenmeyer dan dipanaskan pada air mendidih lalu media dimasukkan ke dalam tabung reaksi untuk kemudian disterilisasikan di dalam autoklaf. Ini bertujuan agar media yang dibuat tidak rusak akibat pemanasan.

kemudian selanjutnya adalah pembiakan bakteri pada medium tersebut. bakteri yang digunakan berasaldari beberapa sumber yaitu permukaan kulit, permukaan lidah, saliva dan kandang tikus. pengamatan dilakukan selama 3 hari dan setiap 24 jam dilakukan pengamatan untuk melihat perkembangannya.

pada media NA dengan sampel bakteri dari permukaan kulit adalah positif menunjukan adanya bakteri. Kebanyakan bakteri kulit di jumpai pada epitelium yang seakan-akan bersisik (lapisan luar epidermis), membentuk koloni pada permukaan sel-sel mati. Kebanyakan bakteri ini adalah spesiesStaphylococcus dan sianobakteri aerobik, atau difteroid. lalu bakteri pada permukaan mulut jug positif , hal tersebut dikarenakan

Kelembapan yang paling tinggi, adanya makanan terlarut secara konstan dan juga partikel-partikel kecil makanan membuat mulut merupakan lingkungan ideal bagi pertumbuhan bakteri. Mikrobiota mulut atau rongga mulut sangat beragam; banyak bergantung pada kesehatan pribadi masing-masing individu.

isoasi identifikasi

Teori: Mikroorganisme ada dimana-mana. Mereka dapat ditemukan di tanah, udara, air,makanan, limbah, bahkan di permukaan tubuh. Singkatnya, setiap area dari lingkungankitapenuh dengan mikroba.Ilmu mikrobiologi memisahkan populasi yang beraneka ragam tersebut menjadi spesies induvidu yang dapat dipelajari (Cappucino, 1983).

Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam populasi yangheterogen.Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam danmenumbuhkannya dalam suatu medium buatan.Prinsip dari isolasi mikroba adalahmemisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuranbermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo,1996).

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. Kultur murni ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal. Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi mikrooraganisme antara cara goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate), cara sebar (spread plate), cara pengenceran ( dilution plate) serta micromanipulator (Pleczar, 1986).

Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (Sutedjo, 1996).

Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu karenaterlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-sel itu dipisahkandengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam media padat dan dibiarkanmembentuk koloni, maka sel-sel tersebut selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang terpisah (Sutedjo, 1996).

Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam mengisolasi bakteri adalah sebagai berikut :

1.Sifat dan jenis mikroorganisme

2.Habitat mikroorganisme

3.Medium pertumbuhan

4.Cara menginokulasi dan inkubasi

5.Cara mengidentifikasi bakteri

6.Cara pemeliharaannya (Dwidjoseputro, 1998)

Ada bermacam-macam metode isolasi yang dapat digunakan. Macam-macam metodeisolasi tersebut antara lain :

1)Isolasi Tunggal

Merupakan metode isolasi dengan cara meneteskan bahan yang mengandung mikroorganisme pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet, yang kemudian diteliti dibawah obyektif mikroskop.

2)Isolasi Gores

Merupakan metode isolasi dengan cara menggeser atau menggoreskan ujung jarum ose yang telah mengandung mikroorganisme dengan hati-hati di atas permukaan agar secara zig zag yang dimulai dari dasar tabung menuju ke bagian atastabung.

3)Isolasi Tebar

Merupakan metode isolasi dengan cara menebarkan bahan yang mengandung mikroorganisme pada permukaan atas tabung

4)Isolasi Tuang

Merupakan metode isolasi dengan cara mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang telah diencerkan dan sampel tersebut kemudian disebarkan didalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer (Dwidjoseputro, 1998).

OlehNuniek, 2001isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu cara penggoresan dan cara penaburan.

a.Isolasi Mikroba dengan Cara Penggoresan

Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat.Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah.

Ada beberapa teknik goresan, diantaranya adalah :

-Goresan T

-Goresan Kuadran

-Goresan Radian

-Goresan Sinambung (Nuniek, 2001)

b.Isolasi Mikroba dengan Cara Penaburan

Cara penaburan (pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu 450C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam mempelajari pertumbuhan kololoniStreptococcalpada sel-sel darah merah.

Distribusi koloni-koloni lebih baik juga diperoleh dalam cawan penaburan yang dibuat dengan baik, dan isolasi akan lebih mudah dibuat. Supaya koloni tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan. (Nuniek, 2001)

Karakteristik koloni bakteri hasil inokulasi merupakan salah satu bagian dalam identifikasi bakteri. Beberapa bentuk koloni spesifik koloni bakteri pada media agar datar yaitu (Sutedjo, 1996) :

-Ukuran

Titik

Kecil

Sedang

Besar

-Warna Koloni

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan tidak kontras dengan air, di mana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Oleh karena itu pengamatan tanpa pewarnaan menjadi lebih sukar dan tidak dapat digunakan untuk melihat bagian-bagian sel dengan teliti.

-Bentuk Koloni

Bundar

Tidak beraturan

Rhizoid (tersebar seperti akar)

-Bentuk Bagian Tepi Koloni (margin)

Rata (entire)

Tidak rata, bergelombang secara beraturan (lobate)

Bergelombang (undulate)

Bergerigi (sellate)

Seperti filamen (filamentous)

Media Spesifik(selective medium) /media penghambat adalah media yang ditambah zat kimia tertentu yang bersifat selektif untuk mencegah pertumbuhan mikroba lain sehingga dapat mengisolasi mikroba tertentu, misalnya media yang mengandung kristal violet pada kadar tertentu, dapat mencegah pertumbuhan bakteri gram positif tanpa mempengaruhi bakteri gram negatif. Media ini selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan.Contohnya adalahLuria bertanimedium yang ditambah Amphisilin untuk merangsangE.coliresisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline Salt Broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuhStreptococcus agalactiaeyang toleran terhadap garam.

Media ini dipakai untuk menyeleksi mikrorganisme sesuai dengan yang diinginkan, jadi hanya satu jenis mikrorganisme saja yang dapat tumbuh dalam media ini atau hanya satu kelompok tertentu saja.

Hal hal yang perlu diperhatikan dalam membuat media adalah :

a)Mencuci tangan sebelum praktikum

b)Menggunakan jas lab dan sarung tangan yang steril

c)Sebelum dan sesudah praktikum meja kerja dan tangan disemprotkan alkohol 70%.

d)Menggunakan alat dan bahan yang sudah disterilkan

e)Tidak banyak bercanda dan berbicara saat praktikum berlangsung.

f)Menggunakan masker

Pada percobaan 3 Isolasi, Identifikasi dan Konfirmasi Mikroba menggunakan beberapa media, diantaranya adalah sebagai berikut ;

-Mac Conkey Agar

Media selektif untuk isolasi dan identifikasi bakteri Gram negatif terutama bakteri yang berasal dari tinja dan urin. Disimpan pada suhu +15C hingga +25C, pH 6.9 - 7.4 dan termasuk media padat. Media ini mengandung garam empedu dan pewarna kristal violet, yang menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan menseleksi bakteri gram negatif. Media ini juga berisi karbohidrat laktosa, yang memungkinkan pembedaan bakteri gram negatif berdasarkan pada kemampuan mereka untuk memfermentasi laktosa.Organisme yang memfermentasi laktosa menghasilkan produk akhir asam yang bereaksi dengan indikator pH merah netral dan menghasilkan warna merah muda.

-Vogel Jonson Agar

Vogel Johnson Agarmengandung mannitol, tellurite dan lithium chloride yang berperan untuk mengisolasi bakteri yang bersifat koagulase positip, karena semua yang bersifat koagulase positip akan tumbuh pada media ini.S. aureusmempunyai koloni hitam sebagai akibat pengendapan hasil reduksi tellurite. Media di sekitar koloni akan berubah menjadi kuning akibat fermentasi mannitol. Adanya lithium chloride:sangat bermanfaat untuk menghambat pertumbuhan bakteri laintermasukE. coli.Namun demikian media ini kurang mampu memilahS. aureuskarena semua koagulase positip dapat tumbuh termasukS. epidermidisdanProteus.

-Cetrimide Agar

Cetrimide Agarbiasanya digunakan untuk isolasiPseudomonas. Kandungan cetrimide yang merupakan quarternary ammonium merupakan senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri lan, karena menyebabkan kebocoran unsur-unsur didalam sel, namun tidak terjadi padaPseudomonas.

Pada media cetrimide konvensional beberapa bakteri dapat tumbuh sepertiKlebsiella, proteusdanProvidencia.Untuk menghambat pertumbuhan mereka dapat ditambahkan cetrimide. Pada media ini,P. aeruginosadapat dibantu dengan menggunakan mediaPseudomonas Selective Mediumyang mengandungNalidixi aciduntuk menghambat pertumbunan bakteri lain.

-Triple Sugar Iron Agar

Media ini berfungsi untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasikan karbohidrat berdasarkan panjang rantai karbon. TSI terdiri dari laktosa 1 %, sukrosa 1%, dan glukosa 0,1 %, kemampuan bakteri dalam menghasilkan H2S dengan adanya presipitat kehitaman pada media dan kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas dengan indikasi media terangkat atau pecah.

Media yang digunakan adalah TSIA (Triple Sugar Iron Agar).Terutama digunakan untuk identifikasi bakteri gram negative.Media ini mengandung 3 macam gula yaitu glukosa, laktosa dan sukrosa, indicator merah fenol dan FeSO4untuk memperlhatkan pembentukan H2S yangditunjukan dengan adanya endapan hitam. Konentrasi glukosa adalah 0,1 dari konsentrasi laktosa aatau sukrosa agar fermentasi glukosa dapatterlihatreaksi dilihat setelah 24-4 8 jam.

penentuan mic

pembahasan

Praktikum kali ini bertujuan untuk menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) antibiotik kloramphenicol terhadap bakteri gram positif maupun gram negatif, dengan menggunakan metoda MIC cair dan menentukan kerentanan suatu bakteri terhadap antibiotik kloramphenicol melalui tes resistensi dengan metode cakram kertas (Paper Disc Plate).

Sebelum melakukan praktikum ini, semua peralatan yang akan digunakan harus disterilisasikan terlebih dahulu untuk memastikan peralatan benar-benar bersih dan mencegah terjadinya kontaminasi yang diakibatkan oleh penggunaan sebelumnya yang dapat mempengaruhi pengamatan pada praktikum ini.

Kloramphenicol merupakan antibiotik spektrum luas yang dapat membunuh bakteri gram positif maupun gram negatif. Kemudian untuk menentukan MIC dari antibiotik kloramphenicol digunakan media cair yakni Nutrient Broth. Nutrient broth dibuat dengan variasi single strength dan double strenght kemudian setelah itu ke dalam media dimasukkan bakteri staphylococcus aureus yang merupakan bakteri gram positif. Ke dalam masing-masing variasi nutrient broth tersebut di masukkan kloramfenicol yang berasal dari konsentrasi 2000 ppm kemudian diencerkan menjadi 1000 ppm,500 ppm, dan 200 ppm. Setelah itu, diinkubasikan pada suhu 37C selama 18-24jam. Pada prinsipnya praktikum ini melihat pengaruh faktor pengenceran dari antibiotika yang dapat menghambat bakteri staphylococcus aureus dalam media nutrient broth yang merupakan nutrisi untuk pertumbuhannya. Dengan begitu kita dapat mengetahui MIC dari kloramphenicol. MIC adalah konsentrasi antibiotik terendah dimana pertumbuhan bakteri terhambat. MIC biasanya dapat dilihat pada tabung reaksi bening terakhir dan tabung reaksi sebelum keruh pertama. Berdasarkan data pengamatan, MIC ditunjukkan saat konsentrasi 1000 ppm pada media nutrient broth yang single strength dan kita dapat lihat juga semakin encer konsentrasi kloramfenicol yang digunakan dia akan semakin keruh karena antibiotik pada konsentrasi yang encer (lebih kecil) tidak mampu untuk meghambat pertumbuhan bakterinya trutama pada media nutrient broth yang double strenght, semuanya menunjukkan cairan yang keruh. Hal ni terjadi karena nutrisi yang diberikan untuk bakteri tersebut konsentrasinya double atau lebih banyak sehingga dapat memperkuat daya tahn bakteri terhadap kloramphenicolnya. Dengan kata lain semakin besar konsentrasi antibiotik yang digunakan maKa ia akan menghmabat pertumbuhan bakteri dalm hal ini memnujukkan cairan berwarna bening dan apabila konsentrasi nutrient broth yang semakin besar maka akan memperkuat daya tahan bakteri terhadap antibiotik yang diberikan.

Dalam penentuan kerentanan suatu bakteri terhadap antibiotik kloramphenicol melalui tes resistensi dengan metode cakram kertas (Paper Disc Plate) digunakn media padat yakni nutrient agar (NA). pertama-tama disiapkan 20 mL NA kemudian dituangkan ke dalam cawan petri. Kerjanya harus dilakukan secara aseptis (ataau di dalam laminar air flow) agar dapar menghindari kontaminasi dari mikroba lain yang mampu merusak hasil percobaan tersebut. Lalu ditunggu hingga NA mengering dan suhunya kira-kira hangat kuku karena jika suhu terlalu panasStaphylococcus aureusakan mati. Setelah NA memadat, suspensi Staphylococcus aureusdigoreskan atas permukaan NA kemudian diratakan dan ditempelkan cakram antibiotika lalu diinkubasikan di dalam inkubator suhu 37C selama 18-24 jam. Cakram antibotika klorampenicol diletakkan pada media nutrient agar dengan jarak sedimikian rupa. Hal ini bertujuan agar zona yang dibentuk oleh Staphylococcus aureusdapat teramati dengan jelas karena bakteri itu bisa tumbuh secara optimal.

Selain itu jarak peletakan cakram antibiotik tersebut bertujuan agar tidak terjadi penumpukan zona inhibisi. Untuk mengetahui pengaruh konsentrasi antibiotika kloramphenicol, dibuat pengenceran dari antibiotika tersebut sehingga dengan begitu kita dapat menbandingkan zona inhibisi yang terbentuk . Dan sebagai controller kita gunakan kontrol negatif yang berisi nutrient agar dan kloramphenicol. Zona inhibisi diukur menggunakan jangka sorong dan pada pengamtan hasilnya negatif smua karena adany kesalahan dalam prosedur plaksanaan praktikum, seharusnya nutrient agar dicampur dengan bakteri tetapi dalam praktikum kmarin nutrient agar dicampur dengan antibiotik kloramphenicol dalam berbagai variassi konsentrasi (1000 ppm, 500 ppm dan 200 ppm) dan pada cakram kertas adalah bakterinya. Tntu saja hasilnya negaif karena bakteri tidak mampu tumbuh dalam media yang sudah dicampur dengan antibiotik tersebbut (sudah terhambat duluan).

penetapan potensi bakteri

teori dasar

Antibiotika atau animikroba adalah zat-zat yang dihasilkan oleh suatu mikroba terutama golongan fungi (jamur), yang dapat menghambat atau membasmi mikroba jenis lain. Suatu obat antibiotika yang ideal menunjukan toksisitas yang selektif. Istilah ini berarti bahwa obat tersebut haruslah bersifat toksis untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksis (dalam konsentrasi yang dapat ditoleransi) terhadap hospes (setiabudi, 1995)

Potensi adalah perbandingan dosis sediaan uji dengan dosis larutan standar atau larutan pembanding yang menghasilkan derajat hambatan pertumbuhan yang sama pada biakan jasad renik yang peka dan sesuai (Farmakope Indonesia). Aktivitas (potensi) antibiotik dapat ditunjukkan pada kondisi yang sesuai dengan efek daya hambatannya pada mikroba. Suatu penurunan aktivitas antimikroba juga akan dapat menunjukkan perubahan kecil yang tidak dapat ditunjukkan oleh metode kimia, sehingga pengujian secara mikrobiologi atau biologi biasanya merupakan suatu standar untuk mengatasi keraguan tentang kemungkinan hilangnya aktivitas.

Potensi Antibiotika adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg atau ug/mg. Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan hayati, sebagai jasad renik digunakan mikroorganisme dan sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya (akmal djamaan, 2012)

Potensi antibiotika standar berkisar antara 95-105%. Namun potensi tersebut dapat menurun karena kadaluwarsa, penyimpanan yang tidak benar dan terjadinya penguraian obat yang menghasilkan zat lain yang tidak memiliki efek lagi. (Farmakope Indonesia)

Aktivitas suatu antibiotika dapat dilihat pada dua kriteria yaitu MIC dan besar diameter hambatan. Makin rendah MIC makin kuat potensialnya, demikian pula semakin besar diameter hambatan, makin kuat pula potensialnya. Namun pada umumnya, antibiotik yang mepunyai potensi tinggi memilki MIC yang rendah dan diameter yang besar. (Modul praktikum mikrobiologi STFI,2013/2014)

Ada dua metode umum pengujian potensi antibiotika yang dapat digunakan :

Metode penetapan dengan lempeng silinder atau cara difusi agar

Metoda ini berdasarkan difusi antibiotika dari silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan petri atau lempeng, sehingga mikroba yang ditambahkan dihambat pertumbuhannya pada daerah berupa lingkaran atau zona disekeliling silinder yang berisi larutan antibiotika.

Metode Turbidimetri atau cara tabung

Metode ini berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroba dalam larutan serbasama antibotika, dalam media cair yang dapat menumbuhkan mikroba dengan cepat bila tidak terdapat antibiotika.

(Menurut akmal Djamaan, 2012 )Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi antibiotika:

1.Mikroba Uji

- Mikroba uji yang digunakan harus berasal dari galur murni

- Dapat memberikan respon yang bertingkat antara peningkatan konsentrasi dengan peningkatan daerah hambatannya.

- Untuk penetapan dengan cara difusi, daerah hambatan yang terbentuk harus jelas dan mudah diukur,

- Untuk penetapan cara tabung (turbidimetri) perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas.

Baku Pembanding Biologi

Sebagai baku pembanding biologi (biological reference) digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurniaan dan potensinya secara pasti.

Baku pembanding ini direkomendasi oleh Badan Kesehatan Dunia (WHO) dan di Indonesia melalui Badan POM RI (SBI, SPI, SBN, SPN, SBL)

Baku ini diberikan dalam bentuk baku sekunder atas permintaan laboratorium-laboratorium penelitian atau Perguruan Tinggi.

Media Perbenihan

Media perbenihan yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji atau dapat menumbuhkan mikroba uji dengan baik.

Media perbenihan tidak boleh mengandung zat yang bersifat antagonis ataupun mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotika yang diperiksa.

Di pasaran banyak ditemui media perbenihan dengan berbagai merek dengan kode Antibiotic Medium No. 1, 2, 3 dan sebagainya.

Larutan Dapar

Digunakan untuk melarutkan antibiotika yang akan diperiksa,baik baku pembanding maupun sampel uji. Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yang akan diuji.

Pemilihan terhadap metode

Pemilihan metode mana yang akan dipakai pada penetapan potensi antibiotika, apakah cara difusi atau cara tabung tergantung pada pengalaman yang dimiliki dan fasilitas laboratorium yang ada. Akan tetapi untuk zat-zat tertentu pemilihan tidak dapat dilakukan sekehendak hati, karena sifat bahan yang akan diuji tersebut. Misalnya tirotrisin karena difusinya yang jelek tidak akan memberikan hasil yang memuaskan bila menggunakan cara difusi,sebaliknya sefaloridin dengan cara tabung tidak cocok bila sampel mengandung hasil urainya yang menyebabkan sampel tetap keruh pada berbagai tingkat pengenceran.

Kelebihan dan kekurangan dari kedua metode

1.Cara turbidimetri, biasanya mempunyai range daerah pengerjaan yang sempit dengan perbandingan tingkat dosis kurang dari 5 : 1.

Sebaliknya pada cara difusi, range tersebut lebih lebar sehingga dimungkinkan perbandingan tingkat dosis sampai 100 : 1.

2.Cara turbidimetri, hanya memerlukan waktu inkubasi kurang dari 4 jam, sedangkan cara difusi memerlukan waktu paling kurang 18-24 jam.

3.Cara turbidimetri adalah mengukur aktivitas total dari antibiotika yang diuji, sedangkan cara difusi tergantung pada kecepatan difusi zat aktif, sehingga ada kemungkinan tidak mengukur aktivitas totalnya.

4.Cara turbidimetri tidak dipengaruhi oleh sifat difusibilitas dari zat aktif, sedangkan cara difusi sangat dipengaruhi oleh hal lain tersebut.

Kloramfenicol adalah antibiotika spektrum luas, efektif melawan sebagian besar bakteri aerob dan anaerob, kecuali Pseudomonas aeruginosa. (Janet L.Stringer,2008)

Kloramfenicol atau kloramisetin adalah antibiotika yang empunyai spektrum luas, berasal dari jamur Streptomyces venezuelae, dan sekarang telah dapat dibuat sintetik di laboratorium. Dalam keadaan murni kloramfenicol berupa kristal jarum atau lemepeng memanjang, warna putih keabu-abuan, tida bebau dan rasanya pahit. Kloramfenicol sukar larut dalam air, muah larut dalam metanol,etanol,etil asetat, dan aseton serta tidak larut dalam benzene. Kloramfenicol dapat digunakan untuk melawan infeksi yang disebabkan oleh beberapa jenis bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Antibiotika ini memiliki khasiat bakteriostatik terhadap beberapa spesies, pada keadaan tertentu, kloramfenikol memepunyai khasiat bakterisid. (damin sumardjo,2008)

Pembahasan

Percobaan ini dilakukan untuk menentukan besarnya potensi sampel terhadap antibiotika standar. Suatu antibiotika memerlukan konsentrasi tertentu agar dapat menjalankan fungsinya yaitu sebagaibakteriostatik atau bakteriosidik. Potensi yang diberikan menurut farmakope haruslah 95% - 105%, di luar itu berarti antibiotik sampel tidakmemenuhi syarat untuk dapat diedarkan di pasaran.

Pada percobaan kali ini, metode yang digunakan dalam penentuanpotensi antibiotika adalah meode penetapan dengan lempeng silinder,yaitu menggunakan perforator untuk menguji antibiotika pada medianutrien agar yang berisi inokulum bakteri pada cawan petri. Potensi dapatditentukan dengan mengukur zona bening yang dihasilkan danmembandingkannya dengan diameter zona bening dari antibiotika standar.

Syarat penggunaan biakan bakteri yang dipakai adalah harusbiakan murni (pure straired). Maksud dari biakan murni adalah bakteriyang diambil dari alam secara langsung kemudian dibiakkan, bukan daribakteri yang diisolasi dari laboratorium klinis (sampel darah, feses, urin,dan sebagainya). Pada percobaan ini antibiotik yang digunakan adalah kloramfenicol dan suspensi bakterinya adalah E Coli karena menurut farmakope dan literatur yang ada antibiotika kloramfenicol dapat menghambat pertumbuhan bakteriE Coli.

Sebelum memulai praktikum, dilakukan perencanaan pengenceran dan perhitungan konsentrasi. Hal ini dilakukan untuk mempermudahpenentuan nilai dosis tertinggi dan dosis terendah yang ingin digunakanpada antibiotika ini, yaitu kloramfenikol . Konsentrasi kloramfenicol pada awalnya adalah 2500g/ml pada larutan baku. Untuk larutan sampel dianggap konsentrasinya sama dengan konsentrasi baku. Dari perencanaanperhitungan konsentrasi, telah ditentukan konsentrasi pada dosis tinggia adalah 2500g/ml, untuk mendapatkannya, dicampurkan kloramfenicol 250mg lalu di tambahkan air suling steril hingga 100 ml, inilah dosis tingginya. Pada dosis menengah, konsentrasinya adalah 500g/ml,dengan cara mencampurkan 2ml kloramfenicol 2500g/ml dengan 10ml airsuling steril. Untuk dosis rendah yaitu 250g/ml, dengan cara mencampurkan .1ml antibiotic kloramfenicol 2500 g/ml dengan .10 ml aquadest steril. Konsentrasi untuk larutan baku dan larutan sampel dianggap sama.Setelah dilakukan pengenceran pada tabung, dilakukan pembagianpada permukaan dasar cawan petri menjadi 4 area sama besar. Setiap area ini diberi label daerah untuk larutan baku tinggi, baku rendah maupun larutan sampel tinggi maupun sampel rendah untuk mempermudah dalampengamatan. Untuk zona baku tinggi dan sampel tinggi diletakkanberseberangan karena jika dua dosis yang sama-sama tinggi diletakkanberdampingan, akan menyulitkan mengukur zona inhibisi karenadikhawatirkan zonanya saling tumpang tindih.

Pada penggunaan cawanpetri, jangan dibiarkan dalam kondisi terbuka, agar isi cawan tidakterkontaminasi oleh udara luar.Semua tahap pengerjaan prosedur harus dilakukan secara aseptis,hal ini dilakukan untuk menghindari kontaminasi yang terjadi oleh mikroba lain yang dapat merusak percobaan. Kemudian siapkan perfortoryang steril, yaitu dengan cara membakarnya di atas nyala ap\i. Cetakan yang dibuat dengan perforator digunakan untuk menampung antibiotika.Namun saat memanaskan perforator dan spatel haruslah didiamkan terlebih dahulu hingga tidak terlalu panas, tetapi tetap di dekat pembakarspiritus, agar bakteri dari udara tidak mengkontaminasi media agar yangberisi bakteri. Suhu yang panas dapat meleburkan nutrien agar saatmelubanginya dan jika terlalu jauh dari api, ditakutkan akanterkontaminasi oleh bakteri. Proses pembuatan lubang harus dilakukan dengan cepat, jangan biarkan cawan petri terbuka terlalu lama untukmenghindari bakteri dari luar masuk ke dalam cawan. Setelah keenam daerah yang dibagi tadi telah dilubangi, maka dimasukkanlah larutan antibiotika dengan dosis tinggi dan rendah dari larutan baku maupunlarutan sampel. Pengisian antibiotika ke lubang yang telah dibuatdilakukan dengan menggunakan mikro pipet 100 l (masingmasing lubang diisi dengan 100 l antibiotika).Pengisian antibiotika ke lubang yang telah dibuat harus dilakukandi dekat api, agar tetap aseptis. Pada saat meneteskan antibiotika harustepat di lubang, dan lubang yang dibentuk harus bulat agar antibiotikberdifusi sempurna dan zona yang dihasilkan juga bulat (diameter yangdihitung mudah). Mikropipet yang digunakan haruslah bersih, setelahdigunakan harus dicuci dengan desinfektan. Saat penggunaan, harus benar-benar kering, jika desinfektan masih di dalam mikropipet maka akanmempengaruhi konsentrasi antibiotika (desinfektan juga bersifatbakteriosida).Setelah semua lubang terisi, cawan petri harus dibungkus dengan koran kemudian diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam supayabakteri dapat tumbuh secara optimal. Pada saat inkubasi, cawan petri tidakboleh dibalik karena antibiotika yang ada di dalamnya bisa tumpah sehingga tidak terdifusi sempurna pada daerah sekitarnya. Percobaan ini dibuat duplo (dua kali) dengan perlakuan yang sama.