BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini memerlukan waktu kurang lebih 3 minggu terdiri dari : 7 hari

minggu pertama dilakukan aklimatisasi hewan uji (tikus) bertujuan agar dapat

menyesuaikan diri terhadap lingkungan baru, 7 hari minggu kedua dilakukannya diet

tinggi kelesterol dan 7 hari berikutnya diberikan perlakuan dengan memberikan

hewan uji bubuk daging buah jambu biji dengan dosis bertingkat. Pembuatan pakan

tinggi kolesterol, bubuk buah jambu biji dan pemeliharan hewan uji dilakukan di

BPPV (Balai Penyelidikan dan Pengujian Veteriner) Regional III Bandar Lampung.

Pengecekan kadar kolesterol darah dilakukan di laboratorium Rumah Sakit

Pertamina-Bintang Amin. Pengambilan organ hati dan pembuatan preparat dilakukan

di BPPV.

3.2. Jenis Penelitian

Pada penelitian ini terdapat perlakuan terhadap objek yang diteliti dan kontrol

sebagai pembanding maka jenis penelitian yang dilakukan adalah eksperimen.

Penelitian eksperimen adalah penelitian yang observasinya dilakukan terhadap efek

dari manipulasi peneliti terhadap satu atau sejumlah ciri (variabel) subjek penelitian

(Praktiknya, 1993).

37

3.3. Rancangan Penelitian

Rancangan penelitian ini menggunakan metode Rancangan acak Lengkap (RAL)

karena percobaan yang dilakukan bersifat homogen seperti pada percobaan yang

dilakukan dalam laboratorium (Nazir, 2003). Tikus yang digunakan dalam penelitian

ini sebanyak 25 + 3 ekor yang dipilih secara acak dengan jenis kelamin jantan.

Kemudian di aklimatisasi pada minggu pertama, selanjutnya sama-sama diberi makan

tinggi kolestrol pada minggu ke-dua dan setelah itu baru dilakukan perlakuan pada

minggu ke-tiga. Lebih jelasnya dapat dilihat pada kerangka konsep (Gambar 2).

Sebanyak 20 ekornya diberikan perlakuan berupa pemberian bubuk buah jambu biji

dengan dosis 2%, 4%, 8% dan 16% dari total pakan, 5 ekor lainnya sebagai kontrol

positif dan + 3 adalah kelompok tikus yang dipakai sebagai kontrol negatif ( K (-) )

yang hanya diaklimatisasi saja. Pemberian bubuk daging buah jambu biji kepada

hewan uji (Tikus) dilakukan dengan cara peroral atau gavage.

Masing-masing kelompok tersebut dilakukan replikasi sebanyak lima ekor tikus

didapatkan berdasarkan Gomez (1995).

Rumus :

T (r-1) ≥ 20

5 (r-1) ≥ 20

r ≥ 5

Keteraangan:

T : Jumlah perlakuan = 5

r : Jumlah replikasi

Setiap kotak diberi tanda dan nomor untuk tikus. Penempatan perlakuan pada

setiap kandang dilakukan randomisasi. Setelah random, maka didapatkan penempatan

perlakuan pada setiap kandang sebagai berikut:

Tabel 4. Pengaturan Randomisasi Tikus

1a 2c 3b 4b 5d

6d 7a 8b 9c 10b

11e 12e 13a 14c 15e

16e 17a 18d 19e 20b

21c 22c 23d 24a 25d

Sumber : (Gomez, 1995)

Tabel 5. Penempatan Perlakuan pada Setiap Kandang

Kandang No.Tikus

A = K 1 7 13 17 24

B = P1 3 4 8 10 20

C = P2 2 9 14 21 22

D = P3 5 6 18 23 25

E = P4 11 12 15 16 19

Sumber : (Gomez, 1995)

Keterangan :

Perlakuan K = 0 %; P1 = 2%; P2 = 4%; P3 = 8%; P4 = 16% bubuk daging buah

jambu biji

3.4. Populasi dan Sampel Peneltian

Populasi yang digunakan adalah tikus putih (Rattus novergicus L.) jantan galur

Wistar yang berumur 12 minggu (3 bulan). Sampel yang digunakan adalah kadar

kolesterol 25 ekor tikus putih (Rattus novergicus L.) jantan galur Wistar yang

berumur delapan minggu dan gambaran histologi dari organ hati.

3.4.1. Kriteria Inklusi

a. Berat tubuh 180-200 gram pada umur 12 minggu

b. Kondisi sehat

c. Kadar kolesterol awal normal (homogen)

3.4.2. Kriteria Drop-out

a. Tikus mengalami diare selama masa penelitian yang ditandai dengan feses

tidak berbentuk

b. Tikus mati selama perlakuan berlangsung

3.4.3. Kriteria Ekslusi

Bila pada tikus yang drop-out, diganti dengan tikus lain sesuai dengan

kriteria inklusi, sehingga didapat jumlah tikus sesuai yang diinginkan.

3.5. Variabel Penelitian

a. Variabel bebas; variabel bebas dalam penelitian ini adalah diet tinggi

kolesterol dan pemberian bubuk daging buah jambu biji.

b. Variabel terikat; variabel terikat pada penelitian ini adalah kadar kolesterol

darah pada tikus dan gambaran histologi organ hati.

3.6. Definisi Operasional

a. Diet tinggi Kolesterol ialah pemberian 6-8 gram kuning telur lewat sonde

lambung setiap hari selama tujuh hari.

b. Pemberian bubuk jambu biji adalah pemberian bubuk buah jambu biji dengan

dosis bertingkat yang diencerkan dengan aquades dan diberikan lewat jarum

gavage setiap hari pada hewan uji (tikus), dosis didapatkan berdasarkan

penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya.

c. Kadar kolesterol darah adalah kadar kolesterol darah tikus yang diukur

dengan metode CHOD-PAP Enzimatic Colorimeter Test for Cholesterol with

Lipid Clearing Factor (LCF).

d. Gambaran histologi adalah hasil preparat histologi organ hati tikus

berdasarkan metode pewarnaan.

3.7. Alat dan Bahan

3.7.1. Alat

a. Untuk pemeliharaan dan pemberian perlakuan adalah kandang hewan,

sonde lambung, jarum gavage, tempat makan, tempat minum, Neraca

analitik toledo dengan tingkat ketelitian 0,01 gram.

b. Untuk pemeriksaan kadar kolesterol darah menggunakan alat sentrifuse,

tabung reaksi, mikropipet dan spectrophotometer metertex.

c. Untuk preparat menggunakan object glass, mokrotom, pemanas (hot

plate), gelas penutup (cover glass), pipet tetes, embedding cassette, water

bath dan microskop.

3.7.2. Bahan

a. Hewan coba berupa tikus putih betina galur Wistar, dari pusat

pemeliharaan hewan percobaan, memenuhi kriteria inklusi, mendapatkan

pakan tinggi kolesterol, minum dan pakan standar secara ad libitum.

b. Bahan perlakuan berupa kuning telur yang dipisahkan dari putihnya dan

dibuat emulsi dengan cara mengocok perlahan. Buah jambu biji di proses

menjadi bubuk.

c. Bahan pembuatan preparat menggunakan xylol, hydrogen peroksida 3%,

aquades, asam asetat glacial, pewarna haematoxylin ehrlich-eosin, alkohol

bertingkat (96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%), paraffin,

enthelen.

3.8. Prosedur Penelitian

3.8.1.Aklimatisasi Tikus

Pemeliharaan dilakukan di BPPV (Balai Penyelidikan dan Pengujian

Veteriner). Sebelum diberi perlakuan, mencit-mencit diaklimatisasi pada suhu

ruangan rata-rata 23-26℃, periode ini dilaksanakan selama seminggu dengan

tujuan agar hewan uji teradaptasi dengan kondisi yang akan di tempati selama

percobaan. Tikus-tikus dikelompokan di dalam kandang berukuran 50 x 30 cm x

20 cm berdasarkan perlakuan yang diberikan dengan kepadatan lima ekor setiap

kandang.

Pemilihan jenis kelamin betina berumur dua bulan dilakukan karena adanya

suatu kondisi bahwa penurunan esterogen dapat menyebabkan naiknya kadar total

lipid, kolesterol LDL serta penurunan kadar HDL (Mu’minah, 2007). Suatu

penelitian yang melaporkan bahwa pemberian lemak dan kolesterol yang

berlebihan pada mencit jantan dapat mempengaruhi keagresifan sehingga akan

membuat data menjadi bias (Clarke, et al., 1996).

Selama aklimatisasi, mencit-mencit tersebut hanya diberi pakan biasa dan

diberi air minum secara ad libitum. Makanan diberikan 5 gram setiap hari dan

botol minuman dibersihkan tiap tiga hari sekali dan diganti airnya atau diisi ulang

dengan air yang baru apabila air sudah habis. Aklimatisasi biasanya digunakan

untuk menghadapi faktor-faktor yang terjadi dalam lingkungan lebih terkontrol di

Laboratorium.

3.8.2. Pembuatan Bubuk Jambu Biji

Cara pengolahan bubuk jambu biji, yaitu (Pujimulyani, 2009):

a) Pengupasan

Buah dipilih yang berkualitas baik dan dicuci agar kotoran bekurang

atau hilang, kemudian dilakukan pengupasan dengan tujuan

menghilangkan kulit agar buah yang dihasilkan berkualitas baik (relative).

b) Pengirisan

Pengecilan ukuran dengan cara pengirisan dilakukan dengan tujuan

memperluas permukaan buah sehingga mempermudah proses selanjutnya.

c) Blanching

Vitamin C bekurang selama perebusan karena bersifat larut dalam air

dan mengalami oksidasi enzimatis pada awal perebusan. Cara

menghindari bekurangnya vitamin C yaitu dikukus (tidak di rebus) dan

jika direbus sebaiknya dimasukan setelah air mendidih. Usaha yang

dilakukan untuk memperkecil kehilangan vitamin C yaitu dengan

menambahkan senyawa natrium bisulfit. Menurut Eskin dkk (1971)

dengan adanya senyawa sulfit, maka oksigen diikat oleh sulfit yang

bersifat lebih mudah teroksidasi dari pada vitamin C yang membentuk

sulfat, sehingga oksidasi vitamin C menjadi terhambat dan kerusakan

vitamin C dapat dicegah. Konsentrasi natrium bisulfit yang semakin tinggi

dan lama waktu perendaman akan menghasilkan kadar vitamin C cukup

tinggi. Namun penggunaan sulfit perlu mendapat perhatian karena residu

sulfit dalam bahan pangan bersifat karsinogen (memicu sel kangker)

sehingga penggunaannya dibatasi maksimal 2000 ppm.

Tahap proses blanching dilakukan dengan sulfit 1000 ppm, kemudian

dimasukan dalam air dengan suhu 83℃ selama 10 menit dengan tujuan

agar enzim-enzim pada buah menjadi kurang aktif dan untuk mengurangi

aktivitas mikroorganisme.

d) Pendinginan

Pendinginan dilakukan dengan menggunakan air yang bersuhu 22℃

selama 14 menit.Tahap pendinginan dapat mengurangi sifat pasta dan

dapat menambah sifat mealiness, karena pendinginan dapat mencegah

pemasakan yang berkelanjutan.

e) Pengukusan

Lama pengukusan 20 menit dengan tujuan agar jaringan buah menjadi

lunak dan mempunyai flavor khas buah masak.

f) Pembuburan

Pembuburan bertujuan agar sel terpisah-pisah secara tunggal maupun

berkelompok.Keadaan sel yang terpisah-pisah merupakan syarat sebelum

bahan dikeringkan agar hasil pengeringan berkualitas baik.

g) Pengeringan

Alat yang digunakan untuk pengeringan adalah spray dryer yang

merupakan salah satu cara pengeringan dengan tujuan mengurangi

kandungan air dalam suatu bahan yang berupa bubur. Pengeringan dengan

cara lain dapat dilakukan dengan pengeringan di bawah panas matahari

selama 3 hari berturut-turut. Sulfitasi dilakukan dengan penyemprotan

sebanyak 100 gram bahan dengan natrium bisulfit sebanyak 300 ppm yang

dilarutkan kedalam 100 ml air selama proses pengeringan berlangsung.

h) Pembubukan

Hasil pengeringan kemudian ditumbuk sehingga menjadi bubuk.

3.8.3. Penentuan Dosis dan Pemberian Bubuk Buah Jambu Biji

Pakan total tikus putih rata-rata adalah 20 gram/ekor/hari (Maryanto, 2003).

Sedangkan pada penelitian ini bahan yang di uji adalah bubuk daging buah jambu

biji dengan dosis untuk kelompok A=0%, B=2%, C=4%, D=8%, E=16% dari

total makanan sehari yang disajikan dalam tebel berikut:

Tabel 6. Penentuan dosis bubuk jambu biji

Kelompok Dosis JumlahA (Kontrol) 0% 0B (P1) 2% x 20 gram/ekor/hari 0,4 gramC (P2) 4% x 20 gram/ekor/hari 0,8 gramD (P3) 8% x 20 gram/ekor/hari 1,6 gramE (P4) 16% x 20 gram/ekor/hari 3,2 gram

Pembagian dosis ini berdasarkan pada penelitian yang telah dilakukan oleh

shinnick dkk dengan menggunakan serat oat bran pada tikus dengan dosis 1-10%

dari total pakan. Pada penelitian tersebut perubahan terjadi dimulai dari dosis 8%

dan perubahan maksimal pada dosis 10% (Shinnick, et al., 1990). Perlakuan

dilaksanakan selama seminggu, mencit di beri minum seperti biasa. Pemberian

dosis bertingkat secara oral dengan menggunakan jarum gavage. Agar dapat

diberikan secara gavage maka tiap dosis diencerkan dengan 1 ml aquades.

3.8.4. Pembuatan dan Pemberian Pakan Berlemak

Pemberian diet kolesterol dilakukan selama seminggu, tikus diberi kuning

telur dibuat dengan cara; 1) memisahkan kuning telur dengan putihnya, 2)

membuat emulsi kuning telur dengan cara mengocok perlahan, 3) menimbang

emulsi kuning telur. Diet kuning telur ditentukan sebesar 3-4% BB tikus atau

sekitar 6-8 gram untuk tikus dengan berat 200 gram, diberikan lewat sonde

lambung setiap hari dan minum seperti biasa (Maliyah, 2006).

3.8.5. Pengambilan Sampel Darah

Sampel darah tikus diambil dari abdominal aorta (Terpsra, 1998 ; Garcia–

Diez, 1995) atau jantung (Hassel, 1996).

3.8.6. Pengukuran Kadar Kolesterol Total Darah

Kadar kolesterol diukur dengan metode CHOP-PAP Enzymatic Colorimeter

Test for Cholesterol with Lipid Clearing Factor (LCF) dengan cara mengambil

sampel darah tikus sebanyak 5μL di pipet kedalam kuvet kemudian ditambahkan

500 μL reagen lalu dihomogenisasi dengan vortex. Serum dipisahkan dari darah

mensentrifugenya selama 20 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Sample standar

diinkubasi selama 10 menit pada suhu 20-25℃, kemudian dimasukan kedalam

spectrophotometer dan dibaca hasilnya pada spektrofotometer pada suhu 37 0C

(Oktaviyanti, 2003).

3.8.7. Tahap Pengambilan Organ

Setelah melewati masa perlakuan (treatment), selanjutnya dilakukan tahap

pengambilan organ dengan cara pembedahan hewan uji. Tikus yang akan dibedah

dibius dengan cara memasukan tikus kedalam kotak yang berisi chloroform

terlebih dahulu kemudian diambil bagian organ yang akan diuji, yakni organ hati

dengan cara digunting atau dipotong menggunakan alat-alat bedah. Hal tersebut

dilakukan dengan hati-hati agar organ-organ yang akan di uji tidak rusak.

Kemudian organ-organ tersebut disimpan kedalam tabung yang telah diisi larutan

formalin 5%.

3.8.8. Tahap Pembuatan Preparat

Tahap pembuatan preparat dikerjakan menurut Suntoro (1983) dapat

menggunakan dua metode yakni metode beku dan metode paraffin.

Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode paraffin.Walaupun

menurut suntoro metode ini kurang baik dalam pembuatan preparat jaringan

organ hewan.Namun, metode tersebut masih dapat digunakan dalam pembuatan

preparat jaringan organ hewan. Alasan lain menggunakan metode paraffin adalah

sebagai pembanding dalam melihat keadaan gambaran histologi organ yang

diteliti. Pembuatan preparat organ hewan dengan menggunakan metode ini

dilakukan dalam beberapa tahap, yakni : narcose, sectio, labeling, fixasi, washing,

dehidrasi, clearing, impregnasi, embedding, affixing, dan staining.

Sedangkan untuk proses pewarnaan dengan metode Haematoxylin Ehrlich-

eosin atau biasa dikenal dengan metode HE dilakukan dengan beberapa tahapan,

seperti (1) dilakukan deparafinisasi dengan xylol selama 30 menit ; (2) tahapan

hidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat (96%, 90%, 80%, 70%, 60%,

50%, 40%, 30%) selama ± 10 detik; (3) setelah itu dicuci dengan aquades; (4)

dicelupkan ke dalam larutan HE, (5) kemudian dicuci kembali dengan air kran

selama 10 menit; (6) dicelupkan dalam aquades; (7) diferensiasi dengan cara

preparat dicelupkan ke dalam larutan asam 1% selama tiga detik; (8) dicuci

kembali dengan air keran selama lima menit; (9) dicelupkan kembali kedalam

aquades; (10) dicelupkan ke dalam alcohol bertingkat (30%, 40%, 50%, 60%,

70%) selama kurang lebih 10 detik; (11) dicelupkan kedalam larutan eosin 1%

selama tiga menit; (12) dicuci kembali dengan air kran; (13) dibilas dengan

aquades; (14) dicelupkan kedalam alcohol bertingkat kembali (30%, 40%, 50%,

60%, 70&, 80%, 90%, 100%) selama kurang lebih 10 detik; (15) difilter dengan

menggunakan kertas saring isap; (16) di-muonting dengan menggunakan entelan.

Hasil dari pewarnaan metode HE ini adalah biru kehitaman adalah inti (sel

hepatica) dan sitoplasma agak kemerah-merahan (Suntoro, 1983).

3.9. Tekhnik Pengolahan Data

Data kadar kolesterol darah tikus sebelum dan sesudah perlakuan akan dilakukan

analisis secara kuantitatif, meliputi analisis deskriptif yang disajikan dalam bentuk

grafik, uji normalitas data menggunakan Kolmogorov-Smirnov test, uji homogenitas

menggunakan uji Leven’s dan perbedaan pengaruh pada masing-masing kelompok

perlakuan dianalisis dengan Anova menggunakan program SPSS 16 (Santoso, 2002).

Preparat histologi organ hati tikus dianalisis secara kualitatif dengan cara melihat,

membandingkan dan mendeskrifkan gambaran histologi organ hati dari setiap dosis

dengan kontrol.

3.10. Alur Penelitian

Persiapan Alat dan Bahan

MInggu Pertama

Aklimatisasi,Pemeriksaan Kolesterol awal dan

Pembuatan Preparat Normal

Pemberian Diet Tinggi Kolesterol pada Tikus dan Pemeriksaan Kolesterol ke-

dua

Pemberian (gavage) Bubuk daging buah Jambu Biji pada Tikus

Pemeriksaan Kolesterol akhir dan Pembuatan Preparat Histologi Organ

Hati pada Tikus

Pengolahan Data dan Penyusunan KTI

Gambar 8. Skema Alur Penelitian

Tambahan : pada bab 1

1.5. Kerangka Teori

MInggu Ke-dua

MInggu Ke-tiga

Sebagai zat yang dibutuhkan tubuh, keberadaan kolesterol dalam tubuh ternyata

sangat penting. Kolesterol yang berada didalam tubuh diketahui berasal dari organ

hati yang memproduksi sekitar 80% dari total kolesterol yang ada di dalam tubuh dan

sekitar 20% kebutuhan kolesterol tubuh dipenuhi oleh kolesterol yang berasal dari

makanan yang dikonsumsi sehari-hari. Secara natural dari dalam tubuh akan

menghasilkan kolesterol sekitar 1000 mg sehari. Jumlah ini akan semakin bertambah

dengan adanya tambahan kolesterol yang berasal dari makanan yang kita konsumsi.

Umumnya kolesterol ini ditemukan pada makanan yang berasal dari hewan.

Mengkonsumsi makanan tinggi kolesterol akan menyebabkan peningkatan kadar

kolesterol dalam darah (hiperkolesterolemia) yang justru akan berefek buruk terhadap

kesehatan (Graha, 2010).

Didalam buah jambu biji terkandung vitamin C, Vitamin B3 dan pektin yang

mempunyai pengaruh terhadap kadar kolesterol dalam darah. Salah satu fungsi

vitamin C di dalam tubuh kita adalah untuk mempercepat pembentukan asam empedu

dalam hati dan kemudian mengekresikannya kekandung empedu. Vitami B3

menekan kadar kolesterol dalam darah dengan cara menekan produksi kolesterol di

hati. Pektin menurunkan kadar kolesterol dengan cara berikatan dengan asam

empedu. Asam empedu merupakan hasil akhir dari metabolisme kolesterol. Semakin

banyak serat yang berikatan dengan asam empedu maka semakin banyak kolesterol

yang dimetabolisme, sehingga pada akhirnya kadar kolesterol menurun.

Pemberian bubuk Buah Jambu biji (Psidium guajava).

Organ Hati (80% dari total kolesterol dalam tubuh) dan Makanan (20% dari total kolesterol dalam tubuh)

Gambar 1. Kerangka teori

1.6. Kerangka konsep

Faktor-faktor : Genetik, Umur, Jenis Kelamin, Diet, Keleinan & penyakit, Perilaku dan Suplementasi Bahan Tertentu

Kolesterol darah Penurunan kadar kolesterol darah

Pektin : mengikat asam empedu di usus

Hiperkolesterolemia

Diet tinggi kolesterol

Vitamin C : mempercepat pembentukan asam empedu dihati

Vitamin B3 : menekan produksi kolesterol di hati

25 + 3 ekor Tikus diaklimatisasi pada

minggu pertama dan dirandomisasi

Gambar 2. Kerangka konsep

1.7. Hipotesis

K = 5 ekor

Pemberian Bubuk Daging Buah Jambu biji (Psidium guajava L.) pada minggu ke-tiga.

K = 0 %

P1 = 2 %

P2 = 4 %

P3 = 8 %

P4 = 16 %

Dari total makanan sehari

Pembuatan preparat Histologi

Organ Hati

Pengukuran kadar kolesterol awal

P1 = 5 ekor P2 = 5 ekor P3 = 5 ekor P4 = 5 ekor K (-) = 3 Ekor

Pemberian diet tinggi kolesterol (kuning telur) pada minggu

ke-dua

Pengukuran kadar

kolesterol awal

Pengukuran kadar kolesterol ke-dua

(Hiperkolesterolemia)

Pengukuran kadar kolesterol ke-tiga

(Kolesterol akhir) dan Pembuatan preparat Histologi Organ Hati

Menurut penelitian yang dilakukan oleh shinnick dkk (1990) disebutkan bahwa

penurunan kadar kolesterol total tikus hiperkolesterolemia menggunakan serat oat

bran mulai tampak pada dosis 8% dan tampak bermakna pada dosis 10% dari dosis

yang diberikan 1 – 10 % dari total pakan. Konsentrasi kolesterol di dalam tubuh yang

berlebih akan disimpan terutama dalam jaringan adiposa dan organ hati, maka akan

mengakibatkan gangguan fungsi organ dalam tubuh (Mahanani, 2005). Oleh sebab

itu, maka hipotesis yang diajukan untuk penelitian ini yakni : “Terjadi penurunan

kadar kolesterol darah dan terdapat perbedaan gambaran histologi organ hati pada

tikus putih (Rattus novergicus L.) jantan galur Wistar setelah pemberian bubuk

daging buah jambu biji (Psidium guajava L.)”.