BAB 4

PENETAPAN METODE ANALISA

4.1 Penetapan Metode Analisis untuk Kosmetika

Menurut Kepala BPOM RI Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 tahun 2011 tentang metode

analisis kosmetika ruang lingkup metode yang ditetapkan dalam Peraturan ini berupa

beberapa Metode Analisis untuk:

1. Pengujian Cemaran Mikroba

Metode Analisis untuk pengujian cemaran mikroba berupa metode analisis untuk:

1.1 Penetapan Angka Kapang Khamir dan Uji Angka Lempeng Total dalam

Kosmetika

a. Penetapan Angka Kapang dan Khamir

Penetapan angka kapang dan khamir dalam kosmetika dengan cara menghitung

koloni dalam media agar selektif setelah inkubasi secara aerobik. Apabila

diperkirakan contoh dapat menghambat pertumbuhan mikroba maka contoh harus

dinetralkan supaya mikroba yang masih hidup dapat terdeteksi dan prosedur

netralisasi harus divalidasi.

Metode yang digunakan melalui penghitungan lempeng dengan:

Cara tuang atau sebar

Penghitungan angka lempeng dilakukan dengan menginokulasikan secara

langsung sejumlah tertentu dari suspensi awal atau yang telah diencerkan

secara desimal ke dalam media spesifik dengan cara tuang atau sebar, dan

diinkubasi secara aerob pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah

mikroba dinyatakan dalam koloni atau cfu (colony forming units) per mL

atau per g produk.

Penyaringan membran

Penyaringan membran dilakukan dengan cara memindahkan sejumlah contoh

ke dalam peralatan filtrasi yang telah dibasahi dengan sejumlah kecil

pengencer yang steril, segera disaring dan dibilas. Membran penyaring

kemudian diletakkan di atas permukaan media agar spesifik serta diinkubasi

pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah koloni dinyatakan

dalam cfu kapang dan khamir per mL atau per g produk.

Penanganan Produk kosmetika dan contoh Produk yang akan diuji disimpan pada

suhu ruang, tidak diinkubasi, didinginkan atau dibekukan sebelum dan sesudah

analisis.

b. Uji Angka Lempeng Total

Pedoman ini digunakan untuk menetapkan angka bakteri aerob mesofil yang

masih memiliki daya hidup dalam produk kosmetika. Metode ini meliputi

penghitungan koloni bakteri pada media agar non selektif maupun ada atau

tidaknya pertumbuhan bakteri setelah pengkayaan. Apabila diperkirakan contoh

dapat menghambat pertumbuhan mikroba maka contoh harus dinetralkan supaya

mikroba yang masih hidup dapat terdeteksi dan prosedur netralisasi harus

divalidasi.

Metode yang digunakan melalui penghitungan lempeng dengan:

Cara tuang atau sebar

Penghitungan angka lempeng total dilakukan dengan menginokulasikan

secara langsung sejumlah tertentu suspense awal atau yang telah diencerkan

secara desimal ke dalam media spesifik dengan cara tuang atau sebar, dan

diinkubasi secara aerob pada suhu yang sesuai dalam waktu tertentu. Jumlah

mikroba dinyatakan dalam koloni atau cfu per mL atau per g produk.

Cara penyaringan membrane

Penyaringan membran dilakukan dengan cara memindahkan sejumlah contoh

ke dalam peralatan penyaring (filtrasi) yang telah dibasahi dengan pengencer

steril, segera disaring dan dibilas. Membran penyaring kemudian diletakkan

di atas permukaan media agar spesifik dan diinkubasi pada suhu yang sesuai

dalam waktu tertentu. Jumlah mikroba dihitung dan angka lempeng total

dinyatakan dalam koloni atau cfu per mL atau per g produk. (Catatan : Cara

penyaringan membran dilakukan untuk contoh yang mengandung pengawet,

atau bahan antimikroba lain yang dapat larut).

Penanganan kosmetika dan contoh Jika diperlukan, simpan kosmetika yang akan

diuji pada suhu ruang. Jangan diinkubasi, didinginkan atau dibekukan sebelum

atau sesudah analisis.

1.2 Uji Efektivitas Pengawet dalam Kosmetika

Pedoman ini digunakan untuk menetapkan efektivitas antimikroba meliputi

penentuan kesesuaian dan kinerja minimal pengawet dalam kosmetika.

Prinsipnya uji tantang terhadap produk bebas cemaran dengan menggunaka

mikroba baku yang telah ditetapkan, kemudian produk yang telah diinokulasi

tersebut disimpan pada suhu yang telah ditetapkan. Penghitungan jumlah mikroba

baku yang bertahan hidup dalam produk yang diuji, pada interval waktu yang

ditentukan dengan metode angka lempeng. Penentuan produk yang memenuhi

kriteria, merupakan produk yang menggunakan pengawet yang sesuai, baik untuk

proses pembuatan maupun penggunaan oleh konsumen. Penentuan produk yang

tidak memenuhi kriteria, merupakan produk yang tidak menggunakan pengawet

yang sesuai.

2. Pengujian Logam Berat

Metode Analisis untuk pengujian logam berat berupa Metode Analisis Penetapan Kadar

Logam Berat (Arsen, Kadmium, Timbal, dan Merkuri) dalam Kosmetika. Prinsipnya

contoh didigesti dengan cara digesti basah atau digesti kering atau digesti gelombang

mikro bertekanan tinggi (High Pressure Microwave Digestion) dan ditetapkan kadar

logam berat seperti arsen (As), cadmium (Cd), timbal (Pb) dan merkuri (Hg)

menggunakan Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrophotometer (GF-AAS) dan

Flow Injection Analysis System-Atomic Absorption Spectrophotometer (FIAS-AAS).

3. Pengujian Beberapa Bahan yang Dilarang Digunakan dalam Kosmetika

Metode Analisis untuk pengujian beberapa bahan yang dilarang digunakan dalam

Kosmetika berupa Metode Analisis untuk:

a. Identifikasi asam retinoat dalam kosmetika secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Secara KCKT Asam retinoat diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik

dengan deteksi ultra violet.

b. Identifikasi bahan pewarna yang dilarang dalam kosmetika secara Kromatografi

Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi bahan pewarna yang dilarang

dalam kosmetika, yaitu tertera pada tabel dibawah ini:

Identifikasi secara KLT dengan cara bahan pewarna yang dilarang dalam

kosmetika diekstraksi terlebih dahulu kemudian diidentifikasi secara KLT.

Dibawah ini tabel mengenai batas deteksi:

Identifikasi secara KCKT dengan cara bahan pewarna yang dilarang dalam

kosmetika diidentifikasi secara kromatografi cair fase balik dengan deteksi

cahaya tampak. Dibawah ini tabel mengenai batas deteksi:

c. Identifikasi dan penetapan kadar hidrokinon dalam kosmetika secara Kromatografi

Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Identifikasi secara KCKT fyaitu Hidrokuinon diidentifikasi secara KCKT fase

balik dengan deteksi sinar UV.

d. Identifikasi senyawa kortikosteroid dalam kosmetika secara Kromatografi Lapis

Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Identifikasi secara KLT

Metode ini menguraikan prosedur untuk identifikasi senyawa kortikosteroid:

hidrokortison asetat, deksametason, betametason, betametason 17-valerat dan

triamsinolon asetonida dalam kosmetika. Prinsipnya senyawa kortikosteroid

dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi secara KLT.

Identifikasi secara KCKT

Metode ini menjelaskan prosedur lebih lanjut untuk identifikasi senyawa

kortikosteroid: hidrokortison asetat, deksametason, betametason, betametason

17-valerat dan triamsinolon asetonida dalam kosmetika. Prinsipnya metode ini

menjelaskan prosedur lebih lanjut untuk identifikasi senyawa kortikosteroid:

hidrokortison asetat, deksametason, betametason, betametason 17-valerat dan

triamsinolon asetonida dalam kosmetika.

Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat dari tabel di bawah ini:

4. Pengujian beberapa bahan pengawet yang digunakan dalam kosmetika

Metode analisis untuk pengujian beberapa bahan pengawet yang digunakan

dalam kosmetika berupa metode analisis identifikasi dan penetapan kadar pengawet

dalam kosmetika secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT).

Identifikasi secara KLT

Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi pengawet: 2-fenoksietanol,

metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat, propil 4-hidroksibenzoat dan butil

4-hidroksibenzoat dalam kosmetika. Prinsipnya pengawet dalam contoh diekstraksi

dan diidentifikasi secara KLT.

Identifikasi dan penetapan kadar secara KCKT

Metode ini menjelaskan prosedur untuk identifikasi dan penetapan kadar pengawet:

2-fenoksietanol, metil 4-hidroksibenzoat, etil 4-hidroksibenzoat, propil 4-

hidroksibenzoat dan butil 4-hidroksibenzoat dalam kosmetika. Prinsipnya

pengawet dalam contoh diekstraksi dan diidentifikasi serta ditetapkan kadarnya

secara KCKT fase balik menggunakan isopropil 4-hidroksibenzoat atau

benzofenon sebagai baku internal.

4.2 Penetapan Metode Analisis untuk Makanan

Metode analisis yang digunakan untuk makanan sebagai berikut:

1. Metode Gravimetri

Gravimetri merupakan cara pemeriksaan kumlah zat yang paling tua dan

yang paling sederhana dibandingkan dengan cara pemeriksaan kimia lainnya.

Analisis gravimetri merupakan cara analisis kuantitatif berdasarkan berat tetap

(berat konstant)-nya. Dalam analisis ini, unsur atau senyawa yang dianalisis

dipisahkan dari sejumlah bahan yang dianalisis. Bagian terbesar analisis gravimetri

menyangkut perubahan unsur atau gugus dari senyawa yang dianalisis menjadi

senyawa lain yang murni dan stabil sehingga dapat diketahui berat tetapnya. Berat

unsure atau gugus yang dianalisis selanjutnya dihitung dari rumus senyawa serta

berat atom penyusunnya. Supaya analisis gravimetri berhasil, maka persyaratan

berikut harus dipenuhi, yakni:

Proses pemisahan analit yang dituju harus berlangsung secara sempurna

sehingga banyaknya analit yang tidak terendapkan secara analitis tidak

terdeteksi

Zat yang akan ditimbang harus murni atau mendekati murni dan mempunyai

susunan yang pasti. Jika syarat ini tidak terpenuhi maka akan menimbulkan

kesalahan yang besar.

Kelebihan cara analisis gravimetri dibanding volumetri adalah bahwa penyusun

yang dicari dapat diketahui pengotornya jika ada; dan bila diperlukan dapat

dilakukan pembetulan (koreksi). Kekurangan atau kejelekan dari metode

gravimetri adalah cara ini sangat memakan waktu (time consuming) (Gandjar,

2007).

2. Metode Volumetri

Volumetri atau titrimetri merupakan suatu metode analisis kuantitatif

didasarkan pada pengukuran volume titran yang bereaksi sempurna dengan analit.

Titran merupakan zat yang digunakan untuk mentitrasi. Analit adalah zat yang

akan ditentukan konsentrasi/kadarnya. Penggolongan volumetri :

Berdasarkan reaksi kimia (reaksi asam-basa, reaksi redoks, reaksi

pengendapan, reaksi pembentukan kompleks)

Berdasarkan cara titrasi (titrasi langsung, titrasi kembali)

Berdasarkan jumlah sampel (titrasi makro, titrasi semi mikro, titrasi mikro)

Untuk dapat dilakukan analisis volumetri harus dipenuhi syarat-syarat sebagai

berikut;

a) Reaksinya harus berlangsung sangat cepat. Kebanyakan reaksi ion

memenuhi syarat ini.

b) Reaksinya harus sederhana serta dapat dinyatakan dengan persamaan reaksi

c) Harus ada perubahan yang terlihat pada saat titik ekivalen tercapai, baik

secara kimia atau fisika

d) Harus ada indikator jika syarat 3 tidak dipenuhi.

(Gandjar, 2007).

3. Metode Instrumentasi

Merupakan metode analisis yang menggunakan instumen seperti

spektrofotometri ultraviolet dan visibel (Uv-Vis) dan spektrofotometri serapan

atom (AAS). Metode ini menggunakan prinsip emisi dan absorpsi pada atom dan

molekul yang akan diuji.

4. Metode Kromatografi

Metode analisis ini (kromatografi) merupakan teknik pemisahan yang

menggunakan fase diam (stationary phase) dan fase gerak, (mobile phase) dapat

dimanfaatkan untuk analisis baik analisis kualitatif, kuantitatif maupun preparative.

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam tergantung pada

pengelompokannya. Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi

dibedakan menjadi: (a) kromatografi adsorbsi; (b) kromatografi partisi; (c)

kromatografi pasangan ion; (d) kromatografi penukar ion; (e) kromatografi ekslusi

ukuran; dan (f) kromatografi afinita.

Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi dapat dibagi atas: (a)

kromatografi kertas; (b) kromatografi lapis tipis, yang keduanya sering disebut

kromatografi planar; (c) kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT); dan (d)

kromatografi gas (KG) (Gandjar, 2007).

4.3 Penetapan Metode Analisis untuk Produk Steril

Dalam pengertian mutlak, steril berarti bebas dari mikroorganisme baik bentuk

vegetatif, nonvegetatif (spora), patogen maupun nonpatogen. Produk steril hendaklah

dibuat dengan persyaratan khusus dengan tujuan memperkecil risiko pencemaran

mikroba, partikulat dan pirogen, yang sangat tergantung dari keterampilan, pelatihan

dan sikap dari personil yang terlibat.

Mutu setiap sediaan farmasi (steril) tidak dapat dihasilkan hanya dengan cara

pengontrolan, tetapi mutu tersebut harus ditangani sejak dini, termasuk sterilitas. Mulai

dari penggunaan bahan awal yang baik dan memenuhi spesifikasi tertentu yang sudah

ditetapkan, menggunakan peralatan yang memenuhi persyaratan, teknik pembuatan

yang digunakan, persyaratan ruangan, dan personal yang bekerja harus betul-betul

memahami dengan baik betapa pentingnya mutu (sterilitas).

Uji sterilitas digunakan untuk menetapkan apakah bahan atau produk farmasi

yang harus steril memenuhi syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti yang tertera

pada masing-masing monografi bahan atau produk. Untuk penggunaan prosedur uji

sterilitas sebagai bagian dari pengawasan mutu di industri, tertera pada <1371>

Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia. Mengingat kemungkinan hasil

positif dapat disebabkan oleh pengerjaan yang salah atau kontaminasi lingkungan,

diberlakukan pengujian 2 tahap seperti yang tertera pada bagian:

Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

Tahap pertama

Pada interval waktu tertentu dan pada akhir periode inkubasi, amati isi

semua wadah akan adanya pertumbuhan mikroba seperti kekeruhan dan/atau

pertumbuhan pada permukaan. Jika tidak terjadi pertumbuhan, maka bahan uji

memenuhi syarat. Jika ditemukan pertumbuhan mikroba, tetapi peninjauan dalam

pemantauan fasilitas pengujian sterilitas, bahan yang digunakan, prosedur

pengujian, dan kontrol negatif menunjukkan tidak memadai atau teknik aseptik

yang salah digunakan dalam pengujian, tahap pertama dinyatakan tidak absah dan

dapat diulang. Jika pertumbuhan mikroba teramati tetapi tidak terbukti uji tahap

pertama tidak absah, lakukan tahap kedua.

Tahap kedua

Jumlah spesimen uji yang diseleksi minimum dua kali jumlah tahap

pertama. Volume minimum tiap spesimen yang diuji, media, dan periode

inkubasi sama seperti yang tertera pada tahap pertama. Jika tidak ditemukan

pertumbuhan mikroba, bahan yang diuji memenuhi syarat. Jika ditemukan

pertumbuhan, hasil yang diperoleh membuktikan bahwa bahan uji tidak

memenuhi sayarat. Jika dapat dibuktikan bahwa uji pada tahap kedua tidak absah

karena kesalahan atau teknik aseptik tidak memadai, maka tahap kedua dapat

diulang.

Untuk produk parenteral, sediaan obat mata, termasuk larutan lensa kontak, dan

produk-produk yang diberikan pada luka terbuka atau untuk proses irigasi rongga

tubuh. Uji sterilitas perlu dilakukan :

Syarat steril : Sterility Assurance Level dengan probabilitas sama atau lebih baik dari

10-6, artinya dalam satu juta sediaan steril hanya boleh maksimum 1 yang tidak steril.

Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya pertumbuhan mikroba pada media

Fluid Thioglycollate (FTM) dan Soyabean Casein Digest (SCD) pada 30-35oC

(bakteri) dan 20-25oC (fungi) selama 7 dan 14 hari.

Sterilisasi dapat dicapai dengan penggunaan panas basah atau panas kering,

dengan radiasi pengionan (tapi tidak dengan radiasi ultraviolet kecuali proses ini

divalidasi secara menyeluruh), dengan etilen oksida (atau gas lain yang sesuai) atau

dengan filtrasi yang dilanjutkan dengan pengisian secara aseptik ke dalam wadah akhir

yang steril. Semua proses sterilisasi hendaklah divalidasi. Perhatian khusus hendaklah

diberikan bila metode sterilisasi yang digunakan tidak sesuai dengan standar farmakope

atau standar nasional lain, atau bila digunakan untuk produk yang bukan merupakan

larutan sederhana dalam air atau minyak.

Sebelum proses sterilisasi digunakan, ketepatan untuk produk terkait dan

efikasinya untuk mencapai kondisi sterilisasi yang diinginkan pada semua bagian dari

tiap jenis beban yang harus diproses, hendaklah dibuktikan dengan pengukuran fisis

dan bila diperlukan menggunakan indikator biologis. Keabsahan proses hendaklah

diverifikasi pada interval yang dijadwalkan, minimal sekali setahun, dan bilamana ada

modifikasi yang signifikan pada peralatan.

Untuk mendapatkan sterilisasi yang efektif, semua bahan harus dicakup dalam

penanganan yang dipersyaratkan dan proses hendaklah didesain untuk memastikan hal

ini dapat dicapai. Pola muatan yang tervalidasi hendaklah ditetapkan untuk semua

proses sterilisasi. Indikator biologis hendaklah dipertimbangkan sebagai metode

tambahan untuk memantau proses sterilisasi. Catatan sterilisasi atau salinannya

hendaklah tersedia untuk tiap siklus sterilisasi. Catatan ini hendaklah disetujui sebagai

bagian dari prosedur pelulusan bets.

Produk yang ditujukan untuk menjadi steril, bilamana memungkinkan,

hendaklah diutamakan disterilisasi akhir dengan carapanas dalam wadah akhir. Bila

sterilisasi cara panas tidak memungkinkan karena stabilitas dari formula produk

hendaklah dipakai metode sterilisasi akhir yang lain setelah dilakukan filtrasi dan/atau

proses aseptik (BPOM RI Nomor Hk.03.1.33.12.12.8195 Tahun 2012).

a. Sterilisasi Cara Panas

b. Sterilisasi Cara Panas Basah

c. Sterilisasi Cara Panas Kering

d. Sterilisasi Radiasi

e. Sterilisasi dengan Etilen Oksida

Kepastian sterilitas dari produk jadi diperoleh melalui validasi siklus sterilisasi

untuk produk yang disterilisasi akhir, dan melalui “media fill” untuk produk yang

diproses secara aseptik. Catatan pengolahan bets dan, dalam hal proses aseptik, catatan

mutu lingkungan, hendaklah diperiksa sejalan dengan hasil uji sterilitas. Prosedur

pengujian sterilitas hendaklah divalidasi untuk produk yang berkaitan. Metode

farmakope harus digunakan untuk validasi dan kinerja pengujian sterilitas. Untuk

produk injeksi, Air untuk Injeksi, produk antara dan produk jadi hendaklah dipantau

terhadap endotoksin dengan menggunakan metode farmakope yang diakui dan

tervalidasi untuk tiap jenis produk. Untuk larutan infus-volume-besar, pemantauan air

atau produk antara hendaklah selalu dilakukan sebagai pengujian tambahan terhadap

pengujian yang dipersyaratkan dalam monografi produk jadi yang disetujui. Bila

terdapat kegagalan uji sampel, penyebab kegagalan hendaklah diinvestigasi dan

dilakukan tindakan perbaikan bila diperlukan (POPP-Aneks 1-Ped-04/CPOB/2013) dan

(BPOM RI Nomor Hk.03.1.33.12.12.8195 Tahun 2012).

DAPUS

BPOM RI Petunjuk Operasional Penerapan Pedoman Cara Pembuatan Obat Yang Baik Aneks 1 Pembuatan Produk Steril Edisi 2013 (POPP-Aneks 1-Ped-04/CPOB/2013).

Gandjar, IG., Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar.Yogyakarta

Peraturan Kepala BPOM RI Nomor HK.03.1.23.08.11.07331 tahun 2011 tentang Metode Analisis Kosmetika

Peraturan Kepala BPOM RI Nomor Hk.03.1.33.12.12.8195 Tahun 2012 Tentang Penerapan

Pedoman Cara Pembuatan Obat Yang Baik.